KR102004003B1

KR102004003B1 - 변경된 점성 표현형을 갖는 사상균

Info

Publication number: KR102004003B1
Application number: KR1020137004310A
Authority: KR
Inventors: 티모시 씨 다지; 알렉산드라 비라그; 마이클 워드
Original assignee: 다니스코 유에스 인크.
Priority date: 2010-08-25
Filing date: 2011-08-25
Publication date: 2019-07-25
Also published as: JP2013533751A; EP2609200B1; JP5707494B2; CN103097536B; US20130224864A1; AU2011293263A1; CN103097536A; MY160960A; WO2012027580A1; RU2013112888A; DK2609200T3; ZA201208720B; RU2608639C2; KR20130100108A; CA2808777A1; AU2011293263B2; CA2808777C; MX346558B; EP2609200A1; BR112013004419A2

Abstract

변경된 성장 특징을 갖는 변이형 사상균에 관련된 조성물 및 방법이 개시된다. 그러한 변이체는 침지 배양에서의 성장에, 예를 들어 상업적 응용을 위한의 효소 및 다른 단백질의 대규모 생성에 적절하다.

Description

변경된 점성 표현형을 갖는 사상균{FILAMENTOUS FUNGI HAVING AN ALTERED VISCOSITY PHENOTYPE}

우선권

본 출원은 전체적으로 참고로 포함되고 2010년 8월 25일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/377,030호의 우선권을 주장한다.

본 발명의 주(strain) 및 방법은 성장 특징이 변경된 변이체를 야기하는 사상균의 유전자 돌연변이에 관한 것이다. 그러한 변이체는 침지 배양에서의 성장에, 예를 들어 상업적 응용을 위한 효소 및 다른 단백질 또는 대사산물의 대규모 생성에 적절하다.

참고 문헌

하기 참고 문헌, 및 여기에 인용된 추가의 참고 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다:

Caracuel, Z. et al. (2005) Molecular Plant-Microbe Interactions 18:1140-47.

Hughes, H. and Stephens, D.J. (2008) Cell Biol. 129:129-51.

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Passolunghi, S. et al. (2010) Microbial Cell Factories 9:7-17.

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Roberg, K.J. et al. (1999) J. Cell. Biol. 145:659-72.

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Turchini, A. et al. (2000) J. Becteriol. 182:1167-71.

사상균은 천연 및 이종 단백질을 고수준으로 발현하여 이것이 산업적 응용을 위한 효소 및 다른 단백질의 대규모 생성에 적절해지게 할 수 있다. 전형적으로 사상균을 생물반응기에서 균사체 침지 배양에서 성장시키는데, 상기 생물반응기는 산소 및 영양소를 배양 배지(즉, 브로쓰(broth)) 내로 도입하고 분배하도록 된다. 균사체의 형태학적 특징들은 브로쓰의 유동학적 특성에 영향을 주고 이럼으로써 생물반응기 성능에 영향을 준다.

일반적으로, 브로쓰의 점성이 더 높을수록 산소 및 영양소의 분포가 덜 균일해지며, 배양물의 교반에 더 많은 에너지가 요구된다. 일부의 경우, 브로쓰의 점성은 산소 및 영양소의 용해를 유의하게 간섭하기에 충분히 높아지게 되고, 이럼으로써 진균류의 성장에 악영향을 주게 된다. 부가적으로, 점성 브로쓰의 혼합 및 통기에 요구되는 동력은 생산 원가를 유의하게 증가시키고, 모터 및 동력 공급 면에서 더 높은 자본 지출을 초래할 수 있다.

변경된 점성 표현형을 야기하는 유전자 변경을 갖는 사상균에 관련된 주 및 방법이 개시된다.

일 태양에서, 모 주(parental strain)로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 상기 변이주는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 변경된 양의 기능성 Sfb3 단백질을 생성하게 하는 유전자 변경을 포함하며, 변이주의 세포는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다.

일부 실시 형태에서, 기능성 Sfb3 단백질의 변경된 양은 감소된 양이며, 변이주는 침지 배양에서 호기성 배양 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다.

일부 실시 형태에서, 유전자 변경은 모 주에 존재하는 sfb3 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 전부의 또는 일부의 sfb3 유전자의 결실의 결과이다. 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자를 포함하는 게놈 DNA의 일부분의 결실의 결과이다. 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 돌연변이 유발의 결과이다.

일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 부위 특이적 재조합을 이용하여 수행된다. 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합되어 수행된다. 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 감소된 점성 표현형을 변이주에 부여함에 있어서의 일차적인 유전자적 결정자이다.

일부 실시 형태에서, 변이주는 기능성 Sfb3 단백질을 생성하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 Sfb3 단백질을 생성하지 않는다.

일부 실시 형태에서, 변이주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다.

일부 실시 형태에서, 변이주는 바이오매스(biomass)의 단위량 당 모 주와 사실상 동일한 양의 단백질을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 바이오매스의 단위량 당 모 주와 사실상 동일한 양의 관심대상의 단백질을 생성한다.

일부 실시 형태에서, Sfb3 단백질은 아미노산 서열 IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (서열 번호 9, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기임)을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 사상균은 페지조마이코티나(Pezizomycotina) 종이다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)이다.

다른 태양에서, 사상균 세포의 변이주를 생성하는 방법이 제공되며, 이는 유전자 변경을 사상균 세포의 모 주 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 유전자 변경은 모 주의 세포와 비교하여 기능성 Sfb3 단백질 생성을 변경시키고, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성한다.

일부 실시 형태에서, 유전자 변경은 기능성 Sfb3 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하며, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성한다.

일부 실시 형태에서, 유전자 변경은 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 sfb3 유전자를 파괴하는 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 유전자 변경은 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 sfb3 유전자를 결실시키는 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 유전자 변경은 부위 특이적 유전자 재조합을 이용하여 수행된다. 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합되어 수행된다.

일부 실시 형태에서, 변이주는 바이오매스의 단위량 당 모 주와 사실상 동일한 양의 단백질을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 변이주는 바이오매스의 단위량 당 모 주와 사실상 동일한 양의 관심대상의 단백질을 생성한다.

일부 실시 형태에서, 사상균은 페지조마이코티나 종이다. 일부 실시 형태에서, 사상균은 트리코데르마 레에세이이다.

일부 실시 형태에서, 모 주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자는 기능성 Sfb3 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하는 유전자 변경을 도입하기 전에 모 주에 존재한다.

다른 태양에서, 전술한 변이주에 의해 생성된 관심대상의 단백질이 제공된다.

다른 태양에서, 전술한 방법에 의해 생성된 사상균의 변이주가 제공된다.

다른 태양에서, 모 주로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 이 변이주는 (a) (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 침지 배양에서 감소된 교반을 요구하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 침지 배양에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 유전자 변경, 및 (b) (a)에서의 유전자 변경 전에 변이주에 존재하는, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 유전자 변경은 모 주에 존재하는 sfb3 유전자의 파괴를 포함한다. 일부 실시 형태에서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합되어 수행된다.

다른 태양에서, 변경된 점성 표현형에 대하여 변이형 사상균 세포를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 이는 (a) 사상균의 모 주의 세포를 변이 세포가 생성되도록 돌연변이 유발시키는 단계와; (b) 형광색소 착색제에 대한 변경된 민감성에 대하여 변이 세포를 스크리닝하는 단계와; (c) 형광색소 착색제에 대한 민감성이 변경된 변이 세포를 선발하는 단계를 포함하고; 형광색소 착색제에 대한 변경된 민감성은 침지 배양에서 호기성 발효 동안 변이형 사상균 세포가 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 소정량의 교반에서 모 주의 세포와 비교하여 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성하는 능력과 상관된다.

일부 실시 형태에서, 변경된 민감성은 증가된 민감성이며, 변이형 사상균 세포는 침지 배양에서 호기성 배양 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다. 일부 실시 형태에서, 형광색소 착색제는 칼코플루오르 화이트(Calcofluor White)이다.

일부 실시 형태에서, 세포의 돌연변이 유발은 유전자 재조합에 의해 수행된다. 일부 실시 형태에서, 세포의 돌연변이 유발은 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합되어 수행된다.

다른 태양에서, 사상균의 페지조마이코티나 종에서의 Sfb3 폴리펩티드의 확인 방법이 제공되며, 이는 (a) 사상균의 페지조마이코티나 종으로부터의 아미노산 서열을 얻는 단계와; (b) 상기 아미노산 서열을 연접 아미노산 서열 IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (서열 번호 9, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기임)의 존재에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하고; (c) 사상균의 페지조마이코티나 종으로부터의 아미노산 서열에 서열 번호 9의 서열이 존재하는 것은 사상균의 페지조마이코티나 종으로부터의 아미노산 서열이 sfb3 폴리펩티드임을 나타낸다.

다른 태양에서, 전술한 방법에 의해 확인되는 단리된 sfb3 폴리펩티드가 제공된다.

다른 추가의 태양에서, 사상균 세포에서 관심대상의 단백질을 생성하는 방법이 제공되며, 이는 모 사상균 세포 내로 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 세포에서 Sfb3 단백질의 양 또는 활성을 감소시키는 유전자 변경을 도입하고 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하고/하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는, 관심대상의 단백질을 포함하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성하는 단계를 포함하며, 상기 관심대상의 단백질은 모 세포와 비교하여 변이 세포에서 사실상 동일한 수준으로 생성된다.

일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질은 하나 초과의 (또는 하나 이상의) 관심대상의 단백질이며, 하나 초과의 관심대상의 단백질 각각은 모 세포와 비교하여 변이 세포에서 사실상 동일한 상대적 수준으로 생성된다. 특정한 실시 형태에서, 하나 초과의 관심대상의 단백질 각각은 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제로부터 선택된다.

관련 태양에서, 그러한 방법에 의해 생성된 관심대상의 단백질이 제공된다. 또 다른 관련 태양에서, 그러한 방법에 의해 생성된 하나 초과의 관심대상의 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 전 셀룰라아제 조성물이다.

본 발명의 주 및 방법의 이들 및 다른 태양과 실시 형태는 첨부된 도면을 비롯하여 설명으로부터 명백해질 것이다.

<도 1>
도 1은 플라스미드 pCR-BluntII-hph-loxP#4의 지도이다.
<도 2>
도 2는 플라스미드 pCR-Blunt II-TOPO 889092의 지도이다.
<도 3a 내지 도 3d>
도 3a 내지 도 3d는 콩고 레드(Congo Red) 함유 배지 상에서의 티. 레에세이 주 MorphΔsfb3 및 29-9Δsfb3의 콜로니 형태를 보여주는 배양 플레이트의 이미지이다. (도 3a) MorphΔsfb3 후보들의 하위세트 및 (도 3b) 상응하는 대조군. (도 3c) 29-9Δsfb3 후보들의 하위세트 및 (도 3d) 상응하는 대조군.
<도 4>
도 4는 Morph Δsfb3 주에서 cre 유전자를 일시적으로 발현시키는 데 사용되는 플라스미드 pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre의 지도이다.
<도 5>
도 5는 플라스미드 pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre의 일시적 발현 후 후보들에 있어서 하이그로마이신 B 내성의 상실 및 아세트아미드 상에서의 성장 능력을 보여주는 이미지이다. 상부 열(도 5a 내지 도 5c): 나타낸 배지 상의 Morph 및 Morph Δsfb3 대조 주. 하부 열 (도 5d 내지 도 5f): 나타낸 배지 상에서의 플라스미드의 일시적 발현 후의 후보들.
<도 6>
도 6은 플라스미드 pNSP23의 지도이다.
<도 7>
도 7은 70H2에서의 상보에 사용되는 4개의 플라스미드 중 하나의 지도이며, 이 플라스미드는 천연 프로모터 및 종결자를 포함하는 야생형 sfb3 유전자를 함유한다.
<도 8>
도 8은 28℃에서의 4일간의 성장 후에 하이그로마이신 B를 포함하는 PDA 상에서의 70H2 및 29-9 형질전환체의 성장을 보여주는 이미지이다 (형질전환 플레이트로부터의 제1 이전). (도 8a 내지 도 8c) 70H2 + 야생형 sfb3 - 29-9 유래의 것 - . (도 8d 내지 도 8f) 70H2 + 야생형 sfb3 - 29-9 유래의 천연 프로모터 및 종결자를 포함함 - . (도 8g) 29-9 + 단지 벡터. (도 8h 내지 도 8j) 70H2 + sfb3 - 70H2 유래의 것 - . (도 8k 내지 도 8m) 70H2 + sfb3 - 70H2 유래의 천연 프로모터 및 종결자를 포함함 - . (N) 70H2 + 단지 벡터.
<도 9>
도 9는 플라스미드 pCR-BluntII-TOPO 949096의 지도이다.
<도 10>
도 10은 주 29-9로부터 얻어진 야생형 sfb3 유전자를 함유하는 pCR-BluntII-TOPO 949096으로 형질전환된 70H2의 형질전환체의 성장 (도 10a)을 보여주는 이미지이다. 주들을 28℃에서 VMH (하이그로마이신 B를 함유하는 보겔 최소 배지(Vogel's minimal medium containing hygromycin B)) 상에서 인큐베이션시켰다. 두 후보는 야생형 표현형(W)을 가지며, 둘은 70H2 표현형(H)을 갖고, 둘은 중간 표현형(I)을 갖는다. 도 10b는 28℃에서의 4일간의 성장, 이어서 실온에서의 3일간의 성장 후 VM(보겔 최소 배지) 상에서의 70H2sfb3#24, 70H2 및 29-9의 비교를 도시한 이미지이다.
<도 11>
도 11은 28℃에서의 4일간의 성장 후 나타낸 배지 상에서의 H3A 및 H3A Δsfb3 #1009의 콜로니 형태를 보여준다.
<도 12>
도 12는 28℃에서의 나타낸 시간 기간 후의 액체 배양에서의 H3A 및 H3A Δsfb3 #1009 균사의 이미지를 보여준다.
<도 13>
도 13은 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) (서열 번호 1) 및 티. 레에세이 (서열 번호 2) 유래의 Sfb3단백질의 아미노산 서열들의 정렬을 보여준다.
<도 14>
도 14는 에스. 세레비지애 (서열 번호 1), 티. 레에세이 (서열 번호 2), 및 에이. 오리자에(A. oryzae) (서열 번호 3) 유래의 Sfb3 단백질의 아미노산 서열들의 정렬을 보여준다.

