CN102586203A - 定向进化构建的催化活力提高的脂肪酶突变体 - Google Patents
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Abstract
定向进化构建的催化活力提高的脂肪酶突变体，其由华根霉（Rhizopuschinensis）CCTCC M201021脂肪酶基因，其Genbank登录号EF405962，运用易错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，经定向进化而获得的脂肪酶突变体，在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变Ala230Thr；以转换数K cat表示，脂肪酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高。
Description
本申请是原申请号200910235185.3的分案申请，申请日2009.11.11，发明名称“通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体”。
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及酶活力提高的华根霉脂肪酶突变体。
背景技术
脂肪酶（EC 3.1.1.3）不仅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、转酯化、酸解等反应，被广泛地应用于化学，食品，制药和洗涤剂或生物能源工业中。微生物是脂肪酶的一个重要来源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生产菌。如今，已有超过30种根霉脂肪酶实现了商品化生产。根霉脂肪酶大都具有高度1,3-位置选择性，因此常用于油脂加工中。此外，根霉脂肪酶还具有稳定性佳，转化效率高等优点，被广泛应用于芳香酯、生物柴油、手性化合物的生产中。
目前为止，国内外已报道了多个根霉脂肪酶的基因序列。日本、德国对米根霉脂肪酶（Rhizopus oryzae lipase, ROL）的基因序列和表达做了比较深入的研究，并先后用大肠杆菌、酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母成功表达了脂肪酶基因（Minning S et al. J Biotechnol, 1998, 66 : 147-156; Beer HD et al. Biochim Biophys Acta, 1998, 1399 : 173-180; Ueda M et al. J Mol Catal B: Enzym, 2002, 17 : 113-124）。发明人在前期研究中成功从酿造浓香型大曲酒的酒曲中筛选到一株高产脂肪酶的华根霉（Rhizopus chinensis CCTCC M 201021）菌株，并从该菌株中克隆得到脂肪酶基因序列(Genbank登录号EF405962)，并实现该脂肪酶在巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高水平分泌表达（Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311）。
定向进化属于非理性设计，是指通过在实验室中模拟达尔文自然进化过程，针对某一蛋白质酶的基因，通过改进的诱变技术改造的酶的基因，然后根据特定的改造目的，筛选有价值的天然酶。近10年来，定向进化技术已经在酯酶和脂肪酶性质改造领域取得巨大的成功，主要集中于提高酶的催化反应活性，改进底物特异性，提高热稳定性，对映立体选择性等方面（Johannes TW et al. Curr. Opin. Microbiol, 2006, 9: 261-267）。
酶活力的提高可以用酶的动力学参数K cat值来表示。K cat又称转化数，指每分子酶或每个酶活性中心在单位时间内能催化的底物分子数(TN)，也称为催化常数。因此，K cat值的提高即代表了酶活的提高。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供酶活力提高的华根霉脂肪酶。
本发明的技术方案：通过定向进化构建的活力提高的脂肪酶突变体，由华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021脂肪酶基因(Genbank登录号EF405962)，运用易错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，经定向进化而获得的脂肪酶突变体，在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸两个、三个或四个突变的组合；以转换数K cat表示，脂肪酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高；突变体的测序结果及其K cat提高的倍数为：
| 脂肪酶突变体 | 氨基酸取代位置 | K cat(/min) | K cat提高的倍数 |
| 出发菌株脂肪酶 | - | 1138 | 1.0 |
| 突变体1-1 | Ala129Ser | 1252 | 1.1 |
| 突变体1-2 | Lys161Arg | 1479 | 1.3 |
| 突变体1-3 | Thr195Tyr | 1479 | 1.3 |
| 突变体1-4 | Ala230Thr | 1821 | 1.6 |
| 突变体1-5 | Val261Gly | 1935 | 1.7 |
| 突变体1-6 | Lys322Arg | 1366 | 1.2 |
| 突变体1-7 | Ser373Asn | 1707 | 1.5 |
