CN103525778A

CN103525778A - 一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体

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Publication number: CN103525778A
Application number: CN201310493241.XA
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 顾磊; 张娟; 堵国成; 闻一凡; 刘晓筱
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2013-10-18
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-10-18
Also published as: CN103525778B

Abstract

本发明公开了一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体，属于遗传工程领域。本发明采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger BBE11721的葡萄糖氧化酶（GOD）基因进行定点突变并克隆连接到毕赤酵母表达载体pPIC9k，转化Pichia pastoris GS115，经纯化验证得到一株可以产具有较好催化活性葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115-pPIC9k-GODTB，该菌株表达的葡萄糖氧化酶酶催化效率为41.52s^-1mM^-1，比野生型葡萄糖氧化酶提高了2.5倍。这为葡萄糖氧化酶的应用奠定了良好的基础。

Description

一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体

技术领域

本发明涉及一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体，属于遗传工程技术领域。

背景技术

葡萄糖氧化酶（GOD）是生物领域中最主要的工具酶之一。自1967年Updike和Hicks将GOD固定在Clark氧电极表面，将其应用于血糖测定以来，GOD被广泛应用于食品、饲料、医药等许多相关领域。

目前，许多国家已将GOD作为工人的安全抗氧剂而广泛应用于各种食品和食品加工工艺中。GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成过氧化氢、形成葡萄糖酸四个方面。利用其专一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析仪，能快速准确简易地测定各种食品中的葡萄糖含量，指导生产。在医药工业中，GOD作为试剂盒、酶电极等用于血清(浆)、尿液及脑脊液中葡萄糖的体外定量分析；GOD制成的酶制剂还可用于除去或缓解牙斑、牙垢和龋齿的形成防止口腔疾病和牙病的发生。此外，由于可以催化生成H₂0₂，还可用于对H₂O₂敏感的淋巴瘤的导向目标的治疗。GOD还是一种新型的酶饲料添加剂，能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。含葡萄糖氧化酶、乳酸过氧化物和乳铁蛋白的混合饲料添加剂，可用于预防牲畜胃肠道感染、腹泻，并有促进动物生长作用。

从动植物组织中提取GOD有一定的局限，酶量亦不丰富；细菌GOD产酶量少；一般采用黑曲霉（具有GRAS资格）和青霉属菌株作为GOD生产菌。我国及美国均采用点青霉及产黄青霉生产GOD，日本常用尼崎青霉，俄罗斯用生机青霉，近年报道胶霉属（Clioctadium）、拟青霉属（Paecilomyces）和帚霉属（Scopulariopsis）也能生产GOD。

产量低、酶活低、检测方法复杂是GOD产业化的限制性因素，国内外为此做了大量工作并取得了明显进展。目前国外生产的GOD厂家主要是德国的Boehringer和日本的TOYOBO。规模化生产高活性的GOD还有困难。发酵生产GOD的同时产生大量杂蛋白，分离提取复杂，成本高。

发明内容

本发明要解决的第一个问题是提供一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶（GOD）突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述GOD突变体是以GenBank:X16061.1所示的序列为出发基因序列，通过定点突变获得在第50位发生E（谷氨酸）→Y（酪氨酸）突变、第559位发生H（组氨酸）→T（苏氨酸）突变的突变体。

产所述产葡萄糖氧化酶突变体的基因工程菌或转基因细胞系也为本发明要求保护的范围。

本发明要解决的第二个问题是提供一种构建产所述葡萄糖氧化酶突变体的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

1）采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述葡萄糖氧化酶突变体的基因GODTB；

2）将步骤1）获得的GODTB基因连接到毕赤酵母表达载体，得到重组表达载体；

3）将步骤2）获得的重组表达载体转化Pichia pastoris GS115得到基因工程菌。

所述表达载体选pPIC9k。

本发明要解决的另一个问题是提供一种应用上述基因工程菌发酵生产葡萄糖氧化酶的方法，是以构建得到的产葡萄糖氧化酶基因工程菌为生产菌株，菌株在种子活化后接种到基本发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养；当OD值为1.2-1.5时，将菌株转入诱导培养基中诱导蛋白的产生。诱导过程的甲醇浓度维持1.8%(W/V)，诱导葡萄糖氧化酶表达。

