CN101948821A - 一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法。具体是将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中构建整合型重组枯草芽孢杆菌，以此重组枯草芽孢杆菌为菌种，在营养培养基中发酵生产α-乙酰乳酸脱羧酶。本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统生产α-乙酰乳酸脱羧酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法。
背景技术
双乙酰是啤酒发酵中的风味物质，但是啤酒中双乙酰含量超过0.15mg/L就能产生令人不愉快的馊饭味，严重影响啤酒的风味，国家标准(GB4927-2008)规定优级啤酒中双乙酰含量不得高于0.10mg/L。α-乙酰乳酸脱羧酶是一类可有效地降低啤酒中双乙酰含量，改善啤酒风味的酶类，它可以直接将啤酒发酵过程中产生的双乙酰的前驱物-乙酰乳酸转化为乙偶姻，使其不经过形成不良风味物质双乙酰阶段，加快啤酒成熟，缩短生产周期，提高设备利用率，具有很好的经济和社会效益。
利用大肠杆菌作为宿主菌表达α-乙酰乳酸脱羧酶已获得成功，苟帮超等人(2006年，四川师范大学学报)将来源于产气大肠杆菌(Enterobacter aerogenes)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因插入到表达载体pBV220，转化到大肠杆菌DH5α，诱导培养后收集细胞、破壁，酶活可达到240U/ml。但大肠杆菌表达系统存在一些缺陷，如含有内毒素、肠毒素、难以分泌表达，产物需要破胞提取等，而且为了保持质粒的稳定性，在生产过程中一般需要使用抗生素。为了避免重组微生物发酵过程中残留的抗生素类物质对于食品安全的影响，国际上对微生物来源的酶制剂的抗菌活性有严格限制，JECFA(Joint FAO/WHOExpert Committee on Food Additives，联合国粮农组织和世界卫生组织下的食品添加剂联合专家委员会)和AOAC(Association of Analytical Communities，美国官方分析化学师协会)等国际组织将抗菌活性列为食品用酶制剂的重要检验要求，这对酶制剂生产企业提出了更高的要求。
枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，是非致病的，不产内毒素和致热致敏蛋白质，是一种食品安全的菌种。另外，枯草芽孢杆菌表达系统还具有以下优点：1具有很强的蛋白质分泌功能，不需要破碎细胞来提取蛋白质，只需要较简单地处理发酵上清液即可得到较纯的目标蛋白质。2没有明显的密码子偏爱性，同时表达产物也不容易形成包函体。3发酵条件简单。因此，开发利用枯草芽孢杆菌表达系统生产食品添加剂具有深远的意义和广阔的市场前景。根据所采用载体类型不同，枯草芽孢杆菌表达模式可分为可复制质粒表达和染色体整合表达。Diderichsen等(1990，Journal of Bacteriology)将来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆到质粒上并转化到枯草芽孢杆菌168衍生菌株，成功获得表达。但复制质粒通常在枯草芽孢杆菌中不很稳定，这限制了外源基因的高效表达。同时也存在着在生产过程中需要使用抗生素的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法。利用整合质粒将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体基因组中，构建整合型重组枯草芽孢杆菌，利用该菌在液体培养基中进行发酵，得到α-乙酰乳酸脱羧酶。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法：
1.整合型重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件克隆到质粒pMLK83或其衍生质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，在含新霉素20ug/ml的LB固体培养基上，挑选出新霉素抗性以及α-淀粉酶缺失的菌株，即为外源基因通过双交换整合到染色体中的重组枯草芽孢杆菌；
所述的α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件，包含
1)能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，例如来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；
2)能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断，例如来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AmyX基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因SacB信号肽DNA片断；
3)来源于克雷伯氏土壤菌(Klebsiella terrigena)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子，或来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子，也可以是来源于其它菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子；
所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或WB800；
2.以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法是，以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种在营养培养基中发酵生产α-乙酰乳酸脱羧酶，生产步骤如下：
1)所述整合型重组枯草芽孢杆菌，是将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件整合到宿主枯草芽孢杆菌染色体中，经过筛选得到的整合型重组枯草芽孢杆菌；
2)所述的营养培养基，为包含0.1-5％胰化蛋白胨，0.1-5％酵母提取物，0.5-2％NaCl的液体培养基，或相同蛋白质含量的水解酪蛋白代替胰化蛋白胨的液体培养基；
