CN104560845A

CN104560845A - 一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

Info

Publication number: CN104560845A
Application number: CN201310518541.9A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 刘珺; 原素英; 郑春阳
Original assignee: TIANJIN QIANGWEITE BIO-TECH Co Ltd
Current assignee: TIANJIN QIANGWEITE BIO-TECH Co Ltd
Priority date: 2013-10-29
Filing date: 2013-10-29
Publication date: 2015-04-29

Abstract

一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种微生物重组菌的构建方法。首先根据波曲热多孢菌的内切-1,4-β-木聚糖酶基因设计了引物，PCR扩增成功后进行酶切消化，连接载体质粒pHT43，经大肠杆菌DH5α扩增后，挑选阳性克隆，经菌体PCR及测序验证后，将基因序列测序正确的质粒大量抽提，经过转化导入枯草芽孢杆菌WB800N宿主，培养并经过1mMIPTG诱导表达后，发酵液上清经SDS-PAGE电泳证明嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶的重组蛋白成功获得表达。所述重组蛋白的相对分子量为27KD，最适反应温度为80℃，最适反应pH为6.0。所述嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在造纸业和食品加工业中有广泛应用。

Description

一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及从一种嗜热菌即波曲热多孢菌中通过PCR得到内切- 1, 4-β-木聚糖酶基因，构建重组表达质粒并转化至枯草芽孢杆菌中进行表达。

背景技术

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是目前原核表达系统中分泌表达外源蛋白较理想的宿主，作为一种表达系统具有如下明显优势：（1）它是一种安全的表达系统：其安全程度可以达到食品级，这是一般原核表达系统无法比拟的；（2）具有很强的蛋白质分泌功能，蛋白质在细胞内合成后，可以通过特定机制（分泌途径）输出到细胞外培养基中。提取不需要破碎细胞，只需较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质。目前，多种外源蛋白质已在枯草芽胞杆菌中实现了分泌表达。（3）没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包涵体。（4）发酵条件简单，产物易于分离纯化。以上优点使得枯草芽孢杆菌成为一种优秀的表达系统。借助于此表达体系，很多重组耐高温α-淀粉酶、多肽类药物、杀虫蛋白都已经实现商业化生产。

目前在纸浆蒸煮过程中，国外主要采用木聚糖酶切断木质素同纤维素之间的联系物（木聚糖或半纤维素），使木质素游离，再用碱蒸煮后，由纸浆游离出的木聚糖可再次吸附在纤维的表面，用木聚糖酶将其分解，可增加孔隙，氯素的浸透性提高，从而使木质素容易从纸浆内部浸提出来。此工艺活性氯用量可减少30%以上。但造纸用木聚糖酶制剂中不允许纤维素酶的活性过高，否则会在酶处理过程中会引起纸浆粘度和纤维强度的下降。碱蒸煮是一个高温过程，同时高温条件更有利于木质素溶出，因此开发在碱性条件下具有高活性的嗜热木聚糖酶将更有应用价值。此外，在食品焙烤及果蔬加工工业中嗜热木聚糖酶具有重要的潜在应用价值，比如在面包生产中，耐热木聚糖酶能够明显改善面团的稳定性，提高入炉急涨性能和增大烘烤后面包体积等功能，展现了良好的酶学性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。通过上述方法构建的重组枯草芽胞杆菌菌株能够表达在高温下具较强酶解活力的嗜热内切- 1, 4-β-木聚糖酶。此类酶在高温下活性较高，热稳定性好，在偏碱性条件下也很稳定，非常适合于工业应用。

本发明的技术方案为:

1. 以波曲热多孢菌基因组为模板，采用phusion高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，引物：

P1: 5′- CAACACTCTAGAATGGATACAACAATCACACA-3′

P2: 5′- ATCATTCCCGGGTCAAAGTGTAGCAACGC-3′

反应条件为：98 ℃预变性30 s；（98 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环）；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存;使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；

2. 将上述PCR扩增产物与枯草表达载体pHT43分别使用Xba I和Sma I双酶切后，回收产物经T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，通过100 μg/mL氨苄青霉素抗性筛选重组质粒，PCR鉴定阳性克隆并测序；

3. 枯草芽孢杆菌WB800N菌株划线于LB培养基中，37 ℃过夜培养。挑取单菌落于5 mL SPC液体培养基中，37 ℃，200 rpm过夜培养；

4. 次日，取1 mL过夜培养物转接至8 mL SPC培养基中，37 ℃，200 rpm继续培养，当培养物生长到OD ₆₀₀=1.2～1.6时，按1:1的比例转接到SPII培养基中，37 ℃ 200 rpm继续培养2小时，然后快速把培养物转移到冰上，加入终浓度为10%的甘油，分装成每管0.5 mL，于-80 ℃保存；

