CN103421758A - 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，包括以下步骤：1）、构建包含重组脂肪酶基因的水稻胚乳特异性表达载体； 2）、将上述水稻胚乳特异性表达载体导入水稻，得到转基因水稻；从而使重组脂肪酶能在所述转基因水稻胚乳细胞蛋白体中高表达。重组脂肪酶基因为以下任一：OsLIPB、OsHIL、OsROL、OsGGL、OsRNL。本发明利用水稻胚乳特异性表达载体在水稻胚乳储藏器官中表达外源重组脂肪酶；将来源于微生物的脂肪酶经密码子优化转移到水稻中，并利用水稻胚乳细胞作为生物反应器高效生产脂肪酶。

Description

利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体为利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产脂肪酶的方法。主要涉及以转基因水稻生产生物酶制剂的方法，和一种从转基因脂肪酶水稻中提取脂肪酶的方法。 

背景技术

脂肪酶（三酰基甘油酯水解酶，EC 3.1.1.3）是能够催化酯键水解的一类水解酶，不仅催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，而且包括其他一些水不溶性酯类的酯化、转酯化、酸解、醇解及氨解反应以及酯类的逆向合成反应(Reis et al., 2009a)。 

脂肪酶不同催化活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。脂肪酶一个最重要的特征是只作用于异相系统，即只在油（酯）水界面上作用，对于水溶性的和均匀分散的底物无作用，只有底物以乳化颗粒、微粒以及小聚合状态存在时，脂肪酶对底物才有催化作用(Reis et al., 2009b)。 

脂肪酶广泛应用于食品、医药、洗涤、制革、纺织、造纸等工业。在食品工业中，脂肪酶已用于奶酪、奶油等奶制品，如脂肪酶和蛋白酶被应用于加快奶酪熟化和香味产生。利用脂肪酶转酯反应，从而重构脂质进而改变其食品应用特性，如人造黄油，起酥油，可可油等(Houde et al., 2004)。脂肪酶在洗涤工业中，可作为添加剂用于配方洗涤剂，使衣服污垢中甘油三酯分解成容易祛除的脂肪酸和甘油，所以加入脂肪酶可大大提高洗涤剂的去污效果洗涤剂，而且脂肪酶是生物产品，易被降解，不污染环境。第一个商业化应用的脂肪酶是Novo-Nordisk的Lipolase (E.Boel等)，Lipolase也是第一个通过欧盟准入的基因工程制品；脂肪酶在造纸工业中添加能直接分解废纸上的油墨、涂料及色料，达成脱墨效果；在皮革脱脂工艺上尤其具有重要的用途，且在碱性条件下使得脂肪更易从皮中除去；在有机合成中，由于脂肪酶具有较高的底物专一性、对映及区域选择性等优点，使其成为重要的生物催化剂。  

脂肪酶广泛存在于动植物和微生物界中。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以微生物脂肪酶是主要的研究对象。 

众多产脂肪酶的微生物中，来源于南极湖泊沉积物的南极假丝酵母，能够产生两种性质完全不同的脂肪酶，分别为脂肪酶A和脂肪酶B，脂肪酶A (即CALA) 具有一定的酸稳定性 以及很强的热稳定性，并且在酯化反应中能够优先利用反式不饱和脂肪酸，同时对位阻醇包括二级和三级醇表现出较高的活性。脂肪酶B (即CALB) 的分子量小，热稳定性较差，但具有较高的区域和立体选择性催化能力，被广泛用于外消旋醇，胺类以及硫醇的拆分，而且它对非水溶性和水溶性物质都有很强的催化活性。 

由于热稳定性的脂肪酶在工业化应用上具有重要的商业价值，而疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）是一种嗜热真菌，能够在60℃产生大量脂肪酶，其最适pH为8.0，而且能够在pH 4.0-pH 11.0范围内稳定，该酶也是最早被商业化的脂肪酶，已被广泛用于配方洗衣粉的添加，并且该酶与其他种类酶，例如蛋白酶、纤维素酶及淀粉酶协同使用，除此之外，该脂肪酶也被用于食品工业以及用于生物催化立体选择性的转换反应。 

目前商品化脂肪酶主要来源于各种细菌、酵母和真菌等微生物的发酵。通过传统诱变育种以及优化发酵条件提高了脂肪酶的产量，使得许多脂肪酶实现了产业化生产，尤其是基因工程的引入，大大提高了脂肪酶的产量。然而作为21世纪的绿色农业革命，利用转基因植物生产酶制剂具有很大的应用潜力。 

利用植物表达系统进行酶制剂生产，主要利用特异性启动子驱动外源基因在植物特定组织部位进行高效表达，利用此技术获得的转基因农作物，可以通过大规模反复种植来获得所需酶制剂，具有低碳，节能，环保等诸多优点。 

植物是一种多样化、低成本和可再生的生物资源，所以利用植物表达系统生产具有重要经济价值的医用蛋白、工农业用酶制剂及次生代谢产物等具有广阔的应用前景(Lau and Sun, 2009)。然而众多植物表达系统中，尤其是以种子具有表达水平高、产量大、稳定性好、易储藏运输及低蛋白酶活性等优点成为首选表达器官。已有的研究表明，利用转基因水稻胚乳特异性表达启动子和信号肽，介导外源重组蛋白在水稻胚乳细胞蛋白体的积累表达已获得成功。杨代常等人(杨代常, 2005)利用水稻胚乳特异性启动子Gt13a介导重组人血清白蛋白进入水稻胚乳细胞内膜系统，并存储到水稻胚乳蛋白体中，从而使重组人血清白蛋白能够在水稻种子中大量累积，而且其表达水平达到水稻种子重量的0.3%以上。同时利用植物作为生物反应器表达真菌微生物产酶基因，尤其在转基因植物种子中表达已有相关报道，Susan L. Woodard等人利用玉米球蛋白启动子驱动牛胰蛋白酶于玉米胚乳细胞中进行表达，该方法也是第一个作为大规模生产商业化蛋白产品的转基因植物的表达系统。继而纤维素酶，淀粉酶等酶制剂也成功在转基因植物种子中得到表达。本发明正是基于上述研究成果，提供一种在水稻中高效生产脂肪酶的方法。 

上文中所用的参考文献如下： 

Houde, A., Kademi, A., Leblanc, D., 2004. Lipases and their industrial applications（脂酶及其工业应用）, Applied Biochemistry and Biotechnology. 118:155-170。 

Lau, O.S., Sun, S.S.M., 2009. Plant seeds as bioreactors for recombinant protein production（植物种子作为生物反应器生产重组蛋白）, Biotechnology Advances. 27(6):1015-1022。 

Reis, P., Holmberg, K., Watzke, H., Leser, M.E., Miller, R., 2009a. Lipases at interfaces: A review（综述：界面酯酶）, Adv Colloid Interface Sci. 147-148:237-250。 

Reis, P., Miller, R., Leser, M., Watzke, H., 2009b. Lipase-catalyzed reactions at interfaces of two-phase systems and microemulsions（酯酶催化的二相系统和微型乳剂交界反应）, Applied Biochemistry and Biotechnology. 158(3):706-721。 

