CN103502431B

CN103502431B - 具有粘度改变表型的丝状真菌

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Publication number: CN103502431B
Application number: CN201280019678.3A
Authority: CN
Inventors: E·A·博迪; R·J·普莱特二世
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc
Priority date: 2011-04-22
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2032-04-20
Also published as: CA2833541C; AR086200A1; BR112013025203A2; CA2833541A1; JP2014513531A; US20140094587A1; EP3000870B1; US9725726B2; EP3000870A1; EP2663633B1; KR20140033053A; AU2017202753A1; DK3000870T3; CA2833660A1; KR101993939B1; KR101952470B1; US9725727B2; AU2012245402B2; AR086201A1; DK2663633T3

Abstract

本发明描述了与具有变异生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。此类变异株非常适于在深层培养物中生长，例如用于大规模生产商业应用的酶和其他蛋白。

Description

具有粘度改变表型的丝状真菌

优先权

本专利申请要求2011年4月22日提交的序列号为61/478,160和61/478,162的美国临时专利申请的优先权，所述专利申请据此全文以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明的菌株和方法涉及丝状真菌中的基因突变，所述突变产生具有变异生长特性的变异菌株。此类变异菌株非常适于在深层培养物中生长，例如用于大规模生产商业应用的酶和其他蛋白或代谢物。

背景技术

丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白，因而非常适于大规模生产用于工业、医药、动物保健以及食品和饮料应用的酶和其他蛋白。丝状真菌通常在生物反应器的菌丝深层培养物中生长，这些生物反应器适于将氧气和营养物质引入培养基（即，培养液）并使氧气和营养物质分布于其中。菌丝体的形态特征影响培养液的流变性，从而影响生物反应器的性能。

通常，培养液的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量也越高。在一些情况下，培养液的粘度变得十分高，显著妨碍了氧气和营养物质的溶解，从而对真菌的生长产生不利影响。另外，混合粘稠培养液并且向粘稠培养液中通气所需的能量可能显著增加生产成本，并且导致在电机和电源供应方面的资本支出更高。

发明内容

本发明描述了涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有可产生粘度改变表型的遗传变异。

在一个方面，提供衍生自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含能使变异菌株的细胞与亲本菌株的细胞相比产生改变量的功能性Seb1蛋白的遗传变异，其中变异菌株的细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

在一些实施例中，功能性Seb1蛋白的改变量为减少量，并且变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

在一些实施例中，遗传变异包括亲本菌株中存在的seb1基因的破坏。在一些实施例中，seb1基因的破坏是全部或部分seb1基因缺失的结果。在一些实施例中，seb1基因的破坏是包含seb1基因的基因组DNA的部分缺失的结果。在一些实施例中，seb1基因的破坏是seb1基因诱变的结果。

在一些实施例中，seb1基因的破坏使用位点特异性重组进行。在一些实施例中，seb1基因的破坏与在seb1基因的基因座引入选择性标记组合进行。

在一些实施例中，变异菌株不产生功能性Seb1蛋白。在一些实施例中，变异菌株不产生Seb1蛋白。

在一些实施例中，变异菌株还包含编码目的蛋白的基因。在一些实施例中，变异菌株还包含sfb3基因的破坏。在一些实施例中，变异菌株还包含mpg1基因的破坏。在一些实施例中，变异菌株还包含sfb3和mpg1基因的破坏。在一些实施例中，变异菌株还包含至少一种选自sfb3基因、mpg1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因的破坏。在一些实施例中，变异菌株每单位量生物质产生与亲本菌株基本等量或更多的蛋白。

在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)菌种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种(Trichoderma spp.)、曲霉属(Aspergillus spp.)、镰刀菌属(Fusarium spp.)、足放线病菌属(Scedosporium spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、金孢子菌属(Chrysosporium spp.)、头孢属(Cephalosporium spp.)、篮状菌属(Talaromycesspp.)、白乔史密斯霉属(Geosmithia spp.)和脉孢菌属(Neurospora spp.)。在一些实施例中，丝状真菌可以包括（但不限于）里氏木霉(Trichoderma reesei)（之前归类为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)）、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、分解乌头酸曲霉(Aspergillusitaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、多育赛多孢(Scedosporium prolificans)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌（白乔史密斯霉）(Talaromyces (Geosmithia)emersonii)、产毒镰刀菌(Fusarium venenatum)和勒克瑙金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在另一方面，提供了产生丝状真菌细胞的变异菌株的方法，该方法包括：将遗传变异引入丝状真菌细胞的亲本菌株，其中与亲本菌株的细胞相比，所述遗传变异改变了功能性Seb1蛋白的产量，从而产生可在深层培养有氧发酵过程中产生细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

在一些实施例中，遗传变异减少或抑制功能性Seb1蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

在一些实施例中，遗传变异包括使用遗传操作来破坏亲本丝状真菌细胞中的seb1基因。在一些实施例中，遗传变异包括使用遗传操作使亲本丝状真菌细胞中的seb1基因缺失。在一些实施例中，遗传变异使用位点特异性基因重组进行。

在一些实施例中，seb1基因的破坏与在seb1基因的基因座中引入选择性标记组合进行。在一些实施例中，变异菌株的每单位量生物质产生与亲本菌株基本上等量或更多的蛋白。在一些实施例中，seb1基因的破坏与sfb3基因的破坏组合进行。在一些实施例中，seb1基因的破坏与mpg1基因的破坏组合进行。在一些实施例中，seb1基因的破坏与至少一种选自sfb3基因、mpg1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因的破坏组合进行。

在一些实施例中，变异菌株的每单位量生物质产生与亲本菌株基本上等量或更多的蛋白。

在一些实施例中，丝状真菌是盘菌亚门物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属、曲霉属、镰刀菌属、足放线病菌属、青霉属、金孢子菌属、头孢属、篮状菌属、白乔史密斯霉属和脉孢菌属。在一些实施例中，丝状真菌可以包括（但不限于）里氏木霉（之前归类为长梗木霉和红褐肉座菌）、黑曲霉、烟曲霉、分解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌（白乔史密斯霉）、产毒镰刀菌和勒克瑙金孢子菌。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

在一些实施例中，亲本菌株还包含编码目的蛋白的基因。在一些实施例中，在引入可减少或抑制功能性Seb1蛋白产生的遗传变异之前，编码目的蛋白的基因存在于亲本菌株中。在一些实施例中，亲本菌株中的目的蛋白由内源基因或异源基因编码。

在另一方面，提供了通过任一种上述变异菌株产生的目的蛋白。

在又一方面，提供了通过任一种上述方法产生且具有任意上述性质的丝状真菌。

在另一方面，提供了衍生自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含：(a)遗传变异，所述遗传变异使得(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码目的蛋白的基因，其中编码目的蛋白的基因在(a)中的遗传变异之前存在于变异菌株中。

在一些实施例中，所得的变异菌株的遗传变异包括亲本菌株中存在的seb1基因的破坏。在一些实施例中，seb1基因的破坏与在seb1基因的基因座中引入选择性标记组合进行。在一些实施例中，seb1基因的破坏与sfb3基因的破坏组合进行。在一些实施例中，seb1基因的破坏与mpg1基因的破坏组合进行。在一些实施例中，seb1基因的破坏与至少一种选自sfb3基因、mpg1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因的破坏组合进行。

由说明书（包括附图），本发明的变异菌株和方法的这些和其他方面以及实施例将显而易见。

附图说明

图1A示出了表示包含pyr4基因的T-DNA的示意图。

图1B为根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)PZP100载体的图谱。

图2为比较14L发酵罐中T4T-DNA突变体F16和T4亲本生长过程中的溶氧量水平的曲线图。

图3为比较14L发酵罐中T4T-DNA突变体F16和T4亲本的生长速率的曲线图。

图4和5为T4Δseb1F16菌株（图4）和Morph菌株（图5）在PDA、山梨醇和氯化钠平板上生长后的图像。T4seb1F16突变体与Morph对照物相比表现出受限制的生长和渗透敏感性。

图6为seb1破坏载体的图谱。

图7为mpg1破坏载体的图谱。

具体实施方式

I.综述

本发明的菌株和方法涉及丝状真菌细胞的变异菌株，其具有影响其形态和生长特性的遗传修饰。当变异细胞培养于深层培养物中时，它们产生的细胞培养液与包含亲本菌株细胞的细胞培养液相比具有不同的流变性。一部分此类变异菌株适于大规模生产酶和其他商业上重要的蛋白质。

II.定义

在详细描述本发明菌株和方法之前，为清楚起见定义了以下术语。未定义的术语应当与相关领域中使用的它们的通常含义相一致。

如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门的丝状真菌。这种生物之前分类为长梗木霉，也分类为红褐肉座菌。

如本文所用，短语“丝状真菌细胞变异菌株”或类似的短语，是指例如通过遗传操作衍生自（即，得自或可得自）属于盘菌亚门的亲本（或参考）菌株的丝状真菌细胞菌株。在本发明的说明中，亲本和变异菌株可以被描述为具有某些特性，例如遗传修饰、表达表型、形态等等；然而，本领域的技术人员将会知道，亲本或变异菌株的细胞在技术上具有这类特性，并且为了方便起见称为“菌株”。

如本文所用，术语“目的蛋白”是指希望在丝状真菌中表达的多肽。这样的蛋白可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等等，并且能够以高水平表达且能够用于商业化目的。目的蛋白相对于变异菌株和/或亲本菌株可以由内源基因或异源基因编码。目的蛋白可以在细胞内表达或作为分泌蛋白进行表达。

如本文所用，词语“基本无活性”或类似词语，意思是特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰混合物的预期目的。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白”（和/或它们各自的复数形式）可互换使用，是指通过肽键连接的包含氨基酸残基的任意长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规单字母代码或三字母代码。聚合物可以为直链或支链的，其可以包含经修饰的氨基酸，并且其可以被非氨基酸隔断。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物，所述干预为例如形成二硫键、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰（例如与标记组分结合）。在所述定义中还包括（例如）包含一个或多个氨基酸（包括，例如非天然氨基酸等）类似物的多肽，以及本领域中已知的其他修改形式。

如本文所用，将功能上和/或结构上类似的蛋白视为“相关蛋白”。此类蛋白可源自不同属和/或种的生物体、或甚至不同纲的生物体（如，细菌和真菌）。相关蛋白还涵盖通过基本序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的或通过免疫交叉反应性确定的同源物。

如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白”是指这样的蛋白，其通过将一个或多个氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点处置换一个或多个氨基酸、在该蛋白质的一端或两端或氨基酸序列中的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸、和/或在氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍生自或可衍生自另一蛋白。制备蛋白衍生物可通过修饰编码天然蛋白的DNA序列、将DNA序列转化到合适的宿主中以及表达经修饰的DNA序列以形成衍生的蛋白而实现。

相关（以及衍生的）蛋白质包括“变体蛋白质”。变体蛋白质由于置换、缺失和/或插入少量的氨基酸残基而不同于参考蛋白质/亲本蛋白质（如，野生型蛋白质）。变体蛋白质与亲本蛋白质之间的差异氨基酸残基数目可为一个或多个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体蛋白质与参考蛋白质可以享有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%或更高的氨基酸序列同一性。变体蛋白质还可以在所选的基序、结构域、表位、保守性区域等中不同于参考蛋白质。

如本文所用，术语“类似序列”是指在蛋白质内提供与目的蛋白质（即，通常是目的原始蛋白质）类似的功能、三级结构和/或保守性残基的序列。例如，在包含α-螺旋或β-片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选地保持相同的特定结构。所述术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发了类似序列，使得置换氨基酸导致变体酶显示类似或改进的功能。在一些实施例中，目的蛋白质中氨基酸的三级结构和/或保守性残基位于目的区段或片段处或其附近。因此，在目的区段或片段包含（例如）α-螺旋或β-片层结构的情况下，置换氨基酸优选地保持该特定结构。

如本文所用，术语“同源蛋白质”是指与参考蛋白质具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不意味着各同源物一定在进化上相关。因此，该术语的意图是涵盖得自不同生物体的相同、类似或相应的酶（即，在结构和功能方面）。在一些实施例中，期望鉴定与参考蛋白质具有类似的四级结构、三级结构和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白质引起与参考蛋白质相似的免疫应答。在一些实施例中，同源蛋白质被工程化以制备具有所需活性的酶。

序列之间同源性的程度可以使用本领域中已知的任何合适的方法确定（参见例如，Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482（Smith和Waterman，1981年，《高等应用数学》，第2卷，第482页）；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.,48:443（Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页）；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444（Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页）；程序，例如在威斯康星遗传学软件包（Wisconsin Genetics SoftwarePackage，得自美国威斯康星州麦迪逊市的遗传学计算机小组(Genetics Computer Group,Madison,WI)）中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；以及Devereux et al.(1984)NucleicAcids Res12:387-95（Devereux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页））。