I. 개관

본 발명의 주 및 방법은 형태 및 성장 특징에 영향을 주는 유전자 변형을 갖는 변이형 사상균 세포에 관련된다. 변이 세포를 침지 배양에서 성장시킬 때, 상기 세포는 모 주의 세포를 포함하는 세포 브로쓰와 비교하여 상이한 유동학적 특성을 갖는 세포 브로쓰를 생성한다. 이들 변이주들 중 일부는 효소 및 다른 상업적으로 중요한 단백질의 대규모 생성에 적절하다.

II. 정의

본 발명의 주 및 방법을 상세히 설명하기 전에, 하기 용어들이 명확함을 위하여 정의된다. 정의되지 않은 용어들은 관련 기술분야에서 사용되는 통상적인 의미에 부합되어야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "트리코데르마 레에세이"는 아스코마이코타(Ascomycota) 문, 페지조마이코티나 아문(subylum)의 사상균을 말한다. 이 유기체는 이전에 트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)으로, 그리고 또한 하이포크레아 제코리나(Hypocrea jecorina)로 분류되었다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "사상균 세포의 변이주" 또는 유사 어구는 예를 들어 유전자 조작에 의해 페지조마이코티나에 속하는 모 (또는 기준) 주로부터 유래된(즉, 그로부터 얻어지거나 또는 그로부터 얻어질 수 있는) 사상균 세포의 주를 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "관심대상의 단백질"은 사상균에서, 선택적으로 고수준으로 그리고 상업화 목적으로 발현시키기를 원하는 폴리펩티드를 말한다. 그러한 단백질은 효소, 기질 결합 단백질, 표면 활성 단백질, 구조 단백질 등일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "사실상 활성이 없는", 또는 유사 어구는 특정 활성이 혼합물에서 검출가능하지 않거나, 또는 혼합물의 의도된 목적을 간섭하지 않을 양으로 존재함을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들을 포함하는 임의의 길이의 중합체를 말하기 위하여 상호교환가능하게 사용된다. 아미노산 잔기들을 위한 통상적인 1문자 또는 3문자 암호가 본 명세서에서 사용된다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이것은 비아미노산(non-amino acid)이 개재될 수 있다. 상기 용어들은 자연적으로 또는 개재에 의해; 예를 들어 다이설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 콘쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 또한 포함한다. 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함)와, 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 또한 상기 정의 내에 포함된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 기능적으로 및/또는 구조적으로 유사한 단백질은 "관련 단백질"인 것으로 간주된다. 그러한 단백질들은 상이한 속 및/또는 종의 유기체로부터 또는 심지어 상이한 강의 유기체 (예를 들어, 박테리아 및 진균류)로부터 유래될 수 있다. 관련 단백질들은 일차 서열 분석에 의해 결정되거나, 이차 또는 삼차 구조 분석에 의해 결정되거나, 또는 면역학적 교차 반응성에 의해 결정된 상동체를 또한 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유도체형 폴리펩티드/단백질"은 N- 및 C-말단(들) 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에의 하나 이상의 아미노산의 부가, 아미노산 서열 내의 하나의 또는 다수의 상이한 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환, 단백질의 어느 하나의 말단 또는 양 말단에서의 또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실, 및/또는 아미노산 서열 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 삽입에 의해 단백질로부터 유도되거나 또는 유도가능한 단백질을 말한다. 단백질 유도체의 제조는 천연 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 변형, 그 DNA 서열로 적합한 숙주를 형질전환시키는 것, 및 변형된 DNA 서열을 발현시켜 유도체형 단백질을 형성하는 것에 의해 성취될 수 있다.

관련 단백질 (및 유도체형 단백질)은 "변이 단백질"을 포함한다. 변이 단백질은 소수의 아미노산 잔기에서의 치환, 결실 및/또는 삽입에 의해 기준/모 단백질 (예를 들어, 야생형 단백질)과 상이하다. 변이 단백질과 모 단백질 사이에서 상이한 아미노산 잔기의 수는 하나 이상, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50개 또는 그보다 많은 아미노산 잔기일 수 있다. 변이 단백질은 기준 단백질과 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상, 또는 그보다 큰 아미노산 서열 동일성을 공유할 수 있다. 또한 변이 단백질은 선택된 모티프, 도메인, 에피토프, 보존 영역 등에서 기준 단백질과 상이할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유사 서열"은 관심대상의 단백질(즉, 전형적으로 관심대상의 원래 단백질)과 유사한 기능, 삼차 구조 및/또는 보존된 잔기를 제공하는 단백질 내의 서열을 말한다. 예를 들어, α-나선 또는 β-시트 구조를 함유하는 에피토프 영역에서, 유사 서열 내의 대체 아미노산들은 바람직하게는 동일한 특정 구조를 유지한다. 이 용어는 또한 아미노산 서열뿐만 아니라 뉴클레오티드 서열도 말한다. 일부 실시 형태에서, 유사 서열은 대체 아미노산이 유사한 또는 개선된 기능을 나타내는 변이 효소를 생성하도록 개발된다. 일부 실시 형태에서, 관심대상의 단백질에서의 아미노산의 삼차 구조 및/또는 보존된 잔기는 관심대상의 절편 또는 단편에 또는 그 근처에 위치한다. 따라서, 관심대상의 절편 또는 단편이 예를 들어 α-나선 또는 β-시트 구조를 함유할 경우, 대체 아미노산은 바람직하게는 그 특정 구조를 유지한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상동 단백질"은 기준 단백질과 유사한 활성 및/또는 구조를 갖는 단백질을 말한다. 상동체는 반드시 진화론적으로 관련될 필요가 있는 것으로 의도되는 것은 아니다. 따라서, 상기 용어는 상이한 유기체들로부터 얻어진 동일하거나, 유사하거나 또는 상응하는 효소(들)(즉, 구조 및 기능 면에서)를 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시 형태에서, 기준 단백질과 유사한 사차, 삼차 및/또는 일차 구조를 갖는 상동체를 확인하는 것이 바람직하다. 일부 실시 형태에서, 상동 단백질은 기준 단백질과 유사한 면역 반응(들)을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 상동 단백질은 원하는 활성(들)을 갖는 효소를 생성하도록 엔지니어링된다.

서열들 사이의 상동성 정도는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48:443]; 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444]; 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package; 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group)) 내의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA와 같은 프로그램; 및 문헌[Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-95] 참조).

예를 들어, PILEUP는 서열 상동성 수준의 결정에 유용한 프로그램이다. PILEUP는 진행형, 쌍 정렬을 이용하여 관련 서열들 군으로부터 다수의 서열 정렬을 생성한다. 또한 이것은 정렬 생성에 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 보여주는 트리(tree)를 도시할 수 있다. PILEUP는 펭(Feng) 및 둘리틀(Doolittle)의 진행형 정렬법을 간소화한 것을 이용한다 (문헌[Feng and Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35:351-60]). 상기 방법은 문헌[Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53])에 기재된 것과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중치(default gap weight), 0.10의 디폴트 갭 길이 가중치, 및 말단 갭 가중치를 포함한다. 유용한 알고리즘의 다른 예로는 문헌[Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10] 및 문헌[Karlin et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87]에 기재되어 있는 BLAST 알고리즘이 있다. 하나의 특히 유용한 BLAST 프로그램으로는 WU-BLAST-2 프로그램이 있다 (예를 들어, 문헌[Altschul et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:460-80] 참조). 파라미터 "W", "T", 및 "X"는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램에서는 디폴트로서 11의 단어 길이(W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (예를 들어, 문헌[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조) 정렬값(B), 10의 기대치(E), M'5, N'-4, 및 양 가닥의 비교가 이용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 적어도 2개의 핵산 또는 폴리펩티드의 맥락에서 어구 "사실상 유사한" 및 "사실상 동일한"은 전형적으로 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 기준(즉, 야생형) 서열과 비교하여 약 70% 이상의 동일성, 약 75% 이상의 동일성, 약 80% 이상의 동일성, 약 85% 이상의 동일성, 약 90% 이상의 동일성, 약 91% 이상의 동일성, 약 92% 이상의 동일성, 약 93% 이상의 동일성, 약 94% 이상의 동일성, 약 95% 이상의 동일성, 약 96% 이상의 동일성, 약 97% 이상의 동일성, 약 98% 이상의 동일성, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성, 또는 그보다 큰 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 서열 동일성은 표준 파라미터를 사용하여 BLAST, ALIGN, 및 CLUSTAL과 같은 공지된 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. (예를 들어, 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]; 문헌[Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915]; 문헌[Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:5873]; 및 문헌[Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244] 참조). BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통하여 공개적으로 이용가능하다. 또한, 데이터베이스는 FASTA를 이용하여 검색될 수 있다 (문헌[Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48]). 두 폴리펩티드가 사실상 동일함을 나타내는 한 가지는 제1 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드와 면역학적 교차 반응성이라는 것이다. 전형적으로, 보존적 아미노산 치환에 의해 상이해지는 폴리펩티드들은 면역학적 교차 반응성을 갖는다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어 두 펩티드가 단지 보존적 치환에 의해 상이해질 경우 제2 폴리펩티드와 사실상 동일하다. 두 핵산 서열이 사실상 동일함을 나타내는 다른 것으로는 두 분자가 엄격한 조건 하에서 (예를 들어, 중간 내지 높은 엄격도의 범위 내에서) 서로에게 혼성화된다는 것이 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 단백질 또는 RNA를 코딩하여 그 발현을 지시하는 핵산을 말함에 있어서 용어 "대립유전자"와 동의어이다. 사상균의 영양형은 일반적으로 반수체이며, 따라서 단일 카피(copy)의 특정 유전자(즉, 단일 대립유전자)가 특정 표현형의 부여에 충분하다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "야생형" 및 "천연" 유전자, 단백질, 또는 주는 자연에서 발견되는 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자의 결실"은 숙주 세포의 게놈으로부터의 그의 제거를 말한다. 유전자가 유전자의 코딩 서열에 바로 인접하여 위치하지 않는 제어 요소 (예를 들어, 인핸서(enhancer) 요소)를 포함할 경우, 유전자의 결실은 상기 코딩 서열, 및 선택적으로, 인접 프로모터 서열 및/또는 종결 서열의 결실을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자의 파괴"는 대체적으로 숙주 세포에서 기능 유전자 생성물, 예를 들어 단백질을 세포가 사실상 생성하지 못하게 하는 임의의 유전자 조작 또는 화학적 조작을 말한다. 예시적인 파괴 방법은 폴리펩티드 코딩 서열, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 조절 요소를 포함하는 유전자의 임의의 부분의 완전한 또는 부분적인 결실, 또는 이들의 돌연변이 유발을 포함하며, 여기서 돌연변이 유발은 치환, 삽입, 결실, 역위, 및 이들의 조합 및 변이를 포함하는데, 상기 돌연변이들 중 임의의 것은 기능 유전자 생성물의 생성을 사실상 방지한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자 조작"은 예를 들어 소정의 핵산 서열에 우선적으로 작용하는 거대분자(즉, 효소 및/또는 핵산)를 이용한, 소정의 핵산 표적 서열의 변경을 말한다. 이러한 방식으로 유전자 조작은 화학적 조작과는 별개인데, 상기 화학적 조작에서는 사전 선택되지 않은 핵산 서열에 대한 변화에 랜덤하게 영향을 주기 위하여 소분자가 사용된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "유전자 변경"은 유전자 조작에서 생기는 세포 DNA 변화이며, 화학적 조작에서 생기는 세포 DNA 변화와는 별개이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "호기성 발효"는 산소의 존재 하에서의 성장을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 브로쓰"는 액체/침지 배양에서 배지와 세포를 총칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세포 매스(mass)"는 액체/침지 배양에서 존재하는 세포 성분(온전한 세포 및 용해된(lysed) 세포를 포함함)을 말한다. 세포 매스는 건조 또는 습윤 중량으로 표현될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "유동학(rheology)"은 물질의 변형 및 유동을 다루는 물리학 분야이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "점도"는 기계적 응력, 예를 들어 전단 응력 또는 인장 응력에 의한 변형에 대한 유체의 내성의 척도이다. 본 발명의 맥락에서, 점성은 예를 들어 로터/임펠러에 의해 제공되는 기계적 응력에 대한, 사상균 세포를 포함하는 세포 브로쓰의 내성을 말한다. 세포 브로쓰의 점성은 직접적으로 측정하는 것이 어려울 수 있기 때문에, 소정량의 교반에서의 배양 브로쓰의 용존 산소 함량, 소정의 용존 산소 함량의 유지에 필요한 교반의 양, 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 세포 브로쓰를 교반하는 데 필요한 동력의 양, 또는 심지어 고체 배지 상에서의 콜로니 형태와 같이 점성의 간접 측정이 이용될 수도 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사상균 세포의 "변경된 점성"의 변이주는 모 주에 의해 생성되는 동등한 세포 브로쓰와 비교하여 점성이 감소되거나 또는 증가된(즉, 전단 또는 인장 응력에 대한 내성이 감소되거나 또는 증가된) 세포 브로쓰를 생성하는 변이주이다. 일반적으로, 동등한 세포 브로쓰는 비견되는 세포 매스를 갖는다. 바람직하게는, 점성의 임의의 직접적인 또는 간접적인 측정과 관련하여 변이주, 변경된 점성의 주 및 모 주 사이의 차이는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 또는 심지어 50% 이상이거나 또는 그보다 크다. 사상균 세포 브로쓰의 점성을 비교하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있다. 일반적으로, 비견되는 (또는 동등한) 세포 브로쓰들은 비견되는 세포 매스를 갖는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사상균 세포의 "감소된 점성"의 변이주는 모 주에 의해 생성되는 동등한 세포 브로쓰와 비교하여 점성이 감소된(즉, 전단 또는 인장 응력에 대한 내성이 감소된) 세포 브로쓰를 생성하는 변이주이다. 바람직하게는, 점성의 임의의 직접적인 또는 간접적인 측정과 관련하여 변이주, 변경된 점성의 주 및 모 주 사이의 차이는 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 또는 심지어 50% 이상이거나 또는 그보다 크다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "일차적 유전자적 결정자"는 다른 유전자, 또는 이의 유전자 조작의 부재 하에 특정한 표현형을 부여하는 데 필요하고 상기 부여에 충분한, 유전자 또는 이의 유전자 조작을 말한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능성 폴리펩티드/단백질"은 활성, 예를 들어 효소 활성, 결합 활성, 표면 활성 특성 등을 보유하며, 그 활성이 폐지되거나 또는 감소되도록 돌연변이 유발된 것이 아니거나, 절단된 것이 아니거나, 또는 달리 변형된 것이 아닌 단백질이다. 기능성 폴리펩티드는 열안정성이거나 또는 열불안정성일 수 있으며, 이는 명시된 바와 같다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기능성 유전자"는 활성 유전자 생성물, 전형적으로 단백질을 생성하기 위하여 세포 성분들에 의해 사용될 수 있는 유전자이다. 기능성 유전자는 파괴된 유전자의 대조물(antithesis)이며, 상기 파괴된 유전자는 활성 유전자 생성물을 생성하기 위하여 세포 성분들에 의해 사용되는 것이 가능하지 않도록 변형된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변이 세포 (또는 변이주)는 변이 세포와 모 세포 사이의 단백질 발현 차이가 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 7% 미만, 약 5% 미만, 또는 심지어 약 3% 미만일 경우 모 세포 (또는 모 주)와 비교하여 "높은 수준의 단백질 발현 및/또는 분비를 유지하거나 또는 보유한다".