杨代常, 2005，利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组人血清白蛋白（ZL20051 0019084.4）。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产脂肪酶的方法。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，包括以下步骤： 

1）、构建包含脂肪酶基因的水稻胚乳特异性表达载体； 

2）、将上述水稻胚乳特异性表达载体导入水稻，得到转基因水稻；从而使脂肪酶（重组脂肪酶）能在所述转基因水稻胚乳细胞蛋白体中表达高表达（大量表达）。 

作为本发明的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法的改进：脂肪酶基因为以下任一： 

多核苷酸序列为SEQ ID NO:2的重组脂肪酶基因OsLIPB； 

多核苷酸序列为SEQ ID NO:3的重组脂肪酶基因OsHIL； 

多核苷酸序列为SEQ ID NO:6 (GeneBank: AF229435)的来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因OsROL； 

多核苷酸序列为SEQ ID NO:7 (GeneBank: DQ313172)的来自白地霉(Galactomyces geotrichum)的脂肪酶基因OsGGL； 

多核苷酸序列为SEQ ID NO:8 (GeneBank: AB013496)的来自雪白根霉(Rhizopus niveus)的脂肪酶基因OsRNL。 

作为本发明的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法的进一步改进： 

重组脂肪酶基因OsLIPB所对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:4(Swiss-Prot: P41365.1)； 

重组脂肪酶基因OsHIL所对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:5 (Swiss-Prot: O59952.1)； 

来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因OsROL对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:9 （GenBank: AAF32408.1）； 

来自白地霉(Galactomyces geotrichum)的脂肪酶基因OsGGL对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:10（GenBank: ABC39650.1）； 

来自雪白根霉(Rhizopus niveus)的脂肪酶基因OsRNL对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:11（GenBank:  BAA31548.1）。 

作为本发明的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法的进一步改进： 

水稻胚乳特异性表达载体为以下任意一种：Gt170-OsLIPB、Gt170-OsHIL、Gt170-OsROL、Gt170-OsGGL、Gt170-OsRNL。 

重组脂肪酶基因由水稻储藏蛋白的Gt1启动子和信号肽驱动表达。 

备注说明：上述Gt170-OsLIPB、Gt170-OsHIL等水稻胚乳特异性表达载体均能满足脂肪酶基因由水稻储藏蛋白的Gt1启动子和信号肽驱动表达。 

作为本发明的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法的进一步改进： 

水稻储藏蛋白的Gt1启动子和信号肽，其多核苷酸序列为SEQ ID NO:1(Genebank: AY585231)。 

即，上述多核苷酸序列包括Gt1启动子和其信号肽序列。 

作为本发明的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法的进一步改进： 

重组脂肪酶LIPB来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)； 

重组脂肪酶HIL来源于疏棉状嗜热丝胞菌(Thermomyces lanuginosus)。 

备注说明：重组脂肪酶LIPB是脂肪酶基因OsLIPB所编码的蛋白质，重组脂肪酶HIL是脂肪酶基因OsHIL所编码的蛋白质。 

作为本发明的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法的进一步改进： 

还包括重组脂肪酶的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤： 

①、将转基因水稻中表达的重组脂肪酶用pH 8.5的20 mM Tris-HCl缓冲液进行提取，从而获得该酶的粗提物； 

②、所述粗提物经DEAE阴离子交换层析柱一步法，得到纯化的重组脂肪酶。 

作为本发明的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法的进一步改进： 

纯化方法包括以下步骤： 

步骤①为：将含有重组脂肪酶的转基因水稻种子按照1g:15~25ml的质量体积比用20 mM Tris-HCl缓冲液(PH 8.5)混合后进行研磨，匀浆，离心，收集上清，经0.22 μm滤膜过滤，所述滤液为酶的粗提物（即，粗酶液）； 

步骤②为：粗提物加入到已平衡过的DEAE琼脂糖凝胶柱梯度洗脱，洗脱液依次为0.07 M 的NaCl溶液、 0.15 M的 NaCl溶液、1 M的NaCl溶液；收集0.07 M 的NaCl溶液所对应的洗脱液；得到纯化的重组脂肪酶。 

具体而言： 

本发明提供转基因水稻中表达水稻储藏蛋白的Gt1启动子和信号肽核苷酸作为目的基因的启动子（其多核苷酸序列为SEQ ID NO: 1），使被驱动的脂肪酶基因能在水稻胚乳细胞中特异性表达。 

本发明还提供利用水稻遗传密码子优化的人工合成重组脂肪酶基因OsLIPB和OsHIL，它们的多核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 2和 SEQ ID NO: 3，或与SEQ ID NO:2 和SEQ ID NO:3具有至少85%相同性。 

在本发明中，1）利用水稻遗传密码子优化的人工合成脂肪酶基因OsLIPB和OsHIL，它们的多核苷酸序列分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3；2）或多核苷酸序列与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3 具有至少85%相同性的序列。 

本发明所述的脂肪酶基因， OsLIPB和OsHIL所对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:4 (Swiss-Prot: P41365.1)和 SEQ ID NO:5 (Swiss-Prot: O59952.1)或与SEQ ID NO:4 和SEQ ID NO:5具有至少90%相同性。 

本发明提供的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其步骤如下： 

1) 构建包含脂肪酶基因的植物表达载体，该载体包含由启动子-基因-终止子组成的脂肪酶基因的表达盒。其中，驱动脂肪酶基因表达的启动子由水稻储藏蛋白启动子Gt1及其信号肽组成，该启动子可以驱动其下游基因在水稻胚乳细胞中特异性表达，此外，这样的启动子也可以是其他可以驱动基因在水稻胚乳细胞中特异性表达的启动子；上述表达盒的终止子为PEPC (phosphoenolpyruvatecarboxylase) terminator，它也可以是其他可用的终止子。 

2) 利用农杆菌介导的植物转化方法将上述包含脂肪酶基因的表达载体转入水稻中得到转基因水稻，使脂肪酶能在转基因水稻胚乳细胞蛋白体中表达。本领域的技术人员也可以很容易地利用其他可行的植物转化方法，如基因枪法、原生质体法或已有或将来可能建立的转化方法，获得转基因水稻。 

本发明还提供一种从转基因脂肪酶的水稻中提取纯化脂肪酶的方法，其特征包括以下步 骤： 

1) 将转基因水稻中表达的重组脂肪酶用PH 8.5, 20 mM Tris-HCl缓冲液进行提取并获得该酶的粗提物。 

2) 上述酶的粗提物离心收集上清并过滤后，经DEAE阴离子交换层析柱一步法，便得到纯化的重组脂肪酶。 

本发明基于酶CALB以及HIL良好的催化性能及广泛适用性，选取其作为基因工程表达的酶制剂。 

本发明正是基于种子作为转基因表达器官的诸多优点，从而利用特异表达的水稻储藏蛋白的Gt1启动子介导重组脂肪酶在水稻胚乳蛋白体中大量表达。 

本发明具有以下优点： 

1、本发明的创新点在于利用水稻胚乳特异性表达载体在水稻胚乳储藏器官中表达外源重组脂肪酶； 

将来源于微生物的脂肪酶经密码子优化转移到水稻中，并利用水稻胚乳细胞作为生物反应器高效生产脂肪酶。 

2、从获得的转基因脂肪酶水稻中进行简便的一步法提取脂肪酶的方法。 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1 Gt1启动子与信号肽的PCR扩增产物，泳道1标准分子量，泳道M为1000 bp Gt1启动子序列。 