例如，PILEUP是可用于测定序列同源程度的程序。PILEUP使用渐进式逐对比对从一组相关序列产生多个序列比对。其还能够绘制显示聚类关系（用于产生比对）的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle的简化渐进式比对方法（Feng and Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35:351-60（Feng和Doolittle，1987年，《分子演化杂志》，第35卷，第351-360页））。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法类似（(1989)CABIOS5:151-53（1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页））。可用的PILEUP参数包括：默认间隙权重3.00、默认间隙长度权重0.10，以及加权末端间隙。可用的算法的另一个例子是Altschul等人（(1990)J.Mol.Biol.215:403-10（1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页））以及Karlin等人（(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-87（1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5887页））描述的BLAST算法。一种尤其可用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序（参见例如Altschul et al.(1996)Meth.Enzymol.266:460-80（Altschul等人，1996年，《酶学方法》，第266卷，第460-480页））。参数“W”、“T”和“X”决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值：字长(W)11、BLOSUM62记分矩阵（参见例如Henikoff andHenikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915（Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页））比对(B)为50、期望值(E)为10，M’5，N’-4，以及对两条链的比较。

如本文所用，在至少两条核酸或多肽的情况下，短语“基本上类似”和“基本上相同”通常意味着多核苷酸或多肽包含的序列与参考（即，野生型）序列相比具有至少约70%的同一性、至少约75%的同一性、至少约80%的同一性、至少约85%的同一性、至少约90%的同一性、至少约91%的同一性、至少约92%的同一性、至少约93%的同一性、至少约94%的同一性、至少约95%的同一性、至少约96%的同一性、至少约97%的同一性、至少约98%的同一性、或甚至至少约99%的同一性或更高的同一性。序列同一性可以使用例如BLAST、ALIGN和CLUSTAL之类的已知程序，使用标准参数测定。（参见，例如Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410（Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页）；Henikoff etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915（Henikoff等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第10915页）；Karin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90:5873（Karin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873页）；以及Higgins et al.(1988)Gene73:237-244（Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页））。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。另外，可使用FASTA对数据库进行搜索（Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444-48（Pearson等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页））。两条多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，因保守氨基酸置换而不同的多肽是免疫交叉反应性的。因此，一种多肽与第二多肽实质上一致，例如，在此情况下两种多肽仅因保守置换而不同。两种核酸序列实质上一致的另一个指示是两种分子在严格的条件（如，在中至高严格度的范围内）下彼此杂交。

如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在指代编码并指导蛋白质或RNA表达的核酸时是同义的。丝状真菌繁殖体通常为单倍体，因而单拷贝的特定基因（即，单个等位基因）足够赋予特定表型。

如本文所用，术语“野生型”与“天然”可互换使用，是指天然存在的基因、蛋白质或菌株。

如本文所用，“基因缺失”是指其从宿主细胞基因组中移除。当基因包含与基因编码序列并未紧挨着的控制元件（如，增强子元件）时，基因缺失是指删除了编码序列，以及任选的相邻增强子元件，包括（但不限于）例如启动子和/或终止子序列。

如本文所用，“基因破坏”广义上是指在宿主细胞中进行的任何基本上防止细胞产生功能基因产物（如，蛋白质）的遗传或化学操作（即，突变）。基因破坏的示例性方法包括完全或部分缺失基因的任何部分，包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一个调控元件，或诱变上述元件，其中诱变包括置换、插入、缺失、倒位以及它们的组合和变化，它们中的任何一种突变基本防止了功能基因产物的产生。还可以使用RNAi、反义或消除基因表达的任何其他方法来破坏基因。

如本文所用，术语“遗传操作”和“遗传变异”可互换使用，是指核酸序列的变异/改变。该变异可以包括（但不限于）核酸序列中至少一种核酸的置换、缺失、插入或化学修饰。

如本文所用，“有氧发酵”是指有氧气存在下的生长。

如本文所用，术语“细胞培养液”统一指液体/深层培养物中的培养基和细胞。

如本文所用，术语“细胞群”是指液体/深层培养物中存在的细胞成分（包括完整和裂解细胞）。可用干重或湿重表示细胞群。

如本文所用，术语“流变学”是指研究物质变形和流动的物理学分支。

如本文所用，“粘度”是液体对机械应力（例如剪切应力或拉伸应力）下变形的抗性的量度。在本发明上下文中，粘度还可以指含有丝状真菌细胞的细胞培养液对机械应力（如，由转子/叶轮提供）的抗性。因为细胞培养液的粘度难以直接测量，可使用间接测量粘度的方式，例如预选搅拌量下发酵液的溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、维持预选溶氧量所需的搅拌细胞培养液的功率大小、或甚至固体培养基上的菌落形态。

如本文所用，“粘度改变”丝状真菌细胞变异菌株是指产生的细胞培养液相比于亲本菌株产生的等同细胞培养液具有降低或增加的粘度（即，对剪切或拉伸应力的抗性降低或增加）的变异菌株。通常，等同细胞培养液具有类似的细胞群。优选地，变异的粘度改变菌株和亲本菌株之间在任何直接或间接粘度测量方面的差异为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。比较丝状真菌细胞培养液粘度的方法在本文中有所描述。通常，类似的（或等同的）细胞培养液具有类似的细胞群。

如本文所用，“粘度降低”丝状真菌细胞变异菌株是指产生的细胞培养液相比于亲本菌株产生的等同细胞培养液粘度降低（，即对剪切或拉伸应力的抗性降低）的变异菌株。优选地，变异的粘度改变菌株和亲本菌株之间在任何直接或间接粘度测量方面的差异为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。

如本文所用，“溶解氧”(DO)是指以体积/体积为单位测量的存在于液体培养基中的氧气(O₂)的量。溶解氧含量在整个发酵过程中可以维持在高水平，例如，介于170-100%和20%之间、介于100-80%和20%之间、介于70%和20%之间、介于65%和20%之间、介于60%和20%之间、介于55%和20%之间、介于50%至20%、介于45%和20%之间、介于44%和20%之间、介于43%和20%之间、介于42%和20%之间、介于41%和20%之间、介于40%和20%之间、介于35%和20%之间、介于30%和20%之间以及介于25%和20%之间。具体地讲，在发酵开始的时候可以具有高的溶解氧含量，并且随着发酵进行溶解氧含量可以下降。可以通过搅拌（如搅动）发酵的速率和/或通过加入空气或氧气的速率而控制溶解氧含量。能够（如）以介于400和700rpm之间的转速搅动而搅拌培养物，并且可以通过改变空气或氧气流速和叶轮转速而将溶解氧含量维持在20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上和55%以上或更高。

如本文所用，“主要遗传决定因素”是指无其他基因或其遗传操作时足以赋予特定表型所必需的基因或其遗传操作。然而，足以赋予特定表型所必需的特定基因不排除能够通过另外的基因操作获得表型的附加效应的可能性。

如本文所用，“功能多肽/蛋白”是指具有活性例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，且未进行诱变、截短或以其他方式修饰以去除或降低其活性的蛋白质。功能多肽可以为耐热性的或不耐热的，如具体说明的。

如本文所用，“功能基因”是指能够被细胞成分所用以产生活性基因产物（通常为蛋白质）的基因。功能基因与被破坏基因相反，后者被修饰，因此不能被细胞成分所用以产生活性基因产物，或具有降低的被细胞成分所用以产生活性基因产物的能力。

如本文所用，相比于亲本菌株，若变异菌株与亲本菌株之间的蛋白表达量差异低于约20%、低于约15%、低于约10%、低于约7%、低于约5%、或甚至低于约3%，则变异细胞“维持或保持高水平的蛋白表达和/或分泌”。

如本文所用，宿主细胞“被修饰以抑制特定蛋白质的产生”，前提条件是宿主细胞进行了遗传或化学改变以抑制产生功能性蛋白/多肽，该蛋白/多肽具有野生型蛋白的活性特征，特别是促进菌丝延长或以其他方式增加液体培养中丝状真菌粘度的活性。此类修饰包括（但不限于）编码蛋白（如本文所述）的基因缺失或破坏、使得所编码的多肽缺乏上述活性的基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的基因修饰以及它们的组合。

如本文所用，“目的蛋白”是期望在丝状真菌细胞的深层培养中产生的蛋白。通常，目的蛋白在工业、医药、动物保健以及食品和饮料用途方面具有重要商业价值，因此希望大规模生产。要将目的蛋白与丝状真菌细胞表达的大量其他蛋白区分开，后者通常不是目的产物并且主要被视为背景蛋白污染物。

如本文所用，若相比于亲本菌株产生的蛋白量，变异菌株产生的蛋白量减少不超过20%、减少不超过15%、减少不超过10%或甚至减少不超过5%，其中蛋白量被归一化为测定了蛋白产量的细胞的生物质总量，其中生物质可用湿重（如，细胞团块）或干重方式表示，则变异菌株每单位量的生物质产生与亲本菌株“基本上等量”的蛋白质。

如本文所用，若相比于亲本菌株，变异菌株产生的蛋白量增加至少5%、增加至少10%、增加至少15%或更多，其中蛋白量被归一化为测定了蛋白产量的细胞的生物质总量，其中生物质可用湿重（如，细胞团块）或干重方式表示，则变异菌株较之亲本菌株“每单位量的生物质产生基本上更多的蛋白质”。

如本文所用，“荧光物”为荧光染料。优选的荧光物与真菌细胞壁的纤维素和/或甲壳质结合。

如本文所用，单数冠词“一个”、“一种”和“该”涵盖多个指代物，除非上下文明确地另有所指。本文引用的全部参考文献均据此全文以引用方式并入本文。除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有下列含义：

CFU 菌落形成单位

EC 酶学委员会

kDa 千道尔顿

kb 千碱基

MW 分子量

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt% 重量百分比

℃ 摄氏度

H₂O 水

H₂O₂ 过氧化氢

dH₂O或DI 去离子水

dIH₂O Milli-Q过滤的去离子水

DO 溶解氧

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

lb 磅

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

mol 摩尔

mmol 毫摩尔

M 摩尔浓度

mM 毫摩尔浓度

μM 微摩尔浓度

nm 纳米

U 单位

ppm 份每一百万份

sec和'' 秒

min和' 分钟

hr和h 小时

EtOH 乙醇

eq. 当量

N 垂直

PCR 聚合酶链反应

DNA 脱氧核糖核酸

FOA 氟乳清酸

UV 紫外线

A₅₄₀ 540nm波长处测得的吸光度

CMC 羧甲基纤维素

rpm 转每分钟

Δ 与缺失相关

CER CO₂释放率

bp 碱基对

III.Seb1蛋白产量改变的丝状真菌菌株

在一个方面，提供了源自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含遗传变异，导致了变异菌株细胞与亲本菌株细胞相比产生改变量的功能性Seb1蛋白。相比于亲本菌株细胞，变异菌株细胞随后在深层培养有氧发酵过程中产生需要改变的搅拌量来保持预选溶氧量的细胞培养液，或在预选搅拌量下保持改变的溶氧量的细胞群。

在一些情况下，遗传变异造成变异菌株细胞产生与亲本菌株细胞相比含量下降的功能性Seb1蛋白，并且与亲本菌株细胞相比，所得的细胞培养液需要减少的搅拌来保持预选溶氧量，或在预选的搅拌量下保持更高的溶氧量。在这种情况下，据信变异菌株细胞群与亲本菌株细胞群相比表现出粘度降低，这也解释了有关溶氧量和搅拌的观察结果，如实例中所述。

功能性Seb1蛋白含量下降可能是亲本菌株中存在的seb1基因被破坏所引起的。因为seb1基因的破坏是赋予变异菌株粘度降低表型的主要遗传决定因素，所以此类变异菌株仅需要包含被破坏的seb1基因，而所有其他基因可以保持完整。在一些情况下，与其来源亲本菌株相比，变异菌株可以任选地包含另外的遗传变异。此类另外的遗传变异并非实现粘度降低所必需的，但可以进一步降低粘度或赋予变异菌株其他优势。

破坏seb1基因可以使用任何合适的基本防止功能性seb1基因产物（即，Seb1蛋白）表达的方法完成。本领域的技术人员已知的示例性破坏方法包括（但不限于）：完整或部分缺失seb1基因，包括完整或部分缺失（如）Seb1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调控元件；以及完整或部分缺失包含seb1基因的任何部分的染色体的一部分。破坏seb1基因的具体方法包括在seb1基因的任何部分（如Seb1编码序列、启动子、终止子、增强子或另一个调控元件）进行核苷酸置换或插入。优选地，采用序列特异性分子生物学技术，通过遗传操作进行缺失、插入和/或置换（统称为突变），这不同于化学诱变，后者通常不能靶向特定核酸序列。然而，化学诱变可以用于破坏seb1基因。

seb1基因中的突变可以降低seb1启动子的效率，降低seb1增强子的效率，干扰seb1mRNA的剪接或编辑，干扰seb1mRNA的翻译，在Seb1编码序列中引入终止密码子以抑制全长Seb1蛋白的翻译，改变Seb1蛋白的编码序列以产生较低活性或失活蛋白或降低Seb1与其他核酸蛋白组分的相互作用，改变Seb1蛋白的编码序列以产生稳定性较低的蛋白或靶向该蛋白使其被破坏，造成Seb1蛋白错误折叠或不正确修饰（如，通过糖基化），或干扰Seb1蛋白的细胞转运。

在一个实施例中，这些以及其他遗传操作的目标是降低或抑制功能性Seb1蛋白的表达，或者降低或抑制Seb1蛋白的正常生物活性，从而产生会导致粘度降低表型的细胞内形态改变。

