CN103097536A

CN103097536A - 具有粘度改变表型的丝状真菌

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Publication number: CN103097536A
Application number: CN2011800409978A
Authority: CN
Inventors: T·C·道奇; A·维拉格; M·华德
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2010-08-25
Filing date: 2011-08-25
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-08-25
Also published as: AU2011293263A1; CN103097536B; MX2013002087A; AU2011293263B2; BR112013004419A2; RU2608639C2; KR20130100108A; EP2609200A1; MX346558B; KR102004003B1; JP5707494B2; ZA201208720B; CA2808777A1; US20130224864A1; WO2012027580A1; CA2808777C; DK2609200T3; JP2013533751A; MY160960A; RU2013112888A

Abstract

本发明描述了与具有改变的生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。此类变异株非常适于在深层培养物中生长，例如用于大规模生产供商业应用的酶和其他蛋白质。

Description

具有粘度改变表型的丝状真菌

优先权

本专利申请要求2010年8月25日提交的系列号为61/377,030的美国临时专利申请的优先权，该专利申请全文以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明菌株和方法涉及丝状真菌的基因突变，所述突变产生具有改变的生长特性的变异株。此类变异株非常适于在深层培养物中生长，如用于大规模生产供商业应用的酶和其他蛋白质或代谢物。

参考文献

以下参考文献和本文引用的另外的参考文献据此以引用方式并入：

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背景技术

丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，因而非常适于大规模生产供工业应用的酶和其他蛋白质。丝状真菌通常在生物反应器的菌丝深层培养物中生长，这些生物反应器适于将氧气和营养物质引入培养基(即，培养液)并使氧气和营养物质分布于其中。菌丝体的形态特征会影响培养液的流变性，从而影响生物反应器的性能。

通常，培养液的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量也越多。在一些情况下，培养液的粘度变得十分高，显著妨碍氧气和营养物质的溶解，从而对真菌的生长产生不利影响。另外，混合粘稠培养液并且向粘稠培养液中通气所需的能量会显著增加生产成本，并且导致在电机和电源供应方面的资本支出更高。

发明内容

本发明描述了涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有可产生粘度改变表型的遗传变更。

在一个方面，提供衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含能使变异菌株的细胞与亲本菌株的细胞相比产生改变量的功能性Sfb3蛋白的遗传变更，其中变异菌株的细胞在深层培养有氧发酵过程产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

在一些实施方案中，功能性Sfb3蛋白的改变量为减少量，并且变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

在一些实施方案中，遗传变更包括亲本菌株中存在的sfb3基因的破坏。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是sfb3基因的全部或部分的缺失的结果。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是包含sfb3基因的基因组DNA的一部分的缺失的结果。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是sfb3基因的诱变的结果。

在一些实施方案中，sfb3基因的破坏使用位点特异性重组进行。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是将粘度降低表型赋予变异菌株的主要遗传决定因子。

在一些实施方案中，变异菌株不产生功能性Sfb3蛋白。在一些实施方案中，变异菌株不产生Sfb3蛋白。

在一些实施方案中，变异菌株还包含编码目的蛋白的基因。

在一些实施方案中，变异菌株每单位量生物质产生的蛋白质数量与亲本菌株实质上相同。在一些实施方案中，变异菌株每单位量生物质产生的目的蛋白数量与亲本菌株实质上相同。

在一些实施方案中，Sfb3蛋白包含如下氨基酸序列：IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO：9，其中X为任何氨基酸残基)。

在一些实施方案中，丝状真菌是盘菌亚门(Pezizomycotina)的种。在一些实施方案中，丝状真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)。

在另一个方面，提供产生丝状真菌细胞变异菌株的方法，该方法包括：将遗传变更引入丝状真菌细胞亲本菌株，其中与亲本菌株的细胞相比，所述遗传变更会改变功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

在一些实施方案中，遗传变更能减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

在一些实施方案中，遗传变更包括使用遗传操作来破坏亲本丝状真菌细胞中的sfb3基因。

在一些实施方案中，遗传变更包括使用遗传操作使亲本丝状真菌细胞中的sfb3基因缺失。

在一些实施方案中，遗传变更使用位点特异性基因重组进行。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。

在一些实施方案中，变异菌株的每单位量生物质可产生与亲本菌株实质上相同量的蛋白。在一些实施方案中，变异菌株的每单位量生物质可产生与亲本菌株实质上相同量的目的蛋白。

在一些实施方案中，丝状真菌是盘菌亚门的种。在一些实施方案中，丝状真菌是里氏木霉。

在一些实施方案中，亲本菌株还包含编码目的蛋白的基因。在一些实施方案中，在引入可减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生的遗传变更之前，编码目的蛋白的基因存在于亲本菌株中。

在另一个方面，提供通过前述变异菌株产生的目的蛋白。

在另一个方面，提供通过前述方法产生的丝状真菌变异菌株。

在另一个方面，提供衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含：(a)遗传变更，所述遗传变更使得(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码目的蛋白的基因，其中所述编码目的蛋白的基因在(a)中的遗传变更之前存在于变异菌株中。

在一些实施方案中，遗传变更包括亲本菌株中存在的sfb3基因的破坏。在一些实施方案中，sfb3基因的破坏是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。

在另一个方面，提供针对粘度改变表型筛选变异丝状真菌细胞的方法，该方法包括：(a)诱变丝状真菌亲本菌株的细胞以产生变异细胞；(b)针对改变的荧光染色剂敏感性筛选变异细胞；以及(c)选择具有改变的荧光染色剂敏感性的变异细胞；其中，改变的荧光染色剂敏感性与变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的能力有关，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

在一些实施方案中，改变的敏感性是增加的敏感性，并且变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样细胞培养液，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。在一些实施方案中，荧光染色剂为卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofiuor White)。

在一些实施方案中，诱变细胞是通过基因重组进行。在一些实施方案中，诱变细胞是与在sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合进行。

在另一个方面，提供鉴定盘菌亚门丝状真菌的种中的Sfb3多肽的方法，该方法包括：(a)从盘菌亚门丝状真菌的种获得氨基酸序列；以及(b)针对连续氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO：9，其中X为任何氨基酸残基)的存在筛选所述氨基酸序列；(c)其中SEQ ID NO：9在所述得自盘菌亚门丝状真菌的种的氨基酸序列中的存在表明所述得自盘菌亚门丝状真菌的种的氨基酸序列是sfb3多肽。

在另一个方面，提供通过前述方法鉴定的分离的sfb3多肽。

在又一个方面，提供在丝状真菌细胞中产生目的蛋白的方法，该方法包括：将编码目的蛋白的基因以及可减少细胞中Sfb3蛋白的量或活性的遗传变更引入亲本丝状真菌细胞，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生包含目的蛋白的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量，并且其中目的蛋白在变异细胞中与亲本细胞相比，以实质上相同的水平产生。

在一些实施方案中，目的蛋白为超过一种目的蛋白(或一种或多种蛋白)，并且所述超过一种目的蛋白中的每种在变异细胞中与亲本细胞相比，以实质上相同的相对水平产生。在一个具体实施方案中，所述超过一种目的蛋白中的每种选自纤维素酶和半纤维素酶。

在一个相关方面，提供通过这种方法产生的目的蛋白。在又一个相关方面，提供包含通过这种方法产生的超过一种目的蛋白的组合物。在一些实施方案中，该组合物是全纤维素酶组合物。

由说明书(包括附图)，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施方案将显而易见。

附图说明

图1是质粒pCR-BluntII-hph-loxP#4的图谱

图2是质粒pCR-Blunt II-TOPO889092的图谱。

图3的小图A-D为培养板图像，显示里氏木霉菌株MorphΔsfb3和29-9Δsfb3在含有刚果红的培养基上的菌落形态。(A)MorphΔsfb3候选菌株亚群，和(B)相应的对照。(C)29-9Δsfb3候选菌株亚群，和(D)相应的对照。

图4是质粒pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre的图谱，该质粒用来在MorphΔsfb3菌株中瞬时表达cre基因。

图5的图像显示潮霉素B抗性的丢失及质粒pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre瞬时表达后候选菌株在乙酰胺上生长的能力。上排(A-C)：指定的培养基上的Morph和MorphΔsfb3对照菌株。下排(D-F)：指定的培养基上质粒瞬时表达后的候选菌株。

图6是质粒pNSP23的图谱。

图7是用于在70H2中进行互补的四个质粒之一的图谱，该质粒包含具有天然启动子和终止子的野生型sfb3基因。

图8的图像显示70H2和29-9转化株在28℃生长四天后(从转化板的第一次转移)在含有潮霉素B的PDA上的生长情况。(A-C)70H2+来自29-9的野生型sfb3。(D-F)70H2+来自29-9的带有天然启动子和终止子的野生型sfb3。(G)29-9+单独载体。(H-J)70H2+来自70H2的sfb3。(K-M)70H2+来自70H2的带有天然启动子和终止子的sfb3。(N)70H2+单独载体。

图9是质粒pCR-BluntII-TOPO949096的图谱。

图10的图像显示(A)转化了pCR-BluntII-TOPO949096的70H2转化株的生长情况，该质粒包含从菌株29-9获得的野生型sfb3基因。菌株是用VMH(含潮霉素B的Vogel基本培养基)在28℃下温育。两个候选菌株具有野生型表型(W)，两个候选菌株具有70H2表型(H)，还有两个候选菌株具有中间表型(I)。(B)70H2sfb3#24、70H2和29-9在28℃下生长4天然后在室温下生长3天后，在VM(Vogel基本培养基)上的对比。

图11显示H3A和H3AΔsfb3#1009在28℃生长4天后在指定的培养基上的菌落形态。

图12显示在28℃下指定时间段后，液体培养物中的H3A和H3AΔsfb3#1009菌丝的图像。

图13显示Sfb3蛋白的氨基酸序列比对，这些蛋白来自酿酒酵母(S.cerevisiae)(SEQ ID NO：1)及里氏木霉(SEQ ID NO：2)。

图14显示Sfb3蛋白的氨基酸序列比对，这些蛋白来自酿酒酵母(SEQID NO：1)、里氏木霉(SEQ ID NO：2)及米曲霉(A.oryzae)(SEQ ID NO：3)。

具体实施方式

I.综述

本发明的菌株和方法涉及具有影响其形态和生长特性的遗传修饰的变异丝状真菌细胞。当变异细胞在深层培养物中生长时，它们产生的细胞培养液与包含亲本菌株的细胞的细胞培养液相比具有不同的流变性。这些变异菌株中有一些非常适于大规模生产酶和其他商业上重要的蛋白质。

II.定义

在详细描述本发明菌株和方法之前，为清楚起见定义了以下术语。未定义的术语应当被赋予其在相关领域中使用的普通含义。

如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门盘菌亚门的丝状真菌。这个生物之前被分类为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)，也被分类为红褐肉座菌(Hypocreajecorina)。

如本文所用，词语“丝状真菌细胞变异菌株”或类似的词语，是指例如通过遗传操作衍自(即得自或可得自)属于盘菌亚门的亲本(或参考)菌株的丝状真菌细胞菌株。

如本文所用，术语“目的蛋白”是指想要在丝状真菌中表达的多肽，任选地以高水平且以商业化为目的进行表达。这种蛋白可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等等。

如本文所用，词语“基本无活性”或类似词语，意思是特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰混合物的预期目的。

如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任意长度的聚合物。本文使用氨基酸残基的常规单字母代码或三字母代码。聚合物可为直链的或支链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且它可间夹有非氨基酸。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；所述干预例如是二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合。在所述定义中还包括(例如)含有氨基酸(包括，例如非天然氨基酸等)的一个或多个类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。

如本文所用，功能上和/或结构上类似的蛋白质被视为“相关蛋白质”。此类蛋白质可衍自不同属和/或种的生物体、或甚至不同纲的生物体(如，细菌和真菌)。相关蛋白质还涵盖通过一级序列分析确定的、通过二级或三级结构分析确定的或通过免疫交叉反应性确定的同源物。

