CN107109424A

CN107109424A - 真菌宿主菌株、dna构建体及使用方法

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Publication number: CN107109424A
Application number: CN201580065097.7A
Authority: CN
Inventors: M·阿伦特肖斯特; S·巴伦兹; P·克勒伊托夫; I·尼古拉耶夫; J·P·韦德拉奥果; A·F·J·拉姆
Original assignee: Danisco USA Inc
Current assignee: Danisco USA Inc; Danisco US Inc
Priority date: 2014-12-01
Filing date: 2015-12-01
Publication date: 2017-08-29
Also published as: DK3227430T3; WO2016089815A1; JP6830891B2; KR20170088964A; EP3227430A1; KR102489871B1; EP3227430B1; JP2018500893A; US20170260559A1

Abstract

提供了真菌宿主菌株和用于其创建和使用的重组DNA构建体，其中该真菌宿主菌株特别稳定并且可用于可靠或变异较小表达感兴趣的蛋白质、酶、变体和其他物质。

Description

真菌宿主菌株、DNA构建体及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年12月1日提交的美国临时专利申请序列号62/085,834的优先权，将其以全文通过引用特此结合。

序列表

将按照37C.F.R.§1.52(e)、经由EFS提交的序列表通过引用结合在此。经由EFS提交的序列表文本文件包含于2015年10月11日创建的文件“2015-580_40676-WO-PCT_ST25.txt”，其大小为13.4千字节。

发明领域

本披露涉及真菌宿主菌株和用于其创建和使用的重组DNA构建体。该真菌宿主菌株特别稳定，并且可用于可靠或变异较小表达感兴趣的蛋白质。本披露进一步涉及如此构建的真菌宿主菌株、感兴趣的蛋白质和组合物的使用，该组合物包含通过使此类改良的真菌宿主菌株发酵制备的此类感兴趣的蛋白质。

背景技术

使用真菌菌株作为感兴趣的蛋白质的生产宿主长期以来一直被认为是经济上可行的并且在一段时间广泛用于商业环境中。然后，这些蛋白质，任选地被纯化后，可以用于各种工业、学术或其他应用中。然而，常见的是实际上仅有非常少量的(如果有的话)使用分子技术构建的转化体产生感兴趣的酶。如此少量的成功转化体的一个原因可能只是转化效率低，导致整体转化体很少。另一个原因可能是低百分比的转化体足够稳定以允许产生表达产物，该产物可以是蛋白质、酶或其他分子。

作为与基因的核酸和/或氨基酸序列无关的因子的结果，可以发生异源基因(例如非天然基因或以与天然形式不同的形式存在的天然基因)的表达变异性。例如，非同源末端连接(NHEJ)机制在多细胞真核生物(包括大多数真菌)中占主导地位。因此，在随机位置将表达载体整合到基因组中，可能导致各种转化体之间的表达水平的位置效应。此外，即使在已经证实感兴趣的基因的表达之后也可能产生不稳定转化体，需要进一步筛选转化体以获得稳定转化体。作为多核原生质体转化的结果，变异性也可能通过异核体的产生而发生，因为丝状真菌的多核性质阻碍了这些生物体中的靶向基因整合。因此，生产遗传稳定的、转化的真菌菌株以按降低的变异性表达感兴趣的蛋白质的可靠手段提供了明显的优点。

这样的明显优点的非限制性实例在于由真菌表达的DNA文库中的感兴趣的基因或变体的功能筛选。表达功效和/或水平的变异性使得难以将给定变体的特征与另一种变体的特征进行比较。因此，如果感兴趣的基因或变体可以被特定的宿主细胞可靠地表达，并且如果以变化性小的水平使得它们的特征可以更容易地被评估和比较，则明显存在特别的优点。

发明概述

本披露涉及真菌宿主菌株和用于其创建和使用的重组DNA构建体。与本领域已知的其他表达方法相比，真菌宿主菌株可以用于提供感兴趣的基因或变体在这些宿主中以更高可靠性和/或更低变异性的表达水平表达。在具体实施例中，真菌宿主菌株可用于有效地靶向基因整合以便可靠或变异较小表达感兴趣的基因。

在第一方面，本披露提供构建遗传稳定的、转化的真菌菌株的方法，该方法包括：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在某些实施例中，限制酶能够使转化的染色体DNA线性化和/或在染色体DNA中产生相容的粘性末端。

在一些实施例中，线性化DNA包含一个或多个感兴趣的基因。合适地，感兴趣的基因编码以下各项之一：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶或某些其他有用的酶。在一些情况下，线性化DNA可以包含多于一个感兴趣的基因，因此转化的真菌菌株表达编码多于一种感兴趣的酶或蛋白质的基因产物的混合物。在某些具体实施例中，转化的真菌菌株合适地表达蛋白质混合物。在一些实施例中，感兴趣的基因能够编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原或任何的这样的基因产物的片段。

在一些实施例中，线性化DNA进一步包含至少一种选择标记。选择标记合适地是als1、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟菌素抗性标记、吡啶硫胺抗性标记、氯嘧磺隆乙酯抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因、胸苷激酶标记或本领域技术人员已知的或将变成本领域技术人员已知的能够用于制作本发明的转化的真菌菌株的任何其他标记。

在一些实施例中，真菌菌株可以是子囊菌真菌菌株。

在一些实施例中，子囊菌真菌菌株可以合适地是丝状真菌菌株。例如，丝状真菌菌株是木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、脉孢菌属(Neurospora)或翘孢霉属(Emericella)。在某些实施例中，丝状真菌菌株合适地是里氏木霉(Trichoderma reesei或T.reesei)。在替代性实施例中，丝状真菌菌株合适地是黑曲霉。

在第二方面，本披露提供使用包括以下步骤的方法获得的遗传稳定的、转化的真菌菌株：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在一些实施例中，该方面的遗传稳定的、转化的真菌菌株包含一种或多种感兴趣的基因。例如，感兴趣的基因可以是编码以下各项的基因：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶或其他有用的酶。在一些情况下，该方面的转化的真菌菌株包含多于一个感兴趣的基因，因此，转化的真菌菌株可以产生作为感兴趣基因的产物的物质混合物。在此意义上，该方面的转化的真菌菌株可以用于生产包含感兴趣基因的产物的混合物或组合物。在某些实施例中，感兴趣的基因可以是编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原或此类物质中任何一种的片段的基因。

在一些实施例中，该方面的转化的真菌菌株是子囊菌真菌菌株。在某些具体实施例中，子囊菌真菌菌株可以合适地是丝状真菌菌株。例如，丝状真菌菌株可以是来自木霉属、青霉属、曲霉属、腐质霉属、金孢子菌属、镰刀菌属、脉孢菌属或翘孢霉属的菌株。在某些具体实施例中，转化的丝状真菌菌株可以是里氏木霉。在另一个具体实施例中，转化的丝状真菌菌株可以合适地是黑曲霉。

在第三方面，本披露提供了一种改善真菌转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌菌株的细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂。

在一些实施例中，改善真菌转化体的稳定性的方法的限制酶能够使转化的染色体DNA线性化和/或在染色体DNA中产生相容的粘性末端。

在一些实施例中，在改善真菌转化体的稳定性的方法中使用的线性化DNA包含一种或多种感兴趣的基因。感兴趣的基因合适地是编码以下各项的基因：半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶等。在某些实施例中，在该方法中使用的线性化DNA包含多于一个感兴趣的基因，因此该方法可以用于生产此类酶的混合物，这些酶是由多于一个感兴趣的基因编码的产物。在此意义上，该方法可以用于生产组合物，该组合物包含由具有改善的稳定性的真菌转化体产生的酶或由这样的真菌转化体产生的酶或蛋白质混合物。在一些另外的实施例中，感兴趣的基因可以是编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原或这样的物质的片段的基因。

在一些实施例中，该方面的方法的线性化DNA进一步包含至少一种选择标记。例如，选择标记合适地可以是als1、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟菌素抗性标记、吡啶硫胺抗性标记、氯嘧磺隆乙酯抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因、和胸苷激酶标记。

在一些实施例中，该方面的真菌菌株是子囊菌真菌菌株。例如，合适的子囊菌真菌菌株可以是丝状真菌菌株。丝状真菌菌株可以是木霉属、青霉属、曲霉属、腐质霉属、金孢子菌属、镰刀菌属、脉孢菌属或翘孢霉属菌株中的一种。在一些具体实施例中，丝状真菌菌株是里氏木霉菌株。在某些其他实施例中，丝状菌株是黑曲霉菌株。

在另一个方面，本披露提供了在合适的培养基中使转化的真菌菌株发酵的方法，该菌株通过以下步骤获得：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。在某些实施例中，在允许感兴趣的基因表达的条件下使真菌菌株发酵。

在一些实施例中，通过使用该方面的方法发酵的真菌菌株表达的感兴趣的基因编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶或一种或多种本文列出的酶的混合物。在一些其他实施例中，由真菌菌株表达的感兴趣的基因也可以是编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原和一种或多种片段、或此类分子的混合物的基因。

在某些相关方面，本发明还涉及一种组合物，该组合物是该方面的最终发酵液，该最终发酵液包含由转化的真菌菌株表达的感兴趣的基因的产物。

在又另一个方面，本披露提供了表达感兴趣的基因的方法，该方法包括在允许所述感兴趣的基因表达的条件下在合适的培养基中使转化的真菌菌株生长和发酵，由此通过以下步骤获得转化的真菌菌株：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在一些实施例中，该方面的方法进一步包括测定所述感兴趣的基因的表达水平。感兴趣的基因可以合适地编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、以及这些酶中的一种或多种的混合物。可替代地，感兴趣的基因合适地可以编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、以及这些物质的片段或这些物质中的两种或更多种的混合物。

在另一个方面，本披露提供了由感兴趣的基因编码的感兴趣的蛋白质，该蛋白质通过在转化的真菌细胞中表达感兴趣的基因的方法生产，其中该真菌细胞通过以下步骤获得：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在另一个方面，本披露提供了一种蛋白质性组合物，该组合物包含由感兴趣的基因编码的感兴趣的蛋白质，由此该感兴趣的基因通过转化的真菌细胞表达，该真菌细胞通过以下步骤获得：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在又另外的方面，本披露提供了在生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物、纺织品处理等中使用如通过使用本文的各种方面的方法中的任一种和/或本披露的转化的真菌菌株生产的蛋白质性组合物的方法。