在其他情况下，遗传变异增加或恢复功能性Seb1蛋白的表达，或增加Seb1蛋白的正常生物活性，从而产生会导致粘度增加或恢复表型的细胞内形态改变。增加或恢复Seb1功能的示例性遗传变异是以下的那些遗传变异：将额外的seb1基因拷贝引入到细胞中，增加seb1启动子、增强子或其他控制元件的效率，增加编码Seb1蛋白的mRNA的翻译，增加编码Seb1蛋白的mRNA的稳定性，在seb1基因中引入增加Seb1蛋白活性或稳定性的改变，在seb1基因中引入调控与其他蛋白或细胞壁成分相互作用的改变等等。其他增加或恢复Seb1功能的遗传变异是使降低或抑制功能性Seb1蛋白表达的遗传变异效应发生逆转的那些遗传变异。

按照所述方法操作和使用的丝状真菌细胞通常源自子囊菌门盘菌亚门，尤其是处于营养菌丝状态且包含seb1基因同源物的真菌。此类生物体包括用于生产具有重要商业价值的工业和药用蛋白质的丝状真菌细胞，包括（但不限于）木霉属物种、曲霉属、镰刀菌属、足放线病菌属、青霉属、金孢子菌属、头孢属、篮状菌属、白乔史密斯霉属和脉孢菌属。具体的生物体包括（但不限于）里氏木霉（之前归类为长梗木霉和红褐肉座菌）、黑曲霉、烟曲霉、分解乌头酸曲霉、米曲霉、构巢曲霉、土曲霉、酱油曲霉、日本曲霉、多育赛多孢、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌（白乔史密斯霉）、产毒镰刀菌和勒克瑙金孢子菌。

如Peterbauer,C.等人（(2002)Molecular Genetics and Genomics268:223-31（2002年，《分子遗传学和基因组学》，第268卷，第223-231页））所述，来自深绿木霉(Trichoderma atroviride)的Seb1为STRE元件结合蛋白，并且据信seb1基因为酵母msn2/4基因和构巢曲霉msnA基因的同源物。要注意的是，seb1基因不能与酵母中的msn2/4基因互补，因此可能不是功能性同源物。Seb1参与（但并非必需）渗透胁迫响应，但在此前尚未被描述为与形态改变（特别是导致低粘度表型的那些）有关。本发明提供了Seb1与形态改变有关的实验证据。

使用深绿木霉Seb1氨基酸序列(SEQID NO:1)作为查询序列，对里氏木霉的已公布基因组DNA序列进行BLAST搜索，发现里氏木霉基因组包含与seb1同源性接近的单个基因。没有鉴定出另外的同源物或类似序列，表明seb1为独特的单拷贝基因。Seb1蛋白的同源物存在于如棒曲霉(Aspergillus clavatus)(SEQ ID NO:2)、烟曲霉Af93(SEQ ID NO:3)和费氏新萨托菌(Neosartorya fischeri)NRRL181(SEQ ID NO:4)中。里氏木霉的预测Seb1氨基酸序列示于SEQ ID NO:5中。

深绿木霉Seb1蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:1所示：

MDGMMSQAMGQQAFYFYNHNHDHKMARQAIFAQQMAAYQMVPTLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSRKHMMLDAEFGDNPYFPSTPPLSTSGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAMKEAVDTTESLVVDWASIVSPPLSPVYFQSQVSRVPSPTSSPSDILSTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLTGLAEDLKGEQLSTAQHTFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSNLVNLGEVNPIDISRPRACTGSSVVSLGHGSFIGDEELSFEDNDAFGFNSLPSPTSSIDFSDVHQDKRRKKEKKDIKPIMNTAASGSPSGNEQIGATPAASAASDSNASSASEDPSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHAGGAIVMNLIEDGSEVPAFDGSMMTGPVGDDYNTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEEGDQSKKKRKRSD

棒曲霉Seb1蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:2所示：

MDTTYTMVGTPVQGQPSFAYYTTNDSQSRQQHFTSHPSEMQAFYGQMQPYPQQQQQTCMPDQQSIYAAQPMLNMHQMATANAFRGALSMTPIVSPQPTHLKPTIIVQQDSPMLMPLDTRFVSSDYYAFPSTPPLSTSGSTISSPPSSGRSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHSELLANADWSRSDSPPLTPVFIHPPSLTASQSSDLLSAHSSCPSLSPSPSPVSSTFIAPPHSGLSVEPSGTDFCDPRQLTVESSVDSSTELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHESLSPAYTSSTEDPLGSLPTFDSFTDLDSEDEFVNNLVDFHPGGNPYFLGDKRQRLGSYLLEEDEFLSDRSFDDLDDHEAFAHSGLPSLEPSELISVQGDVAEVSEEMRSKKRTTSRRTLKRTNSSDSSSESLATSGKRTQASANGRSGHSEATSSSAQQSTTPSRQNSTANASSSSEAPSAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCTLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNASLQASYEEREPRLLGAALYEAANAAANKSTTSDSSDGTISDTSSVEGRPIKKRRREDHA

烟曲霉Af93Seb1蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:3所示：

MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPFEMQYYGQVSSYPQQQAQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQDSPALMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTDWSRSDSPPLTPVFIQPQSLTASQSSDLLSAQIPCPSLSPSPSPDSATFISHPQSILSAEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFQGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESTDFLAVEGDATQSTEEMSSKKRVTSRRSLKKASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSDTTSTVQQSTASSRQNSTANTSNSESPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNSSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV

费氏新萨托菌NRRL181Seb1蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:4所示：

MDATYTMAQTPVQGQPSFAYYPTESQSRQQHFTSHPSEMQYYGQVPPYPQQQHSMPEQQPVYAAQPMLNMHQMATTNAFRGALSMTPIASPQPTHLKPTIIVQQQDSPVLMPLDTRFVSNDFYGFPSTPPLSTSGSTISSPPSSNGSLHTPINDCFFSFEKVEGVKEGCESDVHCELLANTGWSRSDSPPLTPVFIQPPSLTASQSSDLLSAHMSCPSLSPSPSPDSTTFISHPQSVLSAEPSGSDFCDPRQLTVESSVGAPAELPPLPTLSCNEEEPKVVLGSATVTLPVHEGLSPSFSSSSEDPLGSLPTFDSFSDLDSEDEFANKLVDFHPIGNTYFLGDKRQRLGTYLLDEDEFLSERSLEDLDDQEAFAQSGLPSVESSDFLAAEGDATQNTEEMSSKKRVTSRRSLKRASTSESSSDSLAKKTQASATSRSGHSETTSTVQQSTASSRQNSTANTSSSGSPAAPVSVNRRGRKQSLTDDPSKTFVCSLCSRRFRRQEHLKRHYRSLHTQDKPFECHECGKKFSRSDNLAQHARTHGGGSIVMGVIDTNGSNTQPAFDEPEPRALGLALYEAANAATSKSTTSESSDGTISDTSSVGGRPAKKRRRDDHV

里氏木霉Seb1蛋白的预计氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:5所示：

MDGMMSQPMGQQAFYFYNHEHKMSPRQVIFAQQMAAYQMMPSLPPTPMYSRPNSSCSQPPTLYSNGPSVMTPTSTPPLSSRKPMLVDTEFGDNPYFPSTPPLSASGSTVGSPKACDMLQTPMNPMFSGLEGIAIKDSIDATESLVLDWASIASPPLSPVYLQSQTSSGKVPSLTSSPSDMLSTTASCPSLSPSPTPYARSVTSEHDVDFCDPRNLTVSVGSNPTLAPEFTLLADDIKGEPLPTAAQPSFDFNPALPSGLPTFEDFSDLESEADFSSLVNLGEINPVDISRPRACTGSSVVSLGHGSFIGDEDLSFDDEAFHFPSLPSPTSSVDFCDVHQDKRQKKDRKEAKPVMNSAAGGSQSGNEQAGATEAASAASDSNASSASDEPSSSMPAPTNRRGRKQSLTEDPSKTFVCDLCNRRFRRQEHLKRHYRSLHTQEKPFECNECGKKFSRSDNLAQHARTHSGGAIVMNLIEESSEVPAYDGSMMAGPVGDDYSTYGKVLFQIASEIPGSASELSSEEGEQGKKKRKRSD

在本发明组合物和方法的一些实施例中，产量改变的Seb1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列具有特定程度的总体氨基酸序列同一性，如，与SEQID NO:1、2、3、4或5具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。编码每种氨基酸序列的核苷酸序列可以由本领域技术人员已知的针对每种对应蛋白质的BLAST搜索进行识别。

在本发明组合物和方法的一些实施例中，被破坏的seb1基因编码与SEQ ID NO:1、2、3、4或5的氨基酸序列具有特定程度的总体氨基酸序列同一性的Seb1蛋白，如，与SEQ IDNO:1、2、3、4或5具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。

本文提供的氨基酸序列信息使技术人员易于辨识任何丝状真菌中的Seb1蛋白和编码Seb1蛋白的核酸序列，并在seb1基因中进行适当的破坏以影响Seb1蛋白的产量。编码SEQ ID NO:1、2、3、4的多核苷酸序列可存在于本领域的技术人员已知的GenBank或JGI数据库中。

在另一方面，提供了一种改变丝状真菌细胞形态的方法。变异丝状真菌细胞在固体培养基上表现出生长形态改变，并且在深层培养物中生长时与亲本细胞生长和细胞培养液的粘度相比产生具有不同粘度的细胞培养液。

在一些情况下，该方法包括使用合适的遗传方法破坏亲本菌株的seb1基因，其中被破坏的seb1变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生细胞培养液，与亲本菌株细胞相比，所述细胞培养液需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，或在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。可以采用上文以及本领域的技术人员已知的其他地方所述的任何方式，使用此类方法来破坏seb1基因。优选地，使用序列特异性分子生物学技术，通过遗传操作进行seb1基因的破坏，这不同于化学诱变，后者通常不能靶向特定核酸序列。然而，可以使用化学诱变获得令人满意的结果。

在一些实施例中，向亲本菌株中引入粘度降低表型所形成的粘度降低菌株已经包含旨在高水平表达的目的基因。这样，本发明的方法不必再将目的基因引入到预先存在的粘度降低菌株中用来生产。因此，本发明的方法可用于从已含目的基因的亲本菌株生产丝状真菌细胞的粘度降低变异菌株。

IV.改变Sfb3产量所产生的累加效应

在本发明组合物和方法的一些实施例中，影响Seb1产量或Mpg1和Seb1产量的遗传变异与影响Sfb3产量的遗传变异结合。Sfb3基因（也称为Lst1）此前在出芽酵母（即，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)）中进行表征，其中它编码的蛋白质与围绕将蛋白从内质网转运到高尔基体的运输小泡的COPII衣壳蛋白相关。Sfb3和Sfb2是Sec24的同源物，其所有基因参与将特定货物蛋白包装到小泡内。

虽然Sec24是酵母的必需基因，但Sfb3和Sfb2却并不是，尽管已知酵母中Sfb3的缺失会影响质膜转运蛋白(Pma1p)及参与细胞壁合成的葡聚糖转移酶(Gas1p)的转运。

使用酿酒酵母Sec24p、Sfb3p或Sfb2p氨基酸序列作为查询序列，通过BLAST搜索里氏木霉的已公布基因组序列，发现里氏木霉具有与酵母Sec24同源性最接近的单个基因以及与酵母Sfb3同源性最接近的单个基因。没有鉴别出其他同源物，表明里氏木霉不具有等同于Sfb2的基因。此外，Sfb3蛋白的同源物存在于如里氏木霉(SEQ ID NO:6)、米曲霉(SEQID NO:7)、黑曲霉(SEQ ID NO:8)、绳状青霉(SEQ ID NO:9)、产黄青霉(SEQ ID NO:10)、粗糙脉孢菌(SEQ ID NO:11)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)(SEQ ID NO:12)中：

里氏木霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:6)：

MDYTQYHALGHGEVLDPNDPNKTSAPAAPQFQPPSSPYVPPGSPYGAPPYHGGHQAPPMAMPPPSTPGYGPPQGQSFPGSPMPSQDAGLAAQFGGMSLGADAGGAAARKKKKDRHAYHSVEPTGSSQAFNGLPPGTPAEQFLNVNNPQGIPALGGQFGSPLASPMGTPHMANPGQFPAPTSPFTPSAPVSPAEFASRFGSPDAATSIGSAGPSQVSPDDMPSIPASRDAIQEHFFKNVYPTFERHVPPPATVSFVAFDQGNASPKFTRLTLNNIPTTAEGLHATGLPLGMLIQPLAPLQAGEAEIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMMFRSGGNKFVCNLCSYPNETPPEYFCAVSPQGVRLDRDQRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFVIDVTQESYNKGFMETFCEGILAALYGGNDEENDEDGEPKRRIPKGAKVGFITYDKDIHFYNINPHLDQAHMMIMPDLEDPFLPLGEGLFVDPYESKAIITSLLTRLPEMFSTIKNPEPALLATLNAAVAALEATGGKVVCSCSTLPTWGPGRLFMRDDGNHPGGELDKKLYTTEHPAWKKVSEKMASSGIGVDFFLAAPSGGYLDIATIGHVAATTGGETFYYPNFIAPRDGARLSMEITHAITRETGFQALMKVRCSTGLQVAAYHGNFVQHTFGADLEIGVIDADKALGVSFSHDGKLDPKLDAHFQTALLYTTASGQRRVRCSNVIASVSDTSKESNTKELAIRQCLKFVDQDAVVGIFAKEASTKLATTSANLQDVRNWLTERTIDIMAYYKKHSANQFPPSQLVMPERLKEFCMYMLGMLKCRAFKGGIENSDRRVHELRMVRSMGPLELSLYLYPRMIALHNLQPEEGFADPETGHLKMPPSVRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHAQTSPNLITDLFGEGHDSLKGLDPYTSTLPVLETHLSAQVRNIIEFLKSMRGSKGMTIQLARQGIDGAEYEFARMLVEDRNNEAKSYVDWLVHIHRGVQLELSGQRKKEGDGEATAVMANFAGLRPAYW