3)α-乙酰乳酸脱羧酶的生产方法，包括接种、培养、分离、浓缩和包装，具体操作是：以构建的重组枯草芽孢杆菌菌株为菌种，在温度30～40℃，pH6.0～8.0，好氧条件下按0.5％～15％接种量扩增菌种和发酵，好氧发酵18-48小时，发酵液在400～16000g离心力离心或在孔径0.2～0.6um过滤除菌，上清液在截留分子量5000～10000超滤膜浓缩后，得到成品α-乙酰乳酸脱羧酶，4～10℃低温保存。
本发明首次将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件整合到枯草芽孢杆菌染色体中，以该菌作为菌种，常规的生产工艺，发酵生产α-乙酰乳酸脱羧酶。
本发明的优点是：本发明利用食品安全的表达系统生产α-乙酰乳酸脱羧酶，整合型表达的菌株所含的外源基因能够稳定传代和表达，产品达到食品要求，产品无抗菌活性。
具体实施方式
避免表达系统中质粒不稳定的最有效途径是使用枯草芽孢杆菌整合质粒，将外源基因整合到枯草芽孢杆菌染色体中，外源基因随染色体的复制而复制和表达，这样外源基因在宿主中可保持较好的稳定性。本发明用到的整合质粒pMLK83购自美国俄亥俄州立大学Bacillus遗传保藏中心(BGSC，http://www.bgsc.org)，该质粒有两段与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因同源的DNA序列(同源臂)，在这两段同源臂中有新霉素抗性基因；另外该质粒有大肠杆菌复制子而无枯草芽孢杆菌复制子，因此能在大肠杆菌中复制而不能在枯草芽孢杆菌中复制。质粒转化到枯草芽孢杆菌时，通过新霉素抗性选择，只有整合到枯草芽孢杆菌染色体中的重组菌才能生长，这样就筛选出重组子。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但需要说明的是，实施例并不构成对本发明要求保护范围的限制。
实施例1
本实例将包含来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43启动子，来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断和来源于克雷伯氏土壤菌(Klebsiella terrigena)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因单顺反子的α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83，然后转化宿主菌1A751构建整合型重组枯草芽孢杆菌，最终在LB液体培养基中发酵生产α-乙酰乳酸脱羧酶。
1.构建重组质粒pMLK83-P43
根据Genbank中注释的启动子P43序列，设计上游引物为5’attgctggacgcttatggac 3’和下游引物为5’cgggatccattcctctcttacctataat 3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(枯草芽孢杆菌1A751总DNA)1ul(约20ng)，5×PrimeSTAR Buffer 20ul，10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HSDNA聚合酶1ul，添加ddH2O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamH I、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-P43。
2.构建重组质粒pMLK83-P43-ALDC
以公司保存的pETGAU-1为模板，设计上游引物5’cgggatccatgaaaaaaaatatcatcacttct 3’和下游引物5’tccccgcggagcaccaattaccaggcaga 3’。PCR反应体系100ul：DNA模板pETGAU-11ul(约20ng)，5×PrimeSTAR Buffer 20ul，10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚合酶1ul，添加ddH2O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83-P43用限制性内切酶BamH I和Sac II进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-P43-ALDC。
3.整合型质粒pMLK83-P43-ALDC在枯草芽孢杆菌中的转化
取一满环枯草芽孢杆菌1A751甘油菌划LB平板，37℃培养箱培养过夜。转化前一天晚间挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，第二天上午取160μl培养液转接至8ml SPI培养基中(SPI培养基：SP盐加1％体积浓度为50％(W/V)葡萄糖溶液，1％体积100×CAYE溶液；SP盐溶液：0.2％(NH2)SO4，1.4％K2HPO4，0.6％KH2PO4，0.02％MgSO47H2O，0.1％柠檬酸钠)，37℃，250rpm培养至对数生长末期(约4～5小时)；取0.2ml生长至对数末期的培养液至2ml SPII培养基中(SPII培养基：SPI培养基加入1％体积50mmol/L CaCl2溶液，1％体积250mmol/L MgCl2溶液)，37℃，100rpm培养90分钟；在上述SPII培养基的菌体中加入20ul 10mmol/L EGTA，再于37℃，100rpm培养10分钟；将上述处理后的菌液分装成0.5ml每管，加入5ul质粒pMLK83-P43-ALDC(50ng/ul)，再于37℃，250rpm培养90分钟，取菌液涂布新霉素(20ug/ml)LB平板，筛选淀粉酶缺失转化子即是枯草芽孢杆菌基因工程菌株1A751[ALDC]。
4.α-乙酰乳酸脱羧酶的生产，操作步骤如下：
1)一级种的制备：从含新霉素20ug/ml的LB平板(LB培养基：蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl1％，平板加1.5％Agar)上接1A751[ALDC]单菌落在4ml LB液体培养基37℃、220rpm培养过夜，所得的菌种为一级种。
2)二级种的制备：一级种接种于800ml LB液体培养基，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6左右(约4～5小时)。
3)三级种的制备：将二级种接种到80L LB液体发酵罐中，37℃，以柠檬酸、NaOH控pH 7.0左右，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，培养至OD600为0.6左右(约5～6小时)。
4)生产罐发酵：将三级种接种到3T发酵罐中，LB液体培养基，36～38℃，通风搅拌，溶氧控制在20～30％，以柠檬酸、NaOH控pH 6～8，培养约26小时，10000g离心力离心除菌，用截留分子量5000～10000超滤膜浓缩上清液后，即得α-乙酰乳酸脱羧酶浓缩原液。