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 숙주 세포는, 야생형 Sfb3 단백질에 특징적인 활성, 특히 균사의 신장을 촉진하는 활성 또는 달리 액체 배양에서 사상균의 점성을 증가시키는 활성을 나타내는 기능성 Sfb3 폴리펩티드의 생성을 방지하도록 숙주 세포가 유전자적으로 또는 화학적으로 변경된 경우 "Sfb3의 생성을 방지하도록 변경되었다". 그러한 변형은 sfb3 유전자의 결실, sfb3 유전자의 파괴, 코딩된 폴리펩티드에서 전술한 활성이 결여되도록 하는 sfb3 유전자의 변형, 번역 후 프로세싱 또는 안정성에 영향을 주는 sfb3 유전자의 변형, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "관심대상의 단백질"은 사상균 세포의 침지 배양에서 생성하기를 원하는 단백질이다. 일반적으로, 관심대상의 단백질은 산업 용도 또는 제약 용도에 상업적으로 중요하여서 이것이 다량으로 생성되는 것이 바람직해지게 한다. 관심대상의 단백질은, 일반적으로 생성물로서 관심대상이 아니며 주로 배경 단백질 오염물질로 간주되는, 사상균 세포에 의해 발현되는 무수한 다른 단백질과 구별되어야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변이 세포 (또는 변이주)는, 변이 세포에 의해 생성되는 단백질의 양이 모 세포에 의해 생성되는 단백질의 양과 비교하여 20% 이하만큼 감소되거나, 15% 이하만큼 감소되거나, 10% 이하만큼 감소되거나, 심지어 5% 이하만큼 감소될 경우 바이오매스의 단위량 당 모 세포 (또는 모 주)와 "사실상 동량의" 단백질을 생성하며, 여기서 단백질의 양은 단백질 생성량을 측정하는 세포의 바이오매스의 총 양에 대하여 정규화되며, 바이오매스는 (예를 들어, 세포 펠렛의) 습윤 또는 건조 중량으로 표현될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변이 세포 및 모 세포에 의해 발현되는 관심대상의 단백질의 양은, 변이 세포와 모 세포 사이의 발현 차이가 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 심지어 약 1% 미만일 경우 "사실상 유사하다".

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "형광색소"는 형광 염료이다. 바람직한 형광색소는 진균류의 세포벽 내의 키틴 및/또는 셀룰로오스에 결합한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형("a", "an" 및 "the")은 그 문맥에서 명백하게 달리 기술되지 않으면 복수형 지시 대상을 포함한다. 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 하기 약어/두문자어는 달리 특정되지 않는 한 하기 의미를 갖는다:

EC 효소 위원회(enzyme commission)

kDa 킬로달톤

kb 킬로베이스

MW 분자량

w/v 중량/부피

w/w 중량/중량

v/v 부피/부피

wt% 중량 퍼센트

℃ 섭씨 온도

H₂O 물

H₂O₂ 과산화수소

dH₂O 또는 DI 탈이온수

dIH₂O 탈이온수, 밀리-큐(Milli-Q) 여과

g 또는 gm 그램

μg 마이크로그램

mg 밀리그램

kg 킬로그램

lb 파운드

μL 및 μl 마이크로리터

mL 및 ml 밀리리터

mm 밀리미터

μm 마이크로미터

M 몰랄

mM 밀리몰랄

μM 마이크로몰랄

U 단위

ppm 백만분율

sec 및 " 초

min 및 ' 분

hr 시간

EtOH 에탄올

eq. 당량

N 노르말

PCR 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)

DNA 데옥시리보핵산

FOA 플루오로오로트산

UV 자외광

A₅₄₀ 540 nm 파장에서 측정된 흡광도

CMC 카르복시메틸 셀룰로오스

rpm 분 당 회전수

Δ 결실에 관련됨

DO 용존 산소

III . 사상균에서의 감소된 점성 표현형

트리코데르마 레에세이의 감소된 점성의 균주를 개발하려는 이전의 노력은 화학적 돌연변이 유발, 이어서 생성된 돌연변이체 (때로 본 명세서에서 "주"로 칭해짐)를 진균류의 세포벽의 키틴 및 셀룰로오스에 결합하는 형광색소 착색제인 칼코플루오르 화이트에 대한 민감성에 대하여 스크리닝하는 것을 수반하였다. 사상균에서의 칼코플루오르 화이트 민감성의 유의성이 지금까지 공지되지 않았지만 칼코플루오르 화이트에 대한 민감성은 효모 형태의 변화와 관련된다. 이러한 방식으로 모 트리코데르마 레에세이 주 Morph TrglaA (29-9)를 화학적으로 돌연변이 유발시켰으며, 하나의 생성된 주(즉, 70H2)는 고수준의 단백질 발현 및 분비를 유지하면서 액체 배지에서 감소된 점성, 변경된 형태, 감소된 포자 형성, 그리고 한천 플레이트 상에서 감소된 콜로니 성장 속도를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 비교용 게놈 서열 분석에 의하면 모 29-9 주에 비하여 70H2 주에서 다수의 유전자에서 돌연변이가 나타났다.

70H2 주는 "감소된 점성" 표현형을 보인 반면, 이것은 완전히 규정된 게놈이 결여되었으며, 감소된 점성 표현형에 책임이 있는 유전자 또는 유전자들은 공지되지 않았다. 게다가, 70H2는 고수준의 발현을 위하여 외인성 유전자를 도입하기 위한 숙주 주로서 사용될 수 있는 반면, 감소된 점성 표현형에 책임이 있는 유전자 또는 유전자들을 다른 주 내로 도입하는 것은 가능하지 않았다.

IV . Sfb3 생성에서의 변경은 사상균에서 세포 점성에 영향을 준다

Sfb3 생성에서의 변경이 사상균에서 세포 점성에 영향을 준다는 것이 지금에 와서야 발견되었다. 이러한 발견은 상업적으로 중요한 단백질의 발현을 위한 사상균의 사용에 있어서 중요한 함축성을 갖는다.

Sfb3 유전자(Lst1로도 공지됨)는 이전에는 단지 출아 효모(즉, 사카로마이세스 세레비지애)에서 특성화되었는데, 상기 유전자는 단백질을 소포체로부터 골지(Golgi) 장치로 이동시키는 수송 소포를 둘러싸고 있는 COPII 단백질 코트와 결부된 단백질을 코딩한다. Sfb2뿐만 아니라 Sfb3도 Sec24의 상동체이며, 상기 유전자 전부는 특정 카고(cargo) 단백질을 소낭으로 패키징하는 것과 관계된다.

Sec24는 효모에서 필수 유전자인 반면, Sfb3 및 Sfb2는 그렇지 않지만, 효모에서 Sfb3의 결실은 세포벽 합성에 연루된 글루카노실트랜스퍼라아제(Gas1p) 및 원형질막 수송 단백질(Pma1p)의 수송에 영향을 주는 것으로 공지되어 있다.

질의(query) 서열로서 에스. 세레비지애 Sec24p, Sfb3p 또는 Sfb2p 아미노산 서열을 사용한, BLAST를 이용한 트리코데르마 레에세이의 공개적으로 이용가능한 게놈 서열의 검색은 티. 레에세이가 효모 Sec24에 대하여 가장 밀접하게 상동성인 단일 유전자 및 효모 Sfb3에 대하여 가장 밀접하게 상동성인 단일 유전자를 가짐을 나타낸다. 다른 상동체는 확인되지 않았으며, 이는 티. 레에세이가 Sfb2와 동등한 유전자를 갖지 않음을 시사하였다.

질의 서열로서 티. 레에세이 Sfb3 아미노산 서열을 사용한, BLAST를 이용한 페지조마이코티나 종의 공개적으로 이용가능한 게놈 서열의 검색은 일반적인 패턴을 보인다. 즉, 각각의 진균류는 Sfb3 및 Sec24 각각의 명백한 상동체를 갖지만, 효모 Sfb2에 더욱 밀접하게 관련된 추가의 상동체는 이들 사상 자낭균류의 게놈에 존재하지 않는다.

Sfb3 단백질의 상동체는 사상균, 예를 들어 트리코데르마 레에세이 및 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)에서 발견되지만, 이들 단백질의 기능은 지금까지 공지되지 않았다. 에스. 세레비지애 (서열 번호 1), 티. 레에세이 (서열 번호 2), 에이. 오리자에 (서열 번호 3), 에이. 니게르(A. niger) (서열 번호 4), 피. 푸니쿨로숨(P. funiculosum) (서열 번호 5), 피. 크리소게눔(P. chrysogenum) (서열 번호 6), 엔. 크라사(N. Crassa) (서열 번호 7), 및 에프. 옥시스포룸(F. oxysporum) (서열 번호 8) Sfb3단백질의 아미노산 서열은 하기에 예로서 예시되어 있으며; 서열 번호 4-8은 공개적으로 접근가능한 진균류 게놈 데이터베이스로부터 얻어졌지만, 등록 번호를 갖는 것은 아니다.

사카로마이세스 세레비지애 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 1):

트리코데르마 레에세이 Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 2):

아스페르길루스 오리자에 RIB40 Sfb3 아미노산 서열 ( GI : 83766074; 서열 번호 3):

아스페르길루스 니게르 ( Aspergillus niger ) Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 4)

페니실륨 푸니쿨로숨 ( Penicillium funiculosum ) Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 5)

페니실륨 크리소게눔 ( Penicillium chrysogenum ) Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 6)

뉴로스포라 크라사 ( Neurospora crassa ) Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 7)

푸사륨 옥시스포룸 ( Fusarium oxysporum ) Sfb3 아미노산 서열 (서열 번호 8)

에스. 세레비지애 (서열 번호 1) 및 티. 레에세이 (서열 번호 2) 유래의 Sfb3 단백질들의 아미노산 서열들의 정렬이 도 13에 예시되어 있다. 이들 서열은 아미노산 서열 동일성이 대략 30%이다. 이와는 대조적으로, 티. 레에세이 및 에이. 오리자에 유래의 Sfb3 단백질들은 아미노산 서열 동일성이 대략 58%이다. 에스. 세레비지애 (서열 번호 1), 티. 레에세이 (서열 번호 2), 및 에이. 오리자에 (서열 번호 3) 유래의 Sfb3 단백질들의 아미노산 서열들의 정렬이 도 14에 예시되어 있다.

대략 40가지의 페지조마이코티나 종들 유래의 Sfb3 단백질들의 아미노산 서열들의 정렬은 특정 아미노산 서열, 즉, IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL (서열 번호 9, 여기서 X는 임의의 아미노산 잔기임)을 나타냈으며, 이는 Sfb3 단백질의 C-말단과 가깝고 Sec24 단백질에서는 발견되지 않는다. 이 콘센서스(consensus) 서열을 이용하여 페지조마이코티나의 다른 구성원에서 Sfb3 단백질을 확인할 수 있다.

별도의 연구에 의하면, gas1 유전자 (또는 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)에서 공지된 바와 같은 gel1 유전자)의 돌연변이는 진균류 세포벽 구조에 영향을 주며 칼코플루오르 화이트, 콩고 레드(Congo Red) 및 소듐 도데실 설페이트에 대한 과민성뿐만 아니라 형태 변화에도 이르게 됨이 밝혀졌다.

이론에 제한되지 않고서, 사상균에서의 Sfb3 발현 및/또는 활성의 변경은 세포벽 합성에 연루된 단백질의 수성을 간섭하며 이럼으로써 세포벽 구조를 변경시키고 더욱 짧은 균사 및 효모와 더욱 유사한 외관을 특징으로 하는 더욱 콤팩트한(compact) 세포 형태를 생성하게 되는 것으로 여겨진다. 세포벽 합성에 연루된 단백질에 있어서의 가능한 후보는 Gas1/Gel1이다.

액체 배지에서 변경된 점성의 표현형을 나타내는 사상균 변이주는 상업적으로 중요한 단백질의 대규모 생산에 적절할 수 있다. 본 발명의 주 및 방법은 사상균 티. 레에세이를 이용하여 예시되는 반면, 페지조마이코티나 내에서의 Sfb3 단백질의 기능은 보존될 것으로 기대된다. 따라서 본 발명의 주 및 방법은 결코 티. 레에세이에 한정되지 않는다.