米曲霉RIB40Sfb3氨基酸序列(GI:83766074;SEQ ID NO:7)：

MADQSMYNTLGQGTSPAEDPSNPNRMAHQVPPQSQPAAGFPPGPYPPQPGAYYGNPPPNQYDAPAAAPPTQQLQSPPPRGLAPSPQLAYGTETQTHMGAPADPMAGLASQMSGLGIMGDSGARPGKKKHRHAHHEIGGATASAPQQFAGMPQAGMQPSSQFLNTGLNQAPRPISPAAGVPPAGIVPQPGVPAPGSGSVPTQGKIDPEQIPSIPQSRDIPTMYYFDHIYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKHARLTLNNIPTTSDFLSSTALPLGMVLQPLARLDPGEPEVPVLDFGEMGPPRCRRCRAYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVAPEYFAPLDMSGARVDRLQRPELMIGTVEFMVPKEYWNKEPVGLQRLFLIDVSQESVNRGFLKGVCKGITEALYGAPDASEEDAAARRVPEGSKIGIVTYDREVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDIITSLLHRIPKIFSHIKKPEPALLPALNAAMSALQATGGKIFASICSLPTWGPGALHMRDDPKVHGTDAERKLFTTDNQAWRTTAGKMAEHGIGVDMFVAAPGGTYVDVATIGHVAEVSGGETFFYPNFHAPRDILKLSQEFAHAVTRETGYQAMMKVRCSNGLQVSAYHGNFIQHALGADLEIGSIDADKAIGVMFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTTAEGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFIDQDCVVSIMAKEAAAKTVDKSLKDIRASITEKTVDIFSGYRKVFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLALIKSRAFKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGATELALYLYPRVIPIHNMQPEDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQICLLWLHSRVSPNLLEDLLGPGQSSLQGLNPQTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYFSTMRGSKSVAIQLARQGLDGAEYEFARLLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTSAEGSLTSLAGLRAPYW

黑曲霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:8)

MADPNMYHTYGQAPVPGENPSDPNQMAYQVPPQGYPAAGIPPGPSPPQPGAAYGVPAPNQQWPAYGSPPPAQQPLQQPPSQFAHQADPQAAMGAPVDPGMAGLASQMSGLGIMGGEGGAARSSKKKHRHAHHEIAGASASVAQPFAAAPQDPMQPTSQFLNTGLNQAPRPISPAASIPAPVNPAFGGGAGAVPTQGKVDPEQIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKYARLTLNNIPSTSDFLSSTGLPLGMVLQPLARLDGEQPIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMSFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPLDPSGSRIDRMQRPELMMGTVEFLVPKDYWNKEPVGLQWLLLIDVSQESVNKGFLKGVCKGIMEALYSEETENPEDEAPARRIPEGAKIGIVTYDKEVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLQRIPSIFSHVKNPQPALLPALNAALSALRPTGGKIVGTIASLPTWGPGALSLRDDPKVHGTDAERKLFTTEHAGWRETAGHLAEAGIGLDMFIAAPSGTYMDVATIGHIPEVTGGETFFYPNFHAPRDIRKLSKELAHAITRETGYQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFVQHTFGADLEIGAIDADKAIGVVFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSANGQRRVRCINTVAAVNEGGMETMKFVDQDAVVAMVAKDAASKTLDKSLKDIRAGVSEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLIKSRAIKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGCTELSLYLYPRIIPIHNMQPTDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQQCLLWLHSHVSPNLLEDLFGEGQTSLQGLSPQISTIPVLETHLNAQVRNLLQYFSTIRGSKAVTIQLARQGLDGAEYEFARMLVEDRNNEAQSSVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTAGEGGLTSLAGLRAPYW

绳状青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:9)

MADYSTYHSSGYAGAPGEDPNRQQPAVPAPYHSPNAPPGQAIQQPGITPYGAAQPPQFPGQPGVGYGVAPVPSPPQALGGPDVGDLATRIGGLGIISDAGTRSHKKKHRHAYHDIGGPNAQGLNTFPSQTNLQSQFLNTGLNQPEQQPAAPAAFPGAPVGQVPANVAPGAAPEVGGVGSVPTQGKIDPEQIPSVPRSRDLPAQYYFNNVYPTMERHVPPPASIPFIAHDQGNSSPKVARLTLNNIPSSSDFLQSTGLPLGMILQPLAKLDAGEQPVPVIDFGDIGPPRCRRCRTYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPVDPSGVRVDRLQRPELMLGTVEFTVPKEYWVKEPAGLHQLFLIDVSQESVNRGFLKGVCDGIINALYGEEEPVEGAEPETRKVPEGSKIGIVTFDREIHFYNLLPRLDKAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLEQLPSLFARVKSPESTLLPTIKAAISALQATGGKIICCLTSLPTYGPGKLVMKDKSQAPDGENKLFAIDNPDYKAAATKLTEAGVGIDFFVAAPGGSFMDLTTIGYTAAISGGECFFYPNFHSPRDSLKLAQEISHTVTRETGYQALMKVRCSNGLQVSAYYGNFLQHTFGADLEIGTIDADKALGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTAANGQRRVRCINIVAGVNEGGIETMKCIDQDAVVAIIAKEAASKAGDKTLKDIRASITEKTVDIFSGYRKNFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLGLLKSRAFKGGSETADRRVHDLRMLRSIGCLELSLYLYPRIIPIHNMSAEDGFANEQGQLQVPPALRASFSRVEEGGAYLIDNGQGILLWIHSFVSPNLLEDLFGPGITSLQALDPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKAVTIQLARQGIDGAEYEFARSLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEDSATSSGEGALSSLAGIRAPYW

产黄青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:10)

MADSSMYNTMGQGSSEDPSNPQYMAQVPPQQYPAGYPPTAAPLQPGAPYANPAPNQWPAYGSPQQPGMASPGIAYNAPQQPMGAAVDPGMAGLASQMGGLDIAADAGARTHRKKHRHAHHDIGGGAAPPAQGFNTGMDQGGLQQPQPQQQSQFLNTGLNQHADRPVSPAVGLVSGQSVAAIPGIQSGAGSVPTSGRIDPEHIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMDQHLPPPAAIPFVAQDQGNSSPKYARLTLNNIPSASDFLTSTGLPLGMILQPLAPLDPGEQPIPVLDFGDVGPPRCRRCRTYINPFMSFRSGGSKFVCNMCTFPNDTPPEYFAPLDPSGARVDRMQRPELLMGTVEFTVPKEYWNKEPVGLQTLFLIDVSRESVHRGFLKGVCAGIKDALYGDDDKASEGTEGDGSSRKLPVGAKVGIVTYDKEVHFYNLAAALDQAQMMVMTDLDEPFVPLSEGLFVDPYESKSVITSLLSRIPKIFSSIKNPESALLPTLNSALSALQATGGKIVCAVASLPTCGPGHLAIREDPKVHGTDAERKLFTTENPAWKKTASKLAEAGVGLDLFMAAPGGTYLDVATIGHVSSLTGGETFFYPNFHAPRDLLKLRKEIAHAVTRETGYQTLMKVRCSNGLQVSAYHGNFVQHTLGADLEIAGVDADKAVGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSADGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFVDQDAVVSVIAKEAASKTLDKNLKDIRASISEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLVKSRAFKAGPESSDRRIHDMRLIRSMGCTEMALYLYPRIIPVHNMQPEDGFANEHGQLQIPPTMRASYSRIEDGGVYIVDNGQAILLWIHAQVSPNLLEDLFGPGHNSLQGLNPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKSVTIQLARQGLDGAEYEFARLLLEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEEGGEGALASLSAMRTPYW

粗糙脉孢菌Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:11)

MADYTMYHALGQGETLDPNDPNRTTQPAPPQFQPPVAPNPYHPGAEYNAPGQQQQQQQQYGQQYGQQYGQQYGQQQYGQEYGHQQQQQQQQQYGAPSPYGAPPAHSPVSPMDDVGLAAQMGGMSLGAGAGAADHHGRKKKKDRHAFHTVEAPAGSSQPFNGMPPAGIPATQFLNADPSLAGRIPGPGHGQFPMPASPAFGPVPTSAADFAARDATQGVGSGVFAAGGPQGGKPSPDDTPSVPLSRDAVQPYFHTNVYPTFERLVPPPAVTSFVALDQGNSSPKFARLTMTNLPASAEGLKSTGLPLGLLLQPLAETQPGELPIPVLDFGEQGPPRCHRCRAYMNPFMMFKAGGNKFVCNLCTYANDTPPEYFCALSPQGVRVDRDQRPELTRGTVEFVVPKEYWTKEPVGMRYLFVIDVTQESYNKGFLESFCEGILSALYGGSEEGEDQDETGEPKRKIPAGAKVGFVTFDQEIHFYNVSPALEQAQMIVMPDIEDPFLPLSDGLFVDPYESKAVISSLLTRLPQMFSNIKNPEPALLSALNSAVAALEKTGGKVFCSLAALPTWGPGRLFMRDDGKHPGGEPDKKLFTTEHPGWRKLAEKMVSLGVGADFFMASPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFFYPNFVVQRDSTKLSLEIHHAVRRETGYAALMKVRCSNGLQVNAYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKALAVTFGYDGKLDSKLDAHFQAALLYTTASGQRRVRCINVIAGVSDLARDCMKYIDQDAIVSILAKEASTKLSTTSANLKEVRSSLTEKTIDILALYRKNHLAVPHPPQQLVMPERLKEFTMYVLGMLKCRAFKGGNETTDRRVHDMRLIRSMGARELSLYLYPRIIPLHSLQPEDGYPDATTGHLRMPSTMRASFARVEPGGVYLVDNGQVCLLWMHAQTAPALIQDLFGEDKTTLQSLDPYTSTIPVLETHLNAQTRNIIEYMRTVRGSKGLTIQLARQGIDGAEFEFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHVHKGVQLELAGQRKREDGESHSALGSFTGLRPAYW

尖孢镰刀菌Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO:12)

MADYAQYHALGQGEVIDPNDPNRTSQPSAQQFQPPIAPSPYQQQASPYGAPQYLGGQQAPPPMTGSPAPAPGYGYAPPQAQAPPGQAPPSQDATLAAQLGGMNLGDGHGTARRKKKDRHAYHTVEPTGSSQAFNGMPPQGTSATQFLDSVPGGPGFGGQFGSPQGTPQMQSQSQFSAPVNPAFGPGPVAGTPGVGEGLGTASVSTSGPKGVSPDDMPSVPASRDAIQQYYLKNVYPTFERHVPPPSTVSFVAYDQGNSSPKYTRLTLNNIPTTQDALQATGLSLGLLLQPLAPLQAGEAEIPVLDFGEAGPPRCRRCRAYMNPFMMFRSGGNKFVCNLCAYPNDTPPEYFSATNPQGVRVDRDTRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFLIDVTQESYNKGYVEAFCEGIRVALYGGEDQELDENGEPKRRIPEGAKVGFVTYDKDIHFYNVNPALDQAQMMIMPDLEDPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLTRLPDMFSTIKNPEPALLAALNSALAALEATGGKVVASCSALPTWGPGRLFMRDNGNHPGGEIDKKLYTTEHPAWKKVAEKMAASGVGADFFLAAPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFYYPNFIAARDSRKLSLEISHAVTRETGFQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKAMGVSFSYDGKLDPKLDAHFQSALLYTTASGERRVRCSNVIASVTETSKESGAREQGIRECLKFVDQDAVIGMLAKEASTKLATTSSNLKDIRHWLSEKAIDVLACYRKHAAQQHPPGQLVMPERLKEYCMYLLGLLKCRALKGGVENSDRRVHEMRMLRSMGALELSLYLYPRMIPIHNLAPEEGFADPETGHLKMPPAIRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHSQTSPNLISDLFGEDKDSLKSLDPYTSALPLLETHLNAQVRNIIEFLRTMRGSKGLTIQLARQGIDGAEFDFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHKGVQLELSGQRKKEGEEHTAASLSNFAGLRPAYW