图2 构建的水稻胚乳特异性表达脂肪酶的物理图谱。 

上图为Gt170-OsLIPB的载体图谱； 

下图为Gt170-OsHIL的载体图谱； 

上述两个载体均为实施例2所述内容。 

图3 水稻胚乳中表达的OsLIPB脂肪酶的聚丙烯酰胺胶和蛋白印迹图谱。图a为考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺胶图谱；图b为蛋白过柱纯化图谱；图c为蛋白印迹图谱。图a箭头所指处为脂肪酶表达条带，但1号泳道对照样品秀水134中缺乏相应条带。 

具体实施方式

实施例1、克隆Gt1启动子和信号肽： 

从水稻基因组序列中克隆谷蛋白的Gt1基因启动子与信号肽，利用聚合酶链式反应(PCR) 从秀水134品种的基因组DNA中扩增到约1000bp的DNA片段（图1），即，SEQ ID NO: 1所述的997bp；扩增的片段经限制性内切酶HindIII/XbaI酶切，克隆到含有草甘膦抗性的植物双元表达载体中，产生水稻胚乳特异性表达的表达载体1300-GT1-S450RNAi。 

备注说明：含有草甘膦抗性的植物双元表达载体，即1300-S450RNAi (Lin et al., 2010). Lin, C., Nie, P., Lu, W., Zhang, Q., Li, J. and Shen, Z. (2010) A selectively terminable transgenic rice line expressing human lactoferrin. Protein Expr Purif 74, 60-64。 

上述PCR反应体系为： 

水稻（粳稻）DNA  ≤200 ng， 

2×Prime STAR GC Buffer (Mg²⁺ Plus)  25 μl， 

dNTP Mixture (各2.5 mM) 4 μl， 

Prime 1 (10 μM) 1 μl， 

Prime 2 (10 μM) 1 μl， 

2×PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μl) 0.5 μl， 

灭菌蒸馏水补足到50 μl。 

PCR反应条件：98℃ 3 min；98℃ 10 sec，68℃ 1 min， 30个循环；72℃ 7 min。 

Prime 1: 5′-aagcttttggaaaggtgccgtgcagtt-3′； 

Prime 2: 5′-tctagactgggctagggagccatcgcacaag-3′  。 

实施例2、人工合成水稻遗传密码子优化过的重组脂肪酶基因 

本发明的重组脂肪酶基因是来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)和疏棉状嗜热丝胞菌(Thermomyces lanuginosus)，其脂肪酶LIPB (Swiss-Prot NO. P41365.1)，脂肪酶HIL (Swiss-Prot: O59952.1)的氨基酸序列通过Vector NTI 10.0分析软件转换成按水稻遗传密码子编码的核苷酸序列，而氨基酸序列完全相同。同时在合成序列两端加上XbaI和SacI酶切位点，克隆到pGH质粒载体，产生含有水稻密码子优化的重组脂肪酶基因（OsHIL、OsLIPB）。（OsLIPB是编码LIPB的基因）。即，获得pGH-OsLIPB、pGH-OsHIL质粒。 

备注说明：pGH质粒载体选用上海捷瑞生物基因合成标准载体 – pGH（pGHn），http://www.generay.com.cn/News.aspx/Details/1558有明确告知。 

重组脂肪酶基因OsLIPB的多核苷酸序列为SEQ ID NO:2，重组脂肪酶基因OsHIL的多核苷酸序列为SEQ ID NO:3。重组脂肪酶基因OsLIPB编码的蛋白质为SEQ ID NO:4所述的氨基酸序列，重组脂肪酶基因OsHIL编码的蛋白质为SEQ ID NO:5所述的氨基酸序列。 

备注说明：SEQ ID NO:2为975 bp， 975 bp为包括终止密码子的核苷酸序列。 

SEQ ID NO:3为825 bp，825 bp为包括终止密码子的核苷酸序列。 

SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3核酸序列是经过水稻密码子偏好性重新编码过的（其所对应的Genebank序列分别为AF054513, Z30645）。 

实施例3、构建包含脂肪酶基因的植物表达载体 

pGH-OsLIPB、pGH-OsHIL质粒（实施例2所得）经限制性内切酶XbaI和SacI酶切消化，同时XbaI和SacI酶切消化gt170质粒(即为实施例1所得的产生水稻胚乳特异性表达的表达载体1300-GT1-S450RNAi，为了便于表述，命名为gt170质粒)，将酶切后的pGH-OsLIPB、pGH-OsHIL质粒与酶切载体质粒gt170连接，然后转化大肠杆菌TG1菌株，分别获得表达载体为Gt170-OsLIPB、Gt170-OsHIL。 

实施例4、转基因水稻获得 

参照现有农杆菌转化技术（Y. Hiei, et al），选取成熟饱满的水稻种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含有目的基因的农杆菌（gt170-OsLIPB、gt170-OsHIL）划板，挑取单克隆接种转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度农杆菌液中，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中（含乙酰丁香酮，浓度为100 μmol/L），共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含草甘膦的筛选培养基上，筛选培养（2 mM/L）两个月（中间继代一次）。把筛选到的抗性愈伤组织接种到预分化培养基上培养7天左右，再干燥培养3天后，将预分化好的愈伤组织转到分化培养基上，30℃16h光照8h暗培养分化发芽。1周后将分化培养基幼苗转到生根培养基壮苗生根，最后将再生植株洗去根部培养基，移植于温室培养。 

实施例5、从转基因水稻中脂肪酶活性检测 

转基因水稻T0代植株经过分子检测，脂肪酶基因为阳性的植株自交两代，得到T2代种子。选取一定量T1代种子来进行脂肪酶活性检测。

备注说明：此实施例5中的转基因水稻T0代是以上述Gt170-OsLIPB农杆菌为例进行说明的。 

1）1个单位定义为在pH 7.2，37 ℃条件下以4-硝基苯基丁酸酯为底物每分钟释放1纳摩尔的对硝基苯酚所需酶量。 

2）提取试剂 

反应缓冲液：100 mM磷酸二氢钠，150 mM氯化钠和0.5 % (v/v) Triton X-100, pH 7.2； 

底物溶液：50 mM 4-硝基苯基丁酸酯溶于乙腈中； 

转基因脂肪酶的粗提液：取一粒种子（T1代种子）加300 μl的反应缓冲液进行研磨，14000 rpm离心10 min取上清（作为酶粗提液）进行如下反应，对照 (秀水134的种子) 粗提液的操作方式同上。 