在又另一个方面，本披露提供了真菌表达系统，该系统包括：a)在染色体DNA中含有至少一个限制酶位点的真菌宿主细胞；以及b)核酸分子，该核酸分子含有可操作以表达感兴趣的基因的序列、选择标记和与所述染色体限制酶位点侧翼的序列具有实质同源性的序列；其中具有实质同源性的所述序列引起导致感兴趣的基因表达的同源重组事件。

在某些实施例中，真菌表达系统进一步包含表达盒，该表达盒表达能够在真菌宿主细胞的染色体DNA中产生合适的限制酶位点的限制酶。

感兴趣的基因可以是编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、以及这些酶中的两种或更多种的混合物的基因。可替代地，感兴趣的基因可以编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、这些分子的片段或这些分子中的两种或更多种的混合物。

在一些实施例中，选择标记合适地可以是als1、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟菌素抗性标记、吡啶硫胺抗性标记、氯嘧磺隆乙酯抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因、或胸苷激酶标记。

在一些实施例中，真菌宿主菌株是子囊菌真菌宿主菌株。例如，子囊菌真菌菌株合适地是丝状真菌菌株。在一些实施例中，真菌宿主菌株是木霉属、青霉属、曲霉属、腐质霉属、金孢子菌属、镰刀菌属、脉孢菌属或翘孢霉属宿主菌株。在一个具体实例中，丝状真菌宿主菌株是里氏木霉宿主菌株。在另一个具体实例中，丝状宿主菌株是黑曲霉宿主菌株。

在相关方面，本披露提供了使用如本文所述的真菌表达系统的方法，该真菌表达系统包含a)在染色体DNA中含有至少一个限制酶位点的真菌宿主细胞；以及b)核酸分子，该核酸分子含有可操作以表达感兴趣的基因的序列、选择标记和与所述染色体限制酶位点侧翼的序列具有实质同源性的序列。具有实质同源性的序列引起导致感兴趣的基因表达的同源重组事件。在能够产生染色体限制酶位点的限制酶的存在下，将b)的核酸分子转化到真菌宿主细胞中。

在一些实施例中，限制酶由也位于真菌宿主细胞中的表达盒产生。

在进一步的相关方面，本披露提供了通过使用如本文所述的真菌表达系统的方法获得的转化的或衍生的真菌菌株。此外，本披露还提供了使通过以下步骤获得的转化的或衍生的真菌菌株发酵的方法：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在又另外的方面，本披露提供了表达感兴趣的基因的方法，该方法包括在允许所述感兴趣的基因表达的条件下，在合适的培养基中使转化的或衍生的真菌菌株生长和发酵。相关地，本披露还提供了由感兴趣的基因编码的感兴趣的蛋白质。此外，本披露提供了一种蛋白质性组合物，该组合物包含感兴趣的蛋白质。本披露还提供了在生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物、纺织品处理等中使用此类蛋白质性组合物的方法。

在另一个方面，本披露提供了靶向基因整合的方法，该方法包括：

a)获得在染色体DNA中含有至少一个限制酶位点的真菌宿主细胞；以及

b)获得一种核酸分子，该核酸分子含有可操作以表达一个或多个感兴趣的基因的序列、至少一种选择标记和与所述染色体限制酶位点侧翼的序列具有实质同源性的序列，其中所述同源序列引起导致所述感兴趣的基因的表达的同源重组事件；

并且在能够产生限制酶位点的限制酶的存在下将b)的核酸分子转化到a)的真菌宿主细胞中。

在一些实施例中，真菌宿主细胞进一步包含表达盒，该表达盒用于在真菌宿主细胞中生产限制酶。

感兴趣的基因合适地编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、或这些酶中的两种或更多种的混合物。可替代地，感兴趣的基因编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、这些分子的片段或这些分子中的一种或多种的混合物。

选择标记合适地可以是als1、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟菌素抗性标记、吡啶硫胺抗性标记、氯嘧磺隆乙酯抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因、或胸苷激酶标记。

在一些实施例中，真菌宿主菌株合适地是子囊菌真菌菌株。例如，子囊菌真菌菌株可以是丝状真菌菌株。在一些实施例中，丝状真菌菌株是木霉属、青霉属、曲霉属、腐质霉属、金孢子菌属、镰刀菌属、脉孢菌属或翘孢霉属真菌菌株。在某些具体实施例中，丝状真菌菌株合适地是里氏木霉菌株。在某些其他具体实施例中，丝状真菌菌株是黑曲霉菌株。

在一个方面，本披露提供了构建遗传稳定的、转化的木霉属菌株的方法，所述方法包括：a)使用线性化(也称为“线性”)或环状DNA和限制酶(也称为用限制酶“处理”)的混合物转化木霉属细胞，其中该限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶处理的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

在另一个方面，本披露提供了构建遗传稳定的、转化的木霉属菌株的方法，所述方法包括：a)用线性化或环状DNA转化木霉属细胞，其中诱导木霉属细胞生产限制酶，其中该限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶诱导的稳定转化体的百分比高于不用限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

在另一个方面，本披露提供了改善木霉属转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化或环状DNA和限制酶的混合物转化木霉属细胞，其中所述限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)，并且其中用限制酶处理所得到的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

在又另一个方面，本披露提供了改善木霉属转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化或环状DNA转化木霉属细胞，其中木霉属细胞被诱导以生产能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)的限制酶，并且其中用限制酶诱导所得到的稳定转化体的百分比高于不用限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

在段落[0047]中描述的方法的一些实施例中，该方法进一步包括将构建体导入木霉属细胞中，该构建体在转化步骤之前或期间一经诱导即能生产限制酶。

在段落[0046]-[0048]中任一段描述的方法的一些实施例中，该方法进一步包括选择遗传稳定的木霉属转化体。

在段落[0044]-[0049]中任一段描述的方法的一些实施例中，该方法进一步包括使用相同的线性化或环状DNA但不用限制酶处理或限制酶诱导来转化相同的木霉属细胞转化前菌株。

在段落[0044]-[0050]中任一段描述的方法的某些实施例中，在相同条件下使用相同的转化方法，并且在某些实施例中使用约相同数目的细胞和相同量的线性化或环状DNA，获得用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比和不用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比。

在段落[0044]-[0051]中任一段描述的方法的某些实施例中，用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在具体实施例中，用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。

在段落[0044]-[0052]中任一段描述的方法的具体实施例中，用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比为至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在具体实施例中，在所有测试的转化体中，用限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比为至少50％、60％、70％、80％或90％。

在段落[0044]-[0053]中任一段描述的方法的一些实施例中，用限制酶处理或诱导的转化效率比不用限制酶处理或诱导的转化效率高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在具体实施例中，用限制酶处理或诱导的转化效率比不用限制酶处理或诱导的转化效率高至少1倍、2倍、3倍或4倍。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0054]中任一段描述的方法的一些实施例中，限制酶识别至少6个碱基对的限制位点。在一些实施例中，限制酶识别至少8个碱基对的限制位点。在具体实施例中，限制酶识别至少10个碱基对的限制位点。在具体实施例中，限制酶识别至少12个碱基对的限制位点。在具体实施例中，在该方法中使用至少两种不同的限制酶。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0055]中任一段描述的方法的某些实施例中，限制酶是大范围核酸酶。在某些实施例中，限制酶是LAGLIDADG归巢大范围核酸酶。在具体实施例中，限制酶选自下组，该组由以下各项组成：I-SceI、I-CreI、I-MsoI、I-AniI、I-DmiI、和PI-PfuI。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0055]中任一段描述的方法的一些其他实施例中，限制酶是锌指核酸酶(ZFN)，转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或RNA引导的内切核酸酶。

在段落[008]-[0013]、[0022]、[0023]、[0025]、[0026]、[0035]、[0036]、[0038]-[0040]、和[0044]-[0057]中任一段描述的方法的某些实施例中，限制酶能够在转化的木霉属细胞的染色体DNA中产生相容的粘性末端。

在段落[0044]-[0058]中任一段所述的方法的一些实施例中，用线性化DNA转化木霉属细胞。在一些其他实施例中，用环状DNA转化木霉属细胞。

在段落[0044]-[0059]中任一段所述的方法的一些实施例中，线性化或环状DNA包含一个或多个感兴趣的基因。在某些实施例中，感兴趣的基因编码酶。在具体实施例中，感兴趣的基因编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其变体、其功能片段或其两种或更多种的混合物。在又其他具体实施例中，感兴趣的基因编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的混合物。

在段落[0044]-[0060]中任一段描述的方法的某些实施例中，线性化或环状DNA包含选择标记。在具体实施例中，选择标记是als1、amdS、hygR、pyr2、pyr4、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟菌素抗性标记、吡啶硫胺抗性标记、氯嘧磺隆乙酯抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因、或胸苷激酶标记。

在段落[0044]-[0061]中任一段描述的方法的一些实施例中，该方法不包括使用与木霉属基因组序列同源的DNA或RNA序列。在一些实施例中，该方法不包括使用与至少20个、30个、40个、50个、100个、150个或200个核苷酸长的木霉属基因组序列同源的DNA或RNA序列。在某些实施例中，该方法不包括使用与至少150个或200个核苷酸长的木霉属基因组序列同源的DNA序列。在某些实施例中，该方法不包括使用与至少20个、30个、40个或50个核苷酸长的木霉属基因组序列同源的RNA序列。

在段落[0044]-[0061]中任一段描述的方法的一些实施例中，该方法包括使用与木霉属基因组序列同源的DNA或RNA序列。在一些实施例中，该方法包括使用与至少150个、200个、300个或400个核苷酸长的木霉属基因组序列同源的DNA序列。在具体实施例中，该方法包括使用与至少500个、600个、700个、800个、900个或1000个核苷酸长的木霉属基因组序列同源的DNA序列。在具体实施例中，该方法包括使用与至少20个、30个、40个或50个核苷酸长的木霉属基因组序列同源的RNA序列。在某些实施例中，与木霉属基因组序列同源的DNA或RNA序列与同源区域的至少20个、30个、40个、50个、150个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个核苷酸的整个长度具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性(或在RNA的情况下，等同性)。

在段落[0044]-[0061]和[0063]中任一段描述的方法的一些实施例中，该方法包括使用与木霉属基因组序列同源的DNA序列，并且与木霉属基因组序列同源的DNA序列通过在被限制酶切割的位点处的同源重组来与木霉属染色体DNA重组。

在段落[0044]-[0064]中任一段所述的方法的某些实施例中，木霉属菌株是里氏木霉、绿木霉、棘孢木霉、哈茨木霉、康氏木霉、长柄木霉、绿色木霉、或深绿木霉菌株。在具体实施例中，木霉属菌株是里氏木霉菌株。