| 突变体2-1 | Ala129Ser / Lys161Arg | 2278 | 2 |
| 突变体2-2 | Ala129Ser / Ala230Thr | 1365 | 1.2 |
| 突变体2-3 | Ala129Ser / Val261Gly | 1593 | 1.4 |
| 突变体2-4 | Lys161Arg/Thr195Tyr | 2845 | 2.5 |
| 突变体2-5 | Lys161Arg / Lys322Arg | 1707 | 1.5 |
| 突变体2-6 | Lys161Arg / Ser373Asn | 2048 | 1.8 |
| 突变体2-7 | Ala230Thr /Ser373Asn | 1707 | 1.5 |
| 突变体2-8 | Val261Gly/ Ser373Asn | 3726 | 3.3 |
| 突变体3-1 | Ala129Ser/Ala230Thr /Val261Gly | 3186 | 2.8 |
| 突变体3-2 | Ala129Ser/Ala230Thr/Lys322Arg | 2278 | 2 |
| 突变体3-3 | Lys161Arg/Thr195Tyr/Ser373Asn | 2617 | 2.3 |
| 突变体3-4 | Lys161Arg/Ala230Thr/Ser373Asn | 2278 | 2 |
| 突变体3-5 | Lys161Arg/Val261Gly/Lys322Arg | 2731 | 2.4 |
| 突变体3-6 | Ala230Thr/Lys322Arg/Ser373Asn | 2845 | 2.5 |
| 突变体4-1 | Ala129Ser/Lys161Arg/Ala230Thr/ Lys322Arg | 2073 | 1.8 |
华根霉脂肪酶氨基酸原始序列为：SEQ ID NO: 1；华根霉脂肪酶氨基酸突变序列为：SEQ ID NO:2，7个突变氨基酸用底色标记显示。
本发明的有益效果：本发明运用易错PCR方法对华根霉脂肪酶基因(Genbank登录号EF405962)进行定向进化，通过多轮重组和定点突变，获得华根霉脂肪酶突变体，这些突变体包含氨基酸突变Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn以及上述氨基酸突
变的组合。以转换数K cat表示，脂肪酶突变体的酶活得到了提高。
具体实施方式
实施例中涉及到的培养基配方如下：
LB液体培养基：蛋白胨 1％，酵母提取物 0.5％，NaCl 1％，pH7.0。
YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium): Yeast Extract 1％, Trypton 2％, Dextrose 2％，制作平板时加入Agar 2％。121 °C高压灭菌20 min。用于筛选G418抗性时加入G418至终浓度为0.25 mg/mL-1.0 mg/mL，即YPD-G418平板。
MD(Minimal Dextrose Medium): YNB 1.34％, Biotin 4×10-5％, Dextrose 2％, Agar 2％。
MM(Minimal Methanol Medium): YNB1.34％, Biotin4×10-5％, Methanol 0.5％, Agar2％。
BMGY(Buffered Glycerol-complex Medium): Yeast Extract 1％, Trypton 2％, YNB 1.34％, Biotin 4×10-5％, Glycerol 1％, 磷酸钾溶液100 mmol/L。
BMMY(Buffered Methanol-complex Medium): Yeast Extract 1％, Trypton 2％, YNB 1.34％, Biotin 4×10-5％, Methanol 0.5％, 磷酸钾溶液100 mmol/L。
培养基中的单位为％（W/V）
实施例1、利用易错PCR方法构建华根霉脂肪酶突变文库
利用易错PCR技术在体外向华根霉脂肪酶基因proRCL引入核苷酸突变。易错PCR的反应条件如下：
其中，引物F和R序列为：
上游引物 F: 5'-TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3';
下游引物 R: 5'-AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3'。
PCR扩增条件：94℃ 3min；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 2 min，30个循环；72℃10 min。
易错PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，限制性内切酶AvrⅡ和NotI分别对易错PCR扩增产物和质粒pPIC9K进行消化，连接，转化至E .coli JM109感受态细胞。涂布于LB（含100 μg/μL的Amp) 平板。生长12 h后，将转化子转移至LB液体培养基中培养，获得突变质粒。
将突变质粒经限制性内切酶SalI线性化后，电转化毕赤酵母GS115感受态细胞。将转化液涂布于MD平板上，30℃培养2天，构成突变文库。
利用上述同样的方法，以突变体基因组为模版进行多轮易错PCR，构建突变文库。
实施例2、高酶活脂肪酶突变体的筛选
用灭菌牙签将MD平板上生长出的His+转化子复制到YPD和BMMY平板的相同位置，同时将对照菌GS115/ pPIC9K-proRCL接种至BMMY平板上。30°C培养2天。