反应步骤如下： 

计算： 

$\mathrm{Units}/\mathrm{ml}=\frac{({\mathrm{\ΔA}}_{400\mathrm{nm}}/\min \mathrm{Test}-{\mathrm{\ΔA}}_{400\mathrm{nm}}/\min \mathrm{Blank})\left(0.2\right)}{\left(0.0148\right)\left(0.018\right)}$

0.2 =反应总体积(ml) 

0.0148 = 400 nm下的微摩尔吸光系数 

0.018 =反应用酶液体积 (ml)。 

备注说明： 

ΔA_400 nm/min Test、ΔA_400 nm/min Blank分别表示测试样品和对照样品单位时间内其吸光值的变化。 

将含有重组脂肪酶LIPB和HIL的转基因水稻种子来按照上述脂肪酶活性的测定方法，其测定结果显示转基因水稻中脂肪酶的活性为3300 U/g-5220 U/g（按种子重量计）。其测定结果显示各转基因水稻中脂肪酶活性如下所示： 

转基因水稻a	平均表达水平(U/g)b
		Gt170-OsLIPB	4806.15±418.42
Gt170-OsHIL	3692.58±384.73

a表示上述两种转基因水稻分别以载体名表示； 

b表达活性按种子重量计。 

根据上述结果，我们得知：利用水稻胚乳特异性启动子驱动脂肪酶LIPB和HIL在水稻胚乳细胞中进行表达，其脂肪酶LIPB的表达量高于脂肪酶HIL。 

实施例6、从转基因脂肪酶水稻中纯化脂肪酶 

1）将含有重组脂肪酶的转基因水稻种子（“T2代”种子）用20 mM Tris-HCl缓冲液(PH 8.5)（按质量体积比1g:20ml混合）进行研磨，匀浆于4 ℃，12000 rpm，15 min收集上清，再经0.22 μm滤膜过滤，该滤液作为纯化用的粗酶液（酶的粗提物）。 

2）取5 ml上述样品---粗酶液，加入到已平衡过的DEAE琼脂糖凝胶柱上(平衡液:20 mM Tris-HCl buffer, PH 8.5，)，梯度洗脱，洗脱液分别为0.07 M NaCl, 0.15 M NaCl, 1 M NaCl；上述0.07 M NaCl, 0.15 M NaCl, 1 M NaCl的用量均分别为10 ml，流速控制为1 ml/min。 

备注说明：DEAE琼脂糖凝胶柱为10 ml空柱子（规格：1.5 cm × 13.5 cm），内置DEAE为5 ml体积，该内置柱材料为博格隆DEAE Bestarose FF，编号为A10039。 

3）上述收集到的洗脱液（不同浓度的NaCl溶液所得的洗脱液分别进行收集）分别进行SDS-PAGE，确定目的蛋白最佳洗脱条件为采用0.07 M NaCl进行洗脱。纯化后的蛋白同时进行了蛋白含量、酶活力以及产率的测定。 

备注说明：比活力表示每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度。 

由于利用水稻表达系统进行重组重组蛋白生产中，其纯化与加工成本占总生产成本的比例较高，因此寻求一种简便高效的纯化方法显得尤为重要，本发明通过将转基因水稻脱壳后，与提取缓冲液按比例混合研磨，将过滤后得到的粗酶液，经过一步法阴离子交换柱层析后，其产率和纯化倍数分别为79.51%和1.56倍，通过本法能够获得较高得率和纯度的脂肪酶，因此该方法为工业化生产提供了一种低成本，便于操作的纯化方法。 

实施例7、人工合成水稻遗传密码子优化过的重组米根霉、白地霉和雪白根霉脂肪酶基因 

三种来自米根霉(Rhizopus oryzae), 白地霉(Galactomyces geotrichum)和雪白根霉(Rhizopus niveus)的重组脂肪酶基因，其脂肪酶OsROL (GenBank: AAF32408.1)，脂肪酶OsGGL (GenBank: ABC39650.1)，脂肪酶OsRNL (GenBank: BAA31548.1)的氨基酸序列通过Vector NTI 10.0分析软件转换成按水稻遗传密码子编码的核苷酸序列，而氨基酸序列不变。 

即，来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因OsROL的多核苷酸序列为SEQ ID NO:6，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:9 （GenBank: AAF32408.1）； 

来自白地霉(Galactomyces geotrichum)的脂肪酶基因OsGGL的多核苷酸序列为SEQ ID NO:7，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:10（GenBank: ABC39650.1）。 

自雪白根霉(Rhizopus niveus)的脂肪酶基因的OsRNL多核苷酸序列为SEQ ID NO:8，其对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:11（GenBank:  BAA31548.1）。 

实施例8、构建包含米根霉、白地霉和雪白根霉脂肪酶基因的植物表达载体 

如实施例7所述的三种脂肪酶基因，利用已克隆的水稻胚乳特异性启动子Gt1和信号肽构建分别包含三种脂肪酶基因的水稻胚乳特异性表达载体，方案如下。 

将上述pGH-OsROL、pGH-OsGGL、pGH-OsRNL质粒经限制性内切酶XbaI和SacI酶切消化，同时XbaI和SacI酶切消化水稻胚乳特异性表达的表达载体1300-GT1-S450RNAi（该载体简称gt170），将酶切后的pGH-OsROL、pGH-OsGGL、pGH-OsRNL质粒与酶切载体质粒gt170连接，然后转化大肠杆菌TG1菌株，分别获得表达载体为Gt170-OsROL、Gt170-OsGGL、Gt170-OsRNL。 

实施例9、转基因水稻获得 

取含有目的基因的农杆菌（Gt170-OsROL、Gt170-OsGGL、Gt170-OsRNL）划板，挑取单克隆，参照现有农杆菌转化技术（Y. Hiei, et al），并按照上述实施例4的方法进行水稻转化，分别获得含有重组米根霉、白地霉和雪白根霉脂肪酶基因的转基因水稻。 

实施例10、重组脂肪酶活性检测 

选取一定量的含有重组米根霉、白地霉和雪白根霉脂肪酶基因的转基因水稻T0代种子来进行脂肪酶活性检测。

反应步骤可参考实施例5进行，其测定结果显示各转基因水稻中脂肪酶活性如下表所示 

转基因水稻a	平均表达水平(U/g)b
		gt170-OsROL	3957.38±421.38
gt170-OsGGL	3550.57±433.29
		gt170-OsRNL	3901.00±398.00

a表示上述三种转基因水稻分别以载体名表示 

b表达活性按种子重量计。 

根据上述结果，我们得知：利用水稻胚乳细胞作为生物反应器，本发明提供了一个生产脂肪酶的新体系，通过已得到的转基因水稻的测定，说明该体系能够大量表达和积累脂肪酶，且具有耗能低，生产规模易扩大的特点。 

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 

<110> 浙江大学

 

<120> 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法

 

<160> 11

 

<210> 1

<211> 997

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 水稻储藏蛋白的Gt1启动子和信号肽的多核苷酸序列

 