在另一个方面，本披露提供使用段落[0044]-[0065]中任一段的方法获得的遗传稳定的、转化的木霉属菌株。

在段落[0066]中描述的木霉属菌株的一些实施例中，木霉属菌株包含一种或多种感兴趣的基因。在某些实施例中，感兴趣的基因编码酶。在具体实施例中，感兴趣的基因编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其变体、其功能片段或其两种或更多种的混合物。在又其他具体实施例中，感兴趣的基因编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的混合物。

在段落[0066]-[0067]中任一段所述的木霉属菌株的某些实施例中，木霉属菌株是里氏木霉、绿木霉、棘孢木霉、哈茨木霉、康氏木霉、长柄木霉、绿色木霉、或深绿木霉菌株。在具体实施例中，木霉属菌株是里氏木霉菌株。

在又另一个方面，本披露提供了表达感兴趣的蛋白质的方法，该方法包括：a)使用段落[0067]-[0068]中任一段所述的木霉属菌株，其中该感兴趣的基因编码感兴趣的蛋白质；并且b)从木霉属菌株生产感兴趣的蛋白质。在某些实施例中，感兴趣的蛋白质是分泌性蛋白。

在另一个方面，本披露提供通过应用段落[0044]-[0065]和[0069]中任一段所述的方法生产的感兴趣的蛋白质。

在又另一个方面，本披露提供了含有段落[0070]中描述的感兴趣的蛋白质的组合物。

在另一个方面，本披露提供了段落[0071]中所描述的组合物在木质纤维素生物质底物的水解、清洁应用、谷物和淀粉加工、动物营养、食品组合物或纺织品处理中的用途。

附图简述

图1.AclAmy1表达质粒pTrex3gM-AclAmy1的载体NTI图谱。如在实例1中所述，该载体支持由里氏木霉纤维二糖水解酶1(cbh1)启动子和转录终止子驱动的来自基因组AclAmy1基因的AclAmy1表达。该载体携带amdS可选择标记，该选择标记允许转化体在乙酰胺作为唯一的氮源下生长。

图2.pENTRY-AclAmy1的载体NTI图谱。载体已经如在实例1中所述进行设计。该载体充当用于LR反应的‘供体’质粒。

图3.用于AclAmy1表达的AclAmy1表达质粒pTrex8gM-AclAmy1的载体NTI图谱。该载体支持由里氏木霉纤维二糖水解酶1(cbh1)启动子和转录终止子驱动的来自基因组AclAmy1基因的AclAmy1表达。该载体携带pyr2可选择标记，该可选择标记允许转化体在没有补充尿苷的情况下生长。

图4A-4E.使用pTrex8gMAclAmy1对木霉属的转化(图4A)，在PacI存在下使用pTrex8gM-AclAmy1对木霉属的转化(图4B)，与图4B相同但是在柱纯化除去PacI后(图4C)，使用pTrex8gM-AclAmy1作为模板经PCR扩增的表达构建体(图4D)，或与图4D相同的、添加PacI的表达构建体(图4E)。

图5.稳定的木霉属转化体的α-淀粉酶活性

图6.用I-SceI限制位点构建pBJP6。将约1.5kb 5'UTR cbh2、PcbhI和Tcbh2分别进行PCR扩增，通过融合PCR融合在一起，并且克隆到pBluescript SK(+)的XbaI和KpnI位点以产生7.3kb pBJP4质粒。将截短的GFP重复序列的合成序列插入pBJP4的单个NdeI限制位点，并且选择具有正确方向的GFP重复序列的质粒并将其命名为pBJP5(8.6Kb)。通过将由两个I-SceI限制位点包围的PCR扩增的构巢曲霉pyrG标记克隆到pBJP5的单个PmeI位点来获得具有I-SceI限制位点的最终10kb pBJP6质粒。

图7.建立的体内I-SceI活性测定法的基本原理。星号(*)表示截短的GFP序列，并且用更加密集的阴影线盒显示重复的GFP序列。

图8.在里氏木霉P37ΔcbhIpyrG-26的基因组中引入I-SceI限制位点。(A)在里氏木霉基因组中的I-SceI限制位点盒的图。用垂直箭头指出了用于进行下面(B)-(D)的DNA印迹的限制酶。将通过小图A底部的条表示的三种不同的探针(P1、P2、P3)用于确认完整构建体的存在和拷贝数。图中指出了预期的限制性消化片段/DNA印迹条带的大小。(B)-(D)9个转化体(泳道1至9)和亲本菌株(泳道10)的DNA印迹分析。在小图D的右侧指出了泳道1-10中样品的菌株名称。(B)将菌株的基因组DNA用XbaI消化，然后与探针1杂交。当存在于基因组中时，5.4Kb条带表示I-SceI限制性盒。在左侧的数字指出了正确条带的大小。(C)将基因组DNA用PstI消化并与探针2杂交。6.3Kb是整合的I-SceI限制位点盒的预期条带大小。(D)将基因组DNA用XhoI消化并与探针3杂交。与探针3杂交的期望条带大小为2.3Kb。

图9.体内I-SceI活性测试。预测I-SceI的诱导将产生DSB，该DSB将导致尿苷营养缺陷型表型。在30℃下，将菌株点接种到用葡萄糖或乳糖作为碳源的基本培养基+/-尿苷上持续4天。在基于乳糖的培养基上，I-SceI的表达诱导DSB，该DSB导致pyrG标记环出并且该菌株随后不能在不含尿苷的培养基上生长。箭头指出了没有生长的区域。

图10.使用GFP的体内I-SceI活性测试。诱导I-SceI表达导致pyrG标记的切除和GFP的恢复，由绿色荧光菌丝指示。菌株在含有乳糖和尿苷的trMM上生长以分别诱导和允许pyrG标记的丢失。通过微分干涉差显微镜(DIC)观察木霉属细胞的细胞外观或通过荧光显微镜观察木霉属细胞的绿色荧光蛋白表达(GFP)。

图11.由I-SceI介导的葡糖淀粉酶表达盒的靶向整合方法的基本原理。预期葡糖淀粉酶盒在I-SceI着陆位点的靶向整合将导致alS抗性、尿苷营养缺陷型和葡糖淀粉酶生产。

图12.通过在里氏木霉中表达I-SceI来增加转化频率。在乳糖/葡萄糖或葡萄糖板上的对照菌株(JP7.7)和表达I-SceI的菌株JP7.7.12(JP7.7+pTTT-I-SceI)。经由乳糖诱导I-SceI增加转化频率。

图13.在I-SceI着陆位点用于靶向整合葡糖淀粉酶盒的所选转化体进行的DNA印迹分析。(I)当pJP8在I-SceI着陆位点(在cbh2基因座处)整合或不整合(pBJP6仍然存在于cbh2基因座处)时，DNA印迹的图显示预期的印迹大小。用条指出了用于进行DNA印迹的限制酶。使用两(2)种不同的探针(PcbhI和Tcbh2)来分别确认5'侧翼和3'侧翼的整合。图中指出了预期的条带的大小。(II)12个转化体的DNA印迹分析(泳道1至12)。(II-A)转化体的基因组DNA用SpeI消化，然后与探针PcbhI杂交。5.5Kb条带表示pJP8盒在5’侧翼处的同源整合，并且3.6Kb是当I-SceI限制位点盒(pBJP6)仍然存在于cbh2基因座处时预期的大小。在左侧的数字指出了条带的大小。(II-B)将基因组DNA用BamHI消化并与探针Tcbh2杂交。6.8Kb是在3’侧翼处的整合的pJP8的预期条带大小并且3Kb是当未整合时的预期条带大小。所选转化体的pyrG表型和相对葡糖淀粉酶活性提供在紧挨印迹图的表中。

图14.在靶向(pyrG减)与非靶向转化体之间的葡糖淀粉酶活性的比较。对于每个转化体显示了pyrG表型(“pyrG-”指示靶向整合并且“pyrG+”指示非靶向整合)。亲本菌株的葡糖淀粉酶背景活性由左侧的实心“C”条表示。空心条表示从I-SceI诱导条件表达葡糖淀粉酶的转化体。阴影线条表示从I-SceI非诱导条件表达葡糖淀粉酶的转化体，并且虚线条表示对照转化体。两个水平条(紧挨“1.35”和“0.9”)限定了靶向整合转化体的相对葡糖淀粉酶活性。

图15.在I-SceI着陆位点处的葡糖淀粉酶盒的靶向和非整合转化体的DNA印迹分析。DNA印迹的设置与如在图13中所述的相同。(A)转化体的基因组DNA用SpeI消化，然后与探针PcbhI杂交。当pJP8整合在I-SceI着陆位点的5’侧翼处时，预期的正确印迹大小为5.5Kb。(B)将基因组DNA用BamHI消化并与探针Tcbh2杂交。6.8Kb是pJP8正确整合在I-SceI着陆位点的3’侧翼处的预期条带大小。转化体1至10靶向整合在I-SceI着陆位点处(蓝条限制)，并且显示较少的葡糖淀粉酶表达的变异性。转化体11至16是随机整合的转化体(红条限制)，并且具有高的葡糖淀粉酶表达的变异性，其中在I-SceI着陆位点处具有pJP8盒的部分整合(转化体11和14)或者盒的非整合(转化体12、13和15)或多个拷贝的盒的随机整合(转化体16)。在最后一行印迹中将P37ΔcbhIpyrG-26菌株用作对照，并且如预期的那样，当使用PcbhI(印迹A)时，该菌株没有杂交。使用Tcbh2作为探针的对照的预期印迹大小为6.9Kb(印迹B)。

图16.表达质粒pTTT-I-SceI的质粒图谱。该质粒支持由cbhI启动子驱动并且并以cbhI终止子结束的合成密码子优化基因中的I-SceI的表达。该质粒包含amdS选择标记以支持真菌转化体在乙酰胺作为唯一氮源下的生长。由于载体上的端粒序列重复，质粒在真菌细胞中自主维持。

图17A和17B.转化板的图，显示通过多种限制酶处理，稳定的里氏木霉转化体的百分比增加。不用任何限制酶处理(左小图标，记为“PCR”)，用20个单位的AsiSI处理(图17A的中间小图，标记为“PCR+AsiSI”和图17B的中间小图，标记为“AsiSI”)，或者用AsiSI、PacI和SwaI中每一种的7个单位处理(图17A的右小图，标记为“PCR+AsiSI+PacI+SwaI”)或用AsiSI、PacI和PmeI中每一种的7个单位处理(图17B的右小图，标记为“3种酶”)，用含有裂解纤维素单加氧酶(EG4)编码序列的PCR片段转化里氏木霉菌株。