如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白质”是指这样的蛋白质，其通过将一个或多个氨基酸添加到N端和/或C端、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点处置换一个或多个氨基酸、在该蛋白质的任一端或两端或氨基酸序列中的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸、和/或在该氨基酸序列中的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸而衍自或可衍自某一蛋白质。蛋白质衍生物的制备可通过修饰编码天然蛋白的DNA序列、将DNA序列转到合适的宿主中以及表达经修饰的DNA序列以形成衍生的蛋白质来实现。

相关的(以及衍生的)蛋白质包括“变异蛋白质”。变异蛋白质不同于参考蛋白质/亲本蛋白质(如野生型蛋白质)之处在于少量氨基酸残基的置换、缺失和/或插入。变异蛋白质与亲本蛋白质之间的差异氨基酸残基数目可为一个或多个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变异蛋白质与参考蛋白质可享有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％或更高的氨基酸序列同一性。变异蛋白质还可在选定的基序、结构域、表位、保守区域等方面不同于参考蛋白质。

如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白质内的提供与目的蛋白质(即，通常是原始目的蛋白质)相似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在包含α-螺旋或β-片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选地保持相同的特定结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施方案中，开发了类似序列，使得置换氨基酸导致产生显示相似或改进的功能的变异酶。在一些实施方案中，目的蛋白质中氨基酸的三级结构和/或保守残基位于目的区段或片段处或其附近。因此，在目的区段或片段包含(例如)α-螺旋或β-片层结构的情况下，置换氨基酸优选地保持该特定结构。

如本文所用，术语“同源蛋白质”是指与参考蛋白质具有相似活性和/或结构的蛋白质。这并不意味着各同源物一定在进化上相关。因此，该术语的意图是涵盖得自不同生物体的相同、相似或相应的酶(即，在结构和功能方面)。在一些实施方案中，希望鉴定与参考蛋白质具有相似的四级结构、三级结构和/或一级结构的同源物。在一些实施方案中，同源蛋白质引起与参考蛋白质相似的免疫应答。在一些实施方案中，同源蛋白质被工程改造以制备具有所需活性的酶。

序列之间同源性的程度可使用本领域中已知的任何合适的方法确定(参见如Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith和Waterman，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)；Needleman and Wunsch(1970)J. Mol.Biol.，48：443(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页)；Pearson andLipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页)；程序，如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package，得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group，Madison，WI))中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；和Devereux et al.(1984)NucleicAcidsRes.12：387-95(Devereux等人，1984年，《核酸研究》，第12卷，第387-395页)。

例如，PILEUP是测定序列同源水平的有用程序。PILEUP使用渐进式逐对比对从一组相关序列产生多个序列对比。它还能够绘制显示聚类关系(用于产生比对)的树形图。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法(Feng and Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35：351-60(Feng和Doolittle，1987年，《分子进化杂志》，第35卷，第351-360页)的简化版。所述方法与Higgins和Sharp描述的方法类似((1989)CABIOS5：151-53(1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页))。可用的PILEUP参数包括：默认间隙权重3.00、默认间隙长度权重0.10，以及加权末端间隙。可用的算法的另一例子是Altschul等人((1990)J.Mol.Biol.215：403-10(1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页))和Karlin等人((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-87(1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5887页))描述的BLAST算法。一种尤其可用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul et al.(1996)Meth.Enzymol.266：460-80(Altschul等人，1996年，《酶学方法》，第266卷，第460-480页))。参数“W”、“T”和“X”确定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值：字长(W)11、BLOSUM62记分矩阵(参见，例如Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))比对(B)50次、预期(E)10、M′5、N′-4，对两条链进行比较。

如本文所用，词语“实质上类似”和“实质上相同”，在至少两条核酸或多肽的情况下，通常意味着多核苷酸或多肽包含的序列与参考(即，野生型)序列相比具有至少约70％的同一性、至少约75％的同一性、至少约80％的同一性、至少约85％的同一性、至少约90％的同一性、至少约91％的同一性、至少约92％的同一性、至少约93％的同一性、至少约94％的同一性、至少约95％的同一性、至少约96％的同一性、至少约97％的同一性、至少约98％的同一性、或甚至至少约99％的同一性或更高的同一性。序列同一性可使用诸如BLAST、ALIGN和CLUSTAL的已知程序，使用标准参数测定。(参见，例如Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403-410页)；Henikoff etal.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(Henikoff等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页)；Karin etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA90：5873(Karin等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873页)；以及Higginsetal.(1988)Gene73：237-244(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页))。进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。另外，可使用FASTA对数据库进行搜索(Pearson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444-48(Pearson等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页))。两种多肽实质上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因此，例如当一种多肽与第二多肽仅在保守置换上有差异时，这两种多肽实质上相同。两种核酸序列实质上相同的另一个指示是两种分子在严格的条件下(如，在中至高严格性的范围内)彼此杂交。

如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在指代编码蛋白质或RNA并指导蛋白质或RNA的表达的核酸时是同义的。丝状真菌繁殖体通常是单倍体，因而单拷贝的特定基因(即单个等位基因)足够赋予特定表型。

如本文所用，“野生型”与“天然”基因、蛋白质或菌株，是指在自然界中存在的那些基因、蛋白质或菌株。

如本文所用，“基因缺失”是指其从宿主细胞的基因组中移除。当基因包含与基因的编码序列并未紧挨着的控制元件(如增强子元件)时，基因缺失是指缺失掉编码序列以及任选缺失掉相邻启动子和/或终止子序列。

如本文所用，“基因破坏”广义上是指在宿主细胞中进行的任何实质上防止细胞产生功能基因产物(如蛋白质)的遗传或化学操作。基因破坏的示例性方法包括完全或部分缺失掉基因的任何部分，包括多肽编码序列、启动子、增强子或别的调控元件在内，或者诱变上述元件，其中诱变包括置换、插入、缺失、倒位以及其组合和变化，这些突变中的任一者都实质上防止功能基因产物的产生。

如本文所用，“遗传操作”是指预选的核酸靶序列的变更，例如使用优先作用在预选核酸序列上的大分子(即酶和/或核酸)进行变更。因此遗传操作不同于化学操作，后者使用小分子来随机影响对非预选的核酸序列的变化。

如本文所用，“遗传变更”是指遗传操作导致的细胞DNA变化，不同于化学操作导致的细胞DNA变化。

如本文所用，“有氧发酵”是指有氧气存在下的生长。

如本文所用，术语“细胞培养液”统一指液体/深层培养物中的培养基和细胞。

如本文所用，术语“细胞团(cell mass)”是指液体/深层培养物中存在的细胞成分(包括完整和裂解细胞)。可用干重或湿重表示细胞团。

如本文所用，术语“流变学”是指研究物质变形和流动的物理学分支。

如本文所用，“粘度”是液体对机械应力(如剪切应力和拉伸应力)下变形的抗性的量度。在本发明上下文中，粘度是指含有丝状真菌细胞的细胞培养液对机械应力(如由转子/叶轮提供)的抗性。因为细胞培养液粘度难以直接测量，可使用间接测量粘度的方式，例如预选搅拌量下发酵液溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、维持预选溶氧量所需搅拌细胞培养液的功率大小、或甚至固体培养基上的菌落形态。

如本文所用，“粘度改变的”丝状真菌细胞变异菌株是指其产生的细胞培养液相比于亲本菌株产生的等同细胞培养液粘度降低或增加(即对剪切或拉伸应力的抗性降低或增加)的变异菌株。通常，等同的细胞培养液具有类似的细胞团。优选地，粘度改变的变异菌株和亲本菌株之间在任何直接或间接粘度量度方面的差异为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或甚至至少50％或更多。用于比较丝状真菌细胞培养液粘度的方法在本文中有描述。通常，类似的(或等同的)细胞培养液具有类似的细胞团。

如本文所用，“粘度降低的”丝状真菌细胞变异菌株是指其产生的细胞培养液相比于亲本菌株产生的等同细胞培养液粘度降低(即对剪切或拉伸应力的抗性降低)的变异菌株。优选地，粘度改变的变异菌株和亲本菌株之间在任何直接或间接粘度量度方面的差异为至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或甚至至少50％或更多。

如本文所用，“主要遗传决定因子”是指在不存在其他基因或其遗传操作的情况下，为赋予特定表型而必需且充分的基因或其遗传操作。

如本文所用，“功能多肽/蛋白”是指具有活性例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，且未进行诱变、截短或以其他方式修饰以去除或降低该活性的蛋白质。功能多肽可为耐热性的或不耐热的，如所指明的。

如本文所用，“功能基因”是指能够被细胞组分使用以产生活性基因产物(通常是蛋白质)的基因。功能基因与被破坏基因相反，后者被修饰，因此不能被细胞组分使用以产生活性基因产物。

如本文所用，相比于亲本细胞(或亲本菌株)，若变异细胞与亲本细胞之间蛋白表达量差异低于约20％、低于约15％、低于约10％、低于约7％、低于约5％、或甚至低于约3％，则变异细胞(或变异菌株)“维持或保持高水平蛋白表达和/或分泌”。

如本文所用，若宿主细胞进行了遗传或化学变更以防止产生功能性Sfb3多肽——该多肽具有野生型Sfb3蛋白特有的活性，尤其是促进菌丝延长或以其他方式增加液体培养物中丝状真菌粘度的活性——则宿主细胞已“被修饰以防止产生Sfb3”。此类修饰包括但不限于sfb3基因缺失、sfb3基因破坏、使所编码的多肽缺乏上述活性的sfb3基因修饰、影响翻译后加工或稳定性的sfb3基因修饰以及它们的组合。

如本文所用，“目的蛋白”是期望在丝状真菌细胞深层培养物中产生的蛋白质。通常，目的蛋白在工业或医药用途方面具有重要商业价值，因此希望大规模生产。要将目的蛋白与丝状真菌细胞表达的大量其他蛋白质区分开，后者通常非目的产物，主要被视为背景蛋白质污染物。

如本文所用，若相比于亲本细胞产生的蛋白量，变异细胞产生的蛋白量减少不超过20％、减少不超过15％、减少不超过10％或甚至减少不超过5％，其中蛋白量被归一化到从中测定蛋白产量的细胞的生物量总量，其中生物量可用湿重(如细胞团块)或干重方式表示，则变异细胞(或变异菌株)每单位量的生物量产生与亲本细胞(或亲本菌株)“实质上相同量”的蛋白质。

如本文所用，若变异细胞与亲本细胞之间表达差异低于约20％、低于约15％、低于约10％、低于约5％、低于约4％、低于约3％、低于约2％或甚至低于约1％，则变异细胞与亲本细胞表达的目的蛋白量“实质上相似”。

如本文所用，“荧色物”为荧光染料。优选的荧色物与真菌细胞壁的纤维素和/或几丁质结合。

如本文所用，单数词语“一个”、“一种”和“该”涵盖多个指代物，除非上下文明确地另有所指。本文引用的全部参考文献均以引用方式全文并入本文。除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有下列含义：