V. Sfb3 단백질 생성이 변경된 사상균주

일 태양에서, 모 주로부터 유래된 사상균의 변이주가 제공되며, 이 변이주는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 변경된 양의 기능성 Sfb3 단백질을 생성하게 하는 유전자 변경을 포함한다. 호기성 발효 동안 변이주의 세포는 후속적으로 침지 배양에서 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 변경된 양의 교반을 필요로 하는 세포 브로쓰, 또는 소정량의 교반에서 변경된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 매스를 생성한다.

일부의 경우, 유전자 변경은 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 감소된 양의 기능성 Sfb3 단백질을 생성하게 하며, 생성된 세포 브로쓰는 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하거나, 또는 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 더욱 높은 용존 산소 함량을 유지한다. 그러한 경우, 변이주의 세포 매스는 모 주의 세포 매스와 비교하여 감소된 점성을 나타내는 것으로 여겨지는데, 이는 용존 산소 함량 및 교반에 관련된 관찰을 설명한다.

기능성 Sfb3 단백질의 양의 감소는 모 주에 존재하는 sfb3 유전자의 파괴에서 생길 수 있다. sfb3 유전자의 파괴는 변이주에 감소된 점성 표현형을 부여하는 일차적인 유전자적 결정자이기 때문에, 그러한 변이주는 파괴된 sfb3 유전자만을 포함할 필요가 있는 반면 모든 다른 유전자는 온전하게 남아있을 수 있다. 일부의 경우, 변이주는 그가 유래된 모 주와 비교하여 추가의 유전자 변경을 선택적으로 포함할 수 있다. 그러한 추가의 유전자 변경은 점성 감소를 부여하는 데 필요하지 않지만, 다른 유리한 것을 그 주에 부여할 수 있다.

sfb3 유전자의 파괴는 기능성 sfb3 유전자 생성물, 즉 Sfb3 단백질의 발현을 사실상 방지하는 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예시적인 파괴 방법은 sfb3 유전자의 완전한 또는 부분적인 결실을 포함하며, 이는 예를 들어 Sfb3 코딩 서열, 프로모터, 종결자, 인핸서 또는 다른 조절 요소의 완전한 또는 부분적인 결실을 포함한다. 또한 sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 임의의 부분을 포함하는 염색체의 일부분의 완전한 또는 부분적인 결실에 의해 수행될 수 있다. sfb3 유전자의 특정한 파괴 방법은 sfb3 유전자의 임의의 부분, 예를 들어, Sfb3 코딩 서열, 프로모터, 종결자, 인핸서 또는 다른 조절 요소 내에 뉴클레오티드 치환 또는 삽입을 행하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 결실, 삽입 및/또는 치환 (돌연변이로 총칭됨)은 일반적으로 특정 핵산 서열을 표적화하지 않는 화학적 돌연변이 유발에 의한 것에 반대되는, 서열 특이적 분자 생물학 기술을 이용한 유전자 조작에 의해 행해진다.

sfb3 유전자에서의 돌연변이는 sfb3 프로모터의 효율을 감소시키거나, sfb3 인핸서의 효율을 감소시키거나, sfb3 mRNA의 스플라이싱 또는 에디팅(editing)을 간섭하거나, sfb3 mRNA의 번역을 간섭하거나, 종결 코돈을 Sfb3 코딩 서열 내로 도입하여 전장 Sfb3 단백질의 번역을 방지하거나, Sfb3 단백질의 코딩 서열을 변화시켜 덜 활성인 또는 불활성인 단백질을 생성하거나 또는 Sfb3과 다른 세포벽 성분들의 상호작용을 감소시키거나, Sfb3 단백질의 코딩 서열을 변화시켜 덜 안정성인 단백질을 생성하거나 또는 파괴를 위하여 당해 단백질을 표적화하거나, Sfb3 단백질이 잘못 폴딩되게(misfold) 하거나 또는 부정확하게 변형되게 하거나(예를 들어, 글리코실화에 의해), 또는 Sfb3 단백질의 세포 궤적의 추적을 간섭할 수 있다.

일반적으로, 이들 및 다른 유전자 조작의 목표는 기능성 Sfb3 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 방지하거나, 또는 Sfb3 단백질의 정상적인 생물학적 활성을 감소시키거나 또는 방지하고 이럼으로써 감소된 점성 표현형으로 이어지는 형태 변화를 생성하는 것이다.

다른 경우에, 유전자 변경은 기능성 Sfb3 단백질의 발현을 증가시키거나 또는 회복시키거나, 또는 Sfb3 단백질의 정상적인 생물학적 활성을 증가시키고 이럼으로써 증가된 또는 회복된 점성 표현형으로 이어지는 형태 변화를 생성한다. Sfb3 기능을 증가시키거나 또는 회복시키는 예시적인 유전자 변경으로는 sfb3 유전자의 추가의 카피를 세포 내로 도입하는 것, sfb3 프로모터, 인핸서, 또는 다른 제어 요소의 효율을 증가시키는 것, Sfb3 단백질을 코딩하는 mRNA의 번역을 증가시키는 것, Sfb3 단백질을 코딩하는 mRNA의 안정성을 증가시키는 것, Sfb3 단백질의 활성 또는 안정성을 증가시키는 sfb3 유전자 내에 변화를 도입하는 것, sfb3 유전자 내에 변화 - 이는 다른 단백질 또는 세포벽 성분들과의 상호작용을 조정함 - 를 도입하는 것 등이 있다. Sfb3 기능을 증가시키거나 또는 복구시키는 다른 유전자 변경으로는 기능성 Sfb3 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 방지하는 유전자 변경의 효과를 역전시키는 것이 있다.

조작을 위한 사상균 세포 및 기재되어 있는 용도는 일반적으로 아스코마이코타 문, 페지조마이코티나 아문, 특히 영양 균사 상태를 가지며 sfb3 유전자의 상동체를 포함하는 진균류로부터의 것이다. 그러한 유기체는 상업적으로 중요한 공업용 및 의약용 단백질의 생성에 사용되는 사상균 세포를 포함하며, 이는 트리코데르마 spp., 아스페르길루스 spp., 푸사륨 spp., 세도스포륨(Scedosporium) spp., 페니실륨 spp., 크리소스포륨(Chrysosporium) spp., 세팔로스포륨(Cephalosporium) spp., 탈라로마이세스(Talaromyces) spp., 게오스미티아(Geosmithia) spp., 마이셀리오프토라(Myceliophthora) spp., 및 뉴로스포라(Neurospora) spp.를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 특정 유기체는 트리코데르마 레에세이 (이전에는 트리코데르마 롱기브라키아툼 및 하이포크레아 제코리나로 분류됨), 아스페르길루스 니게르, 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 이타코니쿠스(Aspergillus itaconicus), 아스페르길루스 오리자에, 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스페르길루스 테레우스(Aspergillus terreus), 아스페르길루스 소재(Aspergillus sojae), 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 세도스포륨 프롤리피칸스(Scedosporium prolificans), 뉴로스포라 크라사, 페니실륨 푸니쿨로숨, 페니실륨 크리소게눔, 탈라로마이세스 (게오스미티아) 에메르소니이(Talaromyces (Geosmithia) emersonii), 푸사륨 베네나툼(Fusarium venenatum), 마이셀리오프토라 서모필라(Myceliophthora thermophila), 및 크리소스포륨 루크노웬세(Chrysosporium lucknowense)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 예를 들어, 사상균이 티. 레에세이일 경우, sfb3 유전자는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 다른 실시 형태에서, sfb3 유전자는 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는, 예를 들어, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는 단백질을 코딩한다.

일부 실시 형태에서, 예를 들어, 사상균이 에이. 오리자에일 경우, sfb3 유전자는 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 다른 실시 형태에서, sfb3 유전자는 서열 번호 3의 아미노산 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 아미노산 서열 동일성을 갖는, 예를 들어, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는 단백질을 코딩한다.

일부 실시 형태에서, 예를 들어, 사상균이 티. 레에세이일 경우, sfb3 유전자는 하기에 나타낸 서열 번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 다른 실시 형태에서, sfb3 유전자는 서열 번호 10의 뉴클레오티드 서열에 대하여 특정한 정도의 전체 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는, 예를 들어, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 심지어 약 99% 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

트리코데르마 레에세이 sfb3 DNA 서열 (서열 번호 10; 2개의 인트론에는 밑줄이 그어져 있음):

VI . 사상균 세포의 점성 표현형을 변경시키는 방법

다른 태양에서, 사상균 세포의 형태를 변경시키는 방법이 제공된다. 변이형 사상균 세포는 고형 배지 상에서 변경된 성장 형태를 나타내며, 침지 배양에서 성장시킬 때 점성이 상이한 세포 매스를 생성한다.

일부의 경우, 본 방법은 적합한 유전자적 또는 화학적 방법을 이용하여 모 주에서 sfb3유전자를 파괴하는 단계를 포함하며, 여기서 호기성 발효 동안 변이주는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하거나 또는 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하는 세포 브로쓰를 생성한다. 그러한 방법은 상기 및 다른 곳에 기재된 임의의 방식으로 sfb3유전자를 파괴하는 데 사용될 수 있다. 바람직하게는, sfb3유전자의 파괴는 일반적으로 특정 핵산 서열을 표적화하지 않는 화학적 돌연변이 유발에 반대되는 서열 특이적 분자 생물학 기술을 이용한 유전자 조작에 의해 수행된다.

일부 실시 형태에서, 감소된 점성 표현형이 도입된 모 주는 고수준으로 발현시키고자 하는 관심대상의 유전자를 이미 포함한다. 이러한 방식으로, 본 발명의 방법은 생산을 위하여 기존의 감소된 점성의 주 내로 관심대상의 유전자를 도입할 필요성을 배제한다. 따라서, 본 발명의 방법은 관심대상의 유전자를 이미 포함하는 모 주로부터 사상균 세포의 감소된 점성의 변이주를 생성하는 데 사용될 수 있다.

다른 태양에서, 변경된 점성 표현형에 대하여 사상균 세포를 스크리닝하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 사상균 세포 (예를 들어, 돌연변이 유발된 세포 또는 시야 단리체)의 패널을 형광색소 착색제에 대한 변경된 민감성에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 형광색소 착색제에 대한 변경된 민감성은 침지 배양에서 호기성 발효 동안 변이 세포가 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 및/또는 소정량의 교반에서 증가되거나 또는 감소된 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 더하거나 덜한 교반을 필요로 하는 세포 브로쓰를 생성하는 것을 나타낸다. 이러한 방식으로, 형광색소 착색제에 대한 민감성은 변경된 점성 표현형을 갖는 변이형 사상균 세포를 확인하는 데 사용될 수 있다. 일부의 경우, 본 방법은 사상균 세포 (예를 들어, 돌연변이 유발된 세포 또는 시야 단리체)의 패널을 형광색소 착색제에 대한 증가된 민감성에 대하여 스크리닝하는 단계를 포함하며, 여기서 형광색소 착색제에 대한 증가된 민감성은 침지 배양에서 호기성 발효 동안 변이 세포가 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 및/또는 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 교반을 필요로 하는 세포 브로쓰를 생성함을 나타낸다. 이러한 방식으로, 형광색소 착색제에 대한 민감성은 감소된 점성 표현형을 갖는 변이형 사상균 세포를 확인하는 데 사용될 수 있다.

예시적인 형광색소는 사상균의 세포벽의 셀룰로오스 및/또는 키틴에 결합하며, 칼코플루오르 화이트 (CAS 번호: 4193-55-9), 콩고 레드 (CAS 번호: 573-58-0), 솔로페닐 플라빈(Solophenyl Flavine) (CAS 번호: 61725-08-4), 폰타민 패스트 스칼렛(Pontamine Fast Scarlet) (CAS 번호: 79770-29-9), 및 프리물린(primulin) (CAS 번호: 30113-37-2)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

일반적으로 사상균의 모 주에서 sfb3 유전자를 파괴하는 데 사용되는 특정 유전자 기술은, 그 기술이 서열 특이적 방식으로 sfb3 유전자를 표적화하기만 한다면, 당해 방법에 대단히 중요한 것은 아니다. 예시적인 방법으로는 부위 특이적 재조합, 표적화 유전자 삽입, 전위 요소(transposable element)의 사용, 바이러스에 의한 형질감염, 및 RNA-매개 유전자 사일런싱의 사용이 있다 (문헌[Raponi M. and Arndt, G.M. (2003) Nucleic Acids Research 31:4481-89l]; 문헌[Nakayashiki H. and Nguyen, Q.B. (2008) Current Opinion in Microbiology 11:494-502]; 문헌[Kuck, U. and Hoff, B. (2010) Applied and Environmental Biotechnology 86:51-62]).

원할 경우, sfb3유전자의 파괴는 예를 들어 선발가능 마커, 형광 마커 또는 다른 구별가능한 마커, 클로닝 부위 또는 클로닝 카세트, 주의 후속적인 확인을 허용하기 위한 서열 핑거프린트(fingerprint), 또는 주에 특수성 또는 기능성을 부가하기 위한 다른 유전자 변형의 동시적인 또는 순차적인 삽입이 동반될 수 있다. 몇몇 경우에, sfb3유전자 파괴 부위에 감소된 점성 주에서의 고수준 발현용으로 의도된 관심대상의 유전자를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 경우, 감소된 점성 표현형의 도입 및 관심대상의 유전자의 도입은 동시에 수행될 수 있다.

VII . 유용성

사상균의 감소된 점성 주의 사용은 침지 배양에서 산소 및 영양소의 분포를 개선시키고, 침지 배양물의 교반에 필요한 에너지의 양을 감소시키고, 상기 배양물에 존재하는 세포 매스를 증가시켜 증가된 단백질 생성에 이르게 되는 것으로 공지되어 있다. 그러나, 본 발명의 사상균 변이주는 이전에 기재된 감소된 점성 주에 비하여 유의한 이점을 제공한다.