在本发明组合物和方法的一些实施例中，产量改变的Sfb3蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11或12的氨基酸序列具有特定程度的总体氨基酸序列同一性，如，与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11或12具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。编码每种氨基酸序列的核苷酸序列可以由本领域技术人员已知的针对每种对应蛋白质的BLAST搜索进行识别。

在本发明组合物和方法的一些实施例中，sfb3基因被破坏，其中sfb3基因编码Sfb3蛋白，该蛋白与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11或12的氨基酸序列具有特定程度的总体氨基酸序列同一性，如，与SEQ ID NO:6、7、8、9、10、11或12具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。

来自大约40个盘菌亚门物种的Sfb3蛋白的氨基酸序列比对显示了一段特定氨基酸序列，即IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL（SEQ ID NO:13，其中X为任何氨基酸残基），其靠近Sfb3蛋白的C端，但不存在于Sec24蛋白中。这段共有序列可用来鉴定盘菌亚门其他成员中的Sfb3蛋白及其变体。

技术人员将会知道，影响Sfb3产量的遗传变异可以与本文详细叙述的影响Mpg1和/或Seb1产量的遗传变异以同样的方式进行。Sfb3蛋白中导致粘度改变的变异在公开于2012年3月1日的PCT专利公布No.WO2012/027580A1中进行了详细的描述，该专利公布作为国际专利申请No.PCT/US2011/049164提交于2011年8月25日，并以引用的方式并入本文。

V.改变Mpg1产量所产生的累加效应

在本发明组合物和方法的一些实施例中，影响Seb1产量或Seb1和Sfb3产量的遗传变异与影响Mpg1产量的遗传变异结合。如Kruszewska et al.(1998)Cur.Genet.33:445-50（Kruszewska等人，1998年，《当代遗传学》，第33卷，第445-450页）和Zakrzewska et al.(2003)Applied and Enviromnetal Microbiology69:4383-89（Zakrzewska等人，2003年，《应用与环境微生物学》，第69卷，第4383-4389页）所述，源自里氏木霉的Mpg1(PID122551)编码GTP:α-D-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶。mpg1基因的过表达增加了GDP-甘露糖的含量，其能够在蛋白质糖基化的早期起到重要的调节作用。然而，Mpg1迄今尚未与形态改变相关，特别是未与导致低粘度表型的形态改变相关。

里氏木霉Mpg1蛋白(PID122551)的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:36所示：

MKGLILVGGFGTRLRPLTLTLPKPLVEFCNKPMIVHQIEALVAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKFLAEYEEKYNINIEFSVESEPLDTAGPLKLAERILGKDDSPFFVLNSDVICDYPFKELLEFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVEFVGNRINAGMYIFNPSVLKRIELRPTSIEKETFPAMVADNQLHSFDLEGFWMDVGQPKDFLSGTCLYLSSLTKKGSKELTPPTEPYVHGGNVMIHPSAKIGKNCRIGPNVTIGPDVVVGDGVRLQRCVLLKGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGRWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSVLPHKSIKANVDVPAIIM

粗糙脉孢菌Mpg1蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:37所示：

MKALILVGGFGTRLRPLTLTMPKPLVEFGNKRMILHQIEALAAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKYLAEYEKQFGINITISIESEPLGTAGPLKLAEDVLRKDDTPFFVLNSDVTCEYPFKELAAFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVQFVGNRINAGLYIFNPSVIDRVELRPTSIEQETFPAMVRDGQLHSFDLEGFWMDIGQPKDFLTGTCLYLSSLTKKGSKELAPTTLPYIHGGNVLIDPSAKIGKNCRIGPNVTIGPNVVVGDGVRLQRCVLLEGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGKWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSILPHKTIKANVDVPAIIM

米曲霉甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶蛋白的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:38所示：

MKGVGGGTRRTTKVCNKMVHAVAAGVTDVAVNYRMKAYKMKAVGGGTRRTTKVGNRMHVSAAAGVTDVAVNYRDVMVSAKKYYNNSVSDTAGKARGKDDSVNSDVCDYKHKAHGDGTVVTKVYNVKSVSGTAGKAKGKDDSVNSDVCDYKAHKKHGDGTVVTKVDSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGMYNSVKRRTSKTAMVADNHSSKYGVVVHKNHSRDRVKVVGNRNAGYMNSVNRRTSTACKDGHSDGWMDVGKDSGTCYSSTKKGSKTTYVHGGNVMHSAKGKNCRGNVTGDGWMDVGKDSGTCYTSAKRNSKANSYVYGGNVMVDSAKGKNCRGNVVGDVVVGDGVRRCVKGSKVKDHAWVKSTVGWNSTVGRWARNVTVGDDVTGDYVNGGSVHNVVVGDGVRRCVNSKVKDHAWVKSTVGWNSSVGRWARNVTVGDDVTADVYVNGGSHKSKANVDVAMKSKNVDVAM

在本发明组合物和方法的一些实施例中，产量改变的Mpg1蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:36、37或38中至少一者的氨基酸序列具有特定程度的总体氨基酸序列同一性，如，与SEQ ID NO:36、37或38具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。编码每种氨基酸序列的核苷酸序列可以由本领域技术人员已知的针对每种对应蛋白质的BLAST搜索进行识别。

在本发明组合物和方法的一些实施例中，被破坏的mpg1基因编码与SEQ ID NO:36、37或38中至少一者的氨基酸序列具有特定程度的总体氨基酸序列同一性的Mpg1蛋白，如，与SEQ ID NO:36、37或38中的至少一者具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、或甚至至少约99%的同一性。

本文提供的氨基酸序列信息使技术人员易于识别任何丝状真菌中的Mpg1蛋白和编码Mpg1蛋白的核酸序列，并在mpg1基因中进行适当的破坏以影响Mpg1蛋白的产量。编码SEQ ID NO:36、37或38的多核苷酸序列可存在于本领域的技术人员已知的GenBank或JGI数据库中。

技术人员将会知道，影响Mpg1产量的遗传变异可以与本文详细叙述的影响Seb1和/或Sfb3产量的遗传变异以同样的方式进行。Mpg1蛋白中导致粘度改变的变异在2011年4月22日提交的临时专利申请No.61,478,162中进行了详细的描述，其以引用的方式并入本文。

VI.实用性

众所周知，使用丝状真菌粘度降低菌株能够提高深层培养物中氧气和营养物质的分布，降低搅拌深层培养物所需的能量大小，并增加培养物中存在的细胞群，从而提高蛋白质产量。此外，本发明的丝状真菌变异菌株明显优于前述粘度降低菌株。

首先，本发明的变异菌株可能具有清晰界定的基因组，从而非常适合后续遗传操作、互补、配对等等。其次，本发明的菌株不会例如通过导致粘度伴随改变的操作而在产生蛋白的过程中受到不利影响。第三，粘度降低菌株可产自基本上任何亲本菌株，包括这样的亲本菌株：已产生旨在高水平表达的蛋白（即，目的蛋白）、已编码选择性标记或已包括其他在生产宿主中期望的特征。因此，本发明的菌株和方法消除了将编码目的蛋白的基因转移到预先存在的粘度降低生产菌株中的需要。

本发明的菌株和方法可用于经丝状真菌深层培养来生产具有商业价值的蛋白质。具有商业价值的蛋白质包括（例如）纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、裂解酶、蛋白酶、激酶、淀粉酶、支链淀粉酶、脂肪酶、酯酶、过水解酶、转移酶、漆酶、过氧化氢酶、氧化酶、还原酶、叶绿素酶、疏水蛋白、凝乳酶、碳酸酐酶、胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、酪氨酸激酶、多种药物抗性蛋白（如，ABC P-gp蛋白）、CAD（氨基甲酰-P合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢乳清酸酶）、拓扑异构酶、核糖核苷酸还原酶和抗体以及其他酶，以及能够在丝状真菌中表达的非酶蛋白。这类蛋白能够适用于工业、医药、动物保健以及食品和饮料应用。

下列编号段落还描述了本发明组合物和方法的多个方面和实施例。如所指出的那样，各个编号段落的主题可以单独地使用或与任何其他编号段落的主题一起使用。

1.在一个方面，提供了衍生自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含能够使变异菌株的细胞与亲本菌株的细胞相比产生改变量的功能性Seb1蛋白的遗传变异，其中变异菌株的细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

2.在段落1的变异菌株的一些实施例中，功能性Seb1蛋白的改变量为减少量，并且变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

3.在段落1或2的变异菌株的一些实施例中，遗传变异包括破坏亲本菌株中存在的seb1基因。

4.在段落3的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏是缺失全部或部分seb1基因的结果。

5.在段落3的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏是缺失包含seb1基因的基因组DNA的部分的结果。

6.在段落3的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏是seb1基因诱变的结果。

7.在段落3-6中任一者的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏使用位点特异性重组进行。

8.在段落3-7中任一者的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏与在seb1基因的基因座引入选择性标记组合进行。

9.在段落1-8中任一者的变异菌株的一些实施例中，变异菌株不产生功能性Seb1蛋白。

10.在段落1-8中任一者的变异菌株的一些实施例中，变异菌株不产生Seb1蛋白。

11.在段落1-10中任一者的变异菌株的一些实施例中，变异菌株还包含编码目的蛋白的基因。

12.在段落1-11中任一者的变异菌株的一些实施例中，还包含sfb3基因的破坏。

13.在段落1-12中任一者的变异菌株的一些实施例中，变异菌株还包含至少一种选自sfb3基因、mpg1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因的破坏。

14.在段落1-13中任一者的变异菌株的一些实施例中，变异菌株每单位量生物质产生与亲本菌株基本等量或更多的蛋白。

15.在段落1-14中任一者的变异菌株的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

16.在段落1-15中任一者的变异菌株的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

17.在段落1-16中任一者的变异菌株的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

18.在另一方面，提供了产生丝状真菌细胞的变异菌株的方法，该方法包括：将遗传变异引入丝状真菌细胞的亲本菌株，其中与亲本菌株的细胞相比，该遗传变异改变了功能性Seb1蛋白的产量，从而产生可以在深层培养有氧发酵过程中产生细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

19.在段落18的方法的一些实施例中，遗传变异减少或抑制功能性Seb1蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

20.在段落18或19的方法的一些实施例中，遗传变异包括在亲本丝状真菌细胞中采用遗传操作来破坏seb1基因。

21.在段落18-20任一段的方法的一些实施例中，遗传变异包括使用遗传操作来缺失亲本丝状真菌细胞中的seb1基因。

22.在段落18-21任一段的方法的一些实施例中，遗传变异使用位点特异性基因重组进行。

23.在段落18-22任一段的方法的一些实施例中，seb1基因的破坏与在seb1基因的基因座引入选择性标记组合进行。

24.在段落18-23任一段的方法的一些实施例中，seb1基因的破坏与sfb3基因的破坏组合进行。

25.在段落18-24任一段的方法的一些实施例中，seb1基因的破坏与至少一种选自sfb3基因、mpg1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因的破坏组合进行。

26.在段落18-25任一段的方法的一些实施例中，变异菌株每单位量生物质产生与亲本菌株基本等量或更多的蛋白。

27.在段落18-26任一段的方法的一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门物种。

28.在段落18-27任一段的方法的一些实施例中，丝状真菌为木霉属物种。

29.在段落18-28任一段的方法的一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。

30.在段落18-29任一段的方法的一些实施例中，亲本菌株还包含编码目的蛋白的基因。

31.在段落30的方法的一些实施例中，其中在引入会减少或抑制功能性Seb1蛋白的产生的遗传变异之前，编码目的蛋白的基因存在于亲本菌株中。

32.在另一方面，提供了由段落11的变异菌株产生的目的蛋白。

33.在另一方面，提供了通过段落18-31中任一段的方法产生的丝状真菌变异菌株。

34.在另一方面，提供了衍生自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含：

(a)遗传变异，所述遗传变异使得(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持深层培养物中增加的溶氧量，和

(b)编码目的蛋白的基因，其中编码目的蛋白的基因在(a)中所述遗传变异之前存在于变异菌株中。

35.在段落34的变异菌株的一些实施例中，遗传变异包括破坏亲本菌株中存在的seb1基因。

36.在段落35的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏与在seb1基因的基因座引入选择性标记组合进行。

37.在段落35或36的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏与至少一种选自sfb3基因、mpg1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的基因的破坏组合进行。

38.在段落35-37任一段的变异菌株的一些实施例中，seb1基因的破坏与mpg1基因的破坏组合进行。

根据本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施例对于技术人员将显而易见。以下实例旨在进一步说明（但不限于）所述菌株和方法。

实例

实例1：识别作为丝状真菌形态改变的原因的seb1基因

A.综述

采用根瘤农杆菌介导的转化方法，通过转化示例性的具有含pyr4基因的核酸的丝状真菌（即里氏木霉）而制备丝状真菌破坏库。这样，pyr4基因不仅充当选择性标记还充当基因标签。所用的具体根瘤农杆菌菌株为EHA105，其被认为是高毒性的（Hood等人，1993年）。然而，其他根瘤农杆菌菌株（如，A136和EHA101）在里氏木霉中产生类似的转化频率。也可以使用发根土壤杆菌(A.rhizogenes)菌株，如ATCC43057。具体的破坏库包含约50,000种转化株。