EC 酶学委员会

kDa 千道尔顿

kb 千碱基

MW 分子量

w/v 重量/体积

w/w 重量/重量

v/v 体积/体积

wt％重量百分比

℃ 摄氏度

H₂O 水

H₂O₂ 过氧化氢

dH₂O或DI 去离子水

dIH₂O Milli-Q过滤的去离子水

g或gm 克

μg 微克

mg 毫克

kg 千克

lb 磅

μL和μl 微升

mL和ml 毫升

mm 毫米

μm 微米

M 摩尔浓度

mM 毫摩尔浓度

μM 微摩尔浓度

U 单位

ppm 份每一百万份

sec和″ 秒

min和′ 分钟

h 小时

EtOH 乙醇

eq. 当量

N 当量的

PCR 聚合酶链反应

DNA 脱氧核糖核酸

FOA 氟乳清酸

UV 紫外线

A₅₄₀ 540nm波长处测得的吸光度

CMC 羧甲基纤维素

rpm 转每分钟

Δ 与缺失相关

DO 溶解氧

III.丝状真菌的粘度降低表型

之前研发里氏木霉粘度降低菌株的努力涉及化学诱变，然后针对卡尔科弗卢尔荧光增白剂敏感性筛选所得的突变体(有时在本文称为“菌株”)，卡尔科弗卢尔荧光增白剂是能结合真菌细胞壁的纤维素和几丁质的荧光染色剂。卡尔科弗卢尔荧光增白剂敏感性与酵母形态变化有关，尽管卡尔科弗卢尔荧光增白剂敏感性在丝状真菌中的重要性至今尚不清楚。这样，亲本里氏木霉菌株Morph TrglaA(29-9)进行了化学诱变，发现所得的一个菌株(即70H2)在琼脂板上菌落生长率降低，在液体培养基中孢子形成减少、形态改变且粘度降低，但同时保持高水平蛋白表达和分泌。基因组序列比较分析表明，与亲本29-9菌株相比，70H2菌株的多个基因发生了突变。

虽然70H2菌株表现出“粘度降低”表型，但尚未清晰界定其基因组，不清楚负责粘度降低表型的基因。此外，虽然70H2可用作宿主菌株以引入外源基因进行高水平表达，但不可能将负责粘度降低表型的基因引入到其他菌株中。

IV.Sfb3产量的改变会影响丝状真菌的细胞粘度

现已发现Sfb3产量的改变会影响丝状真菌的细胞粘度。这个发现对于使用丝状真菌表达具有商业价值的蛋白质有着重大意义。

Sfb3基因(也称为Lst1)之前只在出芽酵母(即酿酒酵母)中得到表征，在出芽酵母中它编码与围绕运输小泡(其将蛋白质从内质网转运到高尔基体)的COPII蛋白外壳缔合的蛋白质。Sfb3和Sfb2是Sec24的同源物，其所有基因参与将特定货物蛋白质包装到小泡中。

虽然Sec24是酵母的必需基因，但Sfb3和Sfb2却并不是，尽管已知酵母Sfb3缺失会影响质膜转运蛋白(Pma1p)及参与细胞壁合成的葡聚糖转移酶(Gas1p)的转运。

使用酿酒酵母Sec24p、Sfb3p或Sfb2p氨基酸序列作为查询序列，通过BLAST搜索可公开获得的里氏木霉基因组序列，发现里氏木霉有与酵母Sec24同源性最接近的单个基因及与酵母Sfb3同源性最接近的单个基因。没有鉴定到其他同源物，表明里氏木霉不具有与Sfb2等同的基因。

使用里氏木霉Sfb3氨基酸序列作为查询序列，通过BLAST搜索盘菌亚门的种的可公开获得的基因组序列，证明是一般模式。也就是说，每个真菌都具有Sfb3和Sec24各自的明确同源物，但是与酵母Sfb2相关性更接近的另外同源物并不存在于这些丝状子囊菌的基因组中。

在丝状真菌(如里氏木霉和米曲霉)中发现了Sfb3蛋白的同源物，但这些蛋白质的功能至今尚不清楚。酿酒酵母Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ IDNO：1)、里氏木霉Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、米曲霉Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：3)、黑曲霉(A.niger)Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ IDNO：4)、绳状青霉(P.funiculosum)Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：5)、产黄青霉(P.chrysogenum)Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：6)、粗糙脉孢菌(N.Crassa)Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：7)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)Sfb3蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：8)作为示例显示如下：SEQ ID NO：4-8是从可公开访问的真菌基因组数据库获得，但不具有登录号。

酿酒酵母Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：1)：

MSQQNILAASVSALSLDESTVHTGGASSKKSRRPHRAYHNFSSGTVPTLGNSPYTTPQLNQQDGFQQPQAFTPKQFGGFNNGSGSVMSTPVMVSQERFGASEASSPYGQSMLDMTAPQPTSHIVPTQRFEDQAQYLQRSFETCRDSVPPLPTTQFYCVDQGSCDPHLMSLSMYNIPESEHLRAATKLPLGLTIQPFSTLTPNDAEVPTIPLPMDGTPLRCRRCRAYANPKFQFTYDSSVICNICRVKMQVPGEHFAPMGPNGQRSDLNEKSELLHGTVDFLVPSIYNAIQEKELLPLHYVFLIDVSLLANENGSSLAMVEGVRSCIEYISDFQPNCEVAIIVYDNKLRFFNLRPDLDNAQEYIVSELDDVFLPFYNGLFVKPGNSMKIINDTLIKISGYISTDKYSHVPQVCYGSALQAAKLALDTVTGGQGGKIICSLNSLPTIGNGNLSLKRDNAHIAHVKCDNGFYKKLASDFLKSYISLDLYVTNAGFIDMATVGHPVEMTSGILKYYPHFQQETDAFTLVNDMVTNVSNIVGYQALLKVRCSTGLSVEQYYCDSSDNTDHDPIIPVLTRDTTLDVLLKYDSKIKTGTDVHFQTALLYTDIDGVRKVRSINTSGAVSNNIREIFKFINQNPVMRIMIKDVIKTLGDCDFVKIRRLIDDKMVEILTQYRGLVSSNSSTQLILPDSIKTLPAYMLAFEKSELMKPNAQSTRGNERIYDLLKYDSLNSAQLCYKLYPQIVPFHVLLEETDLTFYDANDKLLQINSSSINNLSVRASHSNFINGGCYLIFQGDTIYLWFNENTNRMLLQDLLSVDESLPVSQISLFSGTLPETGTSINQKASNVIKNWQQVVNKSSLPLVLLRPNVDQYYSNVMSQLLCEDKTVNRIESYDNYLVIMHKKIQEKLQKDDFIKVSTAATHENIHQKFVQF

里氏木霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

MDYTQYHALGHGEVLDPNDPNKTSAPAAPQFQPPSSPYVPPGSPYGAPPYHGGHQAPPMAMPPPSTPGYGPPQGQSFPGSPMPSQDAGLAAQFGGMSLGADAGGAAARKKKKDRHAYHSVEPTGSSQAFNGLPPGTPAEQFLNVNNPQGIPALGGQFGSPLASPMGTPHMANPGQFPAPTSPFTPSAPVSPAEFASRFGSPDAATSIGSAGPSQVSPDDMPSIPASRDAIQEHFFKNVYPTFERHVPPPATVSFVAFDQGNASPKFTRLTLNNIPTTAEGLHATGLPLGMLIQPLAPLQAGEAEIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMMFRSGGNKFVCNLCSYPNETPPEYFCAVSPQGVRLDRDQRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFVIDVTQESYNKGFMETFCEGILAALYGGNDEENDEDGEPKRRIPKGAKVGFITYDKDIHFYNINPHLDQAHMMIMPDLEDPFLPLGEGLFVDPYESKAIITSLLTRLPEMFSTIKNPEPALLATLNAAVAALEATGGKVVCSCSTLPTWGPGRLFMRDDGNHPGGELDKKLYTTEHPAWKKVSEKMASSGIGVDFFLAAPSGGYLDIATIGHVAATTGGETFYYPNFIAPRDGARLSMEITHAITRETGFQALMKVRCSTGLQVAAYHGNFVQHTFGADLEIGVIDADKALGVSFSHDGKLDPKLDAHFQTALLYTTASGQRRVRCSNVIASVSDTSKESNTKELAIRQCLKFVDQDAVVGIFAKEASTKLATTSANLQDVRNWLTERTIDIMAYYKKHSANQFPPSQLVMPERLKEFCMYMLGMLKCRAFKGGIENSDRRVHELRMVRSMGPLELSLYLYPRMIALHNLQPEEGFADPETGHLKMPPSVRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHAQTSPNLITDLFGEGHDSLKGLDPYTSTLPVLETHLSAQVRNIIEFLKSMRGSKGMTIQLARQGIDGAEYEFARMLVEDRNNEAKSYVDWLVHIHRGVQLELSGQRKKEGDGEATAVMANFAGLRPAYW

米曲霉RIB40Sfb3氨基酸序列(GI：83766074；SEQ ID NO：3)：

MADQSMYNTLGQGTSPAEDPSNPNRMAHQVPPQSQPAAGFPPGPYPPQPGAYYGNPPPNQYDAPAAAPPTQQLQSPPPRGLAPSPQLAYGTETQTHMGAPADPMAGLASQMSGLGIMGDSGARPGKKKHRHAHHEIGGATASAPQQFAGMPQAGMQPSSQFLNTGLNQAPRPISPAAGVPPAGIVPQPGVPAPGSGSVPTQGKIDPEQIPSIPQSRDIPTMYYFDHIYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKHARLTLNNIPTTSDFLSSTALPLGMVLQPLARLDPGEPEVPVLDFGEMGPPRCRRCRAYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVAPEYFAPLDMSGARVDRLQRPELMIGTVEFMVPKEYWNKEPVGLQRLFLIDVSQESVNRGFLKGVCKGITEALYGAPDASEEDAAARRVPEGSKIGIVTYDREVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDIITSLLHRIPKIFSHIKKPEPALLPALNAAMSALQATGGKIFASICSLPTWGPGALHMRDDPKVHGTDAERKIFTTDNQAWRTTAGKMAEHGIGVDMFVAAPGGTYVDVATIGHVAEVSGGETFFYPNFHAPRDILKLSQEFAHAVTRETGYQAMMKVRCSNGLQVSAYHGNFIQHALGADLEIGSIDADKAIGVMFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTTAEGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFIDQDCVVSIMAKEAAAKTVDKSLKDIRASITEKTVDIFSGYRKVFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLALIKSRAFKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGATELALYLYPRVIPIHNMQPEDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQICLLWLHSRVSPNLLEDLLGPGQSSLQGLNPQTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYfSTMRGSKSVAIQLARQGLDGAEYEFARLLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTSAEGSLTSLAGLRAPYW

黑曲霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：4)

MADPNMYHTYGQAPVPGENPSDPNQMAYQVPPQGYPAAGIPPGPSPPQPGAAYGVPAPNQQWPAYGSPPPAQQPLQQPPSQFAHQADPQAAMGAPVDPGMAGLASQMSGLGIMGGEGGAARSSKKKHRHAHHEIAGASASVAQPFAAAPQDPMQPTSQFLNTGLNQAPRPISPAASIPAPVNPAFGGGAGAVPTQGKVDPEQIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMERHLPPPAAVPFVAHDQGNSSPKYARLTLNNIPSTSDFLSSTGLPLGMVLQPLARLDGEQPIPVLDFGDAGPPRCRRCRAYINPFMSFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPLDPSGSRIDRMQRPELMMGTVEFLVPKDYWNKEPVGLQWLLLIDVSQESVNKGFLKGVCKGIMEALYSEETENPEDEAPARRIPEGAKIGIVTYDKEVHFYNLSAQLDQAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLQRIPSIFSHVKNPQPALLPALNAALSALRPTGGKIVGTIASLPTWGPGALSLRDDPKVHGTDAERKLFTTEHAGWRETAGHLAEAGIGLDMFIAAPSGTYMDVATIGHIPEVTGGETFFYPNFHAPRDIRKLSKELAHAITRETGYQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFVQHTFGADLEIGAIDADKAIGVVFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSANGQRRVRCINTVAAVNEGGMETMKFVDQDAVVAMVAKDAASKTLDKSLKDIRAGVSEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLIKSRAIKGGQEASDRRIHDMRMLRSIGCTELSLYLYPRIIPIHNMQPTDGFPNEQGQLQVPPSLRASFSKIEEGGAYLVDNGQQCLLWIHSHVSPNLLEDLFGEGQTSLQGLSPQISTIPVLETHLNAQVRNLLQYFSTIRGSKAVTIQLARQGLDGAEYEFARMIVEDRNNEAQS SVDWLVHIHRQINLELAGHRKREDTAGEGGLTSLAGLRAPYW