첫째, 본 발명의 주는 완전히 규정된 게놈을 가져서 본 발명의 주가 후속적인 유전자 조작, 상보, 교배 등에 적절해지게 할 수 있다. 둘째, 본 발명의 주는 분비형 단백질 생성에서 악영향을 받지 않는다. 셋째, 감소된 점성 주는 본질적으로 임의의 모 주로부터 생성될 수 있으며, 상기 모 주는 고수준 발현용으로 의도된 단백질(즉, 관심대상의 단백질)을 이미 생성하거나, 선발가능한 마커를 이미 코딩하거나, 또는 생성 숙주에서 바람직한 다른 특징을 이미 포함하는 모 주를 포함한다. 따라서, 본 발명의 주 및 방법은 기존의 감소된 점성 생성 주 내로 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 이전시키는 것에 대한 필요성을 배제시킨다.

본 발명의 주 및 방법은 사상균의 침지 배양에서 상업적으로 중요한 단백질의 생성에서 그 용도를 찾는다. 상업적으로 중요한 단백질은 예를 들어 셀룰라아제, 자일라나아제, 펙티나아제, 라이아제, 펙티나아제, 프로테아제, 아밀라아제, 풀룰라나아제, 리파아제, 에스테라아제, 퍼하이드롤라아제, 트랜스퍼라아제, 락카아제, 카탈라아제, 옥시다아제, 리덕타아제, 하이드로포빈, 및 사상균에서 발현될 수 있는 다른 효소 및 비효소 단백질을 포함한다. 그러한 단백질은 산업 용도용 또는 제약 용도용일 수 있다.

본 발명의 주 및 방법의 이들 및 다른 태양과 실시 형태는 본 설명을 고려하면 당업자에게 명백해질 것이다. 하기 실시예는 본 주 및 방법을 추가로 예시하고자 하는 것이며, 본 주 및 방법을 한정하고자 하는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예를 읽는 것을 돕기 위하여, 일반명, 제넨코르 주 콜렉션 번호(Genencor strain collection number; GICC#), 및 출발 사상균주의 선택된 특징을 표 1에 열거한다. 생성된 사상균주에 대한 동일한 정보를 표 2에 열거한다. 실시예에서 사용한 핵산 프라이머를 표 3에 열거한다. 소형 대문자 형태의 서열은 PCR 증폭 단편의 직접적인 절단을 허용하기 위하여 부가된 뉴클레오티드이다. 이탤릭체의 서열은 제한 효소 인식 부위이다. 볼드체의 서열은 loxP 부위이다. 밑줄이 그어진 CACC 서열을 적절한 프라이머에 부가하여 GATEWAY 엔트리 벡터 내로의 증폭 DNA 단편의 혼입을 허용하였다.

[표 1]

[표 2]

[표 3]

실시예에서 사용한 배지 및 다른 스톡(stock) 용액을 하기에 설명한다:

보겔 최소 배지(VOGEL'S MINIMAL MEDIUM; VM) 1 L

50x 보겔 용액 20 mL

50% 글루코스 20 mL

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

한천 20 g

오토클레이브

50x 보겔 용액

시트르산나트륨.2H₂O 125 g

KH₂PO₄ (무수) 250 g

NH₄NO₃ 100 g

MgSO₄.7H₂O 10 g

CaCl₂.2H₂O 5 g

보겔 미량 원소 용액 5 mL

보겔 바이오틴 용액 2.5 mL

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

필터 살균

보겔 미량 원소 용액

시트르산 50 g

ZnSO₄.7H₂O 50 g

Fe(NH₄)₂SO₄.6H₂O 10 g

CuSO₄.5H₂O 2.5 g

MnSO₄.4H₂O 0.5 g

H₃BO₃ 0.5 g

Na₂MoO₄.2H₂O 0.5 g

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

필터 살균

보겔 바이오틴 용액 1 L

D-바이오틴 0.1 g

필터 살균

VM 하이그로마이신 배지( VM HYGROMYCIN MEDIUM ; VMH ) 1 L

50x 보겔 용액 20 mL

50% 글루코스 20 mL

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

한천 20 g

오토클레이브

VM 소르비톨 하이그로마이신 배지( VM SORBITOL HYGROMYCIN MEDIUM ; VMSH ) 1 L

50x 보겔 용액 20 mL

50% 글루코스 20 mL

소르비톨 218.64 g

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

한천 20 g

오토클레이브

하이그로마이신 B (50 mg/mL의 스톡) 1 mL

감자 덱스트로스 한천( POTATO DEXTROSE AGAR ; PDA ) 1 L

비디 디프코(BD Difco) 감자 덱스트로스 한천 39 g

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

오토클레이브

콩고 레드 배지( CONGO RED MEDIUM ; CR ) 1L

VM 또는 PDA를 제조

오토클레이브

1% 콩고 레드 스톡 6 mL

1% 콩고 레드 스톡 25 mL

콩고 레드 250 mg

dH₂O 25 mL

필터 살균

YEG 배지 1L

효모 추출물 5 g

글루코스 20 g

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

오토클레이브

티. 레에세이 글리신 최소 배지 1 L

글리신 6 g

(NH₄)₂SO₄ 4.7 g

KH₂PO₄ 5 g

MgSO₄.7H₂O 1 g

100mg/mL CaCl₂*2H₂O 용액 10 mL

티. 레에세이 미량 원소 400X 2.5 mL

PIPPS 33 g

50% NaOH로 pH를 5.50으로 조정 (리터 당 약 5 mL).

최종 부피가 되도록 dH₂O를 첨가

오토클레이브.

글루코스/소포로스를 첨가 25 mL

티. 레에세이용 미량 원소 400x 1 L

시트르산 (무수) 175 g

FeSO₄.7H2O 200 g

ZnSO₄.7H2O 16 g

CuSO₄.5H2O 3.2 g

MnSO₄.H2O 1.4 g

H₃BO₃ (붕산) 0.8 g

실시예 1. 감소된 점성 표현형을 얻기 위한 티. 레에세이 주 Morph 및 29-9로부터의 sfb3 의 결실

1.1. Δ sfb3 결실 카세트의 생성

티. 레에세이 sfb3 유전자의 5' 말단의 측면에 있는 DNA 서열을 AVG88/AVG89 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시켰다. 이 프라이머 쌍을 이용한 상기 단편의 증폭은 상기 단편의 5' 말단에 SalI 부위를 도입하고 상기 단편의 3' 말단에 BglII 부위를 도입하였다. 병렬 loxP 부위들이 측면에 있는 하이그로마이신 B 내성 카세트를 AVG90/AVG91 프라이머 쌍을 이용하여 플라스미드 pCR-Blunt II-hph-loxP#4 (도 1)로부터 증폭시켜 상기 단편의 5' 말단에 BglII 부위를 도입하고 상기 단편의 3' 말단에 NotI 부위를 도입하였다. sfb3의 3' 말단의 측면에 있는 DNA 서열을 AVG92/AVG93 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시켜 상기 단편의 5' 말단에 NotI 부위를 도입하고 상기 단편의 3' 말단에 XbaI 부위를 도입하였다.

상기 3개의 단편을 벡터 pCR(등록상표)-Blunt II-TOPO(등록상표) (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.)) 내로 연속적으로 라이게이션시키고, 생성된 플라스미드를 pCR-Blunt II-TOPO 889092 (도 2)로 명명하였다. sfb3 유전자의 5' 및 3' 측면부의 DNA 서열을 Morph TrglaA (29-9) 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 증폭시켰다. 3' sfb3 측면부, 각각의 말단이 loxP 부위로 둘러싸인 하이그로마이신 B-내성 카세트, 및 5' sfb3 측면부를 함유하는 ·sfb3 결실 카세트를 AVG104/AVG105 프라이머 쌍을 이용하여 플라스미드 pCRBluntII-TOPO 889092로부터 증폭시켰다. 다수의 PCR 반응물들을 풀링하고(pooled), PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 에탄올로 침전시켜 증폭 DNA 단편을 농축시켰다. 그와 같이 제조한 DNA를 후속 단계에서 사용하였다.

1.2. sfb3 유전자가 결여된 주 29-9 Δ sfb3 및 Morph Δ sfb3 의 생성

주 Morph 및 29-9를 PEG-매개 형질전환에 의해 Δsfb3 결실 카세트로 형질전환시키고, 하이그로마이신 B 및 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 도말하였다. 트리코데르마 형질전환이 예를 들어 미국 특허 제5,246,853호에 기재되어 있다. 후보들 (29-9 + Δsfb3의 경우 684개, 그리고 Morph + Δsfb3의 경우 348개)을 하이그로마이신 B를 함유하는 보겔 최소 배지로 옮겨서 하이그로마이신 B 내성 후보에 대하여 선발하였다. 하이그로마이신 B 내성 형질전환체를 콩고 레드를 함유하는 PDA 또는 보겔 최소 배지로 옮겨서 콩고 레드 민감성을 평가하였다. PCR 분석에 의하면 하나의 콩고 레드-민감성 후보가 각각의 형질전환으로부터 나타났으며, 여기서 Δsfb3 결실 카세트가 상동 재조합에 의해 sfb3 유전자좌에 통합되었다 (도 3). 29-9 Δsfb3 및 Morph Δsfb3 둘 모두에서의 sfb3 유전자좌에서의 Δsfb3 결실 카세트의 상동적 통합은 AVG108/AVG109, AVG110/AVG111 및 AVG108/AVG111 프라이머 쌍을 사용하여 기대되는 크기의 DNA 단편을 증폭시킴으로써 확증하였다. AVG108/AVG109 프라이머 쌍은 AVG88/AVG89 결실 카세트 영역의 5' 말단 바깥쪽에서 시작하여 하이그로마이신 B 내성 카세트 내에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시킨다. AVG110/AVG111 프라이머 쌍은 하이그로마이신 B 내성 카세트 내에서 시작하여 AVG92/AVG93 결실 카세트 영역의 3' 말단 바깥쪽에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시킨다. AVG108/AVG110 프라이머 쌍은 sfb3 유전자좌에 통합된 전 결실 카세트를 증폭시킨다. 결실 카세트의 확인된 상동적 통합을 갖는 생성된 주들을 각각 29-9 Δsfb3 및 Morph Δsfb3으로 명명하였다.

1.3. 침지 배양에서의 주 29-9, 70 H2 , 및 29-9 Δ sfb3 의 성장

주 29-9, 70H2, 및 29-9 Δsfb3을 침지(액체) 배양에서 동일 조건 하에 성장시키고, 이들의 성장 표현형들을 비교하였다.

간략하게는, 각각의 주의 포자를 측부 배플 및 기저부 배플 둘 모두를 갖춘 3 L 플라스크 내의 500 mL의 배지에 별도로 첨가하였다. 배지는 5 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 4.5 g/L의 KH₂PO₄, 1 g/L의 MgSO₄·7H₂O, 및 14.4 g/L 시트르산을 함유하였으며, 이는 5% NaOH를 이용하여 pH 5.5로 조정하였다. 30분 동안 오토클레이빙한 후, 살균 60% 글루코스를 27.5 g/L의 최종 농도로, 175 g/L의 시트르산, 200 g/L의 FeSO₄·7H2O, 16 g/L의 ZnSO₄·7H₂O, 3.2 g/L의 CuSO₄·5H₂O, 1.4 g/L의 MnSO₄·H₂O, 및 0.8 g/L의 H₃BO₃을 함유하는 2.5 mL/L의 미량 원소 용액과 함께 첨가하였다. 상기 배양물을 진탕 인큐베이터에서 34℃에서 48시간 동안 성장시켰다.

48시간 후, 각각의 플라스크의 내용물들을 4.7 g/L의 KH₂PO₄, 1.0 g/L의 MgSO₄·7H₂O, 4.3 g/L의 (NH₄)₂SO₄ 및 2.5 mL/L의 상기 미량 원소 용액을 함유하는 9.5 L의 배지를 함유하는 15 L 발효기에 별도로 첨가하였다. 이들 성분을 121℃에서 30분 동안 함께 가열 살균하였다. 60%의 글루코스 및 0.48%의 CaCl₂·2H₂O의 용액을 별도로 오토클레이브하고, 냉각시키고, 75 g/L의 글루코스 및 0.6 g/L의 CaCl₂·2H₂O의 최종 농도로 발효기에 첨가하였다. 배지를 28% NH₃으로 pH 3.5로 조정하고, 온도를 전체 성장 기간 동안 34℃에서 유지하였다.

상부 공간에 압력이 부가되지 않았을 때(즉, 0 ㎪ (0 bar)의 게이지 압력, 100 ㎪ (1 bar)의 절대 압력), 용존 산소(DO) 탐침자를 100%로 보정하였다. 그 후, 상부 공간 내의 압력을 70 ㎪ (0.7 bar) (게이지 압력)로 설정하였으며, 그 후 산소 탐침자가 170%로 판독된 후 시드(seed) 배양물을 첨가하였다. 발효기는 처음에 500 rpm으로 설정된 가변 속도 모터를 통한 혼합을 제공하는 2개의 4-블레이드 터빈을 함유하였다.

배양물이 성장함에 따라, 적어도 부분적으로는 사상균 균사의 증식으로 인한 브로쓰의 증가된 점성의 결과로서 DO 수준이 낮아졌다. DO가 40% 미만으로 하락했을 때, 교반 속도를 증가시켜 용존 산소를 40%로 유지하였다. DO가 40% 미만으로 하락하지 않는다면, 발효 실행(run) 동안 교반 속도를 증가시킬 필요가 없으며, 초기 교반 속도는 필요한 것보다 더 높았다. 글루코스가 완전히 소비되었을 때, 각각의 발효기에서 생성된 바이오매스의 양을 측정하였더니, 이는 모든 3가지 주에 있어서 사실상 동일한 것으로 밝혀졌다.

주어진 수준의 교반에서 각각의 발효기 내의 DO 수준, 및 주어진 DO 수준의 유지에 요구되는 교반의 양은 상이한 주 성장 표현형들로 인하여 상이한 브로쓰들의 점성의 간접적인 척도이다. 단지 하나의 변수(즉, DO 또는 교반)를 변화시키고 다른 하나를 측정하는 것이 이상적일 것이지만, 각각의 발효기에서 충분한 바이오매스의 생성을 보장하기 위하여 DO가 40% 미만으로 하락하지 않게 하고 이럼으로써 상이한 주들의 성장 사이의 더욱 유의미한 비교를 가능케 하는 것이 바람직하다.