B.制备DNA

根据PZP100载体选择用于破坏的载体，其包括左侧和右侧的T-DNA边界区、用于从大肠杆菌(E.coli)转移至农杆菌(Agrobacterium)的pBR322bom位点、分别用于在大肠杆菌和农杆菌中复制的ColE1和pVS1质粒起点以及赋予氯四环素抗性的细菌标记（Hajdukiewiez,O.等人，1994年）。代表性的载体在图1B中示出，同时T-DNA破坏盒的示意图在图1A中示出。

通过标准分子生物学技术制备包含pyr4基因的表达盒，并在BamHI位点处将其结合到PZP载体中。所得载体在大肠杆菌XL-Gold细胞（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)）中增殖。使用具有25ppm氯四环素的LA琼脂平板（10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，10g/L琼脂）来选择大肠杆菌转化株。约1-10%的大肠杆菌转化株具有所需的载体。包含载体的大肠杆菌在LB培养基（10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠）加25ppm氯四环素中生长。使用标准方法分离载体DNA。

C.农杆菌细胞的转化

感受态农杆菌细胞的制备如下所示。简而言之，农杆菌细胞通过在28℃的LA培养基中生长约3天而从超低温保存中恢复。然后选择菌落并在28℃的250ml凹底烧瓶中于体积为50ml的包含0.1%葡萄糖的LB培养基中生长直至生长明显。或者，菌落开始在5ml培养管中生长并当生长明显时被转移至250ml烧瓶。然后将250ml烧瓶的体积的约10%转移至具有相同培养基的新鲜烧瓶中，使其生长至OD（600nm；OD₆₀₀）为约0.4-0.8（生长约5-6小时）。通过在冷的离心机中以10,000rpm离心10分钟而使细胞恢复，然后将细胞置于冷的pH为7.0的1MHEPES中洗涤三次。接下来，将细胞置于冷的含有10%甘油的1mM HEPES中洗涤一次，并将等分试样在-70℃冷冻。测定细胞活力（通常在冷冻后为约1×10⁹CFU/ml）。

使用载体DNA通过电穿孔转化农杆菌细胞。将感受态农杆菌细胞置于冰上解冻，然后将约40μl细胞与0.2cm电穿孔细胞（在冰上）中的约1μg DNA混合。使用Buchler3-150电穿孔仪以2.5伏特（200Ohms，以25μF）将细胞电穿孔。电穿孔后立即将SOC培养基（英杰公司(Invitrogen)）添加到电穿孔细胞中。或者，可以使用连接混合物通过电穿孔转化农杆菌细胞，从而不再需要在大肠杆菌中增殖载体DNA。在可供选择的方法中，将约1μl的连接混合物用于转化。在将SOC添加到电穿孔混合物中后，将混合物的稀释物涂布到LA培养基加250ppm氯四环素的培养平板上并在28℃下温育四天。获得1×10⁷CFU/ml农杆菌转化株，并且约90-100%的转化株包含载体DNA，如通过PCR分析所确定。可以使用少至25ppm氯四环素以在较短的时间范围内获得菌落，但是必须筛选大量的菌落以识别真正的转化株。

D.农杆菌属介导的里氏木霉转化

用载体转化的农杆菌的冻存储液或直接来自新鲜LA平板的载体转化的农杆菌接种250ml烧瓶中的25ml基本培养基（2.05g/L K₂HPO₄、1.45g/L KH₂PO₄、0.15g/L NaCl、0.5g/L MgSO₄·7·H₂O、0.1g/L CaCl₂·6·H₂O、0.0025g/L FeSO₄·7·H₂O、0.5g/L(NH₄)₂SO₄和2g/L葡萄糖，消毒后加入25ppm氯四环素）。然后将该基本培养基的培养物在28℃下伴随振摇温育直至浑浊（过夜至数天）。将10ml培养物转移至250ml烧瓶中的50ml诱导培养基（2.05g/L K₂HPO₄、1.45g/L KH₂PO₄、0.15g/L NaCl、0.5g/L MgSO₄·7·H₂O、0.1g/L CaCl₂·6·H₂O、0.0025g/L FeSO₄·7·H₂O、0.5g/L(NH₄)₂SO₄、1.8g/L葡萄糖、5g/L甘油，在pH为5.3的40mM MES中制备，消毒后加入200μL1M乙酰丁香酮）中。起始OD₆₀₀为约0.1，并且载体转化的农杆菌细胞生长至OD₆₀₀为约0.4–0.8。

通过将孢子重悬在10ml的无菌水中而制备里氏木霉T4Δpyr4细胞（衍生自QM6ANRRL3652的全纤维素酶突变菌株，美国马里兰州贝茨维尔的美国农业研究所(Agricultural Research Service,Beltsville,MD,USA)）的新鲜培养物。里氏木霉T4Δpyr4细胞的转化按如下步骤进行：将约100μl农杆菌完全培养液(OD₆₀₀=0.4–0.8)与100μl真菌孢子(10⁷sfu/ml)在管中混合（农杆菌细胞与真菌孢子的其他比率也将产生令人满意的结果）。将约0.1-1.0ml的该混合物涂布到具有嵌入式硝化纤维滤器的诱导琼脂平板上（具有15g/L琼脂和0.25mg/mL尿苷的诱导培养基）。将平板在约18-28℃温育约24-48小时，以允许里氏木霉细胞生长。然后，将硝化纤维滤器转移至Vogel培养基（Vogel,Microbiol.Genet.Bull.13:42-43,1956（Vogel，《微生物学遗传学通报》，第13卷，第42-43页，1956年）），该培养基补充了250ppm羧苄青霉素以杀灭农杆菌/抑制其生长。然后将培养物在28℃温育，直至丝状真菌（代表破坏库的转化株）在滤器上的生长明显为止。

E.筛选形态突变株

使用光学显微镜在破坏库中筛选在固体和液体培养物中改变形态的转化株。转化后，使用菌落挑选仪从硝化纤维滤器中挑选单独的转化株，并将其转移至装有马铃薯葡萄糖琼脂的96-孔微量滴定板（CP-700，美国西弗吉尼亚州费尔里的诺冠系统有限责任公司(Norgren Systems LLC,Fairlea,WV,USA)）中。或者，将来自转化株的孢子合并、使其萌发，然后使用细胞分选器将单独的孢子添加到微量滴定板的孔中。通过使用细胞推刮器将来自Vogel转化平板的孢子悬浮在20ml无菌蒸馏水中而收集孢子。将孢子接种到装有50ml基本培养基的250mL烧瓶中，然后在28℃伴随搅拌而温育24小时直至获得幼殖体。使用高速分选器（MoFlo分选器，美国科罗拉多州柯林斯堡的Cytomation公司(Cytomation,FortCollins,CO,USA)，其采用70μm喷嘴和60psi），以15,000事件每秒的事件率将单独的幼殖体分离到装有马铃薯葡萄糖琼脂（美国密歇根州底特律的Difco公司(Difco,Detroit,MI,USA)）的微量滴定板的孔中。将通过上述任一种方法获得的包含转化株的微量滴定板在28℃温育7天。将单个的萌发孢子重复接种到装有YEG（每1L水中含5g酵母提取物，20g葡萄糖）的384孔黑色玻璃底微孔板SensoPlate中（德国葛莱娜公司(Greiner Bio-one,Germany)），并在20℃温育24小时。通过显微镜检查单个转化株的形态。

F.里氏木霉T4突变株的分离与表征F16

观察到得自上述工序的突变株F16在平板上具有形态改变，随后将其置于液体培养物中。在PDA平板上，突变株F16与T4亲本相比生长受限。在液体培养物中，F16与T4亲本相比，表现出具有较短的菌丝。使菌株T4和F16在相同条件下在深层（液体）培养物中生长，并比较它们的生长表型。简而言之，将每个菌株的孢子单独添加到带有侧面和底面挡板的3L烧瓶内的500ml培养基中。使培养物在摇床培养箱中在34℃下于基本培养基中生长48小时。

48小时后，将每个烧瓶中的内容物单独添加到含有9.5L培养基的14L发酵罐中，所述培养基含有4.7g/L KH₂PO₄、1.0g/L MgSO₄·7·H₂O、4.3g/L(NH₄)₂SO₄和2.5mL/L的相同微量元素溶液。将这些成分在121℃下一起高温灭菌30分钟。单独将含有60%葡萄糖和0.48%CaCl₂·2·H₂O的溶液进行高压灭菌、冷却并添加至发酵罐至最终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/L CaCl₂·2·H₂O。用28%的NH3调节培养基pH至3.5，整个生长过程温度保持在34℃。一旦葡萄糖被耗尽，使温度降低至28℃，并用葡萄糖-槐糖填充培养物。

顶部空间未加压（即表压为0巴，绝对压为1巴）时，溶解氧(DO)探头校准为100%。然后将顶部空间压力设置为0.7巴（表压），之后在添加种菌培养物前氧探头读数为170%。发酵罐含有两个四叶涡轮机，其通过最初设定在500rpm的变速马达进行混合。

随着培养物生长，DO含量水平下降，至少部分原因是由于丝状真菌菌丝增殖导致培养液粘度增加。当葡萄糖被完全消耗时，测量每一个发酵罐中产生的生物量大小，发现两种菌株基本上一样。每个发酵罐中给定搅拌水平下的DO含量水平为衡量不同菌株生长表型导致的不同细胞培养液粘度的间接指标。

seb1基因的核酸序列得自JGI数据库。蛋白质ID：76505，名称：estExt_GeneWisePlus.C_50617，可得自http://genome.jgi-psf.org/cgi-bin/dispGeneModel?db=Trire2&id=76505（美国能源部联合基因组研究所的基因组门户网站(The Genome Portalof the Department of Energy Joint Genome Institute)，I.V.Grigoriev,H.Nordberg,I.Shabalov,A.Aerts,M.Cantor,D.Goodstein,A.Kuo,S.Minovitsky,R.Nikitin,R.A.Ohm,R.Otillar,A.Poliakov,I.Ratnere,R.Riley,T.Smirnova,D.Rokhsar,andI.Dubchak.Nucleic Acids Res20110:gkr947v1-gkr947（I.V.Grigoriev、H.Nordberg、I.Shabalov、A.Aerts、M.Cantor、D.Goodstein、A.Kuo、S.Minovitsky、R.Nikitin、R.A.Ohm、R.Otillar、A.Poliakov、I.Ratnere、R.Riley、T.Smirnova、D.Rokhsar和I.Dubchak，《核酸研究》，2011年，第0卷，第gkr947v1-gkr947页）），如下所公开。非翻译区用斜体表示，编码区用粗体表示，并且内含子用小写字母表示(SEQ ID NO:39)：

GTTCTGCGCAACAAACCACCCTTCGCAAACATCCCCTCCTCTTCCTCCTCCATCACCCTTACCATTACCAAAGACCGCCATCCATTCTTTCACCCGGAGCCGAAGACGACCCTCACCACTCTTTACTCTCTGCCTCTTCTTACAACAACCTGATTGCCTGGGCAATTGTATAATACGGACTACTACTTCTACTATACAACAAACCAATAACGCTTAATATCTAAATCTATACCCTTCGGGACTCGGAAGCCATCGCAAACACACAAAAGAGgtcagacaaagaaccatggcagacaaaacaaaaaggactttcagagagctgacttgtataccttttggctggaacagACAAGCAATGGACGGCATGATGTCTCAACCCATGGGACAGCAGGCGTTCTACTTCTACAACCACGAGCACAAGATGTCCCCTCGACAAGTCATCTTCGCACAACAGATGGCCGCCTACCAGATGATGCCCTCGCTGCCGCCCACGCCCATGTACTCGCGACCAAACTCGTCCTGCTCGCAGCCCCCGACTTTGTACAGCAACGGCCCTTCAGTCATGACTCCCACAAGCACACCCCCTCTGTCCTCGCGCAAGCCCATGCTGGTGGACACGGAGTTTGGCGACAACCCCTACTTCCCCTCCACGCCGCCTCTGTCGGCCTCGGGCAGCACCGTCGGCAGCCCCAAGGCCTGCGACATGCTGCAGACGCCCATGAACCCCATGTTCTCCGGCCTCGAGGGCATTGCCATCAAGGACAGCATCGACGCCACCGAGAGCCTCGTCCTGGACTGGGCCAGCATCGCCTCGCCCCCCCTGTCGCCTGgtaagtcgtcgccttgttttctttaatttccgcagtcgaatgttccttggacccttcctctccgtcaatgccagcctttgtcgcgatgaactggcgccatggtggacatgctgctttagatgaatactggggcgggacagccggctaatccgcttcgggcagTGTATCTCCAGTCCCAGACCAGCTCGGGCAAGGTGCCCTCGCTTACCTCGAGCCCGAGCGACATGCTCTCCACCACAGCTTCGTGCCCTTCGCTGTCTCCCTCGCCAACTCCCTACGCGCGCTCCGTCACGTCGGAGCACGATGTTGACTTCTGCGATCCCCGCAACCTGACCGTCTCTGTTGGCTCCAACCCCACCCTGGCCCCGGAGTTTACCCTGCTGGCCGACGACATCAAGGGCGAGCCGCTGCCCACCGCTGCCCAGCCGTCCTTTGACTTCAACCCTGCGCTGCCCAGCGGCCTGCCGACCTTTGAGGACTTCTCCGATCTCGAGTCGGAAGCCGACTTCAGCAGCCTCGTCAACCTCGGCGAGATCAACCCCGTCGACATCTCCCGCCCCCGCGCCTGCACCGGCTCCTCGGTCGTCTCCCTGGGCCACGGCAGCTTCATTGGCGACGAGGACCTGAGCTTCGACGACGAGGCCTTCCACTTCCCCTCCCTGCCCAGCCCGACCTCGTCCGTCGACTTCTGCGACGTCCACCAGGACAAGAGACAGAAGAAGGACCGCAAGGAGGCCAAGCCCGTCATGAACTCTGCTGCCGGCGGCTCCCAGTCCGGCAACGAGCAGGCTGGCGCCACCGAGGCCGCCTCTGCCGCCTCCGACTCCAATGCCTCCTCTGCCTCTGACGAGCCCTCTTCCTCCATGCCCGCCCCTACCAACCGCCGCGGTCGCAAGCAGTCGCTGACCGAGGATCCCTCAAAGACCTTTGTCTGCGACCTCTGCAACCGCCGCTTCCGTCGCCAGGAGCACCTCAAGCGTCACTACCGCTCCCTGCACACCCAGGAGAAGCCCTTTGAGTGCAACGAGTGCGGCAAGAAGTTCTCTCGCAGCGACAACCTGGCTCAGCACGCCCGCACCCACTCTGGTGGTGCCATTGTCATGAACCTCATCGAGGAGTCCTCCGAGGTGCCCGCCTACGATGGCAGCATGATGGCCGGGCCCGTGGGTGACGACTACAGCACCTATGGCAAGGTCCTGTTCCAGATCGCCTCAGAGATCCCCGGAAGCGCCAGCGAGCTCTCCTCAGAAGAGGGCGAGCAGGGCAAGAAGAAGCGCAAGCGCTCCGATTAAATGACTTCCCCCCATCTCTCTCTCTCATACGCCTGACACGATTTTACACTTTGACACTTCTCGCTTCGCTTCGGCGCAAGCCCTATTTCCACACATACACTTTTTTGCTAGAGGGGGACCACCACCACACTATACAGGGAAAAAGCTCAAGCGGTTATGATTGCATTTCAAAACCTTTCAGTTCTTGTATCGACTTTGCA

