CN102816787B - 利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶 - Google Patents

Abstract

以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，扩增得到编码α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)的基因saald，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，在E.coli BL21中用IPTG诱导表达，利用表达载体pET-28a上的6·His-Tag标签，选用Ni柱亲和层析纯化表达具有活性的α-乙酰乳酸脱羧酶。粗酶液的比酶活为56U/mg，纯化后比酶活达到469.85U/mg，纯化倍数达8.36倍，回收率为87.65％。

Description

利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶

技术领域

利用重组大肠杆菌高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase，简称为ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，避免双乙酰的生成，它可以缩短啤酒熟化周期，提高生产效率，对啤酒工业来说极有经济价值。

α-乙酰乳酸脱羧酶主要应用于啤酒酿造工业。在啤酒酵母代谢过程中，α-乙酰乳酸是亮氨酸一缬氨酸生物合成过程的中间产物。大部分α-乙酰乳酸在酵母细胞内代谢形成缬氨酸和亮氨酸，小部分渗漏到细胞外，进入发酵液中，在胞外经非酶氧化生成双乙酰。在啤酒酿造过程中，双乙酰是影响啤酒质量的关键因素，也是决定啤酒成熟与否的重要指标，虽然双乙酰赋予了啤酒特殊的风味，但是其口味阈值比较低(0.02～0.10mg/L)，当含量超过0.15mg/L时就会给啤酒带来不愉快的馊饭味，因此在整个发酵过程中严格控制双乙酰的产生量是至关重要的。α-乙酰乳酸脱羧酶能将啤酒生产过程中双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸迅速分解为乙偶姻，从而快速地降低啤酒中双乙酰的含量。

酿酒酵母不含ALDC，很多细菌中含有该酶。Godtfredsen等测试的34个属79个种(325株)细菌中，有ALDC活性的占20个属40个种。α-乙酰乳酸脱羧酶首次于1952年从产气肠杆菌中分离得到，之后有关该酶在生物界中的分布及菌种选育得到了广泛研究。a-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)存在于多种细菌中，它参与α-乙酰乳酸代谢，将α-乙酰乳酸转化为乙偶姻。目前还未在真菌、海藻和原生动物等真核生物中发现该酶的存在。

细菌中天然存在的ALDC产量很低，要想将该酶应用于啤酒工业，研究ALDC的分子结构以及ALDC基因，进行基因的克隆和表达，提高酶的产量，是一种必然的选择。随着对ALDC分子水平研究的深入，α-乙酰乳酸脱羧酶基因已经从多种细菌中克隆得到，并在大肠杆菌、枯草杆菌和酵母中获得了不同程度的表达。

发明内容

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自金黄色葡萄球菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因在本发明中简称saald，构建重组表达载体pET-28a(+)-saald，并将其转化E.coliBL21，成功构建了基因工程菌pET-28a-saald/BL21，利用亲和层析法对表达的ALDC进行了纯化，得到了酶活可达到469.85U/mg的纯酶液，并对该酶的酶学性质进行了研究，以便为以后该酶的应用提供理论基础。将发酵获得的α-乙酰乳酸脱羧酶运用在啤酒发酵中，初步探讨了其降低双乙酰含量的能力。

本发明的技术方案：

1.α-乙酰乳酸脱羧酶引物设计

根据NCBI金黄色葡萄球菌的全基因组核酸序列中saald基因序列，设计α-乙酰乳酸脱羧酶的PCR引物P1和P2。

P1：5’-ATCGAATTCATGACGAATGTCTTGTATC-3’(EcoR I)

P2：5’-TGACTGCGGCCGCCTATTCAGCTTCTCTAATTT-3’(Not I)

2.重组菌的构建

从金黄色葡萄球菌中抽提染色体DNA作为模板，根据预先设计好的引物、PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。采用下共同的限制性内切酶对载体pET-28a和纯化的PCR产物进行双酶切，电泳检验酶切产物，并用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化和回收。将载体和PCR产物用T4DNA连接酶过夜连接。取连接产物转入E.coli BL21的感受态细胞进行转化，挑取阳性转化子于10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后，将菌液加入甘油于-40℃冰箱保存。