<400> 1

aagcttttgg aaaggtgccg tgcagttcaa acaattagtt agcagtaggg tgttggtttt      60

tgctcacagc aataagaagt taatcatggt gtaggcaacc caaataaaac accaaaatat      120

gcacaaggca gtttgttgta ttctgtagta cagacaaaac taaaagtaat gaaagaagat      180

gtggtgttag aaaaggaaca atatcatgag taatgtgtga gcattatggg accacgaaat      240

aaaaagaaca ttttgatgag tcgtgtgtcc tcgatgagcc tcaaaagttc tctcaccccg      300

gataagaaac ccttaagcaa tgtgcaaagt ttgcattctc cactgacata atgcaaaata      360

agatatcatc gatgacatag caactcatgc atcatatcat gcctctctca acctattcat       420

tcctactcat ctacataagt atcttcagct aaatgttaga acataaaccc ataagtcacg       480

tttgatgagt attaggcgtg acacatgaca aatcacagac tcaagcaaga taaagcaaaa      540

tgatgtgtac ataaaactcc agagctatat gtcatattgc aaaaagagga gagcttataa      600

gacaaggcat gactcacaaa aattcatttg cctttcgtgt caaaaagagg agggctttac      660

attatccatg tcatattgca aaagaaagag agaaagaaca acacaatgct gcgtcaatta      720

tacatatctg tatgtccatc attattcatc cacctttcgt gtaccacact tcatatatca      780

tgagtcactt catgtctgga cattaacaaa ctctatctta acatttagat gcaagagcct      840

ttatctcact ataaatgcac gatgatttct cattgtttct cacaaaaagc attcagttca      900

ttagtcctac aacaacatgg catccataaa tcgccccata gttttcttca cagtttgctt      960

gttcctcttg tgcgatggct ccctagccca gtctaga                               997

 

 

<210> 2

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 重组脂肪酶基因OsLIPB的多核苷酸序列

 

<400> 2

gccaccccgc tcgtgaagcg cctcccttcc ggctccgacc cagccttctc ccagccgaag      60

tccgtgctcg acgcaggcct cacctgccag ggtgcctccc cgtcttccgt gtccaagccg      120

atcctcctcg tgcctggcac cggcacaacc ggccctcagt ccttcgactc caactggatt      180

ccgctctcca cccagctcgg ctacaccccg tgctggatct cccctccacc gttcatgctc      240

aacgacaccc aggtgaacac cgagtacatg gtgaacgcca tcaccgccct ctacgctggc      300

tccggcaaca acaagctccc ggtgctcacc tggtcccagg gtggcctcgt ggcccagtgg      360

ggcctcacct tcttcccgtc catccgctcc aaggtggacc gcctcatggc cttcgctccg      420

gactacaagg gcaccgtgct cgctggccct ctcgacgccc tcgccgtgtc cgccccttcc      480

gtgtggcagc agaccaccgg ctccgccctc accaccgccc tccgcaacgc aggtggcctc      540

acccagatcg tgccgaccac caacctctac tccgccaccg acgagatcgt gcagccgcag      600

gtgtccaact ccccgctcga ctcctcctac ctcttcaacg gcaagaacat ccaggcccag      660

gccgtgtgcg gccctctctt cgtgatcgac cacgctggct ccctcacctc ccagttctcc      720

tacgtggtgg gccgctccgc cctccgctcc accaccggcc aggctcgctc cgccgactac      780

ggcatcaccg actgcaaccc gctcccagcc aacgacctca ccccggagca gaaggtggca      840

gccgctgcac tcctcgctcc agaagccgct gccatcgtgg caggtccgaa gcagaactgc      900

gagccggacc tcatgccgta cgctcgcccg ttcgccgtgg gcaagcgcac ctgctccggc      960

atcgtgaccc cgtaa                                                       975

 

 

<210> 3

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 重组脂肪酶基因OsHIL的多核苷酸序列

 

<400> 3

tccccgatcc gccgcgaggt gtcccaggac ctcttcaacc agttcaacct cttcgcccag      60

tactccgccg ccgcctactg cggcaagaac aacgacgccc cggccggcac caacatcacc      120

tgcaccggca acgcctgccc ggaggtggag aaggccgacg ccaccttcct ctactccttc      180

gaggactccg gcgtgggcga cgtgaccggc ttcctcgccc tcgacaacac caacaagctc      240

atcgtgctct ccttccgcgg ctcccgctcc atcgagaact ggatcggcaa cctcaacttc      300

gacctcaagg agatcaacga catctgctcc ggctgccgcg gccacgacgg cttcacctcc      360

tcctggcgct ccgtggccga caccctccgc cagaaggtgg aggacgccgt gcgcgagcac      420

ccggactacc gcgtggtgtt caccggccac tccctcggcg gcgccctcgc caccgtggcc      480

ggcgccgacc tccgcggcaa cggctacgac atcgacgtgt tctcctacgg cgccccgcgc      540

gtgggcaacc gcgccttcgc cgagttcctc accgtgcaga ccggcggcac cctctaccgc      600

atcacccaca ccaacgacat cgtgccgcgc ctcccgccgc gcgagttcgg ctactcccac      660

tcctccccgg agtactggat caagtccggc accctcgtgc cggtgacccg caacgacatc      720

gtgaagatcg agggcatcga cgccaccggc ggcaacaacc agccgaacat cccggacatc      780

ccggcccacc tctggtactt cggcctcatc ggcacctgcc tctaa                      825

 

 

<210> 4

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 重组脂肪酶基因OsLIPB所对应的氨基酸序列

 

<400> 4

Ala Thr Pro Leu Val Lys Arg Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala

1 5 10 15

Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln

20 25 30

Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys Pro Ile Leu Leu Val Pro

35 40 45

Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe Asp Ser Asn Trp Ile

50 55 60

Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys Trp Ile Ser Pro

65 70 75

Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr Glu Tyr Met

80 85 90

Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Asn Lys

95 100 105

Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln Trp

110 115 120

Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu

125 130 135

Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro

140 145 150

Leu Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr

155 160 165

Thr Gly Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu

170 175 180

Thr Gln Ile Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu

185 190 195

Ile Val Gln Pro Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr

200 205 210

Leu Phe Asn Gly Lys Asn Ile Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro

215 220 225

Leu Phe Val Ile Asp His Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser

230 235 240

Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala

245 250 255

Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala

260 265 270

Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val Ala Ala Ala Ala Leu Leu

275 280 285

Ala Pro Glu Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly Pro Lys Gln Asn Cys

290 295 300

Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe Ala Val Gly Lys

305 310 315

Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro ·

320

 

 

<210> 5

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 重组脂肪酶基因OsHIL所对应的氨基酸序列

 

<400> 5

Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe

1 5 10 15

Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn

20 25 30

Asn Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala

35 40 45

Cys Pro Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe

50 55 60

Glu Asp Ser Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp

65 70 75

Asn Thr Asn Lys Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser

80 85 90

Ile Glu Asn Trp Ile Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile

95 100 105

Asn Asp Ile Cys Ser Gly Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser

110 115 120

Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp

125 130 135

Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr Arg Val Val Phe Thr Gly His