所述诱导培养基组成为（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g，pH6.0的100mM磷酸缓冲液。

所述种子培养基为YPD培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g。

所述基本发酵培养基为BMGY培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH6.0）。

培养方法：将30℃、200rpm下培养到OD₆₀₀在1.6～1.7之间的种子以2%的接种量转入基本发酵培养基，于30℃、200rpm条件下培养；

本发明采用定点突变技术将黑曲霉Aspergillus niger BBE11721的葡萄糖氧化酶（GOD）基因进行定点突变，并克隆连接到毕赤酵母表达载体pPIC9k，改造催化活性位点增强与辅酶和底物的电子传递速率，转化P.pastoris GS115，经纯化验证得到一株可以产具有较好催化活性葡萄糖氧化酶的重组毕赤酵母P.pastoris GS115-pPIC9k-GODTB，该菌株表达的葡萄糖氧化酶酶催化效率为41.52s^-1mM^-1，比野生型葡萄糖氧化酶提高了2.5倍。这为葡萄糖氧化酶的应用奠定了良好的基础。

附图说明

图1：目的基因的扩增；M：DL2,000DNA Marker；泳道1和泳道2：GOD基因的PCR扩增条带。

图2：蛋白电泳（SDS-PAGE）实验结果；M：蛋白质分子量标准(Protein Molecular WeightMarker)；泳道1和泳道2：GOD重组蛋白。

图3：突变位点结构模拟图。

具体实施方式

实施例1催化活性提高的葡萄糖氧化酶

本发明的葡萄糖氧化酶是在在GenBank:X16061.1的基因序列基础上，两个位点发生氨基酸突变，具体为E50Y/H559T，可以通过化学全合成或定点突变的方式将两个位点进行氨基酸的取代，所得的GOD突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2产葡萄糖氧化酶基因工程菌的构建及鉴定

构建产葡萄糖氧化酶基因工程菌的步骤如下：

1）采用PCR方法或化学全合成方法获得序列如GenBank:X16061.1所示的GOD基因。

2）将GOD基因连接到克隆载体pMD19-T，得到重组载体pMD19-T-GOD。

3）定点突变两个关键位点(E50Y,H559T)：PCR定点方法突变所用引物序列如下：

E50Y：

F：5’-CCTACGCAAATGTCGTCCACTGTCATGACGGTGTTCTAT-3’

R：5’-ATAGAACACCGTCATGACAGTGGACGACATTTGCGTAGG-3’

H559T：

F：5’-ATCAGTGTGCTCGTCATCTATAGTGGCTCCTACGAGTCG-3’

R：5’-CGACTCGTAGGAGCCACTATAGATGACGAGCACACTGAT-3’

PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5×prime STAR PCR buffer II（Mg²⁺plus）5μl;DNTP Mixture4μl;模板DNA1μl；上下游引物各1μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl；PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃（根据不同突变引物而定）退火15s，72℃延伸3min20s（30个循环）；72℃延伸10min；

将胶回收纯化后的PCR产物在37℃,40min条件下DpnI限制性内切酶处理，将处理后的PCR产物用化学转化法转化宿主菌JM109，并挑选转化子。

4）挑选验证正确的转化子并提取重组质粒pMD19-T-GODTB，以其为模板扩增编码突变后的GOD的基因GODTB。

PCR方法引物序列如下：

god-F：5’-GGGGTACCAGCAATGGCATTGAAGC-3’

god-R：5’-AAATATGCGGCCGCTCACTGCATGGAAG-3’

PCR反应体系：0.2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5×prime STAR PCR buffer II（Mg²⁺plus）5μl;DNTP Mixture4μl;模板DNA1μl；上下游引物各1μl；Taq酶0.5μl；加双蒸水至终体积为50μl。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火15s，72℃延伸1min20s（30个循环）；72℃延伸10min。

