CN101985625A - 一种陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因及其表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因及其表达载体。该基因序列为SEQ ID NO.16，其开放阅读框序列为SEQ IDNO.17，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.18。将其插入表达载体后转化大肠杆菌，IPTG诱导表达。表达出的重组酶可催化乙醛氧化生成乙酸。本发明提供了一种新型、高活性的乙醛脱氢酶基因，利用本发明基因，实现在大肠杆菌中的重组表达，克服了发酵陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)生产乙醛脱氢酶产量低的缺点，可提供大量的乙醛脱氢酶进行解酒制品的研究；并且为构建安全的乙醛脱氢酶基因工程菌奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因及其表达载体。
背景技术
人类饮酒后90％的乙醇在肝内主要通过三个酶系统被氧化：细胞质中的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)；微粒体乙醇氧化系统中的细胞色素P4502E1(CYP2E1)；过氧化物酶体中的过氧化物酶。ADH和CYP2E1是乙醇代谢的主要酶，产生第一个和主要产物——乙醛，一种具有高细胞毒性，可诱导基因突变的致癌物质；乙醛经乙醛脱氢酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)转化成乙酸，通过TCA循环代谢为二氧化碳和水。乙醛若未被及时降解会引起酒精敏感反应(表现为脸红、心搏快速、血压下降、头晕、恶心、呕吐等)，还能导致器官病变。
乙醛脱氢酶是一类依赖辅酶NAD(P)+催化内源及外源醛类底物为相应的羧酸类、具有相似的一级特征结构的氧化还原酶类。该酶广泛于自然界中，在动物、植物和微生物中均有发现，具有重要的生理代谢意义。据报道截止至2002年，已有555种编码ALDH的基因被发现。迄今发现人体内至少有12种ALDH同工酶，常见的有ALDH1-ALDH4四种，分别由定位于不同染色体的4个基因编码。其中，位于肝细胞线粒体内的ALDH2，由定位于人12号染色体的ALDH2基因编码，与60％以上的乙醛代谢有关，可将乙醛转化为毒性较低、无致癌作用的乙酸。ALDH2基因在外显子12处发生点突变(Glu487 Cys)，引起ALDH2失活。突变基因ALDH2(2)对野生型ALDH2(1)为显性，这样的ALDH2(2)纯合子和杂合子携带者的ALDH2均无活性，表现出明显的遗传和疾病的多态性，多见于亚洲人种。这种人饮酒后乙醛不能及时代谢，造成乙醛蓄积中毒，引起面红、头痛和恶心等不愉快反应，但是不易使人酗酒，有力地保护了ALDH2(2)携带者。相反，ALDH2(1)纯合型能及时代谢血中乙醛，饮酒出现轻松愉快感，易成为酗酒人群，引发酒精性肝病。但若ALDH2(2)携带者饮酒后乙醛的天然抑制作用被其嗜酒个性所抵消，高浓度的乙醛会长期积蓄在体内。即使比ALDH2(1)纯合型摄入的酒精量少，杂合型习惯性饮酒者个体可能会有酒精性肝病的较高风险。
基于酒精代谢中存在的ALDH基因多态性，开发高活性的ALDH是解酒制品研究的重点方向之一。通过克隆高活性的ALDH基因，选择合适的高效表达系统，构建生产ALDH的功能菌株来研制合适的解酒制品，将不仅有助于乙醛脱氢酶基因缺陷的人群饮酒后快速醒酒、预防和治疗各种酒精性疾病，还能减轻和消除饮酒对人体健康的损害和对社会的不良影响。
本发明涉及的菌株陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2是本发明人从新疆马奶葡萄中分离出的一株产ALDH的菌株，经过NCBI数据库搜索证实该菌株来源的ALDH及其基因未见报道。因此通用生物信息学的方法，在NCBI数据库中已有的ALDH基因资源中，通过简并PCR、Sitefing-PCR及SEFAPCR克隆了陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2的ALDH基因，并实现了其在大肠杆菌中的活性表达，为解酒制品的开发和应用提供依据。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种真核来源的编码乙醛脱氢酶(ALDH)的功能基因。
本发明的另一目的是提供含有该乙醛脱氢酶基因的重组表达载体。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种来自陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2的乙醛脱氢酶基因，该基因序列为SEQ ID NO.16。
本发明所述乙醛脱氢酶基因的开放阅读框，该开放阅读框为完整的乙醛脱氢酶基因开放阅读框，序列为SEQ ID NO.17。
本发明所述乙醛脱氢酶基因编码的乙醛脱氢酶，其氨基酸序列为SEQ IDNO.18。
一种从陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2克隆乙醛脱氢酶基因的方法：在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶蛋白质序列的基础上，通过简并PCR、Sitefinding-PCR及SEFA PCR技术从陆生伊萨酵母全基因组中克隆出乙醛脱氢酶基因。