140 145 150

Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val Ala Gly Ala Asp Leu Arg

155 160 165

Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser Tyr Gly Ala Pro Arg

170 175 180

Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr Val Gln Thr Gly

185 190 195

Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile Val Pro Arg

200 205 210

Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro Glu Tyr

215 220 225

Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp Ile

230 235 240

Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro

245 250 255

Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile

260 265 270

Gly Thr Cys Leu ·

 

 

<210> 6

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因的多核苷酸序列

 

<400> 6

atggtttcat tcatttccat ttctcaaggt gttagtcttt gtcttcttgt ctcttccatg      60

atgctcggtt catctgctgt tcctgtttct ggtaaatctg gatcttccac taccgccgtc      120

tctgcatctg acaattctgc cctccctcct ctcatttcca gccgttgtgc tcctccttct      180

aacaagggaa gtaaaagcga tcttcaagct gaaccttact acatgcaaaa gaatacagaa      240

tggtatgagt cccatggtgg caacctgaca tccatcggaa agcgagatga caatttggtt      300

ggtggcatga ctttggattt acctagcgat gctcctccta tcagcctctc tggatctacc      360

aacagcgcct ctgatggtgg taaggttgtt gctgctacta ctgctcaaat tcaagagttc      420

accaagtatg ctggtatcgc tgccactgcc tactgtcgtt ctgttgtccc tggtaacaag      480

tgggactgtg tccaatgtca aaagtgggtt cctgatggca agatcatcac tacctttacc      540

tccttgcttt ccgacacaaa tggttacgtc ttgagaagtg ataaacaaaa gaccatttat      600

cttgttttcc gtggtaccaa ctccttcaga agtgccatca ctgatattgt cttcaacttt      660

tccgactaca agcctgtcaa gggcgccaag gttcatgctg gtttcctttc ctcttatgag      720

caagttgtca atgactattt ccctgtcgtc caagaacaac tgaccgccaa ccctacttac      780

aaggtcatcg tcaccggtca ctcactcggt ggtgcacaag ctttgcttgc cggtatggat      840

ctctaccaac gtgaaccaag actgtctccc aagaatttga gcatcttcac tgttggtggt      900

cctcgtgttg gtaaccccac ctttgcttac tatgttgaat ctaccggtat tcctttccaa      960

cgtaccgttc acaagagaga tatcgttcct cacgttcctc ctcaatcctt cggattcctt      1020

catcccggtg ttgaatcttg gattaagtct ggtacctcca acgttcaaat ctgtacttct      1080

gaaattgaaa ccaaggattg cagtaactct atcgttcctt tcacctctct ccttgatcac      1140

ttgagttact ttgatatcaa cgaaggaagc tgtttgtaa                             1179

 

 

<210> 7

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 来自白地霉(Galactomyces geotrichum)的重组脂肪酶基因的多核苷酸序列

 

<400> 7

atggtatcca aaagcttgtt cttagccgct gccgtaaacc tagctggcgt cctggcccag      60

gcccccacgg ccgttctcaa tggcaacgag gtcatttctg gtgttgttga gggtaaagtt      120

gataccttca agggaatccc atttgctgac cctcctttga atgacttgcg attcaagcac      180

ccccagcctt tcactggatc ctaccagggt cttaaggcca atgattttag ccctgcttgt      240

atgcagcttg atcctggcaa ctctctcact ttgcttgaca aagctctggg attggcaaaa      300

gtcatccccg aacaatttag aggtcccctt tatgatatgg ccaagggtac cgtgtcgatg      360

aatgaggact gtctttacct caatgttttc cgccctgctg gcaccaagcc tgaagataag      420

ctccccgtca tggtttggat ttacggcggt gcgtttgttt acggttcttc tgctgcctac      480

cctggtaaca gctacgttaa ggaaagtatc aacatgggcc agcccgttgt gtttgtttcc      540

atcaactacc gtaccggtcc atttggattc ctgggtggtg atgccatcac cgctgagggc      600

aacaccaacg ctggtctgca cgaccagcgc aagggtctcg agtgggttag cgacaacatt      660

gccaactttg gtggtgatcc cgacaaggtc atgattttcg gtgagtccgc tggtgccatg      720

agtgttgctc accagcttat tgcctacggt ggtgacaaca cctacaacgg aaagaagctt      780

ttccactctg ccattcttca gtctggtggc cctcttccta accacgactc tagctccgtt      840

ggtcccgata tttcctacaa cagatttgct cagtatgccg gatgtgacac cagtgccagt      900

gccaacgaca ctctggagtg tctccgcagc aagtccagct ctgtcctgca cgatgcccag      960

aactcgtacg atctcaagga cctgtttggt ctgctccctc aattccttgg atttggtccc      1020

agacccgacg gcaacattat tcctgatgcc gcttatgagc tcttccgcag cggtagatac      1080

gccaaggttc cctacattag cggtaaccaa gaggatgaag gtactgcctt tgcccctgtt      1140

gctctcaacg ctaccacgac tccccatgtt aagaagtggt tgcagtacat tttctacgat      1200

gcttccgagg cttccattga ccgtgttttg tcgctgtacc cgcagaccct ctctgttggc      1260

tcgcccttcc gcactggcat tcttaatgcc ctgacccccc agttcaagcg tgttgcggcc      1320

atcttgtccg atatgctttt ccagtctccc cgccgcgtga tgcttagcgc caccaaggac      1380

gttaaccgct ggacttacct ttcgacccat ctgcacaacc tggtgccatt tttgggtact      1440

ttccatggca acgagcttat cttccaattc aatgtgaaca ttggccccgc taactcctac      1500

cttcgttact ttatttcctt tgccaaccac catgacccta atgttggtac taacctgctc      1560

cagtgggatc aatacactga tgaaggcaag gagatgcttg agattcacat gaccgataat      1620

gtcatgagaa ctgatgacta cagaattgag ggaatctcaa actttgagac tgacgttaat      1680

ctctacggtt aa                                                          1692

 

 

<210> 8

<211> 1179

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 来自雪白根霉(Rhizopus niveus)的重组脂肪酶基因的多核苷酸序列

 