绳状青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：5)

MADYSTYHSSGYAGAPGEDPNRQQPAVPAPYHSPNAPPGQAIQQPGITPYGAAQPPQFPGQPGVGYGVAPVPSPPQALGGPDVGDLATRIGGLGIISDAGTRSHKKKHRHAYHDIGGPNAQGLNTFPSQTNLQSQFLNTGLNQPEQQPAAPAAFPGAPVGQVPANVAPGAAPEVGGVGSVPTQGKIDPEQIPSVPRSRDLPAQYYFNNVYPTMERHVPPPASIPFIAHDQGNSSPKVARLTLNNIPSSSDFLQSTGLPLGMILQPLAKLDAGEQPVPVIDFGDIGPPRCRRCRTYINPFMTFRSGGNKFVCNMCTFPNDVPPEYFAPVDPSGVRVDRLQRPELMLGTVEFTVPKEYWVKEPAGLHQLFLIDVSQESVNRGFLKGVCDGIINALYGEEEPVEGAEPETRKVPEGSKIGIVTFDREIHFYNLLPRLDKAQMMVMTDLEEPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLEQLPSLFARVKSPESTLLPTIKAAISALQATGGKIICCLTSLPTYGPGKLVMKDKSQAPDGENKLFAIDNPDYKAAATKLTEAGVGIDFFVAAPGGSFMDLTTIGYTAAISGGECFFYPNFHSPRDSLKLAQEISHTVTRETGYQALMKVRCSNGLQVSAYYGNFLQHTFGADLEIGTIDADKALGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTAANGQRRVRCINIVAGVNEGGIETMKCIDQDAVVAIIAKEAASKAGDKTLKDIRASITEKTVDIFSGYRKNFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLGLLKSRAFKGGSETADRRVHDLRMLRSIGCLELSLYLYPRIIPIHNMSAEDGFANEQGQLQVPPALRASFSRVEEGGAYLIDNGQGILLWIHSFVSPNLLEDLFGPGITSLQALDPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKAVTIQLARQGIDGAEYEFARSLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEDSATSSGEGALSSLAGIRAPYW

产黄青霉Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NQ：6)

MADSSMYNTMGQGSSEDPSNPQYMAQVPPQQYPAGYPPTAAPLQPGAPYANPAPNQWPAYGSPQQPGMASPGIAYNAPQQPMGAAVDPGMAGLASQMGGLDIAADAGARTHRKKHRHAHHDIGGGAAPPAQGFNTGMDQGGLQQPQPQQQSQFLNTGLNQHADRPVSPAVGLVSGQSVAAIPGIQSGAGSVPTSGRIDPEHIPSIPRSRDLPAQYYFNHVYPTMDQHLPPPAAIPFVAQDQGNSSPKYARLTLNNIPSASDFLTSTGLPLGMILQPLAPLDPGEQPIPVLDFGDVGPPRCRRCRTYINPFMSFRSGGSKFVCNMCTFPNDTPPEYFAPLDPSGARVDRMQRPELLMGTVEFTVPKEYWNKEPVGLQTLFLIDVSRESVHRGFLKGVCAGIKDALYGDDDKASEGTEGDGSSRKLPVGAKVGIVTYDKEVHFYNLAAALDQAQMMVMTDLDEPFVPLSEGLFVDPYESKSVITSLLSRLPKIFSSIKNPESALLPTLNSALSALQATGGKIVCAVASLPTCGPGHLAIREDPKVHGTDAERKLFTTENPAWKKTASKIAEAGVGLDLFMAAPGGTYLDVATIGHVSSLTGGETFFYPNFHAPRDLLKLRKEIAHAVTRETGYQTLMKVRCSNGLQVSAYHGNFVQHTLGADLEIAGVDADKAVGVLFSYDGKLDPKLDAHFQAALLYTSADGQRRVRCINVVAAVNEGGLETMKFVDQDAVVSVIAKEAASKTLDKNLKDIRASISEKTVDIFSGYRKIFSGSHPPGQLVLPENLKEFSMYMLSLVKSRAFKAGPESSDRRIHDMRLIRSMGCTEMALYLYPRIIPVHNMQPEDGFANEHGQLQIPPTMRASYSRIEDGGVYIVDNGQAILLWIHAQVSPNLLEDLFGPGHNSLQGLNPNTSSLPVLETHLNAQVRNLLQYLSTVRGSKSVTIQLARQGLDGAEYEFARLLLEDRNNEAQSYVDWLVHIHRQINLELAGHRKKEEGGEGALASLSAMRTPYW

粗糙脉孢菌Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NQ：7)

MADYTMYHALGQGETLDPNDPNRTTQPAPPQFQPPVAPNPYHPGAEYNAPGQQQQQQQQYGQQYGQQYGQQYGQQQYGQEYGHQQQQQQQQQYGAPSPYGAPPAHSPVSPMDDVGLAAQMGGMSLGAGAGAADHHGRKKKKDRHAFHTVEAPAGSSQPFNGMPPAGIPATQFLNADPSLAGRIPGPGHGQFPMPASPAFGPVPTSAADFAARDATQGVGSGVFAAGGPQGGKPSPDDTPSVPLSRDAVQPYFHTNVYPTFERLVPPPAVTSFVALDQGNSSPKFARLTMTNLPASAEGLKSTGLPLGLLLQPLAETQPGELPIPVLDFGEQGPPRCHRCRAYMNPFMMFKAGGNKFVCNLCTYANDTPPEYFCALSPQGVRVDRDQRPELTRGTVEFVVPKEYWTKEPVGMRYLFVIDVTQESYNKGFLESFCEGILSALYGGSEEGEDQDETGEPKRKIPAGAKVGFVTFDQEIHFYNVSPALEQAQMIVMPDIEDPFLPLSDGLFVDPYESKAVISSLLTRLPQMFSNIKNPEPALLSALNSAVAALEKTGGKVFCSLAALPTWGPGRLFMRDDGKHPGGEPDKKLFTTEHPGWRKLAEKMVSLGVGADFFMASPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFFYPNFVVQRDSTKLSLEIHHAVRRETGYAALMKVRCSNGLQVNAYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKALAVTFGYDGKLDSKLDAHFQAALLYTTASGQRRVRCINVIAGVSDLARDCMKYIDQDAIVSILAKEASTKLSTTSANLKEVRS SLTEKTIDILALYRKNHLAVPHPPQQLVMPERLKEFTMYVLGMLKCRAFKGGNETTDRRVHDMRLIRSMGARELSLYLYPRIIPLHSLQPEDGYPDATTGHLRMPSTMRASFARVEPGGVYLVDNGQVCLLWMHAQTAPALIQDLFGEDKTTLQSLDPYTSTIPVLETHLNAQTRNIIEYMRTVRGSKGLTIQLARQGIDGAEFEFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHVHKGVQLELAGQRKREDGESHSALGSFTGLRPAYW

尖孢镰刀菌Sfb3氨基酸序列(SEQ ID NO：8)

MADYAQYHALGQGEVIDPNDPNRTSQPSAQQFQPPIAPSPYQQQASPYGAPQYLGGQQAPPPMTGSPAPAPGYGYAPPQAQAPPGQAPPSQDATLAAQLGGMNLGDGHGTARRKKKDRHAYHTVEPTGSSQAFNGMPPQGTSATQFLDSVPGGPGFGGQFGSPQGTPQMQSQSQFSAPVNPAFGPGPVAGTPGVGEGLGTASVSTSGPKGVSPDDMPSVPASRDAIQQYYLKNVYPTFERHVPPPSTVSFVAYDQGNSSPKYTRLTLNNIPTTQDALQATGLSLGLLLQPLAPLQAGEAEIPVLDFGEAGPPRCRRCRAYMNPFMMFRSGGNKFVCNLCAYPNDTPPEYFSATNPQGVRVDRDTRPELHRGTVEFVVPKEYWTREPVGLRWLFLIDVTQESYNKGYVEAFCEGIRVALYGGEDQELDENGEPKRRIPEGAKVGFVTYDKDIHFYNVNPALDQAQMMIMPDLEDPFVPLSEGLFVDPYESKDVITSLLTRLPDMFSTIKNPEPALLAALNSALAALEATGGKVVASCSALPTWGPGRLFMRDNGNHPGGEIDKKLYTTEHPAWKKVAEKMAASGVGADFFLAAPSGGYLDIATIGHVSSTTGGETFYYPNFIAARDSRKLSLEISHAVTRETGFQALMKVRCSNGLQVSGYHGNFIQHTFGADLEIGVIDADKAMGVSFSYDGKLDPKLDAHFQSALLYTTASGERRVRCSNVIASVTETSKESGAREQGIRECLKFVDQDAVIGMLAKEASTKLATTSSNLKDIRHWLSEKAIDVLACYRKHAAQQHPPGQLVMPERLKEYCMYLLGLLKCRALKGGVENSDRRVHEMRMLRSMGALELSLYLYPRMIPIHNLAPEEGFADPETGHLKMPPAIRTSFSRVEPGGVYLVDNGQQCLLWFHSQTSPNLISDLFGEDKDSLKSLDPYTSALPLLETHLNAQVRNIIEFLRTMRGSKGLTIQLARQGIDGAEFDFARMLVEDRNNEAQSYVDWLVHIHKGVQLELSGQRKKEGEEHTAASLSNFAGLRPAYW

图13中显示了Sfb3蛋白的氨基酸序列比对，这些蛋白来自酿酒酵母(SEQ ID NO：1)及里氏木霉(SEQ ID NO：2)。这些序列具有大约30％的氨基酸序列同一性。相比之下，里氏木霉和米曲霉的Sfb3蛋白具有大约58％的氨基酸序列同一性。图14显示了Sfb3蛋白的氨基酸序列比对，这些蛋白来自酿酒酵母(SEQ ID NO：1)、里氏木霉(SEQ ID NO：2)及米曲霉(SEQ IDNO：3)。

来自大约40个盘菌亚门的种的Sfb3蛋白的氨基酸序列比对揭示了一段特定氨基酸序列，即IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO：9，其中X为任何氨基酸残基)，其与Sfb3蛋白C端相近，但不存在于Sec24蛋白中。这段共有序列可用来鉴定盘菌亚门其他成员的Sfb3蛋白。

独立的研究已经证实gas1基因(或gel1基因，如在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中所知的)突变会影响真菌细胞壁结构，导致形态学变化以及对卡尔科弗卢尔荧光增白剂、刚果红和十二烷基硫酸钠的超敏性。

不受理论的限制，据信丝状真菌中的Sfb3表达和/或活性的改变会干扰涉及细胞壁合成的蛋白的转运，从而改变细胞壁结构，产生更紧密的细胞形态，其特征在于菌丝更短且外观更似酵母。涉及细胞壁合成的蛋白质的一种可能候选蛋白是Gas1/Gel1。

在液体培养基中表现出粘度改变表型的丝状真菌变异菌株可非常适合大规模生产具有商业价值的蛋白质。虽然本发明的菌株和方法以丝状真菌里氏木霉为例，但预计Sfb3蛋白在盘菌亚门内的功能是保守的。因此本发明的菌株和方法决不会局限于里氏木霉。

V.Sfb3蛋白产量改变的丝状真菌菌株

在一个方面，提供衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，该变异菌株包含的遗传变更导致变异菌株的细胞的功能性Sfb3蛋白产生量与亲本菌株的细胞相比发生改变。相比于亲本菌株的细胞，变异菌株的细胞随后在深层培养有氧发酵过程中产生出需要改变的搅拌量来保持预选溶氧量的细胞培养液，或产生出在预选搅拌量下保持改变的溶氧量的细胞团。