5. 取4 μL待转化的质粒加入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，于37 ℃ 200 rpm复苏30 min，向复苏的细胞中添加0.3 mL LB液体培养基，继续在相同条件下培养30 min，把培养物在2500 rpm离心1 min，适当浓缩后把转化产物涂布于5 μg/mL LB平板37 ℃过夜培养；

6. 接种重组枯草芽孢杆菌于2瓶50 mL 2×YT培养基中（一瓶含5 μg/mL Km^r，另一瓶无抗性），37 ℃，200 rpm过夜培养；

7. 次日，将过夜的菌液转接到新的2×YT培养基中，测得起始OD ₆₀₀约为0.15，37 ℃，200 rpm继续培养，当培养至OD ₆₀₀= 0.7～0.8时，分装为2瓶，一瓶用1 mM IPTG诱导，另一瓶作为对照，不加诱导剂，分别收集1、2、3 h的菌体1 ml，12000 rpm，4 ℃离心10 min，取上清；

8. 培养基上清液经TCA-DOC沉淀、丙酮清洗后，用40 μL 的50 mM Tris HCl pH 8.0溶解，加入10 μL 的5×SDS 上样缓冲液经100 ℃加热处理后，采用10% SDS-PAGE分析培养基中蛋白表达情况；

9. 取适当稀释酶液于50～100 ℃水浴进行酶解反应，每隔10 ℃测定酶活，以酶活力最高者为100%，作温度-相对酶活性曲线；

10. 在80 ℃下，分别测定重组嗜热内切-1, 4-β-木聚糖酶在不同pH值下的酶活性，以测得最大值为100%，作pH-相对酶活性曲线。

附图说明

图1为重组表达载体pHT43-XynA的结构图。

图2为重组表达载体pHT43-XynA的电泳图。

图3为重组嗜热内切-1, 4-β-木聚糖酶的SDS-PAGE分析图。

图4为温度对重组嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶活力影响的示意图。

图5为pH对重组嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶活力影响的示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例中使用的酶和试剂：波曲热多孢菌基因组购自美国ATCC No.35864。大肠杆菌DH5α、枯草芽孢杆菌表达宿主WB800N及质粒pHT43购自MoBiTec公司。

Phusion高保真DNA聚合酶，限制性内切酶（Xba I，Sma I）均购自NEB；T4 DNA连接酶，Taq DNA 聚合酶为本公司自产，质粒提取试剂盒及PCR产物回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA marker购自TAKARA；蛋白Marker购自Fermentas；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）和氯霉素购自上海生工。

实施例中使用的主要培养基：LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%， NaCl 1%，重组质粒克隆时使用；2×YT培养基：胰蛋白胨1.6%，酵母提取物1%， NaCl 0.5%。抗生素含量：用于培养含有AMP^r质粒的大肠杆菌时，质量浓度为100 μg/mL；用于培养含有Km^r质粒的枯草芽胞杆菌时，Km^r质量浓度为5 μg/mL。

实施例1：

1 PCR引物设计与基因扩增

以波曲热多孢菌基因组为模板，phusion高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，构建重组质粒的引物序列如下：

P1: 5′- CAACACTCTAGAATGGATACAACAATCACACA-3′；

P2:5′- ATCATTCCCGGGTCAAAGTGTAGCAACGC-3′。

PCR扩增反应条件为：98 ℃预变性30 s；（98 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环）；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2 重组表达载体的构建与转化

将PCR扩增产物回收后，得到内切-1,4-β-木聚糖酶基因片段与枯草表达载体pHT43分别使用Xba I和Sma I双酶切后，回收产物经T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，通过100 μg/mL氨苄青霉素抗性筛选重组质粒，PCR鉴定阳性克隆并送至北京六合华大基因测序。

3 枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化

取保存的WB800N菌株划线于LB培养基中，37 ℃过夜培养。挑取单菌落于5 mL SPC液体培养基中，37 ℃，200 rpm过夜培养。次日，取1 mL过夜培养物转接至8 mL SPC培养基中，37 ℃，200 rpm继续培养，当培养物生长到OD ₆₀₀=1.2～1.6时，按1:1的比例转接到SPII培养基中37 ℃，200 rpm继续培养2小时后停止培养，快速把培养物转移到冰上，加入终浓度为10%的甘油，分装成每管0.5 mL，于-80 ℃保存。取4 μL待转化的质粒加入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，于37 ℃，200 rpm复苏30 min,向复苏的细胞中添加0.3 mL LB液体培养基，继续在相同条件下培养30 min，把培养物在2500 rpm离心1 min，适当浓缩后把转化产物涂布于5 μg/mL LB平板37 ℃过夜培养。