详细说明

I.概述

本文描述的方法以改善的可靠性表达感兴趣的蛋白质或感兴趣的变体。因此，术语“改善的可靠性”意指(1)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的转化体是稳定转化体；或(2)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的转化体按照预期表达超过背景表达水平的感兴趣的蛋白质或变体；或(3)以小于60％(例如，小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于2％)变化的表达水平表达感兴趣的蛋白质或变体。如上面(3)中或本文其他地方提及的术语“表达水平变化”是通过将最高和最低表达水平之间的差除以最高表达水平与背景表达水平之间的差异的值来定义或确定，其中所有测定用相同的构建体和相同的感兴趣的基因或变体进行。

II.定义

在描述本发明的菌株、组合物和方法之前，定义以下术语和短语。未定义的术语应当符合本领域中所使用的常规含义。

在提供了一系列值的情况下，应理解每个中间值为到下限的十分之一单位(除非上下文清晰地另外指示)，该范围的上限与下限之间以及在该陈述范围内的任何其他陈述的或中间值均被涵盖在本发明的组合物和方法之内。这些较小范围的上限和下限可以被独立地包括在所述较小的范围内，并且也被涵盖在本发明的组合物和方法之内，服从所陈述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包括一个或者全部两个限值的情况下，排除那些包括的限值的任一个或者全部两个的范围也包括在本发明的组合物和方法中。

本文提供了某些范围，其中数值前面是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后面的确切数字以及与该术语后面的数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体叙述的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在呈现其的上下文中提供具体叙述的数字的实质性等值的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有具体定义。在另一个实例中，短语“约6的pH值”是指pH值为从5.4至6.6，除非pH值另有具体定义。

本文提供的标题并非对本发明的组合物和方法的各个方面或实施例进行限制，这些方面或实施例可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。因此，将说明书作为一个整体参考时，下面即将定义的术语被定义得更全面。

将本文件分为若干部分以便于阅读；然而，读者将领会的是，在一个部分中进行的陈述可能适用于其他部分。以这种方式，用于本披露的不同部分的标题不应被解释为限制。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本发明组合物和方法的实践或测试中，但现在将对代表性示例方法和材料进行描述。

在本说明书中引用的所有公开物和专利都通过引用结合在此，就好像每个单独的公开物或专利被具体地并单独地指示为通过引用结合，并且通过引用结合在此从而结合引用的公开物来披露和描述这些方法和/或材料。任何公开物的引用内容是针对其在申请日之前的披露，并且不能理解为承认因为先前发明而本发明组合物和方法不能获得比这些公开物更早的申请日。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地证实。

根据该详细说明，适用以下缩写和定义。应当注意单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多个这样的酶，并且提及“剂量”包括提及一个或多个剂量以及本领域技术人员已知的其等效物，等等。

进一步注意的是，权利要求书可以撰写以排除任何可选择的要素。因此，该陈述意在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语例如“单独”、“仅”等或利用“否定型”限定的前提基础。

术语“重组”当用于提及主题细胞、核酸、多肽/酶或载体时，表明受试者已经从其天然状态被修饰。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或以不同于自然界发现的水平或在不同于自然界发现的条件下表达天然基因。重组核酸可以通过一个或多个核苷酸与天然序列不同，和/或可操作地连接到异源序列(例如异源启动子)、允许在表达载体中分泌等的信号序列。重组多肽/酶可以通过一个或多个氨基酸与天然序列不同，和/或与异源序列融合。包含编码感兴趣的蛋白质的核酸的载体是例如重组载体。

进一步注意到，如本文使用的术语“基本上由……组成”是指一种组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总体组合物的以重量计小于30％的总量，并且不会有助于或干扰一种或多种组分的作用或活性。

进一步注意到，如本文所使用的术语“包括”意指包括但不限于在术语“包括”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的组分是必需的或强制性的，但是包含一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或可选择的一种或多种组分。

还要注意的是，如本文所使用的术语“由……组成”意指包括且限于术语“由……组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由……组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。

如将对于本领域技术人员显而易见的是，在阅读本披露时，本文描述和展示的单独实施例中的每一个具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以在不偏离本文所述的本发明组合物和方法的范围或精神的情况下容易地与任何其他几个实施例的任何一个的特征分离或组合。可以按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可行的任何其他顺序来进行任何叙述的方法。

如本文所使用的，术语“遗传稳定的菌株”是指与不稳定的菌株相比其生长速度更快。而且，使用许多丝状真菌宿主(例如像木霉属)，在固体培养基上形成具有光滑的而不是粗糙轮廓的圆形菌落可以用作区别特征。

如本文所使用的，术语“感兴趣的蛋白质”是指期望在丝状真菌中表达的多肽(任选地以高水平和出于商业化的目的)。这样的蛋白质可以是酶、底物结合蛋白、表面活性蛋白、结构蛋白等。

如本文所使用的，术语“感兴趣的基因”是指感兴趣的蛋白质的基因编码序列。

如本文所使用的，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中整合并表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。合适的表达载体的选择是在本领域技术人员的知识范围内。

因此，“表达盒”或“表达载体”是重组或合成产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件的核酸构建体。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，除了其他序列之外，待转录的核酸序列和启动子。

如本文所使用的，术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，并且其在许多细菌和一些真核生物中形成额外的染色体自复制遗传元件。

如本文中可互换使用的，术语“选择标记”或“可选择标记”是指本身存在或引入细胞中的基因，该基因的表达赋予细胞在相应的选择试剂存在下或在相应的选择性生长条件下生长的能力。如本文所使用的，术语“可选择标记编码核苷酸序列”是指编码这样的选择标记或可选择标记的核苷酸序列。

如本文所使用的，术语“启动子”是指起着引导下游基因转录功能的核酸序列。通常启动子将适合于正在表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)一起经常用于表达给定的基因。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。

如本文所使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，是指包含通过肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用用于氨基酸残基的常规一字母或三字母代码。聚合物可以是线性的或支化的，它可以包含修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已经自然地或通过干预被修饰的氨基酸聚合物；这些修饰是例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，例如与标记组分轭合。定义中还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。

如本文所使用的，“真菌”是包括微生物例如酵母和霉菌以及蕈类的大量真核生物体的任何成员。将这些生物分类为与植物、动物、原生生物和细菌分离的一个界，真菌。一个主要区别是真菌细胞具有含有几丁质的细胞壁，这与植物和一些原生生物的含有纤维素的细胞壁不同，并且与细菌的细胞壁不同。

如本文所使用的，“子囊菌真菌菌株”是指真菌界中的子囊菌门中的任何生物体。示例性子囊菌真菌细胞包括但不限于盘菌亚门的丝状真菌，例如木霉属、曲霉属和青霉属物种。

如本文所使用的，“丝状真菌”是指真菌门和卵菌门的所有丝状形式。例如，丝状真菌包括但不限于支顶孢属、曲霉属、翘孢霉属、镰刀菌属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属、柱霉属(Scytalidium)、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属物种。在一些实施例中，丝状真菌可以是棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉或米曲霉。在一些实施例中，丝状真菌是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、大刀镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾镰孢菌(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)、或镰孢霉(Fusariumvenenatum)。在一些实施例中，丝状真菌是特异腐质霉(Humicola insolens)、绵毛状腐质霉(Humicola lanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、嗜热色串孢(Scytalidiumthermophilum)、或土生梭孢壳(Thielavia terrestris)。在一些实施例中，丝状真菌是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏木霉(Trichoderma koningii)、长柄木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉，例如RL-P37(玺尔-奈斯(Sheir-Neiss)等人，应用微生物学和生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnology)，20(1984)pp.46-53；Montenecourt B.S.，Can.，1-20，1987)、QM9414(ATCC No.26921)、NRRL 15709、ATCC13631、56764、56466、56767或绿色木霉例如ATCC 32098和32086。在一些实施例中，丝状真菌是里氏木霉RutC30，作为里氏木霉ATCC 56765其可获自美国典型培养物保藏中心。与此相关，在一些实施例中，本披露提供了本文所述的丝状真菌中的任一种的全细胞液体制剂。

“异源的”核酸构建体或序列具有不是其被表达的细胞天然的或以天然形式存在的序列的一部分。关于控制序列，异源的是指在自然界中不起调节与其目前正在调节的基因表达相同的基因的功能的控制序列(即启动子或增强子)。通常，异源的核酸序列对于它们存在的细胞或部分基因组不是内源的，并且已经通过感染、转染、转化、显微注射、电穿孔等添加到细胞中。“异源的”核酸构建体可以含有与在天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”包括任何真菌，无论是单细胞生物体、来源于多细胞生物体并且被置于组织培养物中的细胞、或作为多细胞生物体的一部分存在的细胞，其易于用根据本发明的核酸构建体转化。这样的宿主细胞，例如酵母和其他真菌细胞可以用于复制DNA并产生由如在本发明中使用的核苷酸序列编码的多肽。合适的细胞通常是丝状真菌或酵母。特别优选的是来自丝状真菌的细胞，该丝状真菌优选是曲霉属例如黑曲霉和塔宾曲霉(A.tubingensis)。其他优选的生物体包括米曲霉、泡盛曲霉、里氏木霉、绿色木霉和长柄木霉中的任何一种。

如本文所使用的，“转化的”意指已经通过使用重组DNA技术转化的细胞。典型地，转化通过将一个或多个核苷酸序列插入细胞而发生。插入的核苷酸序列可以是异源核苷酸序列，即，对于待转化的细胞不是天然的序列，例如融合蛋白。

术语“衍生的”涵盖术语“起源的”、“获得的”“可获得的”和“创造的”，并且通常表示一种指定的材料在另一种指定的材料中找到它的起源或具有可以参考另一种指定材料描述的特征。

如本文所使用的，术语“基因”意指涉及产生多肽的DNA的区段，该区段可以包括或可以不包括编码区之前和之后的区域，例如，5'非翻译区(5’UTR)或“前导”序列以及3’UTR或“尾部”序列，以及个体编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。在其他实施例中，该基因编码商业上重要的工业蛋白质或肽，例如酶，例如蛋白酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、纤维素酶、氧化酶和脂肪酶。感兴趣的基因可以是天然存在的基因、突变基因或合成基因。