在一些情况下，遗传变更造成变异菌株的细胞的功能性Sfb3蛋白产量与亲本菌株的细胞相比下降，并且与亲本菌株的细胞相比，所得的细胞培养液需要减少的搅拌量来保持预选溶氧量，或在预选的搅拌量下保持更高的溶氧量。在此类情况下，据信变异菌株的细胞团与亲本菌株的细胞团相比表现出粘度降低，这也解释了与溶氧量及搅拌量相关的观察结果。

功能性Sfb3蛋白产量下降可能是由亲本菌株中存在的sfb3基因被破坏造成的。因为sfb3基因的破坏是赋予变异菌株粘度降低表型的主要遗传决定因子，此类变异菌株只需包含被破坏的sfb3基因，而所有其他基因可保持完整。在一些情况下，相比于其来源亲本菌株，变异菌株可任选地包含另外的遗传变更。此类另外的遗传变更并非实现粘度降低所必需的，但可以为菌株带来其他优势。

sfb3基因的破坏可采用任何合适的能实质上防止功能性sfb3基因产物(即Sfb3蛋白)表达的方法来完成。示例性的破坏方法包括完全或部分缺失sfb3基因，包括完整或部分缺失(例如)Sfb3编码序列、启动子、终止子、增强子或别的调控元件在内。sfb3基因的破坏也可通过完全或部分缺失包含sfb3基因的任何部分的染色体的一部分来进行。破坏sfb3基因的具体方法包括在sfb3基因的任何部分(例如Sfb3编码序列、启动子、终止子、增强子或别的调控元件)中进行核苷酸置换或插入。优选地，采用序列特异性分子生物学技术，通过遗传操作进行缺失、插入和/或置换(统称为突变)，这不同于化学诱变，后者通常不能靶向特定核酸序列。

sfb3基因中的突变可降低sfb3启动子的效率，降低sfb3增强子的效率，干扰sfb3mRNA的剪接或编辑，干扰sfb3mRNA的翻译，在Sfb3编码序列中引入终止密码子以阻止全长Sfb3蛋白的翻译，改变Sfb3蛋白的编码序列以产生较低活性或失活的蛋白或降低Sfb3与其他细胞壁成分的相互作用，改变Sfb3蛋白的编码序列以产生稳定性较低的蛋白或靶向该蛋白使其被破坏，造成Sfb3蛋白错误折叠或不正确修饰(如通过糖基化)，或干扰Sfb3蛋白的细胞运输。

通常，这些以及其他遗传操作的目标是降低或防止功能性Sfb3蛋白的表达，或者降低或防止Sfb3蛋白的正常生物活性，从而产生会导致粘度降低表型的形态改变。

在其他情况下，遗传变更会增加或恢复功能性Sfb3蛋白的表达，或增加Sfb3蛋白的正常生物活性，从而产生会导致粘度增加或恢复的表型的形态改变。示例性的会增加或恢复Sfb3功能的遗传变更有：会引入额外sfb3基因拷贝到细胞中的遗传变更，会提高sfb3启动子、增强子或其他调控元件的效率的遗传变更，会增加编码Sfb3蛋白的mRNA的翻译的遗传变更，会提高编码Sfb3蛋白的mRNA的稳定性的遗传变更，会在sfb3基因中引入能增加Sfb3蛋白活性或稳定性的变化的遗传变更，会在sfb3基因中引入能调节与其他蛋白质或细胞壁成分的相互作用的变化的遗传变更，等等。其他会增加或恢复Sfb3功能的遗传变异是那些能使会降低或防止功能性Sfb3蛋白表达的遗传变更的作用发生逆转的遗传变更。

用于如所描述进行操作和使用的丝状真菌细胞通常来自子囊菌门盘菌亚门，尤其是具有营养菌丝状态且包含sfb3基因的同源物的真菌。此类生物体包括用于生产具有商业价值的工业和药用蛋白质的丝状真菌细胞，包括但不限于木霉属、曲霉属、镰刀菌属、足放线病菌属(Scedosporium)、青霉属、金孢子菌属(Chrysosporium)、头孢属(Cephalosporium)、篮状菌属(Talaromyce)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、毁丝霉属(Myceliophthora)以及脉孢菌属。具体的生物体包括但不限于里氏木霉(之前归类为长梗木霉和红褐肉座菌)、黑曲霉、烟曲霉、分解乌头酸曲霉(Aspergillusitaconicus)、米曲霉、构巢曲霉(Apergillusnidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育赛多孢(Scedosporium prolificans)、粗糙脉孢菌、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌(白乔史密斯霉)、产毒镰刀菌(Fusarium venenatum)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)和勒克瑙金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)。

在一些实施方案中，例如在丝状真菌为里氏木霉的情况中，sfb3基因编码具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质。在其他实施方案中，sfb3基因编码与SEQ ID NO：2氨基酸序列具有指定程度的总体氨基酸序列同一性的蛋白质，所述程度例如为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。

在一些实施方案中，例如在丝状真菌为米曲霉的情况中，sfb3基因编码具有sEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白质。在其他实施方案中，sfb3基因编码与SEQ ID NO：3氨基酸序列具有指定程度的总体氨基酸序列同一性的蛋白质，所述程度例如为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。

在一些实施方案中，例如在丝状真菌为里氏木霉的情况中，sfb3基因具有如下所示的SEQ ID NO：10核苷酸序列。在其他实施方案中，sfb3基因具有与SEQ ID NO：10核苷酸序列具有指定程度的总体核苷酸序列同一性的核苷酸序列，所述程度例如为至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或甚至至少约99％同一性。

里氏木霉sfb3DNA序列(SEQ ID NO：10；2个内含子用下划线标出)：

atggactacacgcagtatcacgccctgggccacggcgaggtcctcgaccccaacgaccccaacaagacgtccgctccagcggctccccagttccagcccccctcctcgccctacgtgccaccgggctccccttacggcgctcccccgtaccatggcggccaccaagctcctcccatggcaatgccgcctccgtcgacgcccggctacggcccgccgcagggccagagcttccccgggtctccgatgccgtcgcaggatgctggccttgccgcgcagtttggcgggatgagcctgggtgcggatgcgggaggcgccgccgcgaggaagaagaagaaggacaggcacgcgtaccacagcgtggagccgacgggctcgtcgcaggccttcaatggcctgccgccggggacgcccgccgagcagttcctcaacgtcaacaacccgcagggcatcccggcgctgggagggcagtttggaagccctctggccagccccatgggcacgcctcacatggccaatccgggccagttcccggcgccaacctctcccttcaccccctcggcccctgtgtcgccggccgagttcgcatccaggtttggctctcccgacgctgccacgtcaataggctcggctggccccagccaggtgtcgccagacgacatgcccagcatacccgcctcgagggacgccatccaggagcacttttttaagaacgtttacccgaccttcgagcgccatgtgccccctcctgcgacggtttcctttgttgccttcgaccaaggcaatgcctctcccaaattcacccgactcaccctcaacaacatcccaaccacagccgagggcctccatgcgacgggcttgcccctgggcatgctcatccagcctctggccccacttcaagcgggagaggccgagattcccgttctcgactttggcgacgccggcccgcctcgatgtcgaagatgccgggcttatatcaaccccttcatgatgttccgatcgggcggcaacaagttcgtgtgcaacctctgctcgtaccccaacgaaacgccgcccgagtacttttgcgccgtcagcccacagggagtgcgcctagatcgagaccagcggccggagcttcaccgcggtaccgtcgagttcgtcgtccccaaggagtactggacccgagagcccgtcggcctccgctggctgtttgtcatcgacgtcacgcaggaatcctataacaagggcttcatggagacattctgcgagggcatcctcgcggccctctacggcggcaacgacgaggagaatgatgaagatggcgagccaaagcgaaggatacccaagggagccaaggttgggttcatcacgtacgacaaggacattcacttttacaacatcaacgtgagttcacgagcactgggaacaagaatgagatggcccgc taacattaagacagcctcatctggatcaagcgcacatgatgatcatgcccgacctcgaagacccattcctccccctcggcgagggcctctttgtcgacccgtacgagtcaaaggccatcatcacctctctcctcacccgcctccccgagatgttctccaccatcaaaaaccccgagcccgctctgcttgccacgctcaatgccgccgtggctgcgctggaggcaacgggaggtaaagtcgtgtgctcgtgctcgaccttgcctacctggggccctggccgactgttcatgcgcgacgacggcaaccatcccggtggcgagctggacaagaagctgtatacgacggaacaccccgcgtggaagaaggtctcggagaagatggcttcgtccggcattggtgtcgacttcttccttgctgcgccctccggcggctacctggacattgcgacgataggccatgtcgccgccacgactggtggagagacgttctactaccccaacttcatcgccccgcgagacggtgcccggctgtcaatggagattacgcacgccatcacgagggaaacgggcttccaggcgctgatgaaggtccgctgctcgaccgggctgcaggtggcggcgtaccacggcaactttgtccagcacacctttggggcagacctggagattggcgtcattgacgcggacaaggcgctcggcgtgtcgtttagccacgacggtaaactggatcccaagctggacgcccacttccagacggctctcctgtacacgaccgcgtccggacagcgacgcgtgcgatgttccaacgtgattgccagcgtcagcgacacctccaaggagtccaacaccaaggagctggccattcggcagtgcctcaagtttgtcgaccaggacgcggttgtgggtatctttgcaaaagaagccagcaccaagctcgccacgacatcggccaatctccaggatgtgcgaaactggctgacggagcgaacaatcgacatcatggcctactacaagaagcactctgccaatcagttccctccgagccagctggtcatgcccgaacggctgaaggagttctgcatgtacatgctaggcatgttgaaatgcagagctttcaagggcggtatcgagaactcggatcgcagagtgcacgagctgcgcatggtccgcagcatgggcccgctggagcttagcctgtatctgtacccccggatgattgctctgcacaacctccagcccgaagagggctttgccgaccccgaaacaggccacctcaagatgcccccgtccgtgcggacgtccttttcacgggtcgagccgggtggcgtctacctggtggacaacggacagcagtgcttgctgtggtttcacgcccagacgtcgcccaacctcatcaccgacctgtttggcgagggccacgactcgctcaaggggctggatccgtacacgtccacgctgccggtgctggagacgcatctcagcgcacaggtccgcaacattattgagttcctcaaaagcatgaggggatccaagggcatgacgatacagctggcgcggcaggggattgacggcgccgagtacgagtttgcgcggatgttggtggaggatcgcaacaatgaggcgaagagctacgttgactggcttgttcacattcacagaggagttcagctggaggtatgttcccccgcctccccccttttcccccttgcgtcgtcgtcaggagatgatgagaatgct aattc gtcctatagttgagcggacaacgaaagaaggaaggcgatggagaggctaccgccgtaatggccaactttgcaggactgagaccggcctattggtag

VI.改变丝状真菌细胞的粘度表型的方法

在另一方面，提供一种改变丝状真菌细胞的形态的方法。变异丝状真菌细胞在固体培养基上表现出生长形态改变，在深层培养中生长时产生具有不同粘度的细胞团。

在一些情况下，该方法包括使用合适的遗传或化学方法破坏亲本菌株中的sfb3基因，其中与亲本菌株的细胞相比，变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生的细胞培养液需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，或在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。可按上文及其他地方所述的任何方式，使用此类方法破坏sfb3基因。优选地，使用序列特异性分子生物学技术，通过遗传操作进行sfb3基因破坏，这不同于化学诱变，后者通常不能靶向特定核酸序列。

在一些实施方案中，其中引入了粘度降低表型的亲本菌株已经包含想要高水平表达的目的基因。这样，本发明的方法能避免需要将目的基因引入到预先存在的粘度降低菌株中用来生产。因此，本发明的方法可用于从已经包含目的基因的亲本菌株生产粘度降低的丝状真菌细胞变异菌株。