平板初筛：保存生长完毕的YPD平板。每12 h向BMMY平皿盖上补加200 μL甲醇诱导重组脂肪酶表达。诱导2-3 天。向酶活测定底物pNPP中加入0.6%琼脂，混合均匀后，倒于BMMY平板形成顶层琼脂。2 min内出现明显黄色的菌株为初筛目的突变菌株。相同条件下，对照菌GS115/ pPIC9K-proRCL不能显示出明显黄色。
96孔板复筛：向1.8 mL/孔（平底）的96孔板中加入300 μL BMGY培养基，121℃灭菌20 min。向其中接入保藏于YPD平板上的初筛目的菌株（同时接入GS115/ pPIC9K-proRCL作为对照），30℃ 250 r/min振荡培养至OD600为2-6（约16-18 h）。离心，弃上清，用900 μL BMMY培养基重悬菌体，并加入1%（V/V）甲醇诱导脂肪酶表达。此后每24 h补加 100 μL BMMY培养基和1 % （V/V）甲醇，诱导4 天。将诱导表达96 h的96孔板发酵液3000 r/min离心10 min，收集上清。取1 μL上清液稀释500倍后，取5 μL于另一96孔板中，用排枪加入底物，振荡混匀。2 min内迅速显示明显黄色的菌株为复筛目的菌株。相同条件下，对照菌GS115/ pPIC9K-proRCL的发酵上清液不能显示明显黄色。
以易错PCR构建的突变文库为基础进行筛选，获得6株酶活明显提高的菌株，测定脂肪酶核苷酸序列，利用三联体密码子推测脂肪酶的氨基酸序列，脂肪酶突变体的氨基酸取代及K cat值提高倍数如表1所示。根据实施例3的方法测定脂肪酶突变体的K cat值。
表1 突变体的测序结果
| 脂肪酶突变体 | 氨基酸取代位置 | K cat(/min) | K cat提高的倍数 |
| 出发菌株脂肪酶 | - | 1138 | 1.0 |
| 突变体2-1 | Ala129Ser / Lys161Arg | 2278 | 2 |
| 突变体2-4 | Lys161Arg/Thr195Tyr | 2845 | 2.5 |
| 突变体2-7 | Ala230Thr /Ser373Asn | 1707 | 1.5 |
| 突变体2-8 | Val261Gly/ Ser373Asn | 3726 | 3.3 |
| 突变体3-2 | Ala129Ser/Ala230Thr/Lys322Arg | 2278 | 2 |
| 突变体3-4 | Lys161Arg/Ala230Thr/Ser373Asn | 2278 | 2 |
实施例3 脂肪酶突变体的K cat值测定
为测定脂肪酶的K cat值，需要对酶进行分离纯化。
摇瓶发酵：将出发菌株以及各脂肪酶突变体，接种至25 mL BMGY培养基中，30℃振荡培养16～20 h 至OD600为2～6，离心收集菌体，用BMMY培养基稀释至OD600为1，每隔24 h添加0.5 %的甲醇诱导表达，培养3-4 天后，收集发酵上清液。
分离纯化：将突变菌株的发酵上清液经过10 KD超滤膜浓缩，SP-Sepharose FF强阳离子交换层析和Phenyl-Sepharose 6 FF疏水色谱柱层析后得到纯化的突变脂肪酶活性组分。具体操作参考文献Yu Xiao-Wei et al. J Mol Catal B: Enzym, 2009, 57:304-311。
测定方法：
脂肪酶活力的测定方法为pNPP法（Pencreach G et al. Enzyme and Microbial Technol. 1996, 18: 417-422.）。酶活的定义为一定反应条件下每分钟产生1 μmol 对硝基苯酚的酶量为一个脂肪酶水解酶活国际单位。在底物对硝基苯酚棕榈酸酯浓度为0～25 mmol/L 范围内，测定酶活力，计算获得脂肪酶的动力学参数K cat。
实施例4 定点突变组合脂肪酶突变体的基因突变位点
经过多轮易错PCR进行突变文库构建，得到包含有氨基酸突变位点Ala129Ser、Lys161Arg、Thr195Tyr、Ala230Thr、Val261Gly、Lys322Arg、Ser373Asn的7个突变株。为了考察其中某一个突变及各突变的组合对脂肪酶突变株活力的影响，对发现的突变位点进行定点突变组合，获得多个脂肪酶突变体。（定点突变可以利用市售的试剂盒进行。）
将含有上述突变位点组合的基因与载体pPIC9K连接，电转化毕赤酵母GS115，以获得脂肪酶的高效分泌表达。以与实施例3等同的方法测定脂肪酶突变体的K cat值。各突变体酶的组合位点及其K cat提高的倍数如表2所示。
表2 突变体的测序结果及其K cat提高的倍数
| 脂肪酶突变体 | 氨基酸取代位置 | K cat(/min) | K cat提高的倍数 |
| 出发菌株脂肪酶 | - | 1138 | 1.0 |
| 突变体1-1 | Ala129Ser | 1252 | 1.1 |
| 突变体1-2 | Lys161Arg | 1479 | 1.3 |
| 突变体1-3 | Thr195Tyr | 1479 | 1.3 |
| 突变体1-4 | Ala230Thr | 1821 | 1.6 |
| 突变体1-5 | Val261Gly | 1935 | 1.7 |
| 突变体1-6 | Lys322Arg | 1366 | 1.2 |
| 突变体1-7 | Ser373Asn | 1707 | 1.5 |
| 突变体2-2 | Ala129Ser / Ala230Thr | 1365 | 1.2 |
| 突变体2-3 | Ala129Ser / Val261Gly | 1593 | 1.4 |
| 突变体2-5 | Lys161Arg / Lys322Arg | 1707 | 1.5 |
| 突变体2-6 | Lys161Arg / Ser373Asn | 2048 | 1.8 |
| 突变体3-1 | Ala129Ser/Ala230Thr /Val261Gly | 3186 | 2.8 |
| 突变体3-3 | Lys161Arg/Thr195Tyr/Ser373Asn | 2617 | 2.3 |