3.重组菌α-乙酰乳酸脱羧酶的表达纯化

取冻管保藏的菌种接入10mL的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日转接，诱导表达，将诱导液通过亲和层析纯化得到纯酶液。粗酶液蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。经测定粗酶液比酶活是56U/mg，纯酶液比酶活是469.85U/mg。纯酶液进行酶学性质的初步研究。

4.α-乙酰乳酸脱羧酶在啤酒发酵中的应用

将发酵获得的α-乙酰乳酸脱羧酶运用在啤酒发酵中，初步探讨了其降低双乙酰含量的能力。在冷麦汁中加入按照0.05mg/L的量添加所得的纯酶，经检测发现，发酵过程中双乙酰的峰值比不添加的情况下明显降低，且加速了双乙酰的还原，使发酵周期缩短了约3天。啤酒发酵结束后，其中的乙酰乳酸几乎完全生成双乙酰而得到还原，这样就有效避免了成品啤酒中双乙酰的回升现象。

本发明的有益效果：α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)能催化双乙酰的前体物α-乙酰乳酸脱羧形成乙偶姻，避免双乙酰的生成，它可以缩短啤酒熟化周期，提高生产效率，对啤酒工业来说极有经济价值。鉴于α-乙酰乳酸脱羧酶的应用价值，获得该酶的高表达和高酶活一直以来是研究的热点。因此，通过基因工程技术构建高表达载体达到α-乙酰乳酸脱羧酶的高效表达和比较高的酶活水平具有重要意义。以本实验室保藏的一株金黄色葡萄球菌为出发菌株，测得较为可观的α-乙酰乳酸脱羧酶活性，克隆其基因saald并在大肠杆菌中得以高效表达。此外，通过研究其酶学性质也为ALDC的应用打下了良好的理论基础。

附图说明

图1质粒pET-28a-saald的酶切验证。1：DNA Marker：λ-Hind  III；2：pET-28a-saald/EcoR I+Not I；3：pET-28a-saald/EcoR I；4：pET-28a/EcoR I；5：saald/EcoR I；6：DNA Marker：DL-2000

图2α-乙酰乳酸脱羧酶的表达与纯化。1：E.coli BL21；2：purified ALDC；3：E.coli BL21 withrecombinant plasmid pET28a-saaldD/BL21with IPTG；4：E.coli BL21with recombinant plasmidpET28a-saald/BL21without IPTG；5：Protein Marker(kDa)

具体实施方式

实施例1：重组质粒pET-28a-saald的构建及转化

[1]从金黄色葡萄球菌抽提染色体DNA作为模板，抽提方法如下：用接种环从新鲜的金黄色葡萄球平板上挑取单菌落悬浮于0.5mL的灭菌双蒸水中，沸水煮5-10min，8000r/min离心10min，取上清装入一只干净的1.5mL离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[2]以金黄色葡萄球菌总DNA为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，1min，56℃退火，1min，72℃延伸，1min30s，30个循环；72℃，10min，一个循环；15℃，10min，一个循环。PCR扩增体系：模板(金黄色葡萄球菌染色体DNA)2μL，上下游引物各0.5μL，dNTP Mix 4μL，10×Ex Taq Buffer 5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

[3]构建重组质粒pMD18-T-saald，导入感受态E.coli JM109。连接体系：PCR胶回收产物4.8L，solution I 5L，pMD18-T质粒0.5L，16℃过夜连接。转化方法：将连接好的10L pMD18-T-saald加入到1201感受态E.coil JM109中，于冰上放置45min，42℃热击90s，放置冰上2min，加入800 l LB液体培养基，37℃摇床培养1h，离心，倒掉大部分上清液，留150L与沉淀混匀，涂布到氨苄青霉素平板(Amp+LB)上，于37℃培养箱培养9h左右，挑去平板上的阳性菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养。提取质粒，经酶切验证连接成功后，将菌液加入终浓度17％(w/v)的甘油，-40℃冰箱保藏。

[4]将[3]中提取的质粒和质粒pET-28a分别用EcoR I和Not I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系：目的基因酶切产物7.7L，pET-28a酶切产物0.3L，T4DNA连接酶buffer 1L，T4DNA连接酶1L，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET-28a-saald转化到感受态E.coil BL21，转化方法参照实施例2[3]，用卡那霉素平板(Kana+LB)挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20℃冰箱保藏备用。