4 重组枯草芽孢杆菌工程菌pHT43的分泌表达

接种重组芽孢杆菌于2瓶50 mL 2×YT培养基中（一瓶含5 μg/mL Km^r，另一瓶无抗性），37 ℃, 200 rpm过夜培养。次日，将过夜的菌液转接到新的2×YT培养基中，测得起始OD ₆₀₀约为0.15, 37 ℃, 200 rpm继续培养。当培养至OD ₆₀₀= 0.7～0.8时，分装为2瓶，一瓶用1 mM IPTG诱导，另一瓶作为对照，不加诱导剂。分别收集1、2、3 h的菌体1 ml，12000 rpm，4 ℃离心10 min，取胞外上清。胞外清液经TCA-DOC沉淀、丙酮清洗后,用40 μL 的50 mM Tris HCl pH 8.0溶解，加入10 μL 的5×SDS 上样缓冲液经100 ℃加热处理后，采用10% SDS-PAGE分析培养基中蛋白表达情况。

实施例2：重组嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶酶学性质分析

本研究测定酶活力的方法为DNS试剂法：以10 mg/mL的榉木木聚糖为底物，其中酶反应温度设为80 ℃，以在测定的条件下，每分钟释放1 μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。

2.1 酶的最适反应温度

取适当稀释酶液于50～100 ℃水浴进行酶解反应，每隔10 ℃测定酶活，以酶活力最高者为100%，作温度-相对酶活性曲线。

2.2 酶的最适反应pH

配制pH 6.0～8.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和pH8.5～10.5的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。在80 ℃下，分别测定重组嗜热内切-1,4-β-木聚糖酶在不同pH值下的酶活性。以测得最大值为100%，作pH-相对酶活性曲线。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 天津强微特生物科技有限公司

<120> 一种表达嗜热内切- 1, 4-β-木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

<160> 2

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caaca ctcta gaatg gatac aacaa tcaca ca 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atcat tcccg ggtca aagtg tagca acgc 37

Claims

1.一种表达嗜热木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

以波曲热多孢菌基因组为模板，采用Phusion高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，引物：

P1: 5′- CAACACTCTAGAATGGATACAACAATCACACA-3′

P2: 5′- ATCATTCCCGGGTCAAAGTGTAGCAACGC-3′

2）将上述PCR扩增产物与枯草表达载体pHT43分别使用Xba I和Sma I双酶切后，回收产物经T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态，通过100 μg/mL氨苄青霉素抗性筛选重组质粒，PCR鉴定阳性克隆并测序;

3）枯草芽孢杆菌WB800N菌株划线于LB培养基中，37 ℃过夜培养，挑取单菌落于5 mL SPC液体培养基中，37 ℃，200 rpm过夜培养；

4）次日，取1 mL过夜培养物转接至8 mL SPC培养基中，37 ℃，200 rpm继续培养，当培养物生长到OD ₆₀₀=1.2～1.6时，按1:1的比例转接到SPII培养基中，37 ℃ 200 rpm继续培养2小时，然后快速把培养物转移到冰上，加入终浓度为10%的甘油，分装成每管0.5 mL，于-80 ℃保存;

5）取4 μL待转化的质粒加入到枯草芽孢杆菌感受态细胞中，于37 ℃ 200 rpm复苏30 min，向复苏的细胞中添加0.3 mL LB液体培养基，继续在相同条件下培养30 min，把培养物在2500 rpm离心1 min，适当浓缩后把转化产物涂布于5 μg/mL LB平板37 ℃过夜培养;

6）接种重组枯草芽孢杆菌于2瓶50 mL 2×YT培养基中（一瓶含5 μg/mL Km^r，另一瓶无抗性），37 ℃，200 rpm过夜培养；

7）次日，将过夜的菌液转接到新的2×YT培养基中，测得起始OD ₆₀₀约为0.15，37 ℃，200 rpm继续培养，当培养至OD ₆₀₀= 0.7～0.8时，分装为2瓶，一瓶用1 mM IPTG诱导，另一瓶作为对照，不加诱导剂，分别收集1、2、3 h的菌体1 ml，12000 rpm，4 ℃离心10 min，取上清；

8）培养基上清液经TCA-DOC沉淀、丙酮清洗后，用40 μL 的50 mM Tris HCl pH 8.0溶解，加入10 μL 的5×SDS 上样缓冲液经100 ℃加热处理后，采用10% SDS-PAGE分析培养基中蛋白表达情况;

10）取适当稀释酶液于50～100 ℃水浴进行酶解反应，每隔10 ℃测定酶活，以酶活力最高者为100%，作温度-相对酶活性曲线；

11）在80 ℃下，分别测定重组嗜热内切-1, 4-β-木聚糖酶在不同pH值下的酶活性，以测得最大值为100%，作pH-相对酶活性曲线。