如本文中可互换使用的，术语“限制酶”、“限制性内切核酸酶”或“位点特异性内切核酸酶”是在称为限制位点的特定识别核苷酸序列处或其附近切割DNA的酶。限制酶通常分为三种类型，它们的区别在于它们的结构不同，以及它们是否在其识别位点处切割其DNA底物，或者识别和切割位点是否彼此分离。类型I可以从识别序列中在随机位点处切割约1000或更多个碱基对。类型II的切割序列与其识别序列重叠。类型III从识别序列的约25个碱基对处切割DNA。也在限制酶下分类的是大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas，例如RNA引导的内切核酸酶(例如Cas9)。大范围核酸酶是识别在基因组中非常罕见的约12-40个碱基对的大识别位点的天然存在的限制酶。大范围核酸酶的实例包括归巢大范围核酸酶例如LAGLIDADG家族，其实例包括I-SceI、I-CreI、I-MsoI、I-AniI、I-DmiI和PI-PfuI。锌指核酸酶(ZFN)是来自FokI限制性内切核酸酶的非特异性DNA切割结构域与锌指蛋白的融合体。ZFN二聚体诱导刺激DNA损伤反应途径的靶向DNA双链断裂(DSB)。设计的锌指结构域的结合特异性将ZFN引导至特定的基因组位点。转录激活子样效应子(TALE)核酸酶(TALEN)是FokI切割结构域和来源于TALE蛋白的DNA结合结构域的融合体。TALE含有多个33-35个氨基酸重复结构域，这些结构域中每一个识别单个碱基对。像ZFN一样，TALEN诱导靶向的DSB，该DSB激活DNA损伤反应途径并且使定制的改变成为可能。RNA引导的内切核酸酶(例如Cas9)是CRISPR/Cas系统的一部分。CRISPR或成簇的规律间隔的短回文重复序列是包含多个短的正向重复的基因座，并且为细菌和古细菌提供获得性免疫。CRISPR系统依赖crRNA和tracrRNA(用于入侵的外来DNA的序列特异性沉默)。存在三种类型的CRISPR/Cas系统。在II型系统中，Cas9用作RNA引导的DNA内切核酸酶，该内切核酸酶一经crRNA-tracrRNA靶标识别即切割DNA。

为了切割DNA，所有限制酶都进行两次切开，每次通过DNA双螺旋的单个糖-磷酸骨架(即单条链)。已经详细研究了超过3000种限制酶，并且这些酶中超过600种是可商购的。这些酶通常在实验室中用于DNA修饰，并且是分子克隆中的重要工具。例如，以下限制酶识别8个碱基对的限制位点，并且是可商购的：PacI、SwaI、PmeI、AscI、AsiSI、FseI、NotI、SrfI和SgfI。本文使用的限制酶包括天然存在的限制酶和合成的、杂交的或突变的限制酶，只要它们能够在丝状真菌的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)即可。

如本文所使用的，术语“限制酶位点”、“限制位点”或“识别位点”是被各种限制酶识别的、在DNA分子上含有特异性(长度为从4-8个碱基对至12-40个碱基对)核苷酸序列的位置。这些可以是回文序列(因为许多限制酶以同源二聚体结合)或不对称的(针对定制设计的TALEN或ZNF核酸酶)，并且特定的限制酶可以在其识别位点内、附近某处、或远处例如超过1000bp的距离的两个核苷酸之间切割序列。例如，常见的限制酶EcoRI识别回文序列GAATTC，并且在顶部链和底部链上在G和A之间切割，在每一端留下AATT的突出端。突出端是没有附接互补体的DNA链的末端部分，也称为粘性(sticky或cohesive)末端。然后可以将该突出端连接(参见DNA连接酶)到一段具有互补突出端(也称为相容的粘性末端(例如另一个EcoRI切割段))的DNA。一些限制酶以不留下突出端(称为平端)的方式在限制位点处切割DNA。

如本文所使用的，术语“％同一性”与术语“％同源性”可互换使用，并且是指当使用序列比对程序进行比对时，编码任何一个本发明多肽或本发明多肽的氨基酸序列的核酸序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。

III.真菌宿主菌株和DNA构建体及其使用方法

1.使用限制酶介导的整合(REMI)构建遗传稳定的、转化的真菌菌株

在第一方面，本披露还提供了构建遗传稳定的、转化的木霉属菌株的方法，所述方法包括：a)使用线性化(也称为“线性”)或环状DNA和限制酶(也称为用限制酶“处理”)的混合物转化木霉属细胞，其中该限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶处理的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

在第一方面，本披露还提供了构建遗传稳定的、转化的木霉属菌株的方法，所述方法包括：a)用线性化或环状DNA转化木霉属细胞，其中诱导木霉属细胞生产限制酶，其中该限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶诱导的稳定转化体的百分比高于不用限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

在第二方面，本披露提供了使用如上面第一方面所述的方法获得的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在第三方面，本披露提供了一种改善真菌转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂。

在第三方面，本披露还提供了改善木霉属转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化或环状DNA和限制酶的混合物转化木霉属细胞，其中所述限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)，并且其中用限制酶处理所得到的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

在第三方面，本披露还提供了改善木霉属转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化或环状DNA转化木霉属细胞，其中木霉属细胞被诱导以生产能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)的限制酶，并且其中用限制酶诱导所得到的稳定转化体的百分比高于不用限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

a.真菌菌株构建的经典方法

使用真菌菌株作为感兴趣的蛋白质的生产宿主长期以来一直被认为是经济上可行的并且在一段时间广泛用于商业环境中。针对真菌已经开发了用于转化和菌株构建的不同遗传方法，包括通过PEG/原生质体转化(Hinnen等人，1978)、电转化(軽部(Karube)等人，1985)、基因枪法(Armaleo等人，1990)、根癌土壤杆菌介导的转化(ATMT)(德格鲁特(deGroot)等人，1998)和RNA干扰(RNAi)技术(明石(Akashi)等人，2005)的标准方法。

在某些实施例中，为了制备曲霉属物种或肉座菌属物种(Hypocrea sp.)(木霉属物种)以用于转化，制备了真菌菌丝体的原生质体。参见坎贝尔(Campbell)等人，现代遗传学(Curr.Genet.)16:53-56；1989。菌丝体可以从发芽的营养孢子获得。使用消化细胞壁的酶处理菌丝体，产生原生质体。然后，通过悬浮培养基中渗透稳定剂的存在来保护原生质体。合适的稳定剂包括例如山梨糖醇、甘露糖醇、氯化钾、硫酸镁等。典型地，一种或多种稳定剂的浓度可以在约0.8M和约1.2M之间(例如在约0.9M和约1.2M之间、在约1.0M和约1.2M之间、在约1.1M和约1.2M之间等)变化。

在一个具体的实施例中，将约1.2M的山梨糖醇用作悬浮培养基中的稳定剂。将DNA吸收到宿主菌株(例如曲霉属物种或肉座菌属物种(木霉属物种))中常常取决于钙离子浓度。通常在吸收溶液中使用约10mM CaCl₂和约50mM CaCl₂(例如，在约15mM和约45mM之间、在约20mM和约40mM之间、在约25mM和约35mM之间)。除了在吸收溶液中包含钙离子之外，经常包括的其他物质是缓冲系统，例如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mM MOPS(pH 6.0)缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据信，该缓冲液中的聚乙二醇起到融合细胞膜的作用，从而允许培养基的内容物被递送到宿主菌株(例如曲霉属物种或肉座菌属物种)的细胞质中，并且将质粒DNA转移到细胞核中。在某些实施例中，该融合过程保留下整合到宿主染色体中的多个拷贝的质粒DNA。

通常，将含有以10⁵至10⁶/mL、优选2x l0⁵/mL的密度的已经经历渗透性处理的曲霉属物种原生质体或细胞的悬浮液或细胞用于转化。类似地，将含有以10⁸至10⁹/mL、优选2xl0⁸/mL的密度的已经经历渗透性处理的肉座菌属物种(木霉属物种)原生质体或细胞的悬浮液或细胞用于转化。将100μL体积的在合适的溶液(例如1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的这些原生质体或细胞与所希望的的DNA混合。在一些实施例中，将大量的PEG添加到吸收溶液中。例如，可以将从约0.1至约1体积的25％PEG4000添加到原生质体悬浮液中。在具体的实例中，将约0.25体积的25％PEG4000添加到原生质体悬浮液中。也可以将添加剂例如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到吸收溶液中并帮助转化。

在某些实施例中，将混合物在约0℃下孵育约10分钟至约30分钟的时间。可以向混合物中添加另外的PEG以进一步增强所希望的基因或DNA序列的吸收。在某些实施例中，能以转化混合物的5至15倍的量添加25％PEG 4000；然而，更大和更小的体积也可能是合适的。例如，在一些实施例中，以转化混合物的体积的10倍添加25％PEG 4000。在添加PEG之后，将转化混合物在室温或冰上孵育，然后添加山梨糖醇和CaCl₂溶液。然后将原生质体悬浮液进一步添加到生长培养基的熔融等分试样中。该生长培养基允许转化体的生长。在本披露中，许多生长培养基可以合适地用于生长所希望的转化体。在某些实施例中，例如，如果选择Pyr+转化体，则优选使用不含尿苷的生长培养基。例如，将菌落转移到尿苷耗尽的生长培养基上并在该培养基上纯化。

在这个阶段，稳定转化体可以通过其更快的生长速度与不稳定转化体区分开来。而且，使用许多丝状真菌宿主(例如像木霉属)，在缺乏尿苷的固体培养基上形成具有光滑的而不是粗糙轮廓的圆形菌落可以用作区别特征。在一些实施例中，可以通过在固体非选择性培养基(例如含有尿苷)上生长转化体，从该培养基中收获孢子并确定这些孢子的百分比来进行进一步测试和稳定性的选择。允许选择的孢子在缺乏尿苷的选择培养基上发芽并生长。可以在所有测试的转化体中计算稳定转化体的百分比。

但是使用上述转化方法，稳定转化体的百分比可能在5％和30％之间变化，这意味着必须筛选大量的转化体以选择最佳菌株。稳定性频率可能取决于所使用和在木霉属菌株中的选择标记。为什么与一些其他真菌(如曲霉属)相比木霉属中不稳定转化体的频率很高仍然是未知的。由于这种高水平的不稳定转化体，筛选和选择生产菌株的过程趋于非常费力和耗时。因此，生产遗传稳定的、转化的真菌菌株以按降低的变异性表达感兴趣的蛋白质的可靠手段提供了明显的优点。