实施例2：α-乙酰乳酸脱羧酶表达及酶活测定

[1]将实施例1[4]冻管保藏的菌种接入10mL液体LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接，37℃培养至OD₆₀₀约0.6～0.8时加入终浓度为1mmol/L的IPTG，置于30℃摇床过夜诱导表达。取所得菌液1mL于1.5mL离心管中，8000r/min离心2min，倒掉上清，加入100L pH6.8的Tris-HCl缓冲液将菌体混匀，加入30L蛋白胶上样缓冲液，沸水浴30min，使蛋白质变性，8000r/min离心2min，取上清进行SDS-PAGE检测，其中SDS-PAGE使用5％的分离胶和15％的浓缩胶，采用不连续垂直电泳，用考马斯亮蓝R250染色，以含有空载质粒pET-28a的E.coil BL21做空白对照。

[2]将过夜诱导表达的菌液于8000r/min，4℃离心10min，用pH6.0的MES I缓冲液(2-马啉乙磺酸0.05mol/L，brij-350.05％，NaCl 0.6mol/L，pH6.0)洗涤两次，最后用pH6.0的MESI缓冲液悬浮菌体，超声波破碎(300W，工作1S停3S，工作4min)，10000r/min离心30min，上清即为粗酶液。采用400L的酶活测定体系(200L酶液，200L底物)，30℃反应10min，用4.6mL显色剂终止，30℃显色30min。测得粗酶液的比酶活为56U/mg，其中，酶液的蛋白含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。

实施例3：α-乙酰乳酸脱羧酶的纯化及酶学性质

[1]粗酶液经Ni-NTA柱纯化后得到纯的ALDC，纯化后的纯酶液的比酶活是469.85U/mg，纯化倍数达8.36倍，回收率为87.65％。

[2]最适pH及pH稳定性：用底物缓冲液MES II配制不同pH(2～12)的底物溶液，将酶液用MES I稀释一定倍数，然后将不同pH的底物380μL与稀释好的酶液20μL反应，测定不同pH条件下酶的活性，并进行比较，确定酶反应的最适pH值。配制不同pH(5～10)的酶活测定缓冲液MES I，用它们来稀释酶液得到不同pH的酶液。让酶处于不同pH环境中，每隔一定时间取样，测定酶的剩余活性，观察该酶在不同pH下的稳定性，反应体系为：20μL酶液，180μLMES I，200μL底物。

[3]最适温度和热稳定性：在20℃～80℃设置11个反应温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃，测定不同温度条件下酶的活力，确定酶合适的反应温度。将适当稀释的酶液分别在-20℃、0℃、30℃、35℃、45℃、55℃、65℃保温，每隔2h取样，测定不同温度下酶的剩余活力，从而研究该酶在不同温度下的热稳定性。

[4]不同金属离子以及EDTA对酶活的影响：分别在反应体系中加入终浓度为1mmol/L的Ca²⁺、Sn²⁺、Ni⁺、Zn²⁺、Li⁺、Mn²⁺、K⁺、Na⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺离子以及EDTA，以不添加任何金属离子的酶活为100％，研究各金属离子对酶活的影响。

[5]Km值及Vmax的测定：配置不同浓度的底物，进行酶促反应，反应时间控制在2min。采用双倒数作图法确定ALDC的Km及Vmax值。

其中反应最适pH为6.0，在pH值7.0-9.0的范围内温度，反应最适温度为45℃，在35℃以下酶的稳定性较好。Sn²⁺、Zn²⁺对ALDC有明显的抑制作用，其中Zn²⁺和Fe³⁺的添加几乎使酶完全失去活性。而Ca²⁺、K⁺、Mg²⁺和EDTA对酶的影响非常小。没有发现对该酶有明显激活作用的金属离子。酶动力学参数以α-乙酰乳酸为底物的Km值为0.0177mmol/L，Vmax为2.06μmol/(mL/min)。

Claims (1)

1.一种高效表达Staphyloccocus aureus α-乙酰乳酸脱羧酶的重组菌E.coli BL21/pET-28a-saald，其特征是构建方法如下：

1)以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因组DNA为模板，扩增得到编码α-乙酰乳酸脱羧酶的saald基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，将所述saald基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-saald；

2)将重组质粒pET-28a-saald通过转化大肠杆菌感受态转入大肠杆菌BL21中，在含卡那霉素的抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌E.coli BL21/pET-28a-saald。