<400> 8

atggtttcat tcatttccat ttctcaaggt gttagtcttt gtcttcttgt ctcttccatg      60

atgctcggtt catctgttgt tcctgtttct ggtaaatctg gatcttccaa caccgccgtc      120

tctgcatctg acaatgctgc cctccctcct ctcatctcca gccgttgtgc tcctccttct      180

aacaagggaa gtaaaagcga tctccaagct gaaccttaca acatgcaaaa gaatacagaa      240

tggtatgagt cccatggtgg caacctgaca tccatcggaa agcgtgatga caacttggtt      300

ggtggcatga ctttggactt acccagcgat gctcctccta tcagcctctc tagctctacc      360

aacagcgcct ctgatggtgg taaggttgtt gctgctacta ctgctcagat ccaagagttc      420

accaagtatg ctggtatcgc tgccactgcc tactgtcgtt ctgttgtccc tggtaacaag      480

tgggattgtg tccaatgtca aaagtgggtt cctgatggca agatcatcac tacctttacc      540

tccttgcttt ccgatacaaa tggttacgtc ttgagaagtg ataaacaaaa gaccatttat      600

cttgttttcc gtggtaccaa ctccttcaga agtgccatca ctgatatcgt cttcaacttt      660

tctgactaca agcctgtcaa gggcgccaaa gttcatgctg gtttcctttc ctcttatgag      720

caagttgtca atgactattt ccctgtcgtc caagaacaat tgaccgccca ccctacttat      780

aaggtcatcg ttaccggtca ctcactcggt ggtgcacaag ctttgcttgc cggtatggat      840

ctctaccaac gtgaaccaag attgtctccc aagaatttga gcatcttcac tgtcggtggt      900

cctcgtgttg gtaaccccac ctttgcttac tatgttgaat ccaccggtat ccctttccaa      960

cgtaccgttc acaagagaga tatcgttcct cacgttcctc ctcaatcctt cggattcctt      1020

catcccggtg ttgaatcttg gatcaagtct ggtacttcca acgttcaaat ctgtacttct      1080

gaaattgaaa ccaaggattg cagtaactct atcgttcctt tcacctctat ccttgaccac      1140

ttgagttact ttgatatcaa cgaaggaagc tgtttgtaa                             1179

 

 

<210> 9

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 来自米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因所对应的氨基酸序列

 

<400> 9

Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu

1 5 10 15

Leu Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ser Ser Ala Val Pro Val Ser

20 25 30

Gly Lys Ser Gly Ser Ser Thr Thr Ala Val Ser Ala Ser Asp Asn

35 40 45

Ser Ala Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro Pro Ser

50 55 60

Asn Lys Gly Ser Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Tyr Met

65 70 75

Gln Lys Asn Thr Glu Trp Tyr Glu Ser His Gly Gly Asn Leu Thr

80 85 90

Ser Ile Gly Lys Arg Asp Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu

95 100 105

Asp Leu Pro Ser Asp Ala Pro Pro Ile Ser Leu Ser Gly Ser Thr

110 115 120

Asn Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala

125 130 135

Gln Ile Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala

140 145 150

Tyr Cys Arg Ser Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln

155 160 165

Cys Gln Lys Trp Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr

170 175 180

Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys

185 190 195

Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg

200 205 210

Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro

215 220 225

Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu

230 235 240

Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Glu Gln Leu Thr

245 250 255

Ala Asn Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly

260 265 270

Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu

275 280 285

Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly Gly

290 295 300

Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr

305 310 315

Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro

320 325 330

His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu

335 340 345

Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser

350 355 360

Glu Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr

365 370 375

Ser Leu Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser

380 385 390

Cys Leu ***

 

 

<210> 10

<211> 563

<212> PRT

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 来自白地霉(Galactomyces geotrichum)的重组脂肪酶基因对应的氨基酸序列

 

<400> 10

Met Val Ser Lys Ser Leu Phe Leu Ala Ala Ala Val Asn Leu Ala

1 5 10 15

Gly Val Leu Ala Gln Ala Pro Thr Ala Val Leu Asn Gly Asn Glu

20 25 30

Val Ile Ser Gly Val Val Glu Gly Lys Val Asp Thr Phe Lys Gly

35 40 45

Ile Pro Phe Ala Asp Pro Pro Leu Asn Asp Leu Arg Phe Lys His

50 55 60

Pro Gln Pro Phe Thr Gly Ser Tyr Gln Gly Leu Lys Ala Asn Asp

65 70 75

Phe Ser Pro Ala Cys Met Gln Leu Asp Pro Gly Asn Ser Leu Thr

80 85 90

Leu Leu Asp Lys Ala Leu Gly Leu Ala Lys Val Ile Pro Glu Gln

95 100 105

Phe Arg Gly Pro Leu Tyr Asp Met Ala Lys Gly Thr Val Ser Met

110 115 120

Asn Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Phe Arg Pro Ala Gly Thr

125 130 135

Lys Pro Glu Asp Lys Leu Pro Val Met Val Trp Ile Tyr Gly Gly

140 145 150

Ala Phe Val Tyr Gly Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Gly Asn Ser Tyr

155 160 165

Val Lys Glu Ser Ile Asn Met Gly Gln Pro Val Val Phe Val Ser

170 175 180

Ile Asn Tyr Arg Thr Gly Pro Phe Gly Phe Leu Gly Gly Asp Ala

185 190 195

Ile Thr Ala Glu Gly Asn Thr Asn Ala Gly Leu His Asp Gln Arg

200 205 210

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asp Asn Ile Ala Asn Phe Gly Gly

215 220 225

Asp Pro Asp Lys Val Met Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ala Met

230 235 240

Ser Val Ala His Gln Leu Ile Ala Tyr Gly Gly Asp Asn Thr Tyr

245 250 255

Asn Gly Lys Lys Leu Phe His Ser Ala Ile Leu Gln Ser Gly Gly

260 265 270

Pro Leu Pro Asn His Asp Ser Ser Ser Val Gly Pro Asp Ile Ser

275 280 285

Tyr Asn Arg Phe Ala Gln Tyr Ala Gly Cys Asp Thr Ser Ala Ser

290 295 300

Ala Asn Asp Thr Leu Glu Cys Leu Arg Ser Lys Ser Ser Ser Val

305 310 315

Leu His Asp Ala Gln Asn Ser Tyr Asp Leu Lys Asp Leu Phe Gly

320 325 330

Leu Leu Pro Gln Phe Leu Gly Phe Gly Pro Arg Pro Asp Gly Asn

335 340 345

Ile Ile Pro Asp Ala Ala Tyr Glu Leu Phe Arg Ser Gly Arg Tyr

350 355 360

Ala Lys Val Pro Tyr Ile Ser Gly Asn Gln Glu Asp Glu Gly Thr

365 370 375

Ala Phe Ala Pro Val Ala Leu Asn Ala Thr Thr Thr Pro His Val

380 385 390

Lys Lys Trp Leu Gln Tyr Ile Phe Tyr Asp Ala Ser Glu Ala Ser

395 400 405

Ile Asp Arg Val Leu Ser Leu Tyr Pro Gln Thr Leu Ser Val Gly

410 415 420

Ser Pro Phe Arg Thr Gly Ile Leu Asn Ala Leu Thr Pro Gln Phe

425 430 435

Lys Arg Val Ala Ala Ile Leu Ser Asp Met Leu Phe Gln Ser Pro

440 445 450

Arg Arg Val Met Leu Ser Ala Thr Lys Asp Val Asn Arg Trp Thr

455 460 465

Tyr Leu Ser Thr His Leu His Asn Leu Val Pro Phe Leu Gly Thr

470 475 480

Phe His Gly Asn Glu Leu Ile Phe Gln Phe Asn Val Asn Ile Gly

485 490 495

Pro Ala Asn Ser Tyr Leu Arg Tyr Phe Ile Ser Phe Ala Asn His

500 505 510

His Asp Pro Asn Val Gly Thr Asn Leu Leu Gln Trp Asp Gln Tyr

515 520 525

Thr Asp Glu Gly Lys Glu Met Leu Glu Ile His Met Thr Asp Asn

530 535 540

Val Met Arg Thr Asp Asp Tyr Arg Ile Glu Gly Ile Ser Asn Phe

545 550 555

Glu Thr Asp Val Asn Leu Tyr Gly ·

560

 