일반적으로, 표적 DO 수준을 유지하기 위하여 교반 속도를 증가시키는 것이 필요할 경우, 교반의 양은 발효기 터빈을 구동시키는 모터에 공급되는 동력의 양에 의해 개산될 수 있으며, 이는 브로쓰의 점도와 상관되는 측정의 기준을 제공한다.

특히, 현탁된 배양물을 교반하는 데 요구되는 가외의 동력은 교반 속도의 세제곱에 비례한다. 표 4는 성장기의 마지막에 용존 산소를 40%로 유지하는 데 요구되는 최고 교반 속도를 나타낸다.

[표 4]

이들 성장 조건 하에서, 원래의 주, 29-9는 40%의 DO를 유지하고 당해 양의 바이오매스를 생성하기 위하여 70H2 또는 29-9 Δsfb3 주 중 어느 하나보다 2.6배 더 큰 동력을 요구하였다. 주 70H2 및 29-9 Δsfb3은 점성 특성이 유사하였으며, 현탁 배양에서 유사한 수준의 관심대상의 단백질(TrGA)을 생성하였고, 이는 감소된 점성의 성장 표현형이 sfb3 유전자의 파괴에 의해 사상균에 부여될 수 있음을 입증하는 것이었다.

1.4. Morph Δ sfb3 으로부터의, loxP 가 측면에 위치하는 하이그로마이신 B 내성 카세트의 제거

loxP가 측면에 위치하는 하이그로마이신 B 내성 카세트를 loxP 부위들 사이에서 재조합을 유도하는 cre 유전자의 일시적 발현에 의해 주 Morph Δsfb3으로부터 제거하였다. Morph Δsfb3 주를 cre-함유 텔로미어(telomeric) 플라스미드 pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre (도 4)로 형질전환시켜 loxP 부위들 사이에서 재조합을 유도하고 하이그로마이신 B 내성 카세트를 제거하였다. 이 벡터는 amdS 마커 카세트를 함유하여서 아세트아미드 함유 배지 상에서의 성장을 허용한다. 형질전환체를 일단 아세트아미드 함유 배지로 옮기고, 이어서 PDA 배지로 3회 옮겨서 cre-함유 텔로미어 플라스미드의 상실을 허용하였다. 그 후, 형질전환체를 병렬적으로 하이그로마이신 B를 함유하는 보겔 배지로 옮겨서 하이그로마이신 B 카세트가 상실되었는지를 평가하고 아세트아미드 함유 배지로 옮겨서 cre-함유 플라스미드가 상실되었는지를 평가하였다 (도 5; PDA = 감자 덱스트로스 한천(Potato Dextrose Agar), VMH = 하이그로마이신 B를 함유하는 보겔 최소 배지, amdS = 아세트아미드를 포함하는 최소 배지, hph^- = 하이그로마이신 B에 대하여 민감함, cre^- = 배지 중 아세트아미드의 존재에 대하여 민감함). 형질전환체들 중 91.8%가 하이그로마이신 B 카세트를 상실하였으며, 형질전환체들 중 92.5%가 cre-함유 플라스미드를 상실하였다. 이는 하이그로마이신 B 카세트를 통합 Δsfb3 결실 카세트로부터 제거하는 것이 가능함을 입증하였다.

1.5. 관심대상의 유전자의 발현은 sfb3 유전자의 파괴에 의해 손상되지 않는다

글루코아밀라아제 효소를 코딩하는 발현 카세트는 예시적인 관심대상의 유전자로서의 역할을 하였으며, 이는 사상균 변이주로부터 분비되는 단백질의 양을 측정하는 편리한 방법을 제공하였다. cbhI 프로모터, 티. 레에세이 글루코아밀라아제 유전자 TrglaA, 및 cbhI 종결자를 함유하는 글루코아밀라아제 발현 카세트(즉, TrglaA 발현 카세트)가 amdS 마커 카세트에 융합된 것을 프라이머 쌍 SK745/SK746을 사용하여 플라스미드 pNSP23 (도 6)으로부터 PCR 증폭시켰다. 다수의 PCR 반응물들을 풀링하고, PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 에탄올로 침전시켜 증폭 DNA 단편을 농축시켰다. Morph Δsfb3 주를 PEG-매개 형질전환에 의해 TrglaA 발현 카세트로 형질전환시키고, 그 후 소르비톨을 포함하는 아세트아미드 최소 배지 상에 도말하였다. 안정한 후보를 아세트아미드 최소 배지 상에서 선발하고, 마이크로타이터 플레이트 포맷으로 유도 배지로 옮겼다. 주들을 마이크로타이터 플레이트에서 성장시키고, 상청액 중 글루코아밀라아제의 활성을 기질로서 PNPG를 사용하여 분석하였다.

최상의 Morph Δsfb3 + TrglaA 후보들은 글루코아밀라아제 활성이 29-9 주 (이것은 TrglaA 발현 카세트를 또한 포함함)보다 더 높았다. 최고의 후보의 상청액 글루코아밀라아제 활성을 진탕 플라스크에서의 성장 후 확증하였으며, 이는 마이크로타이터 플레이트에서 얻어진 결과를 확인해 주었다. 이 결과는 sfb3의 결실이 관심대상의 단백질의 발현 또는 분비를 손상시키지 않음을 나타낸다.

실시예 2. 야생형 sfb3 유전자에 의한 70 H2 주의 상보

2.1. sfb3 유전자를 함유하는 제작물의 생성

sfb3 유전자를 함유하는 4개의 제작물을 만들었다. AVG82/AVG83 프라이머 쌍을 이용하여 야생형 sfb3 유전자 - 그의 천연 프로모터 및 29-9 게놈 DNA 유래의 종결자를 포함함 - 및 돌연변이 sfb3 유전자 - 그의 천연 프로모터 및 70H2 게놈 DNA 유래의 종결자를 포함함 - 를 증폭시켰다. AVG84/AVG85 프라이머 쌍을 이용하여 29-9 게놈 DNA를 사용하여 개시 코돈으로부터 종결 코돈까지의 야생형 sfb3 유전자를 증폭시키고 70H2 게놈 DNA를 사용하여 개시 코돈으로부터 종결 코돈까지의 돌연변이 sfb3 유전자를 증폭시켰다. 그 결과는 천연 sfb3 프로모터 및 종결자를 포함하거나 포함하지 않는, 야생형 또는 돌연변이 sfb3 유전자를 함유하는 4개의 PCR-증폭 단편이었다. 이들 4개의 단편 각각을 독립적으로 pENTR/D-TOPO 벡터 (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐) 내로 클로닝하였다.

다음 단계에서, 4개의 pENTR/D-TOPO 제작물을 LR 클로나아제 반응을 이용하여 목적 벡터 pTrex2g/HygB로 이전시켰다. 4개의 제작물 각각을 이. 콜라이(E. coli)에서 증폭시키고, 각각의 제작물에 대하여 얻은 미니프렙(miniprep)을 진공 농축시켰다. 이러한 방식으로 제조한 DNA를 후속 단계에서 사용하였다. 예시적인 목적 제작물을 도 7에 나타낸다.

2.2. sfb3 유전자를 이용한 70 H2 표현형의 상보

PEG-매개 형질전환에 의해 70H2를 4개의 목적 벡터 제작물 각각으로 개별적으로 형질전환시키고, 이어서 이를 하이그로마이신 B를 포함하는 보겔 최소 배지 상에 도말하였다. 4회의 형질전환 각각으로부터의 30개의 후보를 하이그로마이신 B를 포함하는 PDA로 옮기고, 그 표현형을 (대조군으로서) pTrex2g/HygB 벡터 단독으로 형질전환시킨 70H2 및 29-9와 비교하였다. 야생형 sfb3 유전자로 형질전환시킨 모든 후보는 하이그로마이신 B를 포함하는 PDA 배지 상에서 29-9와 유사한 야생형 표현형을 가졌다. 70H2로부터 유래된 돌연변이 sfb3 유전자로 형질전환시킨 모든 후보는 70H2 표현형을 유지하였다 (도 8). 이들 결과는 29-9로부터 유래된 야생형 sfb3 유전자는 야생형 표현형을 70H2 주에 부여할 수 있지만 70H2로부터 유래된 돌연변이 sfb3 유전자는 그렇게 할 수 없음을 나타냈다.

표현형 복귀가 야생형 sfb3 유전자의 존재에 의해 야기되며 염색체 DNA의 변화에 의해 야기되는 것은 아님을 확인하기 위하여, 후보들을 PDA 배지 (비-선발 조건) 상에 4회 옮겨서 후보들이 당해 벡터를 상실하였는지에 대하여 보고, 그 후 하이그로마이신 B를 포함하는 선발 배지로 되돌렸다. 불안정하고 상기 플라스미드를 상실한 (하이그로마이신 B 내성의 상실을 바탕으로 함) 모든 후보에 있어서, 플라스미드의 상실은 70H2 표현형의 재출현과 상관되었다. 이들 결과는 야생형 sfb3이 야생형 표현형을 70H2로 회복시키는 데 책임이 있음을 확인해 준다.

2.3. 야생형 sfb3 유전자를 함유하는 sfb3 유전자 대체 카세트의 생성

야생형 sfb3 유전자의 3' 말단의 약 2/3를 함유하는 DNA 서열을 AVG94 /AVG95 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시켰는데, 이는 상기 단편의 5' 말단에 SpeI 부위를 도입하고 상기 단편의 3' 말단에 BglII 부위를 도입하였다. loxP 부위들이 측면에 있는 하이그로마이신 B 내성 카세트를 AVG90/AVG91 프라이머 쌍을 이용하여 플라스미드 pCR-Blunt II-hph-loxP#4 (도 1)로부터 증폭시켰는데, 이는 상기 단편의 5' 말단에 BglII 부위를 도입하고 상기 단편의 3' 말단에 NotI 부위를 도입하였다. sfb3 종결자 영역의 하류의 3' DNA 서열을 함유하는 DNA 서열을 AVG96/AVG97 프라이머 쌍을 이용하여 증폭시켰는데, 이는 상기 단편의 5' 말단에 NotI 부위를 도입하고 상기 단편의 3' 말단에 XbaI 부위를 도입하였다.

이들 3개의 단편을 벡터 pCR(등록상표)-Blunt II-TOPO(등록상표) (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐 코포레이션) 내로 연속적으로 라이게이션시키고, 생성된 플라스미드를 pCR-Blunt II-TOPO 949096로 명명하였다 (도 9). 하이그로마이신 B 내성 카세트를 둘러싸고 있는 2개의 DNA 서열을 주형으로서 29-9 게놈 DNA를 사용하여 증폭시켰다. sfb3의 하류의 3' 서열, 각각의 말단이 loxP 부위로 둘러싸인 하이그로마이신 B-내성 카세트, 및 sfb3 유전자의 일부를 함유하는 sfb3 유전자 대체 카세트를 AVG102/AVG103 프라이머 쌍을 이용하여 플라스미드 pCR-Blunt II-TOPO 889092로부터 증폭시켰다. 다수의 PCR 반응물들을 풀링하고, PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 에탄올로 침전시켜 증폭 DNA 단편을 농축시켰다. 이러한 방식으로 제조한 DNA를 후속 단계에서 사용하였다.

2.4. 천연 sfb3 유전자좌로부터의 sfb3 야생형 유전자의 발현에 의한 70 H2 표현형의 상보

주 70H2를 PEG-매개 형질전환에 의해 sfb3 유전자 대체 카세트 (섹션 2.3에서 설명함)로 형질전환시키고, 이어서 하이그로마이신 B 및 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 도말하였다. 야생형 콜로니 표현형을 갖는 15개의 후보를 하이그로마이신 B를 함유하는 보겔 최소 배지로 옮겨서 야생형 콜로니 표현형을 갖는 하이그로마이신 B 내성 후보에 대하여 선발하였다. 하이그로마이신 B에 대하여 내성을 갖는 안정한 후보를 하이그로마이신 B를 함유하는 최소 배지 상에서 선발하고, 야생형 콜로니 표현형에 대하여 평가하였다 (도 10).

70H2의 sfb3 유전자좌에서의 sfb3 유전자 대체 카세트의 상동적 통합을 AVG112/AVG113 및 AVG114/AVG115 프라이머 쌍을 이용하여 기대되는 크기의 DNA 단편들을 증폭시킴으로써 확증하였다. AVG112/AVG113 프라이머 쌍은 AVG94/AVG95 sfb3 유전자 대체 카세트 영역의 5' 말단 바깥쪽에서 시작하여 하이그로마이신 B 내성 카세트 내부에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다. AVG114/AVG115 프라이머 쌍은 하이그로마이신 B 내성 카세트 내부에서 시작하여 AVG96/AVG97 sfb3 유전자 대체 카세트 영역의 3' 말단의 바깥쪽에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다.

sfb3 유전자 대체 카세트의 확인된 상동적 통합을 갖는 생성된 주를 70H2 + 야생형 sfb3으로 명명하였다. 이 주는 표현형이 29-9와 유사하였다. 이와 같이, 천연 sfb3 유전자좌에서의, 야생형 sfb3 유전자를 이용한 70H2 내의 돌연변이 sfb3 유전자의 대체는 야생형 표현형을 70H2로 복구시켰으며, 이는 sfb3 유전자의 파괴가 70H2에서의 감소된 점성 표현형에 책임이 있다는 추가의 증거를 제공하였다.

실시예 3. 침지 배양에서의 주 29-9, 70 H2 , 및 29-9 Δ sfb3 의 성장.