如图2中所示，F16突变株中seb1基因的破坏导致菌株在生长过程中较之包含T4亲本的培养物具有较高的溶解氧含量，而生长水平（图3）和蛋白质产量（未示出）不受影响。Southern分析显示，F16菌株仅包含pyr4基因的一个拷贝，这表明发生了单个预期的破坏事件（未示出）。

使用反向PCR通过测定pyr4旁侧区而鉴定F16突变株中T-DNA pyr4基因的插入位点。简而言之，用限制性内切酶PstI和NsiI将来自菌株F16的高分子量基因组DNA完全消化。在对酶进行热灭活之后，将反应物在连接缓冲液中稀释五倍，并加入T4DNA连接酶。在进行过夜连接反应之后，将连接酶热灭活，并且用醋酸铵和乙醇沉淀反应物。将洗涤后的DNA粒料溶解在TE中，并用作使用引物RPG097和RPG098（参见表1）的PCR的模板。然后将该PCR反应稀释并用作使用巢式引物RPG099和RPG100的PCR的模板。清洗所得的PCR产物，然后使用引物RPG116进行测序，从而确定T-DNA插入位点旁侧的核苷酸序列。根据JGI里氏木霉数据库2.0版基因组序列对该序列进行BLASTn分析，鉴定出旁侧序列为支架5上的1203727至1204065区域，且T-DNA的插入位点定位在1203727位。

通过使用与插入位点旁侧的基因组DNA同源的引物和与T-DNA同源的引物的PCR确认插入位点。具体地讲，使用引物RPG099和RPG133确认T-DNA的5'端处（即靠近pyr4启动子）的序列，并且使用引物RPG112和RPG134确认T-DNA的3'端处（即靠近pyr4终止子）的序列。引物RPG133和RPG134在鉴定的位点处扩增完整的T-DNA插入。

突变株F16中的pyr4插入位点位于里氏木霉JGI基因组数据库2.0版中支架5的1203727位处。在该位点处发现的基因与存在于包括烟曲霉和深绿木霉的若干其他真菌中的seb1基因具有同源性。seb1基因编码AGGGG-结合蛋白，该蛋白表现出参与渗透胁迫响应（Peterbauer, C. et al.(2002)Molecular Genetics and Genomics 268:223-31（Peterbauer,C.等人，2002年，《分子遗传学与基因组学》，第268卷，第223-231页））。实际上，发现F16菌株具有与文献中的描述类似的胁迫响应表型。因为在该位点处的插入显示为仅仅是F16菌株中发生的遗传变化，由此断定，seb1基因的破坏是所观察到的形态改变的原因。

表1：实例1中使用的引物。

引物	序列	SEQ ID NO
			RPG097	5'-GCGAGGAGACGGACTCGTACTGCT-3'	14
RPG098	5'-CCGGGAGCACAAGGACTTTGTCAT-3'	15
			RPG099	5'-GCGTCGTCGTCAAACGAGTCCAT-3'	16
RPG100	5'-CCGACGATGCCTTTATCCACATGA-3'	17
			RPG116	5'-CCCGGCATCATAGAATGCA-3'	18
RPG133	5'-GGAGCCAACAGAGACGGTCAGGTT-3'	19
			RPG112	5'-CCACAACGGCACCCTAAGGGTTAA-3'	20
RPG134	5'-GCTAATCCGCTTCGGGCAGTGTAT-3'	21

实例2：从里氏木霉的Morph 1.1 ku80缺失菌株中缺失seb1基因

里氏木霉Morph 1.1（即，“Morph”）突变株缺失四种主要的纤维素酶基因（即，cbhI、cbhII、eglI和eglII），这使得其可用于在不存在纤维素酶背景活性的情况下表达其他蛋白质。使ku80基因从Morph中缺失以增加同源重组，并有助于seb1的序列特异性破坏。将pyr4基因破坏以使得其可以用作转化标记。通过PCR，通过扩增来自由前述F16突变株获得的DNA的被破坏seb1基因以及约500bp 5' seb1旁侧序列和约500bp 3'seb1旁侧序列而制备seb1破坏盒。使用采用该缺失盒的PEG转化Morph1.1 Δku80Δpyr4，从而制备菌株Morph1.1 Δku80Δpyr4Δseb1。同上，该菌株具有与文献（Peterbauer,C.等人，2002年）中所述的深绿木霉seb1缺失菌株类似的渗透胁迫响应。

使菌株Morph1.1Δku80和Morph1.1Δku80Δpyr4Δseb1在相同条件下在深层（液体）培养中生长，并比较它们的生长表型。简而言之，将每个菌株的孢子单独添加到带有侧面和底面挡板的3L烧瓶内的500ml培养基中。使培养物在摇床培养箱中在34℃下于基本葡萄糖培养基中生长48小时。

48小时后，将每个烧瓶中的内容物单独添加到含有9.5L培养基的14L发酵罐中，所述培养基含有4.7g/L KH₂PO₄、1.0g/L MgSO₄·7·H₂O、4.3g/L(NH₄)₂SO₄和2.5mL/L的相同微量元素溶液。将这些成分在121℃下一起热力灭菌30分钟。单独将含有60%葡萄糖和0.48%CaCl₂·2·H₂O的溶液进行高压灭菌、冷却并添加至发酵罐至最终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/L CaCl₂·2·H₂O。用28%的NH₃调节培养基pH至3.5，并且整个生长过程温度保持在34℃。

随着培养物生长，DO水平下降，至少部分原因是由于丝状真菌菌丝增殖导致培养液粘度增加。当DO低于40%时，增加搅拌速率以保持溶解氧浓度为40%。一旦达到750rpm的搅拌速率，DO便可以下降到低于40%。如果DO不低于40%，就不必增加发酵过程的搅拌速率，并且初始搅拌速率高于所需。当葡萄糖被完全消耗时，测量每一个发酵罐中产生的生物量大小，发现两种菌株基本上一样。

每个发酵罐中给定搅拌水平下的DO水平及保持给定DO水平所需的搅拌量是衡量不同菌株生长表型导致的不同培养液粘度的间接指标。尽管最理想的情况是只改变一个变量（即DO或搅拌速率）并测量另一个，但期望防止DO低于40%以确保每个发酵罐产生足够的生物量从而使比较不同菌株的生长更有意义。

通常，当需要增加搅拌速率以保持目标DO水平时，搅拌量可以根据为驱动发酵罐涡轮机的马达供给的功率大小来估计，它提供了一个与培养液粘度相关的度量标准。具体地讲，搅拌悬浮培养物所需的额外功率与搅拌速率的三次幂成比例。

如图2中所示，从菌株Morph1/1 Δku80中缺失seb1基因导致菌株的培养液粘度降低。在批量生长阶段结束时，当所有葡萄糖被耗尽时，两种菌株达到类似的生物质浓度。为达到这个目标，观察到对照菌株的搅拌速率增至最高750rpm，然后观察到DO下降至低至29%。所述seb1缺失菌株不需要如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增至高于500rpm，并且DO仅下降到55%。

表2：具有和不具有seb1基因的Morph1/1 Δku80的培养液粘度

实例3：具有被破坏的seb1和sfb3基因的突变株中的累加粘度降低

A.Morph菌株TrGA#32

此前用天然的木霉属葡糖淀粉酶基因(TrGA)在CBH1启动子的控制下，使用amds作为标记对上述Morph菌株进行转化。随后分离包含葡糖淀粉酶的两个串联拷贝(TrGA 29-9)的转化株，并使用随机化学诱变制备细胞壁突变株(70H2)，其具有与粘度降低表型相关的形态改变。然后测得该粘度降低的表型为sfb3基因截短的结果（数据未示出）。用TrGA的额外拷贝（即TrGA#32）转化的70H2菌株可以进一步用于过表达TrGA。

B.seb1破坏盒的生成

使用标准分子生物学方法制备seb1破坏盒质粒pRATT240（图6）。该质粒包含DNA序列，该DNA序列与紧挨菌株T4 F16中鉴定出的T-DNA插入位点的5'端（相对于seb1转录）的DNA序列具有3.3Kb区域同源性并且与紧挨T-DNA插入位点3'端的DNA序列具有3.0Kb区域同源性。这些序列被设计用于靶向居间盒序列向菌株T4 F16中鉴定出的插入位点的插入。包含源自深绿木霉的pyr2选择标记的这些居间序列旨在最大限度地减小与待转化菌株的基因组中的内源性里氏木霉pyr2的同源性。紧挨pyr2选择标记的上游是该标记的3'端的同向重复副本，其有利于后续的标记损失以及转化株/破坏株的可用pyr2突变衍生物的分离。通过采用引物RPG257和RPG264（参见表2）的PCR扩增该完整的seb1破坏盒。使用后续步骤中使用的标准分子生物学方法合并和纯化多重PCR反应。

C.菌株TrGA#32Δseb1的生成

采用PEG介导的转化，使用seb1破坏盒转化菌株TrGA#32，之后将其接种到含有山梨醇的Vogel基本培养基上以基于通过pyr2标记获得的尿苷原养型挑选候选菌株。通过转移至Vogel基本培养基而将各个转化株分离。使用PCR分析鉴定出其中seb1破坏盒通过同源重组整合在seb1基因座处的转化株。通过采用两对引物对扩增出预期大小的DNA片段，从而验证了Δseb1破坏盒在seb1基因座处的同源整合。引物对RPG297和RPG253扩增了在破坏盒区域的5'端外部开始并在3'区域内结束的DNA片段。引物对RPG296和RPG273扩增了在破坏盒的5'区域内开始并在破坏盒区域的3'端外部结束的DNA片段。与破坏相一致，第三对引物对RPG133和RPG220使用来自未转化亲本菌株的模板DNA扩展了跨越插入位点的1.6Kb DNA片段，但是无法使用来自seb1破坏菌株的模板DNA扩展该片段。将确认同源整合了seb1破坏盒的构建菌株命名为TrGA#32Δseb1。

D.TrGA#32Δseb1在深层培养中的生长

使菌株TrGA#32和TrGA#32Δseb1在如实例2中描述的相同条件下在深层（液体）培养中生长，并比较它们的生长表型。如表3中所示，从TrGA#32菌株中缺失seb1基因得到了粘度进一步降低的菌株（基于保持预选的溶解氧含量所需的rpm），从而表明seb1基因的破坏和sfb3基因的破坏相对于形态和粘度降低具有累加效应。蛋白质产量不受seb1缺失的影响（未示出）。

表3：TrGA#32和TrGA#32Δseb1在液体培养基中的生长特性。

表4：实例3中使用的引物。

实例4：具有破坏的seb1和mpg1基因的突变体的粘度降低

A.Morph菌株TrGA77B7

此前用天然的木霉属葡糖淀粉酶基因(TrGA)在CBH1启动子的控制下，使用amds作为标记对上述Morph菌株进行转化。随后分离包含葡糖淀粉酶的两个串联拷贝(TrGA29-9)的转化株，并使用随机化学诱变制备突变株(77B7)。随后通过5-氟-乳清酸(FOA)选择法分离自发的pyr2突变衍生物。