| 突变体3-5 | Lys161Arg/Val261Gly/Lys322Arg | 2731 | 2.4 |
| 突变体3-6 | Ala230Thr/Lys322Arg/Ser373Asn | 2845 | 2.5 |
| 突变体4-1 | Ala129Ser/Lys161Arg/Ala230Thr/ Lys322Arg | 2073 | 1.8 |
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 389
<212> PRT
<213> 华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021脂肪酶氨基酸
<400> 1
Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu
5 10 15
Leu Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ser Ser Ala Val Pro Val Ala
20 25 30
Gly His Lys Gly Ser Val Lys Ala Thr Asn Gly Thr Asp Phe Gln
35 40 45
Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Thr Pro Pro Ser His Pro
50 55 60
Glu Thr Thr Gly Asp Pro Asp Ala Glu Ala Tyr Tyr Ile Asn Lys
65 70 75
Ser Val Gln Trp Tyr Gln Ala His Gly Gly Asn Tyr Thr Ala Leu
80 85 90
Ile Lys Arg Asp Thr Glu Thr Val Gly Gly Met Thr Leu Asp Leu
95 100 105
Pro Glu Asn Pro Pro Pro Ile Pro Ala Thr Ser Thr Ala Pro Ser
110 115 120
Ser Asp Ser Gly Glu Val Val Thr Ala Thr Ala Ala Gln Ile Lys
125 130 135
Glu Leu Thr Asn Tyr Ala Gly Val Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg
140 145 150
Ser Val Val Pro Gly Thr Lys Trp Asp Cys Lys Gln Cys Leu Lys
155 160 165
Tyr Val Pro Asp Gly Lys Leu Ile Lys Thr Phe Thr Ser Leu Leu
170 175 180
Thr Asp Thr Asn Gly Phe Ile Leu Arg Ser Asp Ala Gln Lys Thr
185 190 195
Ile Tyr Val Thr Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile
200 205 210
Thr Asp Met Val Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Pro Val Lys Gly
215 220 225
Ala Lys Val His Ala Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Asn Gln Val Val
230 235 240
Lys Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Asp Gln Leu Thr Ala Tyr Pro
245 250 255
Asp Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln
260 265 270
Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Arg Leu
275 280 285
Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Tyr Thr Val Gly Cys Pro Arg Val
290 295 300
Gly Asn Asn Ala Phe Ala Tyr Tyr Val Asp Ser Thr Gly Ile Pro
305 310 315
Phe His Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro
320 325 330
Pro Gln Ala Phe Gly Tyr Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp Ile
335 340 345
Lys Glu Asp Pro Ala Asp Val Gln Ile Cys Thr Ser Asn Ile Glu
350 355 360
Thr Lys Gln Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Ser Ile Ala
365 370 375
Asp His Leu Thr Tyr Phe Gly Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
380 385 389
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 389
<212> PRT