주 29-9, 70H2, 및 29-9 Δsfb3을 침지(액체) 배양에서 동일 조건 하에 성장시키고, 이들의 성장 표현형들을 비교하였다. 간략하게는, 각각의 주의 포자를 측부 배플 및 기저부 배플 둘 모두를 갖춘 3 L 플라스크 내의 500 mL의 배지에 별도로 첨가하였다. 배지는 5 g/L의 (NH₄)₂SO₄, 4.5 g/L의 KH₂PO₄, 1 g/L의 MgSO₄·7H₂O, 및 14.4 g/L 시트르산을 함유하였으며, 이는 5% NaOH를 이용하여 pH 5.5로 조정하였다. 30분 동안 오토클레이빙한 후, 살균 60% 글루코스를 27.5 g/L의 최종 농도로, 175 g/L의 시트르산, 200 g/L의 FeSO₄·7H2O, 16 g/L의 ZnSO₄·7H₂O, 3.2 g/L의 CuSO₄·5H₂O, 1.4 g/L의 MnSO₄·H₂O, 및 0.8 g/L의 H₃BO₃을 함유하는 2.5 mL/L의 미량 원소 용액과 함께 첨가하였다. 상기 배양물을 진탕 인큐베이터에서 34℃에서 48시간 동안 성장시켰다.

상부 공간에 압력이 부가되지 않았을 때(즉, 0 ㎪ (0 bar)의 게이지 압력, 100 ㎪ (1 bar)의 절대 압력), 용존 산소(DO) 탐침자를 100%로 보정하였다. 그 후, 상부 공간 내의 압력을 70 ㎪ (0.7 bar) (게이지 압력)로 설정하였으며, 그 후 산소 탐침자가 170%로 판독된 후 시드 배양물을 첨가하였다. 발효기는 처음에 500 rpm으로 설정된 가변 속도 모터를 통한 혼합을 제공하는 2개의 4-블레이드 터빈을 함유하였다.

[표 4]

이들 성장 조건 하에서, 원래의 주, 29-9는 40%의 DO를 유지하고 당해 양의 바이오매스를 생성하기 위하여 70H2 또는 29-9 Δsfb3 주 중 어느 하나보다 2.6배 더 큰 동력을 요구하였다. 중요하게는, 주 70H2 및 29-9 Δsfb3은 현탁 배양에서 점성 특성이 유사하였으며, 이는 감소된 점성의 성장 표현형이 sfb3 유전자의 파괴에 의해 사상균에 부여될 수 있음을 입증하는 것이었다.

실시예 4. 전 셀룰라아제 조성물을 생성하기 위한 Δsfb3 H3A 주의 생성

4.1 Δ sfb3 결실 카세트의 생성

상기 3개의 단편을 벡터 pCR(등록상표)-Blunt II-TOPO(등록상표) (미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재의 인비트로겐 코포레이션) 내로 연속적으로 라이게이션시키고, 생성된 플라스미드를 pCR-Blunt II-TOPO 889092 (도 2)로 명명하였다. sfb3 유전자의 5' 및 3' 측면부의 DNA 서열을 Morph TrglaA (29-9) 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 증폭시켰다. 3' sfb3 측면부, 각각의 말단이 loxP 부위로 둘러싸인 하이그로마이신 B-내성 카세트, 및 5' sfb3 측면부를 함유하는 ·sfb3 결실 카세트를 AVG104/AVG105 프라이머 쌍을 이용하여 플라스미드 pCRBluntII-TOPO 889092로부터 증폭시켰다. 다수의 PCR 반응물들을 풀링하고(pooled), PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고, 에탄올로 침전시켜 증폭 DNA 단편을 농축시켰다. 그와 같이 제조한 DNA를 후속 단계에서 사용하였다.

sfb3 유전자가 결여된 주 H3A Δ sfb3 #1009의 생성

H3A 통합 트리코데르마 레에세이 발현 주를 국제특허 공개 WO/2011/038019호로 공개된 국제특허 출원 제PCT/US2010/049849호의 설명에 따라 제조하였다. 주 H3A를 PEG(폴리에틸렌 글리콜)-매개 형질전환에 의해 ·sfb3 결실 카세트로 형질전환시키고, 하이그로마이신 B 및 소르비톨을 함유하는 보겔 최소 배지 상에 도말하였다. 트리코데르마의 PEG-매개 형질전환은 이전에 예를 들어 미국 특허 제5,246,853호에 기재되었다.

1020개의 후보를 하이그로마이신 B를 함유하는 보겔 최소 배지 플레이트로 옮겨서 하이그로마이신 B-내성에 대하여 선발하였다. 그 후, 하이그로마이신 B-내성 후보를 콩고 레드를 함유하는 PDA 배지 또는 보겔 최소 배지로 옮겨서 콩고 레드 민감성을 평가하였다.

콩고 레드에 대하여 온화한 민감성을 나타내는 43개의 안정한 후보의 PCR 분석을 행하였으며, 하나의 후보, #1009는 천연 sfb3 유전자의 제거와 커플링된, H3A 게놈 내로의 sfb3 결실 카세트의 상동적 통합과 일치하는 프로파일을 나타냈다. H3A ·sfb3 #1009에서의 sfb3 유전자좌에서의 ·sfb3 결실 카세트의 상동적 통합을 AVG108/AVG109; AVG110/AVG111; 및 AVG108/AVG111 프라이머 쌍을 이용하여 기대되는 크기의 DNA 단편을 증폭시킴으로써 확증하였다. 구체적으로, AVG108/AVG109 프라이머 쌍은 AVG88/AVG89 결실 카세트 영역의 5' 말단 바깥쪽에서 시작하여 하이그로마이신 B 내성 카세트 내부에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다. AVG110/AVG111 프라이머 쌍은 하이그로마이신 B 내성 카세트 내부에서 시작하여 AVG92/AVG93 결실 카세트 영역의 3' 말단의 바깥쪽에서 끝나는 DNA 단편을 증폭시켰다. AVG108/AVG111 프라이머 쌍은 sfb3 유전자좌에 통합된 전 결실 카세트를 증폭시켰다. sfb3 유전자의 부재는 내부 sfb3 단편을 증폭시키도록 디자인된 AVG160/AVG161 프라이머 쌍을 이용할 때 PCR 생성물의 부재에 의해 확인하였다.

H3A 숙주 주와 비교할 때, H3A Δsfb3 #1009 주는 PDA 상에서 감소된 분생자 형성, 더욱 느린 성장 속도 및 콩고 레드-함유 배지 상에서 더욱 제한된 콜로니 형태를 가졌으며, 하이그로마이신 B를 함유하는 배지 상에서 성장이 가능하였다 (도 11). 주 H3A 및 H3A ·sfb3 #1009의 액체 배양을 또한 비교하였다. 둘 모두의 주의 진탕 플라스크 배양물을 50 mL의 YEG 또는 글리신 최소 배지에서 28℃ 및 220 rpm에서 각각 1일 또는 6일 동안 성장시켰다. YEG 및 글리신 최소 배지 둘 모두에서 주 H3A Δsfb3 #1009는 일반적으로 더욱 짧은 길이의 균사를 가졌으며 (도 12), 이는 개선된 점성 특성을 시사하는 것이었다.

4.3 H3A Δsfb3 #1009에서의 전 셀룰라아제 조성물의 효율적인 생성

두 발효 실행을 나란히 행하였는데, 표준 발효 조건 하에서 하나는 H3A를 이용하여 그리고 다른 하나는 H3A ·sfb3 #1009를 이용하여 행하였으며, 이는 예를 들어 국제특허 출원 제PCT/US2010/049849호에 기재된 바와 같았다. 500 rpm의 교반 속도를 각각의 발효 탱크에서 이용하였다. 용존 산소를 해밀턴 광산소 센서(Hamilton Optical Oxygen sensor) (미국 네바다주 레노 소재의 해밀턴 컴퍼니, 유에스에이(Hamilton Company, USA))를 이용하여 성장기의 마지막에 측정하였다. DO 수준의 비교를 하기 표 5에 나타낸다:

[표 5]

발효 실행들 각각으로부터의 생성된 전 셀룰라아제 조성물들을 HPLC법을 이용하여 특성화하였으며, 이는 예를 들어 국제특허 출원 제PCT/US2010/049849호에 기재된 바와 같았다. 그 안에 함유된 주요 셀룰라아제/헤미셀룰라아제의 양을 하기 표 6에서 나란히 비교한다:

[표 6]

둘 모두의 전 셀룰라아제 조성물은 사실상 동일한 양의 각각의 주요 성분을 함유하였으며, 이는 H3A Δsfb3 #1009에서의 단백질 발현이 H3A의 것과 유사하였음을 나타내는 것이었다.