一种乙醛脱氢酶基因重组表达载体，该重组表达载体是将本发明所述的乙醛脱氢酶基因插入表达载体所得，优选将本发明所述的乙醛脱氢酶基因插入载体pET-32a所得。
本发明所述的乙醛脱氢酶基因在制备解酒制品中的应用。
本发明所述的基因是一种真核来源编码乙醛脱氢酶的基因，在原核宿主中具有高活性表达优势。其碱基组成为：
碱基 数目 百分比
A 460 29.15
C 315 19.96
G 331 20.98
T 472 29.91
G+C 646 40.94。
本发明人在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶氨基酸序列的基础上，设计简并引物，以陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)基因组DNA为模板，利用简并PCR、Sitefinding-PCR以及SEFAPCR进行扩增，拼接所有扩增产物获得全长3255bp的序列，其中在191处有起始密码子ATG，在1766bp处有终止密码子TAA，具有1578bp完整的开放阅读框(ORF)。该ORF序列无内含子，编码525个氨基酸。编码产物分子量为57.223kD，等电点pI为5.7。将该ORF序列两端分别加上BamHI和XhoI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pET-32a连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，实现了异源表达。
本发明的有益效果是：
1.本发明运用生物信息学，在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶蛋白质序列的基础上，设计简并引物，通过简并PCR、Sitefinding-PCR和SEFAPCR技术，从陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)中克隆得到一种新型、高活性的乙醛脱氢酶基因。
2.在该基因两端分别加上BamHI和XhoI限制酶识别序列，与经相同限制酶消化的pET-32a连接并转化大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，实现了该陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因的异源表达，酶活达44.23U/mL。
3.利用本发明基因，实现在大肠杆菌中的重组表达，克服了发酵陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)生产乙醛脱氢酶产量低的缺点，可提供大量的乙醛脱氢酶进行解酒制品的研究；并且为构建安全的乙醛脱氢酶基因工程菌奠定了基础。
附图说明
图1重组陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶表达载体构建示意图
具体实施方式
实施例1：陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脱氢酶基因的克隆
将陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)接入100mL YPD培养基，30℃，200rpm培养17h。离心收集菌体，用《分子克隆实验指南》中的酵母DNA的小量制备方法提取陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)的基因组DNA。
从NCBI网站中搜索几种酵母乙醛脱氢酶序列，进行生物信息学分析，用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)程序选择其中的两处高度保守的氨基酸序列VCGQIIPWN和GEVCCAGS，据此设计了简并引物ALD-F1(SEQ ID NO.1)和ALD-R1(SEQ ID NO.2)，进行简并PCR扩增两个保守区之间的序列。
在50μl体系中，引物ALD-F1(SEQ ID NO.1)和ALD-R1(SEQ ID NO.2)终浓度各为0.8μM，dNTPs终浓度为0.2mM，陆生伊萨酵母基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃5min，35×(94℃30s，55℃60s，72℃60s)，72℃10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与pMD19-T vector(TaKaRa，Dalian，China)连接，转化E.coli DH5α(Novagen，Germany，下同)，涂于含有50μL X-gal/IPTG premix、100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。