B.mpg1破坏盒的生成

里氏木霉mpg1(jgi|Trire2|122551)蛋白质序列如下所示(SEQ ID NO:29)：

MKGLILVGGFGTRLRPLTLTLPKPLVEFCNKPMIVHQIEALVAAGVTDIVLAVNYRPEIMEKFLAEYEEKYNINIEFSVESEPLDTAGPLKLAERILGKDDSPFFVLNSDVICDYPFKELLEFHKAHGDEGTIVVTKVEEPSKYGVVVHKPNHPSRIDRFVEKPVEFVGNRINAGMYIFNPSVLKRIELRPTSIEKETFPAMVADNQLHSFDLEGFWMDVGQPKDFLSGTCLYLSSLTKKGSKELTPPTEPYVHGGNVMIHPSAKIGKNCRIGPNVTIGPDVVVGDGVRLQRCVLLKGSKVKDHAWVKSTIVGWNSTVGRWARLENVTVLGDDVTIGDEIYVNGGSVLPHKSIKANVDVPAIIM*

使用标准分子生物学方法制备mpg1破坏盒质粒pRATT249（图7）。该质粒包含与跨越部分5'非翻译区以及邻接的上游序列（左旁侧）的DNA序列具有2.5Kb区域同源性的DNA序列。该质粒内还包含与跨越mpg1基因的第四外显子的一部分和邻接的下游序列（右旁侧）的DNA序列具有3.3Kb区域同源性的DNA序列。这些序列被设计用于靶向mpg1基因，并用居间盒序列替代左旁侧和右旁侧之间的基因组区域。这些居间序列包含来自深绿木霉的pyr2选择标记，该标记旨在最大限度地降低与待转化菌株的基因组中的內源里氏木霉pyr2的同源性。紧挨pyr2选择标记的上游是该标记的3'端的同向重复副本，其有利于后续的标记损失以及转化株/破坏株的可用pyr2突变衍生物的分离。通过采用引物RPG388和RPG391的PCR扩增该完整的mpg1破坏盒。使用后续步骤中使用的标准分子生物学方法合并和纯化多重PCR反应。

C.菌株Morph77B7Δmpg1的生成

采用PEG介导的转化，使用mpg1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7，之后将其接种到含有山梨醇的Vogel基本培养基上以基于通过pyr2标记获得的尿苷原养型挑选候选菌株。通过转移至Vogel基本培养基而分离并增殖各个转化株。使用PCR分析鉴定出其中mpg1破坏盒通过同源重组整合在mpg1基因座处的转化株。通过采用两对引物对扩增出预期大小的DNA片段，从而验证了Δmpg1破坏盒在mpg1基因座处的同源整合。引物对RPG394和RPG253扩增了在破坏盒区域5'端外部开始并在3'区域内结束的DNA片段。引物对RPG395和RPG273扩增了在破坏盒的5'区域内开始并在破坏盒区域的3'端外部结束的DNA片段。将确认同源整合了mpg1破坏盒的构建菌株命名为TrGA77B7Δmpg1。

D.从TrGA77B7和TrGA77B7Δmpg1中缺失seb1

如实例3中所述从TrGA77B7Δmpg1中缺失seb1，从而生成菌株TrGA77B7Δmpg1Δseb1。

E.TrGA77B7Δseb1和TrGA77B7Δmpg1Δseb1在深层培养中的生长

使菌株Morph TrGA77B7Δmpg1和TrGA77B7Δmpg1Δseb1在如实例2中描述的相同条件下在深层（液体）培养中生长，并比较它们的生长表型。如表5中所示，从MorphTrGA77B7Δmpg1菌株中缺失seb1基因导致粘度进一步降低，即便TrGA77B7Δmpg1Δseb1的细胞群较高，从而表明mpg1和seb1基因的破坏相对于形态和粘度降低具有累加效应。TrGA77B7Δmpg1Δseb1的蛋白质产量为Morph TrGA77B7和Morph TrGA77B7Δmpg1的蛋白质产量的至少85%或更高。

表5：TrGA77B7Δmpg1和TrGA77B7Δmpg1Δseb1的培养液粘度

表6：实例4中使用的引物。

实例5：具有被破坏的gas1、crz1和tps2基因中的至少一者结合被破坏的mpg1、 seb1和/或sbf3的突变株中的累加粘度降低

A.被破坏的gas1中的粘度降低

真菌β(1,3)-葡聚糖转移酶的Gel/Gas/Phr家族在细胞壁的生物发生过程中通过加工主要成分β(1,3)-葡聚糖而起着重要作用（Popolo等人，2008年）。gas1(PID22914)编码β-1,3-葡聚糖转移酶，其为能够破坏并连接β-1,3-葡聚糖的GPI（和/或葡聚糖）锚定蛋白。在多个真菌基因组（包括里氏木霉）中存在多个旁系同源基因，对于里氏木霉而言为五个。独立的研究已经表明gas1基因（或烟曲霉中所知的gel1基因）突变影响真菌细胞壁结构，并且能够导致形态学变化以及对卡尔科弗卢尔荧光增白剂、刚果红和十二烷基硫酸钠的超敏性（Schirawski,J.等人，2005年，Mouyna,I.等人，2005年）。

里氏木霉Morph菌株缺失四种主要的纤维素酶基因（包括cbhI、cbhII、egII和egIV），使其在不存在纤维素酶背景或在降低的纤维素酶背景的情况下特别适用于表达其他蛋白质。参见WO05/001036。此前用天然的木霉属葡糖淀粉酶基因(TrGA)在CBH1启动子的控制下，使用amdS作为标记对Morph菌株进行转化。随后分离包含葡糖淀粉酶的两个串联拷贝(TrGA29-9)的转化株，并使用随机化学诱变制备突变株(77B7)。随后通过5-氟-乳清酸(FOA)选择法分离自发的pyr2突变衍生物。从突变株Morph77B7中缺失里氏木霉gas1(PID22914)。

采用PEG介导的转化，使用gas1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，之后将其接种到含有山梨醇的Vogel基本培养基上以基于通过pyr2标记获得的尿苷原养型挑选候选菌株。如表8中所示，Morph77B7Δgas1与亲本Morph77B7相比具有降低的培养液粘度。在批量生长阶段结束时，当所有葡萄糖被耗尽时，两种菌株达到类似的生物质浓度。为了达到批量生长的结束阶段，观察到Morph77B7对照菌株的搅拌速率增至616rpm，然后观察到DO含量水平下降至低至40%。菌株Morph77B7Δgas1不需要如此多的能量（即搅拌过程中rpm增加）来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增至高于500rpm，并且%DO从未降至低于115。蛋白质产量在Morph77B7Δgas1中较之Morph77B7未受到不利影响（数据未示出）。gas1破坏的详情可见于提交于2011年4月29日的美国临时专利申请No.61,480,602，其全文以引用方式并入本文中。

表8：Morph77B7较之Morph77b7Δgas1的培养液粘度

B.被破坏的crz1中的粘度降低

在真菌中，已经显示钙调磷酸酶介导的Ca²⁺信号传导是许多生物体中生长、发育和致病力所必需的。其能够适应包括高阳离子水平和碱性pH值在内的不同环境条件很有必要。基因crz1编码钙调磷酸酶调节的转录因子。当通过Ca²⁺/钙调蛋白激活磷酸酶钙调磷酸酶时，Crz1p转录因子发生去磷酸化。然后它进入细胞核并诱导多个基因的表达，所述基因中的多个编码具有细胞壁相关功能的蛋白质（Yoshimoto等人，2002年；Lagorce等人，2003年；Garcia等人，2004年；Karababa等人，2006年；Pardini等人，2006年；Munro,C.等人，2009年）。crz1或同源物的缺失能够导致菌丝形态改变（Kothe,G.和Free,S.，1998年；Prokisch,H.等人，1997年）。

如上所述制备里氏木霉Morph菌株。从突变株Morph77B7中缺失里氏木霉crz1(PID36391)。采用PEG介导的转化，使用crz1破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，之后将其接种到含有山梨醇的Vogel基本培养基上以基于通过pyr2标记获得的尿苷原养型挑选候选菌株。如表9中所示，Morph77B7Δcrz1与亲本Morph77B7相比具有降低的培养液粘度。在批量生长阶段结束时，当所有葡萄糖被耗尽时，两种菌株达到类似的生物质浓度。为了达到批量生长的结束阶段，观察到Morph77B7对照菌株的搅拌速率增至616rpm，然后观察到DO含量水平下降至低至40%。菌株Morph77B7Δcrz1不需要如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增至高于500rpm，并且%DO从未降至低于100。所述crz1破坏的详情可见于提交于2011年4月29日的美国临时专利申请No.61,480,610，其全文以引用方式并入本文中。

表9：Morph77B7较之Morph77b7Δcrz1的培养液粘度

C.被破坏的tps1中的粘度降低

基因tps2编码参与合成二糖海藻糖的海藻糖-磷酸酯磷酸酶。海藻糖为压力诱导的糖，其缓冲细胞质和ER中变性蛋白的再折叠（Singer,M等人，1998年；Simola,M等人，2000年）。通过多样化的生物体响应于多种压力而大量制备这种二糖。在酵母中，海藻糖使蛋白质在高温下稳定，并且有助于再折叠热损伤的蛋白质（Simola,M等人，2000年）。

如上所述制备里氏木霉Morph菌株。从突变株Morph77B7中缺失里氏木霉tps2(PID48707)。采用PEG介导的转化，使用tps2破坏盒转化菌株Morph TrGA77B7Δpyr2，之后将其接种到含有山梨醇的Vogel基本培养基上以基于通过pyr2标记获得的尿苷原养型挑选候选菌株。如表10中所示，Morph77B7Δtps2与亲本Morph77B7相比具有降低的培养液粘度。在批量生长阶段结束时，当所有葡萄糖被耗尽时，两种菌株达到类似的生物质浓度。为了达到批量生长的结束阶段，观察到Morph77B7对照菌株的搅拌速率增至616rpm，然后观察到DO含量水平降至低至40%。菌株Morph77B7Δtps2不需要如此多的能量来实现相同的生物质浓度。搅拌速率从未增至高于500rpm，并且%DO从未降至低于110。所述tps1破坏的详情可见于提交于2011年4月29日的美国临时专利申请No.61,480,629，其全文以引用方式并入本文中。

表10：Morph77B7较之Morph77b7Δtps2的培养液粘度

虽然出于清晰理解的目的已通过举例说明和实例的方式对上述组合物和方法进行了相当详细的描述，但是对于本领域的技术人员而言，可以进行某些更改和修改将是显而易见的。因此，所述说明不应理解为对本发明的范围进行限制，本发明的范围仅通过所附权利要求书进行界定。

本文引用的全部出版物、专利以及专利申请据此全文以引用方式并入以用于所有目的、且达到与似乎每个单独的专利公开、专利或专利申请被特别和单独地指出以便如此以引用方式并入相同的程度。

参考文献

以下参考文献和本文引用的另外的参考文献据此以引用方式并入：

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Claims

1.一种衍生自亲本菌株的丝状真菌变异菌株的用途，其中所述变异菌株包含遗传变异，与所述亲本菌株的细胞相比，所述遗传变异使得所述变异菌株的细胞产生减少量的功能性Seb1蛋白，其中所述用途是所述变异菌株的细胞在深层培养有氧发酵过程中可以产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的所述细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的所述细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量，其中所述丝状真菌为盘菌亚门物种。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的所述细胞相比，需要减少的搅拌来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的所述细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述遗传变异包括所述亲本菌株中存在的所述seb1基因的破坏。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述seb1基因的破坏是缺失所述seb1基因的全部或部分的结果。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述seb1基因的破坏是缺失包含所述seb1基因的基因组DNA的部分的结果。

6.根据权利要求3所述的用途，其中所述seb1基因的破坏是所述seb1基因诱变的结果。

7.根据权利要求3所述的用途，其中使用位点特异性重组来进行所述seb1基因的破坏。

8.根据权利要求3所述的用途，其中所述seb1基因的破坏与在所述seb1基因的所述基因座引入选择性标记组合进行。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述变异菌株不产生功能性Seb1蛋白。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述变异菌株不产生Seb1蛋白。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述变异菌株还包含编码目的蛋白的基因。

12.根据权利要求1所述的用途，还包含sfb3基因的破坏。

13.根据权利要求1所述的用途，还包含至少一种选自sfb3基因、mpg1基因、gas1基因、crz1基因和tps2基因的破坏。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述变异菌株每单位量生物质产生与所述亲本菌株基本等量或更多的蛋白。

15.根据权利要求1所述的用途，其中所述丝状真菌为木霉属物种。

16.根据权利要求1所述的用途，其中所述丝状真菌为里氏木霉。

17.根据权利要求1所述的用途，其中所述遗传变异包括使用遗传操作在亲本丝状真菌细胞中破坏所述seb1基因。

18.根据权利要求1所述的用途，其中所述seb1基因的破坏与sfb3基因的破坏组合进行。