전술한 조성물 및 방법을 이해의 명확성을 위하여 예시로 그리고 예로 약간 상세하게 설명하였지만, 소정의 변화 및 변형이 이루어질 수도 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기 설명은 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 안되는데, 상기 범주는 첨부된 특허청구범위에 의해 묘사된다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적상, 그리고 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 특정적으로 그리고 개별적으로 그렇게 참고로 포함되는 것으로 나타내어진 것과 같은 정도로 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Danisco US Inc. Dodge, Timothy C. Virag, Aleksandra Ward, Michael <120> Filamentous Fungi Having an Altered Viscosity Phenotype <130> 31463WO-2 <140> PCT/US2011/049164 <141> 2011-08-25 <150> US 61/377,030 <151> 2010-08-25 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 929 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Gln Gln Asn Ile Leu Ala Ala Ser Val Ser Ala Leu Ser Leu 1 5 10 15 Asp Glu Ser Thr Val His Thr Gly Gly Ala Ser Ser Lys Lys Ser Arg 20 25 30 Arg Pro His Arg Ala Tyr His Asn Phe Ser Ser Gly Thr Val Pro Thr 35 40 45 Leu Gly Asn Ser Pro Tyr Thr Thr Pro Gln Leu Asn Gln Gln Asp Gly 50 55 60 Phe Gln Gln Pro Gln Ala Phe Thr Pro Lys Gln Phe Gly Gly Phe Asn 65 70 75 80 Asn Gly Ser Gly Ser Val Met Ser Thr Pro Val Met Val Ser Gln Glu 85 90 95 Arg Phe Gly Ala Ser Glu Ala Ser Ser Pro Tyr Gly Gln Ser Met Leu 100 105 110 Asp Met Thr Ala Pro Gln Pro Thr Ser His Ile Val Pro Thr Gln Arg 115 120 125 Phe Glu Asp Gln Ala Gln Tyr Leu Gln Arg Ser Phe Glu Thr Cys Arg 130 135 140 Asp Ser Val Pro Pro Leu Pro Thr Thr Gln 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305 310 315 320 Met Asn Pro Phe Met Met Phe Arg Ser Gly Gly Asn Lys Phe Val Cys 325 330 335 Asn Leu Cys Ala Tyr Pro Asn Asp Thr Pro Pro Glu Tyr Phe Ser Ala 340 345 350 Thr Asn Pro Gln Gly Val Arg Val Asp Arg Asp Thr Arg Pro Glu Leu 355 360 365 His Arg Gly Thr Val Glu Phe Val Val Pro Lys Glu Tyr Trp Thr Arg 370 375 380 Glu Pro Val Gly Leu Arg Trp Leu Phe Leu Ile Asp Val Thr Gln Glu 385 390 395 400 Ser Tyr Asn Lys Gly Tyr Val Glu Ala Phe Cys Glu Gly Ile Arg Val 405 410 415 Ala Leu Tyr Gly Gly Glu Asp Gln Glu Leu Asp Glu Asn Gly Glu Pro 420 425 430 Lys Arg Arg Ile Pro Glu Gly Ala Lys Val Gly Phe Val Thr Tyr Asp 435 440 445 Lys Asp Ile His Phe Tyr Asn Val Asn Pro Ala Leu Asp Gln Ala Gln 450 455 460 Met Met Ile Met Pro Asp Leu Glu Asp Pro Phe Val Pro Leu Ser Glu 465 470 475 480 Gly Leu Phe Val Asp Pro Tyr Glu Ser Lys Asp Val Ile Thr Ser Leu 485 490 495 Leu Thr Arg Leu Pro Asp Met Phe Ser Thr Ile Lys Asn Pro Glu Pro 500 505 510 Ala Leu Leu Ala Ala Leu Asn Ser Ala Leu Ala Ala Leu Glu Ala Thr 515 520 525 Gly Gly Lys Val Val Ala Ser Cys Ser Ala Leu Pro Thr Trp Gly Pro 530 535 540 Gly Arg Leu Phe Met Arg Asp Asn Gly Asn His Pro Gly Gly Glu Ile 545 550 555 560 Asp Lys Lys Leu Tyr Thr Thr Glu His Pro Ala Trp Lys Lys Val Ala 565 570 575 Glu Lys Met Ala Ala Ser Gly Val Gly Ala Asp Phe Phe Leu Ala Ala 580 585 590 Pro Ser Gly Gly Tyr Leu Asp Ile Ala Thr Ile Gly His Val Ser Ser 595 600 605 Thr Thr Gly Gly Glu Thr Phe Tyr Tyr Pro Asn Phe Ile Ala Ala Arg 610 615 620 Asp Ser Arg Lys Leu Ser Leu Glu Ile Ser His Ala Val Thr Arg Glu 625 630 635 640 Thr Gly Phe Gln Ala Leu Met Lys Val Arg Cys Ser Asn Gly Leu Gln 645 650 655 Val Ser Gly Tyr His Gly Asn Phe Ile Gln His Thr Phe Gly Ala Asp 660 665 670 Leu Glu Ile Gly Val Ile Asp Ala Asp Lys Ala Met Gly Val Ser Phe 675 680 685 Ser Tyr Asp Gly Lys Leu Asp Pro Lys Leu Asp Ala His Phe Gln Ser 690 695 700 Ala Leu Leu Tyr Thr Thr Ala Ser Gly Glu Arg Arg Val Arg Cys Ser 705 710 715 720 Asn Val Ile Ala Ser Val Thr Glu Thr Ser Lys Glu Ser Gly Ala Arg 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935 940 Leu Asn Ala Gln Val Arg Asn Ile Ile Glu Phe Leu Arg Thr Met Arg 945 950 955 960 Gly Ser Lys Gly Leu Thr Ile Gln Leu Ala Arg Gln Gly Ile Asp Gly 965 970 975 Ala Glu Phe Asp Phe Ala Arg Met Leu Val Glu Asp Arg Asn Asn Glu 980 985 990 Ala Gln Ser Tyr Val Asp Trp Leu Val His Ile His Lys Gly Val Gln 995 1000 1005 Leu Glu Leu Ser Gly Gln Arg Lys Lys Glu Gly Glu Glu His Thr 1010 1015 1020 Ala Ala Ser Leu Ser Asn Phe Ala Gly Leu Arg Pro Ala Tyr Trp 1025 1030 1035 <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic Sfb3 consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (13)..(15) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 9 Ile Gln Leu Ala Arg Gln Gly Xaa Asp Gly Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Ala 1 5 10 15 Arg Xaa Leu Xaa Glu Asp Arg Asn Xaa Glu Ala Xaa Ser Xaa Val Asp 20 25 30 Trp Leu <210> 10 <211> 3261 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 10 atggactaca cgcagtatca cgccctgggc cacggcgagg tcctcgaccc caacgacccc 60 aacaagacgt ccgctccagc ggctccccag ttccagcccc cctcctcgcc ctacgtgcca 120 ccgggctccc cttacggcgc tcccccgtac catggcggcc accaagctcc tcccatggca 180 atgccgcctc cgtcgacgcc cggctacggc ccgccgcagg gccagagctt ccccgggtct 240 ccgatgccgt cgcaggatgc tggccttgcc gcgcagtttg gcgggatgag cctgggtgcg 300 gatgcgggag gcgccgccgc gaggaagaag aagaaggaca ggcacgcgta ccacagcgtg 360 gagccgacgg gctcgtcgca ggccttcaat ggcctgccgc cggggacgcc cgccgagcag 420 ttcctcaacg tcaacaaccc gcagggcatc ccggcgctgg gagggcagtt tggaagccct 480 ctggccagcc ccatgggcac gcctcacatg gccaatccgg gccagttccc ggcgccaacc 540 tctcccttca ccccctcggc ccctgtgtcg ccggccgagt tcgcatccag gtttggctct 600 cccgacgctg ccacgtcaat aggctcggct ggccccagcc aggtgtcgcc agacgacatg 660 cccagcatac ccgcctcgag ggacgccatc caggagcact tttttaagaa cgtttacccg 720 accttcgagc gccatgtgcc ccctcctgcg acggtttcct ttgttgcctt cgaccaaggc 780 aatgcctctc ccaaattcac ccgactcacc ctcaacaaca tcccaaccac agccgagggc 840 ctccatgcga cgggcttgcc cctgggcatg ctcatccagc ctctggcccc acttcaagcg 900 ggagaggccg agattcccgt tctcgacttt ggcgacgccg gcccgcctcg atgtcgaaga 960 tgccgggctt atatcaaccc cttcatgatg ttccgatcgg gcggcaacaa gttcgtgtgc 1020 aacctctgct cgtaccccaa cgaaacgccg cccgagtact tttgcgccgt cagcccacag 1080 ggagtgcgcc tagatcgaga ccagcggccg gagcttcacc gcggtaccgt cgagttcgtc 1140 gtccccaagg agtactggac ccgagagccc gtcggcctcc gctggctgtt tgtcatcgac 1200 gtcacgcagg aatcctataa caagggcttc atggagacat tctgcgaggg catcctcgcg 1260 gccctctacg gcggcaacga cgaggagaat gatgaagatg gcgagccaaa gcgaaggata 1320 cccaagggag ccaaggttgg gttcatcacg tacgacaagg acattcactt ttacaacatc 1380 aacgtgagtt cacgagcact gggaacaaga atgagatggc ccgctaacat taagacagcc 1440 tcatctggat caagcgcaca tgatgatcat gcccgacctc gaagacccat tcctccccct 1500 cggcgagggc ctctttgtcg acccgtacga gtcaaaggcc atcatcacct ctctcctcac 1560 ccgcctcccc gagatgttct ccaccatcaa aaaccccgag cccgctctgc ttgccacgct 1620 caatgccgcc gtggctgcgc tggaggcaac gggaggtaaa gtcgtgtgct cgtgctcgac 1680 cttgcctacc tggggccctg gccgactgtt catgcgcgac gacggcaacc atcccggtgg 1740 cgagctggac aagaagctgt atacgacgga acaccccgcg tggaagaagg tctcggagaa 1800 gatggcttcg tccggcattg gtgtcgactt cttccttgct gcgccctccg gcggctacct 1860 ggacattgcg acgataggcc atgtcgccgc cacgactggt ggagagacgt tctactaccc 1920 caacttcatc gccccgcgag acggtgcccg gctgtcaatg gagattacgc acgccatcac 1980 gagggaaacg ggcttccagg cgctgatgaa ggtccgctgc tcgaccgggc tgcaggtggc 2040 ggcgtaccac ggcaactttg tccagcacac ctttggggca gacctggaga ttggcgtcat 2100 tgacgcggac aaggcgctcg gcgtgtcgtt tagccacgac ggtaaactgg atcccaagct 2160 ggacgcccac ttccagacgg ctctcctgta cacgaccgcg tccggacagc gacgcgtgcg 2220 atgttccaac gtgattgcca gcgtcagcga cacctccaag gagtccaaca ccaaggagct 2280 ggccattcgg cagtgcctca agtttgtcga ccaggacgcg gttgtgggta tctttgcaaa 2340 agaagccagc accaagctcg ccacgacatc ggccaatctc caggatgtgc gaaactggct 2400 gacggagcga acaatcgaca tcatggccta ctacaagaag cactctgcca atcagttccc 2460 tccgagccag ctggtcatgc ccgaacggct gaaggagttc tgcatgtaca tgctaggcat 2520 gttgaaatgc agagctttca agggcggtat cgagaactcg gatcgcagag tgcacgagct 2580 gcgcatggtc cgcagcatgg gcccgctgga gcttagcctg tatctgtacc cccggatgat 2640 tgctctgcac aacctccagc ccgaagaggg ctttgccgac cccgaaacag gccacctcaa 2700 gatgcccccg tccgtgcgga cgtccttttc acgggtcgag ccgggtggcg tctacctggt 2760 ggacaacgga cagcagtgct tgctgtggtt tcacgcccag acgtcgccca acctcatcac 2820 cgacctgttt ggcgagggcc acgactcgct caaggggctg gatccgtaca cgtccacgct 2880 gccggtgctg gagacgcatc tcagcgcaca ggtccgcaac 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60 attgggtgtt acg 73 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 15 gagagcggcc gcgggcgtca atggcagagg 30 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 16 ttaatctaga cgtgttgtgc ggagaggc 28 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 17 cagctggact gactgtgcc 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 18 agaggcccat gctgttgg 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 19 ttcctccgtt ctccctga 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 20 gcggtgagtt caggcttt 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 21 aaattccgtc accagccc 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 22 cttgcgttgg ctcacaga 18 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 23 gagtggtgaa gtcggtaatc c 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 24 ctggaaacgc aaccctgaag 20 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 25 caccccgata gaaggcacag caacgctt 28 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 26 gtgatggaag caatgtagtc cgcag 25 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 27 caccatggac tacacgcagt atcacgcc 28 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 28 ctaccaatag gccggtctca gtcct 25 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 29 gagaactagt acccgactca ccctcaacaa 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 30 gagaagatct agtgtggtgt gattgtcccg 30 <210> 31 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 31 aattgcggcc gctgcctagg tatggattta ctcc 34 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 32 gtgttctaga cgattatgtc gtgagcctct a 31 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 33 ccgactcacc ctcaacaac 19 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 34 cgattatgtc gtgagcctct 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 35 tcaataggct cggctggc 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 36 ccacggcgaa gaatccac 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 37 ctccggcgaa gcagaaga 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 38 tcatgctgtg tcctgccg 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 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Claims

모 주(parental strain)로부터 유래된 트리코데르마 종(Trichoderma sp.) 사상균의 변이주로서, 상기 변이주는 변이주의 세포가 모 주의 세포와 비교하여 감소된 양의 기능성 Sfb3 단백질을 생성하게 하는 유전자 변경을 포함하며, 변이주의 세포는 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 양의 교반을 필요로 하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하거나, 또는 (i) 및 (ii) 인 세포 브로쓰(broth)를 생성하는 변이주.
삭제
제1항에 있어서, 유전자 변경은 모 주에 존재하는 sfb3 유전자의 파괴를 포함하는 변이주.
제3항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴는 전부의 또는 일부의 sfb3 유전자의 결실의 결과인 변이주.
제3항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자를 포함하는 게놈 DNA의 일부분의 결실의 결과인 변이주.
제3항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 돌연변이 유발의 결과인 변이주.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴는 부위 특이적 재조합을 이용하여 수행되는 변이주.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합되어 수행되는 변이주.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴는 감소된 점성 표현형을 변이주에 부여함에 있어서의 일차적인 유전자적 결정자인 변이주.
제1항에 있어서, 기능성 Sfb3 단백질을 생성하지 않는 변이주.
제1항에 있어서, Sfb3 단백질을 생성하지 않는 변이주.
제1항에 있어서, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 변이주.
제1항에 있어서, 바이오매스(biomass)의 단위량 당 모 주와 사실상 동일한 양의 단백질을 생성하는 변이주.
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제1항에 있어서, 사상균은 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei)인 변이주.
트리코데르마 종(Trichoderma sp.) 사상균 세포의 변이주를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 유전자 변경을 사상균 세포의 모 주 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 유전자 변경은 모 주의 세포와 비교하여 기능성 Sfb3 단백질 생성을 감소시키고, 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 양의 교반을 필요로 하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하거나, 또는 (i) 및 (ii) 인 세포 브로쓰를 생성하는, 변이형 사상균 세포를 생성하는 방법.
삭제
제17항에 있어서, 유전자 변경은 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 sfb3 유전자를 파괴하는 것을 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 유전자 변경은 유전자 조작을 이용하여 모 사상균 세포에서 sfb3 유전자를 결실시키는 것을 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 유전자 변경을 부위 특이적 유전자 재조합을 이용하여 수행하는 방법.
제17항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴를 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합하여 수행하는 방법.
제17항에 있어서, 변이주는 바이오매스의 단위량 당 모 주와 사실상 동일한 양의 단백질을 생성하는 방법.
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제17항에 있어서, 사상균은 트리코데르마 레에세이인 방법.
제17항에 있어서, 모 주는 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 방법.
제27항에 있어서, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자는 기능성 Sfb3 단백질의 생성을 감소시키거나 또는 방지하는 유전자 변경을 도입하기 전에 모 주에 존재하는 방법.
삭제
제17항, 제19항 내지 제23항 및 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 사상균 변이주.
모 주로부터 유래된 트리코데르마 종(Trichoderma sp.) 사상균 변이주로서,
(a) (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 침지 배양에서 감소된 교반을 필요로 하게 하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 침지 배양에서 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하게 하거나, 또는 (i) 및 (ii) 이게 하는, Sfb3 유전자 변경, 및
(b) (a)에서의 유전자 변경 전에 변이주에 존재하는, 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 변이주.
제31항에 있어서, 유전자 변경은 모 주에 존재하는 sfb3 유전자의 파괴를 포함하는 변이주.
제32항에 있어서, sfb3 유전자의 파괴는 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합되어 수행되는 변이주.
감소된 점성 표현형에 대하여 변이형 트리코데르마 종(Trichoderma sp.) 사상균 세포를 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은
(a) 사상균의 모 주의 세포를 변이 세포가 생성되도록, Sfb3 유전자의 돌연변이를 유발시키는 단계와;
(b) 형광색소 착색제에 대한 증가된 민감성에 대하여 변이 세포를 스크리닝하는 단계와;
(c) 형광색소 착색제에 대한 민감성이 증가된 변이 세포를 선발하는 단계를 포함하고;
형광색소 착색제에 대한 증가된 민감성은 침지 배양에서 호기성 발효 동안 변이형 사상균 세포가 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 양의 교반을 필요로 하거나 (ii) 소정량의 교반에서 모 주의 세포와 비교하여 증가된 용존 산소 함량을 유지하거나, 또는 (i) 및 (ii) 인 세포 브로쓰를 생성하는 능력과 상관되는 방법.
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제34항에 있어서, 형광색소 착색제는 칼코플루오르 화이트(Calcofluor White)인 방법.
제34항에 있어서, 세포의 돌연변이 유발을 유전자 재조합에 의해 수행하는 방법.
제34항에 있어서, 세포의 돌연변이 유발을 sfb3 유전자의 유전자좌에 선발가능한 마커를 도입하는 것과 조합하여 수행하는 방법.
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트리코데르마 종(Trichoderma sp.) 사상균 세포에서 관심대상의 단백질을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 모 사상균 세포 내로 관심대상의 단백질을 코딩하는 유전자 및 상기 세포에서 Sfb3 단백질의 양 또는 활성을 감소시키는 유전자 변경을 도입하고 이럼으로써 침지 배양에서 호기성 발효 동안 (i) 모 주의 세포와 비교하여 소정의 용존 산소 함량을 유지하기 위하여 감소된 양의 교반을 필요로 하거나 (ii) 모 주의 세포와 비교하여 소정량의 교반에서 증가된 용존 산소 함량을 유지하거나, 또는 (i) 및 (ii) 인, 관심대상의 단백질을 포함하는 세포 브로쓰를 생성하는 변이형 사상균 세포를 생성하는 단계를 포함하며, 상기 관심대상의 단백질은 모 세포와 비교하여 변이 세포에서 사실상 동일한 수준으로 생성되는 방법.
제41항에 있어서, 상기 관심대상의 단백질은 하나 초과의 관심대상의 단백질이며, 상기 하나 초과의 관심대상의 단백질 각각은 모 세포와 비교하여 변이 세포에서 사실상 동일한 상대적 수준으로 생성되는 방법.
제42항에 있어서, 상기 하나 초과의 관심대상의 단백질은 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제로부터 선택되는 방법.
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