乙醛脱氢酶基因保守区的旁邻序列由Sitefinding-PCR方法进行扩增。这种技术涉及了两种衔头SiteFinder1(SEQ ID NO.3)和SiteFinder2(SEQ ID NO.4)及与之对应的衔头序列引物SFP1(SEQ ID NO.5)、SFP2(SEQ ID NO.6)，还有2个已知基因特异引物GSP1、GSP2。以乙醛脱氢酶基因保守区序列的测序结果为基础，设计与SiteFinder1和SiteFinder2分别匹配的上游引物GSP-R1(SEQID NO.7)，GSP-R2(SEQ ID NO.8)和下游引物GSP-F1(SEQ ID NO.9)，GSP-F2(SEQ ID NO.10)。Sitefinding-PCR扩增有3轮嵌套反应程序。以SiteFinder-1扩增保守区序列5’端为例(保守区3’端序列的扩增则用SiteFinder-2替换SiteFinder-1并用特异引物GSP-F1，GSP-F2替换GSP-R1，GSP-R2)。在第一轮反应中，利用一个单一循环反应使SiteFinder1与基因组DNA退火，使SiteFinder1与保守区序列5’端连接。反应体系：10×PCR buffer 2μL，2.5mM dNTP 2μL，5U/μLTaq聚合酶0.5μL，10μM Sitefinder1 1μL，基因组DNA0.5μL，ddH2O 14μL，共计20μL；扩增程序：92℃2min，95℃1min，25℃1min，以0.2℃/sec升温至68℃，68℃10min。在随后的第二轮反应中，以第一轮反应产物为模板，利用衔头序列引物SFP1(SEQ ID NO.5)与基因特异引物GSP-R1(SEQ ID NO.7)对目标序列进行扩增；反应体系：第一轮反应结束后立即将反应产物置冰上加入10×PCR buffer 0.5μL，20μM SFP1 2.5μL，10μM GSP-R1 1μL，ddH2O 1μL，共计25μL；扩增程序：94℃1min，30×(95℃10s，68℃6min)。在第三轮反应中，将第二轮反应扩增产物稀释100倍作为模板，利用衔头引物SFP2(SEQ IDNO.6)与基因特异引物GSP-R2(SEQ ID NO.8)继续使目的片段扩增并延伸；反应体系：10×PCR buffer 5μL，10μM SFP2 5μL，10μM GSP-R2 5μL，2.5mM dNTP4μL，5U/μL Taq聚合酶1μL，ddH2O 28μL，稀释100倍的第二轮反应产物2μL，共计50μL；扩增程序：72℃10min，94℃1min，30×(95℃10s，68℃6min)，72℃10min。PCR结束后各取5μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确定有特异性条带出现。将PCR产物纯化后与pMD19-T载体连接，转化E.coliDH5α，涂于含有50μL X-gal/IPTG premix、100μg/mL氨苄青霉素LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。
分析测序结果，找到保守区与其旁邻序列的重叠区并拼接后提交至NCBI利用Blastx比对，从已知序列中推测出乙醛脱氢酶ORF自起始密码子ATG开始的大部分片段，但其3’端距终止子还缺400bp左右的片段。因此采用SEFAPCR法扩增该区域的序列。根据Site-finding PCR法所扩增保守区下游序列设计嵌套引物SP1-SP5，其中SP1(SEQ ID NO.11)，SP2(SEQ ID NO.12)，SP4(SEQID NO.14)，SP5(SEQ ID NO.15)是根据已知序列设计的特异性高退火的引物，SP3(SEQ ID NO.13)是能够与已知序列部分退火配对的特殊引物，是整个SEFAPCR的关键所在。SEFAPCR有三轮嵌套反应程序。第一轮扩增是先利用一个单一循环反应以SP3为引物在低退火温度下利用其3’端的6个碱基在已知序列附近配对，并以0.2℃/s的速度升至最高退火温度向已知序列方向扩增；反应体系：2×GC buffer I 15μL，2.5mM dNTP 5μL，5U/μL LATaq聚合酶0.3μL，基因组DNA 1μL，10μM SP3 0.5μL，ddH2O 8.2μL，共计30μL；扩增程序：94℃90s，35℃3min，以0.2℃/min升温至70℃，70℃5min。反应结束后，取出PCR管加入10μM引物SP1 1.5μL，使其在高退火温度下扩增目的片段，扩增程序：25×(94℃30s，70℃5.5min)；随后利用已有的反应体系进行热不对称PCR，在目标片段得到大量扩增的同时，使SP3“回头”与自身链配对并向5’端延伸，获得5’和3’端都含有和SP2配对的序列，扩增程序：2×(94℃30s，70℃5min)，94℃30s，55℃30s，70℃5min)，共10个循环。第二轮反应以第一轮反应产物稀释10倍为模板，以SP2为唯一引物进行巢式PCR扩增，使得PCR体系中两端包含SP2的目标条带大量扩增。反应体系：2×GC buffer I 15μL，2.5mM dNTP 5μL，5U/μL LATaq聚合酶0.3μL，10μM SP2 1.5μL，稀释10倍的第一轮反应产物1μL，ddH2O 7.2μL，共计30μL；扩增程序：30×(94℃3s，70℃5.5min)。第三轮反应用于进一步甄别目标产物，以第二轮反应产物的10倍稀释液为模板，以SP4为上游引物和SP5(位于SP2和SP3之间)为下游引物进行热不对称PCR，使得PCR体系中两端分别包含SP4和SP5的目标条带大量扩增；反应体系：2×GCbuffer I 15μL，2.5mM dNTP 5μL，5U/μL LATaq聚合酶0.3μL，10μM SP4 1.5μL，10μM SP5 0.15μL，稀释10倍的第二轮反应产物1μL，ddH2O 7.05μL，共计30μL；扩增程序：2×(94℃30s，70℃5min)，94℃30s，55℃30s，70℃5min)，共10个循环。PCR结束后各取5μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确定有特异性条带出现。将PCR产物纯化后与pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有50μL X-gal/IPTG premix、100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。