在另一方面，还提供针对粘度改变表型筛选丝状真菌细胞的方法。所述方法涉及针对改变的荧光染色剂敏感性筛选一组丝状真菌细胞(例如，诱变的细胞或田间分离株)，其中改变的荧光染色剂敏感性表明与亲本菌株的细胞相比，变异细胞在深层培养有氧发酵过程中产生的细胞培养液需要增加或减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或在预选的搅拌量下保持增加或减少的溶氧量。这样，荧光染色剂敏感性可用于鉴定具有粘度改变表型的变异丝状真菌细胞。在一些情况下，所述方法涉及针对增加的荧光染色剂敏感性筛选一组丝状真菌细胞(例如，诱变的细胞或田间分离株)，其中增加的荧光染色剂敏感性表明与亲本菌株的细胞相比，变异细胞在深层培养有氧发酵过程中产生的细胞培养液需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。这样，荧光染色剂敏感性可用于鉴定具有粘度降低表型的变异丝状真菌细胞。

示例性的荧色物能结合丝状真菌细胞壁中的纤维素和/或几丁质，并且包括但不限于卡尔科弗卢尔荧光增白剂(CAS No.4193-55-9)、刚果红(CASNo.573-58-0)、沙拉菲尼尔嫩黄(Solophenyl Flavine)(CAS No.61725-08-4、滂胺坚牢猩红(Pontamine Fast Scarlet)(CAS No.79770-29-9)以及樱草黄(primulin)(CAS No.30113-37-2)。

用于破坏丝状真菌亲本菌株中的sfb3基因的特定遗传学技术对于本发明方法通常并非关键，只要该技术以序列特异性方式靶向sfb3基因即可。示例性的方法有位点特异性重组、定向基因插入、使用转座元件、通过病毒转导、使用RNA介导的基因沉默(Raponi M.and Arndt，G.M.(2003)Nucleic Acids Research31：4481-89(Raponi M.和Arndt，G.M.，2003年，《核酸研究》，第31卷，第4481-4489页)；Nakayashiki H.and Nguyen，Q.B.(2008)Current Opinionin Microbiology11：494-502(Nakayashiki H.和Nguyen，Q.B.，2008年，《微生物学新见》，第11卷，第494-502页)；Kuck，U.and Hoff，B.(2010)Appliedand EnvironmentalBiotechnology86：51-62(Kuck，U.和Hoff，B.，2010年，《应用和环境生物技术》，第86卷，第51-62页))。

如有需要，破坏sfb3基因可伴随同时或顺序插入(例如)选择性标记、荧光标记或其他可分辨标记、克隆位点或克隆盒、便于后续菌株鉴定的序列指纹、或能给菌株增添辨别性或功能性的其他遗传修饰。在一些情况下，可能可取的是在粘度降低菌株皤中sfb3基因破坏位点引入想要高水平表达的目的基因。在此类情况下，引入粘度降低表型和引入目的基因可同时进行。

VII.实用性

已知使用丝状真菌粘度降低菌株能改善深层培养物中氧气和营养物质的分布，降低搅拌深层培养物所需的能量，并增加培养物中存在的细胞团，从而导致蛋白质产量提高。然而，本发明的丝状真菌变异菌株与之前描述的粘度降低菌株相比具有显著优点。

首先，本发明的菌株可具有清晰界定的基因组，从而非常适合后续遗传操作、互补、交配等等。其次，本发明菌株在分泌蛋白产量方面不会受到不利影响。第三，粘度降低菌株可从实质上任何亲本菌株产生，包括这样的亲本菌株在内：已产生想要高水平表达的蛋白(即目的蛋白)的亲本菌株、已编码选择性标记的亲本菌株或已包括其他在生产宿主中期望的特征的亲本菌株。因此，本发明的菌株和方法能避免需要将编码目的蛋白的基因转移到预先存在的粘度降低生产菌株中。

本发明的菌株和方法可用于在丝状真菌深层培养物中生产具有商业价值的蛋白质。具有商业价值的蛋白质包括(例如)纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、裂解酶、果胶酶、蛋白酶、淀粉酶、支链淀粉酶、脂肪酶、酯酶、过水解酶、转移酶、漆酶、过氧化氢酶、氧化酶、还原酶、疏水蛋白和其他酶，以及能够在丝状真菌中表达的非酶蛋白。此类蛋白质可用于工业或医药用途。

根据本说明书，本发明的菌株和方法的这些和其他方面以及实施方案对于技术人员将显而易见。以下实施例旨在进一步说明而非限制所述菌株和方法。

实施例

为了有助于阅读以下实施例，丝状真菌出发菌株普通名称、杰能科(Genencor)菌株保藏编号(GICC#)以及所选的特征列在表1中。所产生的丝状真菌菌株的相同信息列在表2中。实施例所用的核酸引物列在表3中。小体大写字母表示的序列是添加的核苷酸，以便直接消化PCR扩增片段。斜体表示的序列是限制酶识别位点。粗体表示的序列是loxP位点。将带下划线的CACC序列添加到合适的引物，以便将扩增的DNA片段掺入到GATEWAY入门载体中。

表1.实施例所用的预先存在的里氏木霉菌株。

表2：本研究中产生的里氏木霉菌株

表3.实施例中所用的引物序列。

实施例中所用的培养基和其他储备液描述如下：

VOGEL基本培养基(VM)1L

50×VOGEL溶液

添加dH₂O至最终体积

过滤灭菌

Vogel痕量元素溶液

添加dH₂O至最终体积

过滤灭菌

Vogel生物素溶液1L

D-生物素 0.1g

过滤灭菌

VM潮霉素培养基(VMH)1L

VM山梨醇潮霉素培养基(VMSH)1L

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)1L

BD Difco马铃薯葡萄糖琼脂 39g

添加dH₂O至最终体积

高压灭菌

刚果红培养基(CR)1L

制备VM或PDA

高压灭菌

1％刚果红储液 6mL

1％刚果红储液25mL

刚果红 250mg

dH₂O 25mL

过滤灭菌

YEG培养基1L

里氏木霉甘氨酸基本培养基1L

里氏木霉痕量元素400×1L

实施例1.缺失里氏木霉菌株Morph和29-9中的sfb3以获得粘度降低表型

1.1.Δsfb3缺失盒

的产生用引物对AVG88/AVG89扩增里氏木霉sfb3基因5′端侧翼DNA序列。用这个引物对扩增该片段在该片段5′端引入了SalI位点并在该片段3′端引入了BglI位点。用引物对AVG90/AVG91从质粒pCR-Blunt II-hph-loxP#4(图1)扩增侧翼带有平行loxP位点的潮霉素B抗性盒，从而在该片段5′端引入BglII位点并在该片段3′端引入NotI位点。用引物对AVG92/AVG93扩增sfb33′端侧翼DNA序列，从而在该片段5′端引入NotI位点并在该片段3′端引入XbaI位点。

将上述三个片段相继连接到载体

(美国加州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA))中，得到的质粒命名为pCR-Blunt II-TOPO889092(图2)。用Morph TrglaA(29-9)基因组DNA作为模板扩增sfb3基因5′及3′侧翼的DNA序列。用引物对AVG104/AVG105从质粒pCRBluntII-TOPO889092扩增Δsfb3缺失盒，其含有sfb35′侧翼序列、两端被loxP位点围绕的潮霉素B抗性盒及sfb33′侧翼序列。将多个PCR反应液合并，使用PCR纯化试剂盒纯化，并用乙醇沉淀以浓缩扩增的DNA片段。在后续步骤中使用这样制备的DNA。

12缺失sfb3基因的29-9Δsfb3和MorphΔsfb3菌株

的产生通过PEG介导的转化，用Δsfb3缺失盒转化Morph和29-9菌株，并接种到含有潮霉素B和山梨醇的Vogel基本培养基上。木霉属的转化在例如美国专利第5,246,853号中有描述。将候选株(684个29-9+Δsfb3和348个Morph+Δsfb3)转移到含有潮霉素B的Vogel基本培养基，以选择潮霉素B抗性候选株。将潮霉素B抗性转化株转移到含有刚果红的Vogel基本培养基或PDA，以评估刚果红敏感性。PCR分析显示每次转化得到一个刚果红敏感候选株，其中通过同源重组在sfb3基因座整合了Δsfb3缺失盒(图3)。通过采用引物对AVG108/AVG109、AVG110/AVG111及AVG108/AVG111扩增出预期大小的DNA片段，验证了29-9Δsfb3和MorphΔsfb3都在sfb3基因座同源整合了Δsfb3缺失盒。引物对AVG108/AVG109扩增一段起始于AVG88/AVG89缺失盒区域5′端外部并结束于潮霉素B抗性盒内部的DNA片段。引物对AVG110/AVG111扩增一段起始于潮霉素B抗性盒内部并结束于AVG92/AVG93缺失盒区域3′端外部的DNA片段。引物对AVG108/AVG110扩增整合在sfb3基因座的整个缺失盒。所产生并确认同源整合了缺失盒的菌株分别命名为29-9Δsfb3和MorphΔsfb3。

1.3.29-9、70H2及29-9Δsfb3菌株在深层培养中的生长

将29-9、70H2及29-9Δsfb3菌株在相同条件下进行深层(液体)培养生长，并比较它们的生长表型。

简而言之，将每个菌株的孢子单独添加到带有侧面和底面挡板的3L烧瓶中的500ml培养基。培养基含有5g/L(NH₄)₂SO₄、4.5g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O以及14.4g/L柠檬酸，用5％NaOH调到pH5.5。高压灭菌30分钟后，添加60％的无菌葡萄糖至终浓度为27.5g/L，同时添加2.5mL/L的痕量元素溶液，所述痕量元素溶液含有175g/L的柠檬酸、200g/L的FeSO₄·7H2O、16g/L的ZnSO₄·7H₂O、3.2g/L的CuSO₄·5H₂O、1.4g/L的MnSO₄·H₂O以及0.8g/L的H₃BO₃。使培养物在34℃摇床培养箱中生长48小时。

48小时后，将每个烧瓶的内容物单独添加到含有9.5L培养基的15L发酵罐，所述培养基含有4.7g/L的KH₂PO₄、1.0g/L的MgSO₄·7H₂O、4.3g/L的(NH₄)₂SO₄以及2.5mL/L的相同痕量元素溶液。将这些成分在121℃下一起高温灭菌30分钟。单独地将含有60％葡萄糖和0.48％CaCl₂·2H₂O的溶液进行高压灭菌、冷却并添加到发酵罐至终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/L CaCl₂·2H₂O。用28％的NH₃调节培养基pH至3.5，整个生长过程温度保持在34℃。

顶部空间未加压(即表压为0巴，绝对压为1巴)时，将溶解氧(DO)探头校准为100％。然后将顶部空间中的压力设置为0.7巴(表压)，之后在添加种菌培养物前氧探头读数为170％。发酵罐含有两个四叶涡轮机，其通过最初设定在500rpm的变速马达提供混合。

随着培养物生长，DO水平下降，至少部分原因是由于丝状真菌菌丝增殖导致培养液粘度增加。当DO低于40％时，增加搅拌速率以保持溶解氧浓度为40％。如果DO不低于40％，在发酵运行过程中就不必提高搅拌速率，并且初始搅拌速率高于所需。当葡萄糖被完全消耗时，测量每一个发酵罐中产生的生物量数量，发现所有三种菌株实质上相同。

每个发酵罐中给定搅拌水平下的DO水平及保持给定DO水平所需的搅拌量，是衡量不同菌株生长表型导致的不同培养液的粘度的间接指标。尽管理想的情况是只改变一个变量(即DO或搅拌速率)并测量另一个变量，但可取的是防止DO低于40％以确保每个发酵罐中产生足够的生物量，从而使不同菌株生长之间的比较更有意义。