 

<210> 11

<211> 392

<212> PRT

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 来自雪白根霉(Rhizopus niveus)的重组脂肪酶基因对应的氨基酸序列

 

<400> 11

Met Val Ser Phe Ile Ser Ile Ser Gln Gly Val Ser Leu Cys Leu

1 5 10 15

Leu Val Ser Ser Met Met Leu Gly Ser Ser Val Val Pro Val Ser

20 25 30

Gly Lys Ser Gly Ser Ser Asn Thr Ala Val Ser Ala Ser Asp Asn

35 40 45

Ala Ala Leu Pro Pro Leu Ile Ser Ser Arg Cys Ala Pro Pro Ser

50 55 60

Asn Lys Gly Ser Lys Ser Asp Leu Gln Ala Glu Pro Tyr Asn Met

65 70 75

Gln Lys Asn Thr Glu Trp Tyr Glu Ser His Gly Gly Asn Leu Thr

80 85 90

Ser Ile Gly Lys Arg Asp Asp Asn Leu Val Gly Gly Met Thr Leu

95 100 105

Asp Leu Pro Ser Asp Ala Pro Pro Ile Ser Leu Ser Ser Ser Thr

110 115 120

Asn Ser Ala Ser Asp Gly Gly Lys Val Val Ala Ala Thr Thr Ala

125 130 135

Gln Ile Gln Glu Phe Thr Lys Tyr Ala Gly Ile Ala Ala Thr Ala

140 145 150

Tyr Cys Arg Ser Val Val Pro Gly Asn Lys Trp Asp Cys Val Gln

155 160 165

Cys Gln Lys Trp Val Pro Asp Gly Lys Ile Ile Thr Thr Phe Thr

170 175 180

Ser Leu Leu Ser Asp Thr Asn Gly Tyr Val Leu Arg Ser Asp Lys

185 190 195

Gln Lys Thr Ile Tyr Leu Val Phe Arg Gly Thr Asn Ser Phe Arg

200 205 210

Ser Ala Ile Thr Asp Ile Val Phe Asn Phe Ser Asp Tyr Lys Pro

215 220 225

Val Lys Gly Ala Lys Val His Ala Gly Phe Leu Ser Ser Tyr Glu

230 235 240

Gln Val Val Asn Asp Tyr Phe Pro Val Val Gln Glu Gln Leu Thr

245 250 255

Ala His Pro Thr Tyr Lys Val Ile Val Thr Gly His Ser Leu Gly

260 265 270

Gly Ala Gln Ala Leu Leu Ala Gly Met Asp Leu Tyr Gln Arg Glu

275 280 285

Pro Arg Leu Ser Pro Lys Asn Leu Ser Ile Phe Thr Val Gly Gly

290 295 300

Pro Arg Val Gly Asn Pro Thr Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ser Thr

305 310 315

Gly Ile Pro Phe Gln Arg Thr Val His Lys Arg Asp Ile Val Pro

320 325 330

His Val Pro Pro Gln Ser Phe Gly Phe Leu His Pro Gly Val Glu

335 340 345

Ser Trp Ile Lys Ser Gly Thr Ser Asn Val Gln Ile Cys Thr Ser

350 355 360

Glu Ile Glu Thr Lys Asp Cys Ser Asn Ser Ile Val Pro Phe Thr

365 370 375

Ser Ile Leu Asp His Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Asn Glu Gly Ser

380 385 390

Cys Leu ·

 

 

 

 

 

Claims (8)

1.利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是包括以下步骤：

1）、构建包含重组脂肪酶基因的水稻胚乳特异性表达载体；

2）、将上述水稻胚乳特异性表达载体导入水稻，得到转基因水稻；从而使重组脂肪酶能在所述转基因水稻胚乳细胞蛋白体中高表达。

2.根据权利要求1所述的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是：所述重组脂肪酶基因为以下任一：

多核苷酸序列为SEQ ID NO:2的重组脂肪酶基因OsLIPB；

多核苷酸序列为SEQ ID NO:3的重组脂肪酶基因OsHIL；

多核苷酸序列为SEQ ID NO:6的来自米根霉(Rhizopus oryzae)的重组脂肪酶基因OsROL；

多核苷酸序列为SEQ ID NO:7的来自白地霉(Galactomyces geotrichum)的重组脂肪酶基因OsGGL；

多核苷酸序列为SEQ ID NO:8的来自雪白根霉(Rhizopus niveus)的重组脂肪酶基因OsRNL。

3.根据权利要求2所述的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是：

所述重组脂肪酶基因OsLIPB所对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；

所述重组脂肪酶基因OsHIL所对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；

所述来自米根霉(Rhizopus oryzae)的重组脂肪酶基因OsROL对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；

所述来自白地霉(Galactomyces geotrichum)的重组脂肪酶基因OsGGL对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；

所述来自雪白根霉(Rhizopus niveus)的重组脂肪酶基因OsRNL对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。

4.根据权利要求2或3所述的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是：

所述水稻胚乳特异性表达载体为以下任意一种：

Gt170-OsLIPB、Gt170-OsHIL、Gt170-OsROL、Gt170-OsGGL、Gt170-OsRNL。

5.根据权利要求4所述的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是：

所述水稻储藏蛋白的Gt1启动子和信号肽，其多核苷酸序列为SEQ IDNO:1。

6.根据权利要求5所述的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是：

重组脂肪酶LIPB来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)；

重组脂肪酶HIL来源于疏棉状嗜热丝胞菌(Thermomyces lanuginosus)。

7.根据权利要求1~6任一所述的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是：还包括重组脂肪酶的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：

①、将转基因水稻中表达的重组脂肪酶用pH 8.5的20 mM Tris-HCl缓冲液进行提取，从而获得该酶的粗提物；

②、所述粗提物经DEAE阴离子交换层析柱一步法，得到纯化的重组脂肪酶。

8.根据权利要求7所述的利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法，其特征是：所述纯化方法包括以下步骤：

所述步骤①为：将含有重组脂肪酶的转基因水稻种子按照1g:15~25ml的质量体积比用20 mM Tris-HCl缓冲液(PH 8.5)混合后进行研磨，匀浆，离心，收集上清，经0.22 μm滤膜过滤，所述滤液为酶的粗提物；

所述步骤②为：粗提物加入到已平衡过的DEAE琼脂糖凝胶柱梯度洗脱，洗脱液依次为0.07 M 的NaCl溶液、 0.15 M的 NaCl溶液、1M的NaCl溶液；收集0.07 M 的NaCl溶液所对应的洗脱液；得到纯化的重组脂肪酶。

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