当外源DNA作为靶向基因置换整合进染色体时，其涉及DNADSB(双链断裂)的细胞修复机制。DSB通过两个主要途径在基因组的维持中起关键作用：依赖于同源序列的HR(同源重组)途径和不依赖于序列同源性的NHEJ途径(Kanaar等人，1998)。这两种修复机制被认为独立工作，但揭示了功能竞争(凡·戴克(van Dyck)等人，1999)。在单细胞真核生物酿酒酵母(S.cerevisiae)中，HR是涉及修复DSB的主要途径，而大多数丝状真菌中HR的低频率(5％)阻碍了靶向基因置换的研究(韦尔德(Weld)等人，2006)。因此，需要通过消除NHEJ途径增加HR途径的方法来实现丝状真菌中的高度有效的基因靶向。已经开发了NHEJ缺陷型菌株以改善HR的效率，因为该基因将更容易地经由HR在其内源基因座上整合。尽管NHEJ缺陷型菌株的形态与野生型相似，但是突变体对腐草霉素、博来霉素、和甲磺酸甲酯/乙酯等几种化学药品更加敏感。因此，需要开发其他方法、系统或技术以便使感兴趣的基因能以靶向的方式整合到真菌基因组中。

b.使用限制酶介导的整合(REMI)构建真菌菌株

基于PEG-原生质体系统的限制酶介导的整合(REMI)最初在酿酒酵母中建立(Schiest和皮特斯(Petes)，1991)，并且已经成功地应用于几种真菌植物病原体，例如异旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)(鲁(Lu)等人，1994)和互隔交链孢霉(Alternariaalternata)(田中(Tanaka)等人，1999)。今天，REMI技术已经成功地产生更高数量或百分比的真菌突变体，这些突变体可用于鉴定致病性基因以及其他基因功能评估。例如，用优化的REMI方法处理捕获线虫的真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)，得到34-175个转化体/μg线性质粒DNA，以及总共超过2000个转化体。另外，还鉴定了经由REMI在禾谷镰刀菌突变文库中筛选的11个有趣的突变体以及与小麦痂病毒性相关的另外两个基因CBL1和MSY1(相(Seong)等人，2005)。此外，通过REMI技术从尖孢镰刀菌鉴定了与致病性或对植物防御化合物的抗性相关的几种蛋白质(Duyvesteijn等人，2005；Imazaki等人，2007；马德里(Madrid)等人，2003)。总之，可以通过REMI可靠地获得改善的突变体(转化体)频率和单拷贝插入率。

本披露提供了REMI在迄今为止未被认识和未应用的背景中的使用，也就是说，将REMI用于显著增加(与转化体的频率对照)稳定的木霉属转化体的百分比。实际上，与已预期的相反，当将REMI应用于木霉属时，发现转化体的频率更少。然而，在所制得的转化体中，就这样在降低的频率下，稳定的转化体的数量剧烈增加。

从另一个观点来描述，当在限制酶存在下用DNA转化木霉属时，不稳定转化体的数量剧烈下降，从而允许容易地选择稳定的菌落(图4A-4E)。

在传统的PEG介导的转化实验中，稳定转化体的百分比可以在5％和30％之间变化。相比之下，当将REMI应用于木霉属PEG介导的转化时，稳定转化体的百分比增加至90％。因此，必须筛选以选择最佳菌株的转化体的数量可以显著降低。

另外，当应用REMI时，观察到更高百分比的高生产转化体。

在一些实施例中，用于该方法或与本文所述的真菌宿主菌株一起使用的限制酶由置于真菌宿主细胞中的表达盒产生。例如，表达盒可以合适地插入含有可选择标记和对高水平转录有用的序列的任何表达载体中。

考虑可以将限制酶的编码区或其部分插入到这样的通用型表达载体中，将其置于表达盒启动子和终止子序列的转录控制下。这样的通用型表达载体的非限制性实例是曲霉属中的pRAX。可以将感兴趣的基因或变体基因或其一部分插入强glaA启动子的下游。这样的通用型表达载体的非限制性实例是肉座菌属中的pTrex3gM。可以将感兴趣的基因或变体基因或其一部分插入强cbhl启动子的下游。

在某些实施例中，在载体中，编码限制酶或感兴趣的蛋白质的DNA序列可以可操作地连接到在阅读框中结构基因上的转录和翻译序列(例如合适的启动子序列和信号序列)上。启动子合适地是在特定宿主细胞中显示转录活性的任何DNA序列，并且可以来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。可任选的信号肽可以提供感兴趣的蛋白质或变体的细胞外生产。编码信号序列的DNA优选是与待表达的基因天然相关的DNA。然而，考虑了来自任何合适来源(例如来自外切纤维二糖水解酶或来自木霉属的内切葡聚糖酶)的信号序列。

可以用来将编码限制酶或感兴趣的蛋白质的DNA序列连接到启动子上的试验方案，以及将这样的构建体插入合适的载体中是本领域已知的。

根据本文所述的已知技术，例如转化、转染、显微注射、微孔化、基因枪轰击等，可以将本文所述的DNA载体或构建体引入真菌宿主细胞中。

合适地与用此方法提供的本发明一起使用的真菌菌株可以是来自木霉属，特别是里氏木霉(长柄木霉)的菌株。然而，感兴趣的基因还可以来源于任何其他合适的微生物，包括真菌，例如犁头霉属的物种(Absidia spp.)；支顶孢属的物种(Acremoniυm spp.)；Agancus spp.、厌氧鞭菌属的物种(Anaeromyces spp)；曲霉属的物种(Aspergillus spp)，包括棘孢曲霉(A.auculeatus)、泡盛曲霉(A.awamon)、黄曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、反丁烯二酸曲霉(A.fumaricus)、烟曲霉(A.fumigatus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、土曲霉(A.terreus)和杂色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidium spp.；头孢菌属的物种(Cephalosporum spp.)；毛壳菌属的物种(Chaetomium spp.)；金孢子菌属的物种(Chrysosporium spp)；鬼伞属的物种(Coprinus spp)；Dactyllum spp.；镰刀菌属的物种(Fusarium spp.)，包括F.conglomerans、拾胞镰孢菌(F.decemcellulare)、爪哇镰刀菌(F.javanicum)、F.lim、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)和腐皮镰刀菌(F.solani)；胶枝霉属的物种(Gliocladium spp.)；腐质霉属的物种(Humicola spp)，包括特异腐质霉(H.insolens)和绵毛状腐质菌(H.lanuginosa)；毛霉属的物种(Mucor spp.)；脉孢菌属的物种(Neurospora spp.)，包括粗糙脉孢菌(N.crassa)和好食链孢霉(N.sitophila)；新美鞭菌属的物种(Neocallimastix spp)；根囊鞭菌属的物种(Orpinomyces spp.)；青霉属的物种；平革菌属的物种(Phanerochaete spp.)；射脉菌属的物种(Phlebia spp.)；瘤胃壶菌属的物种(Piromyces spp.)；假单胞菌属的物种；根霉属的物种(Rhizopus spp.)；裂褶菌属的物种(Schizophyllum spp.)；栓菌属的物种(Trametes spp)；木霉属的物种，包括里氏木霉、里氏木霉(长柄木霉)和绿色木酶(T.viride)；以及接霉属的物种(Zygorhynchusspp.)。类似地，可以设想感兴趣的基因或其编码的蛋白质可以在细菌和酵母菌中找到，该细菌例如是芽孢杆菌属的物种、纤维单胞菌属的物种(Cellulomonas spp.)；梭菌属的物种(Clostridium spp.)、毁丝霉属的物种(Mysoliophthora spp.)；高温单孢菌属的物种(Thermomonospora spp)；链霉菌属的物种，产橄榄色链霉菌(S.olivochromogenes)；产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)；并且该酵母菌包括念珠菌(Candidatorresn)；C.parapsllosis；清酒假丝酵母(C.sake)；涎沫假丝酵母(C.zeylanoides)，小毕赤酵母(Pichia minuta)；黏红酵母(Rhodotorula glutinis)；胶红酵母(R.mucilaginosa)和红掷孢酵母(Sporobolomyces roseus)。可替代地，感兴趣的基因可以来源于其他来源，例如细菌。

c.真菌菌株中的靶向基因整合系统

在一个方面，本披露提供了真菌表达系统，该系统包括：在第一部分，在染色体DNA中含有至少一个限制酶位点的真菌宿主细胞；以及在第二部分，含有可操作以表达一个或多个感兴趣的基因的序列、一种选择标记和与所述染色体限制酶位点侧翼的序列具有实质同源性的序列的一种核酸分子，其中该同源序列引起导致该感兴趣的基因的表达的同源重组事件。此外，本披露提供了使用上述方面的真菌表达系统的方法，该方法包括在能够产生限制酶位点的限制酶存在下将所述核酸分子转化到真菌宿主细胞中。

此外，本披露提供了通过使用真菌表达系统的方法获得的转化的或衍生的真菌菌株。

还另外，本披露提供了靶向基因整合的方法，该方法包括首先获得在染色体DNA中含有至少一个限制酶位点的真菌宿主细胞，以及含有可操作以表达一个或多个感兴趣的基因的序列、至少一种选择标记和与所述染色体限制酶位点侧翼的序列具有实质同源性的序列的一种核酸分子，其中该同源序列引起导致该感兴趣的基因的表达的同源重组事件；然后在能够产生限制酶位点的限制酶的存在下将第一步骤的核酸分子转化到第一步骤的真菌宿主细胞中。

本披露提供了一种靶向基因整合系统，该靶向基因整合系统被开发用于阐明基因功能，包括在微生物和真核两种基因组中鉴定基因产物的相互作用的蛋白质伴侣。传统上，用于确定基因功能的方法典型地涉及为感兴趣的基因创建无效突变以评估生物体的表型，该评估通过比较使得感兴趣的基因为无功能的时候的表型与感兴趣的基因是有功能的时候的表型来进行。使用由重组DNA技术制得的基因破坏载体，通过基因破坏(也称为基因敲除或基因替换)产生无效突变。在转化到相关生物体中后，具有一个或多个被破坏的感兴趣的基因的DNA构建体将通过同源重组整合到这样的生物体的基因组中的一个或多个驻留位置，替换基因的功能性拷贝。如上所述的传统方法对于一系列生物体中的基因的破坏是有效的，但是具有若干固有限制。例如，在多细胞真核生物(包括大多数真菌)中占优势的非同源末端连接(NHEJ)导致表达载体随机地整合到基因组中。另外，即使在转化体中，通常产生很大百分比的不稳定转化体，需要进一步筛选转化体以获得稳定转化体。