通常，当需要增加搅拌速率以保持目标DO水平时，可以通过供应给驱动发酵罐涡轮机的马达的功率大小来估计搅拌量，这提供一个与培养液粘度相关的度量标准。

具体地讲，搅拌悬浮培养物所需的额外功率与搅拌速率的三次幂成比例。表4示出了生长期结束时保持溶解氧为40％所需的最高搅拌速率。

表4.生长期结束时保持DO为40％所需的搅拌速率

菌株	搅拌速率	相对于500rpm基线值的相对功率增加
			29-9	750	(750/500)³＝3.4
70H2	539	(539/500)³＝1.3
			29-9Δsfb3	540	(540/500)³＝1.3

在这些生长条件下，为了保持DO为40％并产生该生物量数量，原始菌株29-9需要的功率是70H2或29-9Δsfb3菌株的2.6倍。70H2和29-9Δsfb3菌株在悬浮培养中具有相似的粘度性质，并产生相似水平的目的蛋白质(TrGA)，证实可通过破坏sfb3基因赋予丝状真菌粘度降低生长表型。

1.4.从MorphΔsfb3中去除侧翼带有loxP的潮霉素B抗性盒

通过瞬时表达ere基因引发loxP位点之间的重组，来去除MorphΔsfb3菌株中侧翼带有loxP的潮霉素B抗性盒。用含有cre的端粒质粒pTrex-Tel-pyrG13/pDONR221/0927853cre(图4)转化MorphΔsfb3菌株，以引发loxP位点之间的重组并去除潮霉素B抗性盒。这个载体含有amdS标记盒，使得可以在含乙酰胺的培养基上生长。将转化株在含乙酰胺的培养基上转移一次，之后在PDA培养基上转移三次，以使得含cre的端粒质粒丢失。然后将转化株平行转移到含潮霉素B的Vogel培养基上和含乙酰胺的培养基上，以分别评估潮霉素B盒是否丢失和评估含cre的质粒是否丢失(图5；PDA＝马铃薯葡萄糖琼脂，VMH＝含潮霉素B的Vogel基本培养基，amdS＝含乙酰胺的基本培养基，hph^-＝对潮霉素B敏感，cre^-＝对培养基中存在的乙酰胺敏感。91.8％的转化株丢失了潮霉素B盒，92.5％的转化株丢失了含cre的质粒。这证明可以从整合的Δsfb3缺失盒中去除潮霉素B盒。

1.5.目的基因的表达不因sfb3基因的破坏而受损

编码葡糖淀粉酶的表达盒用作一个示例性的目的基因，提供一种测量变异丝状真菌菌株分泌的蛋白质的量的便捷方法。葡糖淀粉酶表达盒(即TrglaA表达盒)含有cbhl启动子、里氏木霉葡糖淀粉酶基因TrglaA及cbhI终止子，并融合到amdS标记盒，用引物对SK745/SK746从质粒pNSP23(图6)对葡糖淀粉酶表达盒进行PCR扩增。将多个PCR反应液合并，使用PCR纯化试剂盒纯化，并用乙醇沉淀以浓缩扩增的DNA片段。通过PEG介导的转化，用TrglaA表达盒转化MorphΔsfb3菌株，然后接种在含有山梨醇的乙酰胺基本培养基上。在乙酰胺基本培养基上选择稳定的候选株并转移到微量滴定板中的诱导培养基。这些菌株在微量滴定板中生长，用PNPG作为底物测定上清液中葡糖淀粉酶的活性。

最好的MorphΔsfb3+TrglaA候选株的葡糖淀粉酶活性高于29-9菌株(其也包括TrglaA表达盒)。在摇瓶培养后验证最佳候选株的上清液葡糖淀粉酶活性，确认了微量滴定板中得出的结果。这些结果表明sfb3缺失不损害目的蛋白的表达或分泌。

实施例2.用野生型sfb3基因对70H2菌株进行互补

2.1.含有sfb3基因的构建体的产生

制备了四个含有sfb3基因的构建体。用引物对AVG82/AVG83从29-9基因组DNA扩增带有其天然启动子和终止子的野生型sfb3基因，并从70H2基因组DNA扩增带有其天然启动子和终止子的突变型sfb3基因。用引物对AVG84/AVG85扩增29-9基因组DNA的野生型sfb3基因起始密码子至终止密码子区域，并扩增70H2基因组DNA的突变型sfb3基因起始密码子至终止密码子区域。得到四个含有野生型或突变型sfb3基因的PCR扩增片段，带有或不带有天然sfb3启动子和终止子。将这四个片段每一个独立地克隆到pENTR/D-TOPO载体(美国加州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA))中。

下一步，使用LR clonase反应将四个pENTR/D-TOPO构建体转移到目的载体pTrex2g/HygB。在大肠杆菌中扩增四个构建体的每一个，得到每个构建体的小量制备样，并进行真空浓缩。在后续步骤中使用这种方式制备的DNA。图7示出了一个示例性目的构建体。

2.2.用sfb3基因对70H2表型进行互补。

通过PEG介导的转化将四个目的载体构建体的每个独立地转化到70H2中，然后接种在含有潮霉素B的Vogel基本培养基上。将四次转化每次所得的三十个候选株转移到含有潮霉素B的PDA，并将其表型与用单独pTrex2g/HygB载体转化的70H2和29-9(作为对照)进行比较。所有用野生型sfb3基因转化的候选株在含潮霉素B的PDA培养基上都具有与29-9相似的野生型表型。所有用衍自70H2的突变型sfb3基因转化的候选株都保持70H2表型(图8)。这些结果表明衍自29-9的野生型sfb3基因，而不是衍自70H2的突变型sfb3基因，可赋予70H2菌株野生型表型。

为了确认这种表型逆转是由野生型sfb3基因的存在而不是由染色体DNA的变化导致的，将候选株在PDA培养基(非选择性条件)上转移四次以寻找丢失载体的候选株，然后转回到含有潮霉素B的选择性培养基。对于所有不稳定且丢失质粒(根据潮霉素B抗性的失去)的候选株，质粒的丢失与70H2表型的再出现相关。这些结果证实野生型sfb3起到了恢复70H2野生型表型的作用。

2.3.金有野生型sfb3基因的sfb3基因置换盒

的产生用引物对AVG94/AVG95扩增含有野生型sfb3基因3′端的约2/3的DNA序列，该引物对在该片段5′端引入SpeI位点，并在该片段3′端引入BglII位点。用引物对AVG90/AVG91从质粒pCR-Blunt II-hph-loxP#4(图1)扩增侧翼带有loxP位点的潮霉素B抗性盒，该引物对在该片段5′端引入BglII位点，并在该片段3′端引入NotI位点。用引物对AVG96/AVG97扩增含有sbf3终止子区域下游3′DNA序列的DNA序列，该引物对在该片段5′端引入NotI位点，并在该片段3′端引入XbaI位点。

将这三个片段相继连接到载体

(美国加州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA))中，得到的质粒命名为pCR-Blunt II-TOPO949096(图9)。用29-9基因组DNA作为模板扩增围绕潮霉素B抗性盒的两条DNA序列。sfb3基因置换盒包含部分sfb3基因、两端被loxP位点围绕的潮霉素B抗性盒及sfb3下游的3′序列，用引物对AVG102/AVG103从质粒pCR-Blunt II-TOPO889092扩增sfb3基因置换盒。将多个PCR反应液合并，使用PCR纯化试剂盒纯化，并用乙醇沉淀以浓缩扩增的DNA片段。在后续步骤中使用这种方式制备的DNA。

2.4.通过表达天然sfb3基因座sfb3野生型基因对70H2表型进行互补

通过PEG介导的转化，用sfb3基因置换盒(2.3节中所述)转化70H2菌株，然后接种在含有潮霉素B和山梨醇的Vogel基本培养基上。将具有野生型菌落表型的15个候选株转移到含有潮霉素B的Vogel基本培养基，以选择具有野生型菌落表型的潮霉素B抗性候选株。在含有潮霉素B的基本培养基上选择稳定的潮霉素B抗性候选株，并评估野生型菌落表型(图10)。

通过采用引物对AVG112/AVG113和AVG114/AVG115扩增出预期大小的DNA片段，验证了70H2sfb3基因座同源整合了sfb3基因置换盒。引物对AVG112/AVG113扩增了一段起始于AVG94/AVG95sfb3基因置换盒区域5′端外部并结束于潮霉素B抗性盒内部的DNA片段。引物对AVG114/AVG115扩增了一段起始于潮霉素B抗性盒内部并结束于AVG96/AVG97sfb3基因置换盒区域3′端外部的DNA片段。

所产生并确认同源整合了sfb3基因置换盒的菌株命名为70H2+野生型sfb3。这个菌株与29-9具有相似的表型。因此，在天然sfb3基因座用野生型sfb3基因置换70H2中的突变型sfb3基因恢复了70H2的野生型表型，这进一步证明sfb3基因的破坏导致70H2的粘度降低表型。

实施例3.29-9、70H2及29-9Δsfb3菌株在深层培养中的生长。

将29-9、70H2及29-9Δsfb3菌株在相同条件下进行深层(液体)培养生长，并比较它们的生长表型。简而言之，将每个菌株的孢子单独添加到带有侧面和底面挡板的3L烧瓶中的500ml培养基。培养基含有5g/L(NH₄)₂SO₄、4.5g/L KH₂PO₄、1g/L MgSO₄·7H₂O以及14.4g/L柠檬酸，用5％NaOH调到pH5.5。高压灭菌30分钟后，添加60％的无菌葡萄糖至终浓度为27.5g/L，同时添加2.5mL/L的痕量元素溶液，所述痕量元素溶液含有175g/L的柠檬酸、200g/L的FeSO₄·7H2O、16g/L的ZnSO₄·7H₂O、3.2g/L的CuSO₄·5H₂O、1.4g/L的MnSO₄·H₂O以及0.8g/L的H₃BO₃。使培养物在34℃摇床培养箱中生长48小时。

48小时后，将每个烧瓶的内容物单独添加到含有9.5L培养基的15L发酵罐中，所述培养基含有4.7g/L的KH₂PO₄、1.0g/L的MgSO₄·7H₂O、4.3g/L的(NH₄)₂SO₄以及2.5mL/L的相同痕量元素溶液。将这些成分在121℃下一起高温灭菌30分钟。单独将含有60％葡萄糖和0.48％CaCl₂·2H₂O的溶液进行高压灭菌、冷却并添加到发酵罐至终浓度为75g/L葡萄糖和0.6g/L CaCl₂·2H₂O。用28％的NH₃调节培养基pH至3.5，整个生长过程温度保持在34℃。

顶部空间未加压(即表压为0巴，绝对压为1巴)时，将溶解氧(DO)探头校准为100％。然后将顶部空间压力设置为0.7巴(表压)，然后在添加种菌培养物前氧探头读数为170％。发酵罐含有两个四叶涡轮机，其通过最初设定在500rpm的变速马达提供混合。

随着培养物生长，DO水平下降，至少部分原因是由于丝状真菌菌丝增殖导致培养液粘度增加。当DO低于40％时，增加搅拌速率以保持溶解氧浓度为40％。如果DO不低于40％，就不必在发酵运行过程中提高搅拌速率，并且初始搅拌速率高于所需。当葡萄糖被完全消耗时，测量每一个发酵罐中产生的生物量数量，发现所有三种菌株实质上相同。

表4.生长期结束时保持DO为40％所需的搅拌速率

菌株	搅拌速率	相对于500rpm基线值的相对功率增加值
			29-9	750	(750/500)³＝3.4
70H2	539	(539/500)³＝1.3
			29-9Δsfb3	540	(540/500)³＝1.3

在这些生长条件下，为了保持DO为40％并产生该生物量数量，原始菌株29-9需要的功率是70H2或29-9Δsfb3菌株的2.6倍。重要的是，70H2和29-9Δsfb3菌株在悬浮培养物中具有相似的粘度性质，这证实可通过破坏sfb3基因赋予丝状真菌粘度降低生长表型。