用计算机软件DNAMAN分析所有PCR扩增产物测序结果，找到重叠区拼接，获得了全长为3255bp的序列(SEQ ID NO.16)，具有一个完整的1578bp的开放阅读框(SEQ ID NO.17)，即陆生伊萨酵母乙醛脱氢酶基因(ist-ALD)，编码一个由525个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO.18)。
实施例2：陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脱氢酶基因原核表达载体的构建(图1)
根据获得的乙醛脱氢酶基因序列，设计两个引物，上游引物ALD-F2(SEQ IDNO.19)加上BamHI识别序列，下游引物ALD-R2(SEQ ID NO.20)加上XhoI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列)。
按照下列PCR体系加入各成分，扩增乙醛脱氢酶基因：10×Pfu PCR buffer10μL，10μM ALD-F2 4μL，10μM ALD-R2 4μL，2.5mM dNTPs 8μL，基因组DNA10ng，Pfu DNA聚合酶5U，ddH2O补至100μL。PCR程序为94℃5min，30×(94℃30s，60℃50s，72℃4min)，72℃10min。
用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加BamHI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH2O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-32a连接，转化大肠杆菌DH5a。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。
实施例3：陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola XJ-2)乙醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达
将含有ist-ALD表达质粒pET-32a-ist-ALD转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上于37℃培养10-11小时后挑取小菌落，接入添加100μg/mL氨苄青霉素和0.2％(w/v)葡萄糖的50mlLB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜，按照1∶40的体积比取种子液加入到含有100μg/mL氨苄青霉素和0.2％(w/v)葡萄糖的100mL LB液体培养基，37℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)于16℃诱导表达16h后离心收集菌体。破碎菌体，离心收集上清液，作为乙醛脱氢酶粗酶液。其酶活测定方法：3mL酶活测定体系中含有0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，2mM乙醛，0.5mM NAD+，0.1M KCl，0.1M 2-巯基乙醇以及一定浓度的粗酶液，在25℃，340nm下测定NADH的浓度变化。以每分钟生成1μmol NADH所用的酶量为1个酶活单位(U)。最终获得重组乙醛脱氢酶的酶活为44.23U/mL。
Claims (7)
1.一种来自陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2的乙醛脱氢酶基因，其特征在于该基因序列为SEQ ID NO.16。
2.一种权利要求1所述乙醛脱氢酶基因的开放阅读框，其特征在于该开放阅读框为完整的乙醛脱氢酶基因开放阅读框，序列为SEQ ID NO.17。
3.权利要求1所述乙醛脱氢酶基因编码的乙醛脱氢酶，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO.18。
4.一种从陆生伊萨酵母Issatchenkia terricola XJ-2克隆乙醛脱氢酶基因的方法，其特征在于：在分析NCBI数据库中数种酵母乙醛脱氢酶蛋白质序列的基础上，通过简并PCR、Sitefinding-PCR及SEFAPCR技术从陆生伊萨酵母全基因组中克隆出乙醛脱氢酶基因。
5.一种乙醛脱氢酶基因重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将权利要求1所述的乙醛脱氢酶基因插入表达载体所得。
6.根据权利要求5所述的乙醛脱氢酶基因重组表达载体，其特征在于该重组表达载体是将权利要求1所述的乙醛脱氢酶基因插入载体pET-32a所得。
7.权利要求1所述的乙醛脱氢酶基因在制备解酒制品中的应用。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110316 |