另外，由于靶向整合事件的低效率，使用真菌系统(例如涉及里氏木霉的真菌系统)用于鉴定具有较高比活性的蛋白质或变体的高通量筛选是一个挑战。在另一方面，长期以来理解的是，为了提供对然后可以由真菌宿主生物表达或产生、接下来可以被应用到工业用途中的蛋白质/变体/酶的有意义的筛选，至关重要的是在最终将产生感兴趣的蛋白质/变体/酶的真菌系统或在相对密切相关的至少一个真菌系统中进行这样的高通量筛选。然而，在例如木霉属系统的真菌系统中，受本领域技术人员喜爱的、含有突变的感兴趣的基因的表达盒的随机整合几乎是不可避免的并且经常发生，产生两个变量(其相互作用导致非凡的复杂性)：1)表达水平；和2)感兴趣的蛋白质/变体/酶的活性。因此，经由感兴趣的基因靶向整合到基因组中的预定位点而导致转化体的蛋白质表达的均一性的方法(例如本文所述的方法)是非常需要的，因为蛋白质活性可以与特征突变直接相关。

以前已经进行努力来降低表达水平的变异性。例如，已经发现非同源末端连接(NHEJ)途径(例如ku70、ku80或lig4)已经失活的突变真菌菌株展示增加的同源整合频率。不幸的是，由此获得的转化体的数量相当低。另外，已经报道，当工业菌株中ku70的突变导致遗传不稳定时，它们有时是不需要的(阿乌(Aw)和波利齐(Polizzi)，2013)。

本披露表明，通过使用I-SceI内切核酸酶在里氏木霉基因组中的预定位点处产生双链断裂，在里氏木霉菌株中完整的NHEJ基因的靶向整合频率得到改善。

在具体实例(实例2)中，构建了重组的里氏木霉，以在cbh2基因座处含有I-SceI限制位点，并且在I-SceI(其在里氏木霉基因组中的预定位点处产生双链断裂的)存在下使用与I-SceI限制位点侧翼的序列具有实质同源性的葡糖淀粉酶表达盒来转化重组的里氏木霉。经由双交叉观察到葡糖淀粉酶表达盒在目的位点处的靶向整合(图11)。如表3中进一步所示，68％的表达葡糖淀粉酶的转化体(I-SceI诱导的)以靶向方式整合，而与之相对，非诱导的I-SceI构建体仅为46％，并且对照构建体为16％。

d.真菌菌株的发酵

在一个方面，本披露提供了在合适的培养基中发酵转化的真菌菌株的方法，该转化的真菌菌株已经使用以下方法获得，该方法包括：a)用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌的细胞，其中该限制酶能够在真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在这一方面，本披露还提供了在合适的培养基中发酵转化的真菌菌株的方法，该转化的真菌菌株已经使用以下方法获得，该方法包括：a)使用线性化/线性或环状DNA和限制酶的混合物转化木霉属细胞，其中该限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶处理的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

在同一方面，本披露还提供了在合适的培养基中发酵转化的真菌菌株的方法，该转化的真菌菌株已经使用以下方法获得，该方法包括：a)用线性化/线性或环状DNA转化木霉属细胞，其中诱导木霉属细胞生产限制酶，其中该限制酶能够在木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶诱导的稳定转化体的百分比高于不用限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

在另一个方面，本披露提供了表达感兴趣的基因的方法，该方法包括在合适的培养基中，在允许感兴趣的基因表达的条件下，使例如根据在上述方面中已经描述的那样获得的转化的真菌菌株生长和发酵。

在另外的方面，本披露提供了在合适的培养基中使转化的或衍生的真菌菌株发酵的方法，由此使用如本文所述的方法和真菌表达系统获得转化的或衍生的真菌菌株。

在又另外的方面，本披露提供了表达感兴趣的基因的方法，该方法包括在合适的培养基中并且在允许感兴趣的基因表达的条件下，使如本文提供的转化的或衍生的真菌菌株生长和发酵。由此获得的转化的或衍生的真菌菌株可以合适地使用如本文所述或提供的真菌表达系统，该系统通常包括：在能够产生合适的限制酶位点的限制酶存在下将特定核酸分子转化到真菌宿主细胞中。

本领域熟知的任何发酵方法都可以合适用来使如本文提供的转化的或衍生的真菌菌株发酵。在一些实施例中，真菌细胞在分批或连续发酵条件下生长。

经典的分批发酵是封闭的系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成，并且该组成在发酵期间不改变。在发酵开始时，用一种或多种所希望的生物体接种培养基。换言之，整个发酵过程发生而自始至终没有向发酵系统添加任何组分。

可替代地，分批发酵符合关于添加碳源的“分批”的资格。此外，通常在整个发酵过程中进行尝试来控制因素例如pH和氧气浓度。典型地，分批系统的代谢物和生物质组成不断变化直到发酵停止的时间。在分批培养中，细胞通过静态停滞期进展到高生长对数期，最后进入生长速率减少或停止的稳定期。不经处理，稳定期中的细胞将最终死亡。通常，在对数期的细胞负责产物的大量生产。

标准分批系统的一个合适的变体是“补料分批发酵”系统。在典型的分批系统的这种变化中，随着发酵的进展，将底物以增量添加。当已知分解代谢物抑制将抑制细胞的代谢时和/或在发酵培养基中希望具有有限量的底物的情况下，补料分批系统是有用的。在补料分批系统中实际底物浓度的测量是困难的，并且因此基于可测量因素(例如pH、溶解的氧和废气(例如CO₂)的分压)的变化对其进行估计。分批和补料分批发酵是本领域熟知的。

连续发酵是另一种已知的发酵方法。它是一个开放的系统，在该系统中，将定义的发酵培养基连续添加到生物反应器中，同时除去等量的条件培养基以用于处理。连续发酵通常将培养物保持在恒定的密度，其中将细胞主要维持在对数期生长。连续发酵允许对一种或多种影响细胞生长和/或产物浓度的因素进行调节。例如，限制营养素(例如碳源或氮源)可以维持在固定的速率，并允许调节所有其他参数。在其他系统中，影响生长的许多因素可以不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持不变。连续系统努力维持稳定态的生长条件。因此，由于转移培养基而引起的细胞损失应当与发酵中的细胞生长速率相平衡。调节用于连续发酵过程的营养素和生长因子的方法以及最大化产物形成速率的技术在工业微生物学领域中是熟知的。

e.由真菌菌株产生的感兴趣的蛋白质

在一个方面，本披露提供了由感兴趣的基因编码并且通过表达感兴趣的基因的方法生产的感兴趣的蛋白质，该表达感兴趣的基因的方法包括在允许该感兴趣的基因表达的条件下在合适的培养基中使转化的真菌菌株生长和发酵，该菌株使用以下方法获得，该方法包括：a)使用线性化DNA和限制酶的混合物转化真菌细胞，其中该限制酶能够在所述真菌菌株的染色体DNA中产生双链断裂；以及b)选择在步骤a)中产生的遗传稳定的、转化的真菌菌株。

在这一方面，本披露还提供了由感兴趣的基因编码并且通过表达感兴趣的基因的方法生产的感兴趣的蛋白质，该表达感兴趣的基因的方法包括在允许该感兴趣的基因表达的条件下在合适的培养基中使转化的真菌菌株生长和发酵，该菌株使用以下方法获得，该方法包括：a)使用线性化/线性或环状DNA和限制酶的混合物转化木霉属细胞，其中该限制酶能够在该木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶处理的稳定转化体的百分比高于不用限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

在同一方面，本披露还提供了由感兴趣的基因编码并且通过表达感兴趣的基因的方法生产的感兴趣的蛋白质，该表达感兴趣的基因的方法包括在允许该感兴趣的基因表达的条件下在合适的培养基中使转化的真菌菌株生长和发酵，该菌株使用以下方法获得，该方法包括：a)用线性化/线性或环状DNA转化木霉属细胞，其中该木霉属细胞被诱导产生限制酶，其中该限制酶能够在该木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；并且b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用限制酶诱导的稳定转化体的百分比高于不用限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

在另一个方面，本披露提供了由感兴趣的基因编码并且通过在合适的培养基中在允许感兴趣的基因表达的条件下在衍生的真菌菌株中表达感兴趣的基因的方法产生的感兴趣的蛋白质，该菌株通过使用真菌表达系统的方法获得，该真菌表达系统在第一部分中包含在染色体DNA中含有至少一个限制酶位点的真菌宿主细胞；并且在第二部分，含有可操作以表达一个或多个感兴趣的基因的序列、一种选择标记和与所述染色体限制酶位点侧翼的序列具有实质同源性的序列的一种核酸分子，其中该同源序列引起导致该感兴趣的基因的表达的同源重组事件；由此在能够产生限制酶位点的限制酶的存在下将第一部分的核酸分子转化到真菌宿主细胞中。

感兴趣的蛋白质可以合适地是任何内源和异源的蛋白质。感兴趣的蛋白质可以含有一个或多个二硫键，或者可以是其功能形式是单体或多聚体的蛋白质，即蛋白质具有四级结构并且由多个相同(同源的)或不相同的(异源的)亚基构成，然而，感兴趣的蛋白质优选是具有感兴趣的性质的蛋白质。

感兴趣的蛋白质可以是感兴趣的变体。感兴趣的蛋白质或感兴趣的变体可以合适地是半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、或其变体、或这些酶或变体中的两种或更多种的混合物。感兴趣的蛋白质或感兴趣的变体蛋白质的非限制性实例可以是涉及淀粉代谢的蛋白质或酶或其变体；涉及糖原代谢的蛋白质或酶或其变体；酶例如乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白质、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：02-氧化还原酶，EC1.1.3.5)，其变体，以及这些酶或其变体的两种或更多种的组合。

感兴趣的蛋白质或感兴趣的变体还可以合适地是肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原(例如，HBV表面抗原、HPVE7等)或其变体或片段，或这样的物质、变体或片段中的两种或更多种的混合物。

其他类型的感兴趣的蛋白质或变体可以是能够为食品或作物提供营养价值的蛋白质或变体。非限制性实例包括可以抑制抗营养因子形成的植物蛋白质和具有更理想的氨基酸组成的植物蛋白质(例如比非转基因植物具有更高的赖氨酸含量)。

f.由此制成的蛋白质性组合物的使用

在一个方面，本披露提供了包含感兴趣的蛋白质的蛋白质性组合物。蛋白质性组合物使用本文提供的方法合适地生产。组合物包含由感兴趣的基因编码、使用本文所述的方法表达的感兴趣的蛋白质。该组合物可用于各种有用的工业应用中，例如像用于生物质水解、清洁应用、谷物加工、动物营养、食品组合物、纺织品处理等中。