实施例4：产生用于生产全纤维素酶组合物的Δsfb3H3A菌株

4.1Δsfb3缺失盒的产生

用引物对AVG88/AVG89扩增里氏木霉sfb3基因5′端侧翼DNA序列。用这个引物对扩增该片段，在该片段5′端引入了SalI位点并在该片段3′端引入了BglI位点。用引物对AVG90/AVG91从质粒pCR-Blunt II-hph-loxP#4(图1)扩增侧翼带有平行loxP位点的潮霉素B抗性盒，在该片段5′端引入了BglII位点并在该片段3′端引入了NotI位点。用引物对AVG92/AVG93扩增sfb33′端侧翼DNA序列，在该片段5′端引入了NotI位点并在该片段3′端引入了XbaI位点。

将上述三个片段相继连接到载体

(美国加州卡尔斯巴德英杰公司(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA，USA))中，得到的质粒命名为pCR-Blunt II-TOPO889092(图2)。用Morph TrglaA(29-9)基因组DNA作为模板扩增sfb3基因5′及3′侧翼DNA序列。用引物对AVG104/AVG105从质粒pCRBluntII-TOPO889092扩增Δsfb3缺失盒，其含有sfb35′侧翼序列、两端被loxP位点围绕的潮霉素B抗性盒及sfb33′侧翼序列。将多个PCR反应液合并，使用PCR纯化试剂盒纯化，并用乙醇沉淀以浓缩扩增的DNA片段。在后续步骤中使用这样制备的DNA。

4.2sfb3基因缺失的H3AΔsfb3#1009菌株

的产生根据公布为WO/201I/038019的PCT/US2010/049849的描述来制备H3A整合型里氏木霉表达菌株。通过PEG(聚乙二醇)介导的转化，用Δsfb3缺失盒转化H3A菌株，并接种在含有潮霉素B和山梨醇的Vogel基本培养基上。PEG介导的木霉属转化在之前有描述，如美国专利第5，246,853号。

将1020个候选株转移到含有潮霉素B的Vogel基本培养基平板以选择潮霉素B抗性菌株。然后将潮霉素B抗性候选株转移到含有刚果红的Vogel基本培养基或PDA培养基，以评估刚果红敏感性。

对43个表现出对刚果红轻微敏感的稳定候选株进行PCR分析，一个候选株#1009显示的特征符合以下情形：H3A基因组中同源整合了sfb3缺失盒同时去除了天然sfb3基因。通过采用引物对AVG108/AVG109、AVG110/AVG111、和AVG108/AVG111扩增出预期大小的DNA片段，验证了H3AΔsfb3#1009的sfb3基因座同源整合了Δsfb3缺失盒。具体地讲，引物对AVG108/AVG109扩增了一段起始于AVG88/AVG89缺失盒区域5′端外部并结束于潮霉素B抗性盒内部的DNA片段。引物对AVG110/AVG111扩增了一段起始于潮霉素B抗性盒内部并结束于AVG92/AVG93缺失盒区域3′端外部的DNA片段。引物对AVG108/AVG111扩增了整合在sfb3基因座的整个缺失盒。当使用设计用来扩增内部sfb3片段的引物对AVG160/AVG161时未得到PCR产物，这证实了不存在sfb3基因。

相比于H3A宿主菌株，H3AΔsfb3#1009菌株在含有刚果红的培养基上的菌落形态更为局限，生长率更低，在PDA上分生孢子形成下降，且能够在含有潮霉素B的培养基上生长(图11)。也对H3A和H3AΔsfb3#1009菌株的液体培养物进行了比较。这两种菌株的摇瓶培养物在50mL的YEG或甘氨酸基本培养基中，在28℃和220rpm下分别生长1天或6天。在YEG和甘氨酸基本培养基中，H3AΔsfb3#1009菌株通常具有长度更短的菌丝(图12)，这表明粘度性质改进了。

4.3H3AΔsfb3#1009中全纤维素酶组合物的高效生产

并行进行两个发酵运行，一个使用H3A，另一个使用H3AΔsfb3#1009，在例如PCT/US2010/049849中所述的标准发酵条件下进行。在每个发酵罐中都采用500rpm的搅拌速率。在生长期结束时使用汉密尔顿光学氧传感器(美国内华达州雷诺汉密尔顿公司(Hamilton Company，USA，Reno NV))测量溶氧量。下表5中显示DO水平的比较：

表5.生长期后的DO水平

使用例如在PCT/US2010/049849中所述的HPLC方法对每个发酵运行得到的全纤维素酶组合物进行表征。其中含有的主要纤维素酶/半纤维素酶的量在下表6中进行了并列比较：

表6.全纤维素酶组合物中存在的纤维素酶/半纤维素酶的比较

纤维素酶/半纤维素酶

H3AΔsfb3

H3A

Fv3A	7％	7％
			FV43D/Fv51A	12％	14％
Xyn3	14％	12％
			Bgl1	10％	7％
CBH1	33％	40％
			EGLs	12％	8％
CBH2	7％	9％

两种全纤维素酶组合物中每种主要成分的含量都实质上相同，这表明H3AΔsfb3#1009中的蛋白质表达与H3A相似。

尽管出于清晰理解的目的已通过举例说明和实施例的方式对上述组合物和方法进行了相当详细的描述，但是对于本领域的技术人员显而易见的是，可以进行某些更改和修改。因此，本说明书不应理解为对本发明的范围进行限制，本发明的范围仅通过所附权利要求书进行界定。

本文引用的全部出版物、专利以及专利申请都以引用方式全文并入本文以用于所有目的，犹如每个单独的专利公开、专利或专利申请被特别和单独地指出以引用方式如此并入。

Claims

1.一种衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，所述变异菌株包含能使所述变异菌株的细胞与所述亲本菌株的细胞相比产生改变量的功能性Sfb3蛋白的遗传变更，其中所述变异菌株的细胞在深层培养有氧发酵过程产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

2.根据权利要求1所述的变异菌株，其中功能性Sfb3蛋白的所述改变量为减少量，并且所述变异菌株在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

3.根据权利要求1或2所述的变异菌株，其中所述遗传变更包括破坏所述亲本菌株中存在的所述sfb3基因。

4.根据权利要求3所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是缺失所述sfb3基因的全部或部分所致。

5.根据权利要求3所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是缺失包含所述sfb3基因的基因组DNA的一部分所致。

6.根据任何权利要求3所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是诱变所述sfb3基因所致。

7.根据权利要求3至6中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是使用位点特异性重组来进行。

8.根据权利要求3至7中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。

9.根据权利要求3至8中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是赋予所述变异菌株粘度降低表型的主要遗传决定因子。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株不产生功能性Sfb3蛋白。

11.根据权利要求1至9中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株不产生Sfb3蛋白。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株还包含编码目的蛋白的基因。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的变异菌株，其中所述变异菌株每单位量生物质产生的蛋白质数量与所述亲本菌株实质上相同。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的变异菌株，其中所述Sfb3蛋白包含氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO：9，其中X为任何氨基酸残基)。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌是盘菌亚门的种。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的变异菌株，其中所述丝状真菌是里氏木霉。

17.一种产生丝状真菌细胞变异菌株的方法，包括：将遗传变更引入到丝状真菌细胞亲本菌株中，其中与所述亲本菌株的细胞相比，所述遗传变更会改变功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述遗传变更会减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述遗传变更包括使用遗传操作在亲本丝状真菌细胞中破坏所述sfb3基因。

20.根据权利要求17或19所述的方法，其中所述遗传变更包括使用遗传操作在亲本丝状真菌细胞中缺失所述sfb3基因。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法，其中所述遗传变更是使用位点特异性基因重组来进行。

22.根据权利要求17至21中任一项所述的方法，其中破坏所述。sfb3基因是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。

23.根据权利要求17至22中任一项所述的方法，其中所述变异菌株每单位量生物质产生的蛋白质数量与所述亲本菌株实质上相同。

24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述Sfb3蛋白包含氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ ID NO：9，其中X为任何氨基酸残基)。

25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是盘菌亚门的种。

26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌是里氏木霉。

27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中所述亲本菌株还包含编码目的蛋白的基因。

28.根据权利要求27所述的方法，其中在引入所述会减少或防止功能性Sfb3蛋白的产生的遗传变更之前，编码所述目的蛋白的所述基因存在于所述亲本菌株中。

29.一种目的蛋白，所述目的蛋白由根据权利要求12或13所述的变异菌株产生。

30.一种丝状真菌变异菌株，所述丝状真菌变异菌株通过根据权利要求17至28中任一项所述的方法产生。

31.一种衍自亲本菌株的丝状真菌变异菌株，所述变异菌株包含：

(a)遗传变更，所述遗传变更使得(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持深层培养物中增加的溶氧量，和

(b)编码目的蛋白的基因，

其中编码所述目的蛋白的所述基因在(a)中所述遗传变更之前存在于所述变异菌株中。

32.根据权利要求31所述的变异菌株，其中所述遗传变更包括破坏所述亲本菌株中存在的所述sfb3基因。

33.根据权利要求31中任一项所述的变异菌株，其中破坏所述sfb3基因是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。

34.一种针对粘度改变表型筛选变异丝状真菌细胞的方法，包括：

(a)诱变所述丝状真菌亲本菌株的细胞以产生变异细胞；

(b)针对改变的荧光染色剂敏感性筛选所述变异细胞；以及

(c)选择对所述荧光染色剂敏感性改变的所述变异细胞；

其中，对所述荧光染色剂的敏感性改变与所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液的能力有关，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述敏感性改变是指敏感性增加，并且所述变异丝状真菌细胞在深层培养有氧发酵过程中产生这样的细胞培养液，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要减少的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持增加的溶氧量。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述荧光染色剂是卡尔科弗卢尔荧光增白剂。

37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中诱变所述细胞通过基因重组来进行。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中诱变所述细胞是与在所述sfb3基因的遗传基因座引入选择性标记相结合来进行。

39.一种鉴定盘菌亚门丝状真菌的种中的sfb3多肽的方法，包括：

(a)从盘菌亚门丝状真菌的种获得氨基酸序列；以及

(b)针对连续氨基酸序列IQLARQGXDGXEXXXARXLXEDRNXEAXSXVDWL(SEQ IDNO：9，其中X为任何氨基酸残基)的存在筛选所述氨基酸序列；

(c)其中SEQ ID NO：9在来自所述盘菌亚门丝状真菌的种的所述氨基酸序列中的存在表明来自所述盘菌亚门丝状真菌的种的所述氨基酸序列是sfb3多肽。

40.一种通过根据权利要求39所述的方法鉴定的分离sfb3多肽。

41.一种在丝状真菌细胞中产生目的蛋白的方法，包括：将编码所述目的蛋白的基因以及可减少所述细胞中Sfb3蛋白的量或活性的遗传变更引入到亲本丝状真菌细胞中，从而产生出可在深层培养有氧发酵过程中产生包含所述目的蛋白的细胞培养液的变异丝状真菌细胞，所述细胞培养液(i)与所述亲本菌株的细胞相比，需要改变的搅拌量来保持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本菌株的细胞相比，在预选的搅拌量下保持改变的溶氧量，并且其中所述目的蛋白在所述变异细胞中与所述亲本细胞相比，以实质上相同的水平产生。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述目的蛋白为超过一种目的蛋白，并且所述超过一种目的蛋白中的每种在所述变异细胞中与所述亲本细胞相比，以实质上相同的相对水平产生。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述超过一种目的蛋白选自纤维素酶和半纤维素酶。

44.一种通过根据权利要求41至43中任一项所述的方法生产的目的蛋白。

45.一种组合物，其包含通过根据权利要求42至43中任一项所述的方法生产的超过一种目的蛋白。

46.根据权利要求45中所述的组合物，其中所述组合物为全纤维素酶组合物。