5）以1%琼脂糖凝胶电泳验证并以0.8%琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，结果扩增得到GODTB基因片段(图1)。

6)用限制性内切酶SnaB I和Not I双酶切消化纯化后的GODTB基因和载体pPIC9k，用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物用化学转化法转化宿主菌JM109，转化菌液涂布在含有氨苄青霉素（100mg/mL）的LB平板上，37℃过夜培养，以god-F和god-R为引物进行菌落PCR的方法鉴定阳性克隆子（图1b-泳道1、泳道2），最终获得含有GODTB基因的重组表达质粒pPIC9k-GODTB，用双酶切进行验证。

大肠杆菌化学转化为：取连接产物5μl加入到含有100μl JM109感受态细胞中，充分混匀后，冰浴30min；将装有混合物的Eppendorf管，42℃水浴热休克90s，然后将Eppendorf管立即转移到冰上冷却2min；向管中加入600μl LB液体培养基，置于37℃200rpm恒温摇床上培养1h，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37℃向上放置1h，倒置培养12-16h后观察菌落。

7）将重组质粒pPIC9k-GODTB线性化后转化P.pastoris GS115感受态细胞，得到能在含有G418（2.5mg/mL）的MD固体平板上正常生长的基因工程菌，并经过鉴定命名为P.pastoris GS115-pPIC9k-GODTB。P.pastoris GS115是商业化的常用工具菌株，可以购买，如Invitrogen公司。

实施例3重组菌的酶活测定和蛋白电泳

酶活测定方法：将发酵液离心10min（10000×g，4℃）取发酵上清液，适当稀释的酶液，加入2.5mL邻联茴香胺溶液，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的90U mL^﹣1辣根过氧化物酶，35℃保温2min后，向试管中加入稀释好的酶液样品0.1mL，反应3min后，加入2mol L^﹣1硫酸终止反应，取出试管，测OD₅₄₀的吸光值，以热失活的酶液做空白对照。根据标准曲线的结果，计算葡萄糖氧化酶活力单位。

培养基：种子和斜面培养基为YPD培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g；斜面培养基添加琼脂20g；基本发酵培养基为BMGY培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH6.0）；诱导培养基为BMMY培养基（1L）：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g，100mM磷酸缓冲液（pH6.0）；

诱导条件：在BMGY中培养至OD值为1.2-1.5时，将酵母细胞转入BMMY培养基中诱导蛋白的产生。

通过蛋白电泳（SDS-PAGE）得到一条分子量大小约为68kDa的蛋白条带（图2），酶催化效率为41.52s^-1mM^-1，比野生型葡萄糖氧化酶（WT，未经突变的酶）提高了2.5倍（见表1），结构模拟图见图3。

表1催化活性改造葡萄糖氧化酶的酶学性质催化效率比较

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种催化活性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，是以GenBank：X16061.1所示的序列为出发基因序列，通过定点突变，将葡萄糖氧化酶第50位谷氨酸突变为酪氨酸、将第559位组氨酸突变为苏氨酸。

3.编码权利要求1所述葡萄糖氧化酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的质粒。

5.表达权利要求3所述基因的基因工程菌。

6.构建权利要求5所述基因工程菌的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述氧化酶突变体的基因GODTB；

2)将步骤1)获得的GODTB基因连接到毕赤酵母表达载体，得到重组表达载体：

3)将步骤2)获得的重组表达载体转化Pichia pastoris GS115得到基因工程菌。

7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pPIC9k。

8.应用权利要求5所述基因工程菌发酵生产葡萄糖氧化酶突变体的方法，其特征在于，将基因工程菌经种子培养基活化后接种到基本发酵培养基中，于30℃、200rpm条件下培养；当OD₆₀₀值为1.2-1.5时，将菌株转入诱导培养基中诱导蛋白的产生。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基组成为(1L)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g，pH6.0的100mM磷酸缓冲液。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，诱导过程甲醇浓度维持1.8％(W/V)。