<213> 华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021脂肪酶氨基酸突变体
<400> 2
Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu
5 10 15
Leu Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ser Ser Ala Val Pro Val Ala
20 25 30
Gly His Lys Gly Ser Val Lys Ala Thr Asn Gly Thr Asp Phe Gln
35 40 45
Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Thr Pro Pro Ser His Pro
50 55 60
Glu Thr Thr Gly Asp Pro Asp Ala Glu Ala Tyr Tyr Ile Asn Lys
65 70 75
Ser Val Gln Trp Tyr Gln Ala His Gly Gly Asn Tyr Thr Ala Leu
80 85 90
Ile Lys Arg Asp Thr Glu Thr Val Gly Gly Met Thr Leu Asp Leu
95 100 105
Pro Glu Asn Pro Pro Pro Ile Pro Ala Thr Ser Thr Ala Pro Ser
110 115 120
Ser Asp Ser Gly Glu Val Val Thr Ser Thr Ala Ala Gln Ile Lys
125 130 135
Glu Leu Thr Asn Tyr Ala Gly Val Ala Ala Thr Ala Tyr Cys Arg
140 145 150
Ser Val Val Pro Gly Thr Lys Trp Asp Cys Arg Gln Cys Leu Lys
155 160 165
Tyr Val Pro Asp Gly Lys Leu Ile Lys Thr Phe Thr Ser Leu Leu
170 175 180
Thr Asp Thr Asn Gly Phe Ile Leu Arg Ser Asp Ala Gln Lys Tyr
185 190 195
Ile Tyr Val Thr Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg Ser Ala Ile
200 205 210
Thr Asp MET Val Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Pro Val Lys Gly
215 220 225
Ala Lys Val His Thr Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Asn Gln Val Val
230 235 240
Lys Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Asp Gln Leu Thr Ala Tyr Pro
245 250 255
Asp Tyr Lys Val Ile Gly Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Gln
260 265 270
Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu Lys Arg Leu
275 280 285
Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Tyr Thr Val Gly Cys Pro Arg Val
290 295 300
Gly Asn Asn Ala Phe Ala Tyr Tyr Val Asp Ser Thr Gly Ile Pro
305 310 315
Phe His Arg Thr Val His Arg Arg Asp Ile Val Pro His Val Pro
320 325 330
Pro Gln Ala Phe Gly Tyr Leu His Pro Gly Val Glu Ser Trp Ile
335 340 345
Lys Glu Asp Pro Ala Asp Val Gln Ile Cys Thr Ser Asn Ile Glu
350 355 360
Thr Lys Gln Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr Asn Ile Ala
365 370 375
Asp His Leu Thr Tyr Phe Gly Ile Asn Glu Gly Ser Cys Leu
380 385 389
<210> SEQ ID NO: 3
<400> 3
F: 5'-TCAAGATCCCTAGGGTTCCTGTTGGTCATAAAGGTTC-3';
R: 5'-AATTCCAGTGCGGCCGCTTACAAACAGCTTCCTTCG-3'。
Claims (1)
1.定向进化构建的催化活力提高的脂肪酶突变体，其特征是由华根霉（Rhizopus chinensis）CCTCC M 201021脂肪酶基因，其Genbank登录号EF405962，运用易错PCR方法，通过多轮重组和定点突变，经定向进化而获得的脂肪酶突变体，在突变体的氨基酸序列中，包含氨基酸突变Ala230Thr；以转换数K cat表示，脂肪酶突变体的酶活较出发菌株得到了提高；突变体的测序结果及其K cat提高的倍数为：
。
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