α-乙酰乳酸脱羧酶酶活的测定按国家标准GB 20713-2006进行。经测定，发酵原液离心后，上清液的酶活为120～130U/ml左右。
实施例2
本实例将包含来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子和来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因(包括信号肽)单顺反子的α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件克隆到整合质粒pMLK83，然后转化宿主菌1A751构建整合型重组枯草芽孢杆菌，最终在LB液体培养基中发酵生产α-乙酰乳酸脱羧酶。
1.构建重组质粒pMLK83-amyM
根据Genbank中注释的启动子amyM序列，设计上游引物为5’CCCAAGCTTCTGTACACTTGCGTCCTCCA 3’和下游引物为5’cgggatccTCTCCTCCCCTTTCAATGTG 3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(Bacillus licheniformis ATCC 14580总DNA)1ul(约20ng)，5×PrimeSTARBuffer 20ul，10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTAR HS DNA聚合酶1ul，添加ddH20至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和质粒pMLK83用限制性内切酶BamHI、Hind III分别进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5α中，经筛选鉴定获得重组质粒pMLK83-amyM。
2.构建重组质粒pMLK83-amyM-ALDB
设计上游引物5’CGGGATCCATGAAAAAAAATATCATCAC 3’和下游引物5’tccccgcggAGCACCAATTACCAGGCAGA 3’。PCR反应体系100ul：DNA模板(Bacillus brevis ATCC 11031总DNA)1ul(约100ng)，5×PrimeSTAR Buffer 20ul，10pmol/ul dNTP 2ul，10pmol/ul正反向引物各为2ul，2.5U/ul PrimeSTARHS DNA聚合酶1ul，添加ddH2O至100ul。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃保存。PCR片段和载体pMLK83-amyM用限制性内切酶BamH I和SacII进行双酶切后用T4连接酶进行连接，转化到大肠杆菌DH5C中，经筛选鉴定获得重组载体pMLK83-amyM-ALDB.
3.整合型质粒pMLK83-amyM-ALDB在枯草芽孢杆菌中的转化以及用获得的重组菌株进行α-乙酰乳酸脱羧酶的生产同实例一。此菌株发酵原液离心后，上清液的酶活为70～80U/ml左右。
Claims (1)
1.一种以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法，其特征在于：
1)整合型重组枯草芽孢杆菌的构建方法，是将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件克隆到质粒pMLK83或其衍生质粒上，得到的重组质粒转化宿主枯草芽孢杆菌，在含新霉素20ug/ml的LB固体培养基上，挑选出新霉素抗性以及α-淀粉酶缺失的菌株，即为外源基因通过双交换整合到染色体中的重组枯草芽孢杆菌；
所述的α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件，包含
(1)能够在枯草芽孢杆菌中高效启动基因表达的启动子，例如来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)重叠启动子P43，或来源于地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)麦芽糖淀粉酶基因amyM的启动子；
(2)能在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达蛋白的信号肽DNA片断，例如来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AmyX基因信号肽DNA片断，或枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因SacB信号肽DNA片断；
(3)来源于克雷伯氏土壤菌(Klebsiella terrigena)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子，或来源于短芽孢杆菌(Bacillus brevis)的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子，也可以是来源于其它菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因的单顺反子或多顺反子；
所述的宿主枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌168衍生菌株，例如1A751，WB600，或WB800；
2)以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种生产α-乙酰乳酸脱羧酶的方法是，以整合型重组枯草芽孢杆菌为菌种在营养培养基中发酵生产α-乙酰乳酸脱羧酶，生产步骤如下：
(1)所述整合型重组枯草芽孢杆菌，是将α-乙酰乳酸脱羧酶表达元件整合到宿主枯草芽孢杆菌染色体中，经过筛选得到的整合型重组枯草芽孢杆菌；
(2)所述的营养培养基，为包含0.1-5％胰化蛋白胨，0.1-5％酵母提取物，0.5-2％NaCl的液体培养基，或相同蛋白质含量的水解酪蛋白代替胰化蛋白胨的液体培养基；
(3)α-乙酰乳酸脱羧酶的生产方法，包括接种、培养、分离和浓缩，具体操作是：以构建的重组枯草芽孢杆菌菌株为菌种，在温度30～40℃，pH 6.0～8.0，好氧条件下按0.5％～15％接种量扩增菌种和发酵，好氧发酵18-48小时，发酵液在400～16000g离心力离心或在孔径0.2～0.6um过滤除菌，上清液在截留分子量5000～10000超滤膜浓缩后，得到成品α-乙酰乳酸脱羧酶，4～10℃低温保存。
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