例如，由此产生的蛋白质性组合物可以用于木质纤维素生物质水解中。木质纤维素是世界上最大的可再生生物质资源，主要由木质素、纤维素和半纤维素构成，其中后者中大部分是木聚糖。将木质纤维素原料转化成乙醇具有以下优点：大量原料的即时可得性、避免燃烧或填埋材料的期望性、以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残留物、草本作物和市政固体废物已经被认为是用于乙醇生产的原料。一旦木质纤维素被转化为可发酵糖，例如葡萄糖，可发酵糖就容易被酵母发酵成乙醇。纤维素是单糖葡萄糖通过β-1,4-键共价连接的聚合物。许多微生物产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。木聚糖是由1,4-β-糖苷连接的D-吡喃木糖形成的多糖。木聚糖酶(例如内切-1,4-β-木聚糖酶，EC 3.2.1.8)水解木聚糖中的内部β-1,4-木糖苷键以产生较小分子量的木糖和木糖低聚物。本披露为这样的木质纤维素生物质用途提供了转化的真菌细胞，该真菌细胞已经被证明具有改善的转化体稳定性，作为感兴趣的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。

在另一个实例中，由此产生的蛋白质性组合物可以用于清洁应用中。酶促清洁组分是受欢迎的，因为它们能够分解常规化学洗涤剂不容易分解的土壤、污渍和其他杂物。可用于清洁的众所周知的酶包括蛋白酶和淀粉酶，连同其他酶例如脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶，甚至是某些纤维素酶，这些酶各自提供一组不同的功能。蛋白酶与基于蛋白质的污渍相抗衡；淀粉酶对碳水化合物和淀粉起作用；并且脂肪酶分解例如脂质或脂肪。本披露为在清洁应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞，该真菌细胞已经被证明具有改善的转化体稳定性，作为感兴趣的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。

在另一个实例中，由此制得的蛋白质性组合物可以用于谷物加工中。淀粉是植物中最常见的储存碳水化合物，由植物本身以及由微生物和由高等生物使用。多种酶能够催化淀粉水解。来自所有植物来源的淀粉以颗粒的形式发生，但是取决于植物来源的种类，淀粉呈现明显不同的大小和物理特征。淀粉的酸水解在过去被广泛使用，然而这一过程现在已经在很大程度上被酶促加工所替换，已知所述酶促加工要求更少的耐腐蚀材料和其他益处，需要更少的加热能量，并且比酸处理相对更容易控制。本披露为在淀粉降解和谷物加工中的这样的用途提供了转化的真菌细胞，该真菌细胞已经被证明具有改善的转化体稳定性，作为感兴趣的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。

在另一个实例中，由此制得的蛋白质性组合物可以用于食品应用中。由细菌、酵母和霉菌产生的酶数千年以来已经用于食品应用，以制作食品例如面包、奶酪、啤酒和葡萄酒。今天，酶被用于面包店、奶酪制作、淀粉加工、以及果汁和其他饮料的生产中，提供各种益处，例如改善的质地、外观和营养价值，产生理想的香味和香气等。食品酶典型地来源于动物和植物(例如淀粉消化酶，即淀粉酶，可以从大麦种子发芽获得)以及来自一系列有益微生物。酶被认为是传统基于化学的技术的可行和理想的替代品，在许多工艺中替代合成的化学药品。酶可以帮助改善食品生产过程的环境性能，降低能源消耗并改善废物或副产品的生物降解性。就其作用而言，酶比合成的化学药品更具特异性，因此，酶促加工常常提供更少的副反应和废物或副产物，因此产生更高质量的产品并降低污染的可能性。酶促加工通常也是唯一可行的加工。这方面的一个实例是浓缩苹果清汁的生产，其依赖于酶(果胶酶)的使用。大多数食品酶由微生物例如芽孢杆菌属、曲霉属、链霉属或克鲁维酵母属生产。本披露为在食品应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞，该真菌细胞已经被证明具有改善的转化体稳定性，作为感兴趣的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。

在另一个实例中，由此制得的蛋白质性组合物可以用于动物饲料添加剂中。纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶和碳水化合物酶已经广泛用于动物饲料工业。由于许多基于植物的饲料包含具有减少动物生长的抗营养因子的物质，所以添加到此类饲料中的酶通过降解纤维、蛋白质、淀粉和植酸来改善这些抗营养因子的可消化性，使它们更易被动物消化，并且使得能够使用更便宜和通常在本地生产的饲料，同时使肉、蛋或奶的生产力最大化。同时，添加到此类饲料中的酶还可以提供支持肠道健康和增强的动物性能的益处。本披露为在动物饲料应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞，该真菌细胞已经被证明具有改善的转化体稳定性，作为感兴趣的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。

在又另外的实例中，由此制得的蛋白质性组合物可以用于纺织品应用中。酶已经成为纺织品加工的一个不可分割的部分。在纺织品工业中存在两个已确立起来的酶应用。首先，酶(例如淀粉酶)通常用于预精整区域以用于退浆。第二，酶(例如纤维素酶)通常用于精整区域以用于软化、生物石化和减少棉制品的起球倾向。其他酶例如像果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、过氧化氢酶、木聚糖酶等也用于织物品加工。此外，有各种需要酶的应用，包括牛仔布和非牛仔布的褪色、生物洗擦、生物磨光、羊毛精整、过氧化物去除、染料的脱色等(卡瓦科-保罗(Cavaco-Paulo)和古比茨(Gubitz)，2003；舍利卡尼(Chelikani)等人，2004；Nalankilli，1998；申爱(Shenai)，1990)。本披露为在纺织品应用中的这样的用途提供了转化的真菌细胞，该真菌细胞已经被证明具有改善的转化体稳定性，作为感兴趣的工业酶、变体和混合物的生产者是合适和有益的。

实例

根据以下实例可以进一步理解本发明菌株、组合物和方法的方面，这些实例不应被解释为限制性的。材料和方法的修改对本领域技术人员而言是显而易见的。

本披露中使用的一些真菌(木霉属)菌株和质粒的概述(主要在本研究中构建)显示于下表1中：

实例1：使用REMI进行AclAmy1表达

A.构建AclAmy1表达载体

1)pTrex3gM-AclAmy1

此处用作模式感兴趣的蛋白质的酶AclAmy1是指来源于棒曲霉(Aspergillusclavatus)的酸稳定的真菌α淀粉酶，该酶具有以下的氨基酸序列(其中信号序列为加粗斜体)(SEQ ID NO:1)：

MKLLALTTAFALLGKGVFGLTPAEWRGQSIYFLITDRFARTDGSTTAPCDLSQRAYCGGSWQGIIKQLDYIQGMGFTAIWITPITEQIPQDTAEGSAFHGYWQKDIYNVNSHFGTADDIRALSKALHDRGMYLMIDVVANHMGYNGPGASTDFSTFTPFNSASYFHSYCPINNYNDQSQVENCWLGDNTVALADLYTQHSDVRNIWYSWIKEIVGNYSADGLRIDTVKHVEKDFWTGYTQAAGVYTVGEVLDGDPAYTCPYQGYVDGVLNYPIYYPLLRAFESSSGSMGDLYNMINSVASDCKDPTVLGSFIENHDNPRFASYTKDMSQAKAVISYVILSDGIPIIYSGQEQHYSGGNDPYNREAIWLSGYSTTSELYKFIATTNKIRQLAISKDSSYLTSRNNPFYTDSNTIAMRKGSGGSQVITVLSNSGSNGGSYTLNLGNSGYSSGANLVEVYTCSSVTVGSDGKIPVPMASGLPRVLVPASWMSGSGLCGSSSTTTLVTATTTPTGSSSSTTLATAVTTPTGSCKTATTVPVVLEESVRTSYGENIFISGSIPQLGSWNPDKAVALSSSQYTSSNPLWAVTLDLPVGTSFEYKFLKKEQNGGVAWENDPNRSYTVPEACAGTSQKVDSSWR

AclAmy1基因的核苷酸序列包含8个内含子，该序列如下所示(SEQ ID NO:2)：

ATGAAGCTTCTAGCTTTGACAACTGCCTTCGCCCTGTTGGGCAAAGGGGTATTTGGTCTAACTCCGGCCGAATGGCGGGGCCAGTCTATCTACTTCCTGATAACGGACCGGTTTGCTCGTACAGATGGCTCAACAACCGCTCCATGTGATCTCAGCCAGAGGGTTAGTGATTTCATCGTATTCTTTGTCATGTGTCATGACGCTGACGATTTCAGGCGTACTGTGGTGGAAGCTGGCAGGGTATTATCAAGCAAGTAAGCCTACTGGTTTCCAATTTTGTTGAATTCCTTTCTGACTCGGCCAGCTCGATTATATCCAAGGAATGGGCTTCACTGCTATTTGGATCACACCCATTACGGAGCAAATCCCACAGGATACCGCTGAAGGATCAGCATTCCACGGCTATTGGCAGAAGGATATGTGAGTTTCCTTATAACATTCACTACGTTTTGCTAATATAGAACAGTTACAATGTCAACTCCCATTTCGGAACCGCCGATGACATTCGGGCATTGTCCAAGGCCCTTCACGACAGGGGAATGTACCTGATGATTGACGTTGTTGCCAACCACATGGTAGGTGATATCTCACTGATTGAGTTATACCATTCCTACTGACAGCCCGACCTCAACAAAAGGGTTACAATGGACCTGGTGCCTCGACTGATTTTAGCACCTTTACCCCGTTCAACTCTGCCTCCTACTTCCACTCGTACTGCCCGATCAACAACTATAACGACCAGTCTCAGGTAGAGAACTGTTGGTTGGGAGACAACACTGTGGCTCTGGCAGACCTATACACCCAGCATTCGGATGTGCGGAACATCTGGTACAGCTGGATCAAAGAAATTGTTGGCAATTACTCTGGTTAGTAATCCAATCCAAGTCCCGTCCCCTGGCGTCTTTCAGAACTAACAGAAACAGCTGATGGTCTGCGTATCGACACCGTCAAGCACGTTGAAAAGGATTTCTGGACTGGCTACACCCAAGCTGCTGGTGTTTATACCGTTGGCGAGGTATTAGATGGGGACCCGGCTTATACCTGCCCCTATCAGGGATATGTGGACGGTGTCCTGAATTATCCCATGTGAGTTCACCCTTTCATATACAGATTGATGTACTAACCAATCAGCTATTATCCCCTCCTGAGAGCGTTCGAATCGTCGAGTGGTAGCATGGGTGATCTTTACAATATGATCAACTCTGTGGCCTCGGATTGTAAAGACCCCACCGTGCTAGGAAGTTTCATTGAGAACCATGACAATCCTCGCTTCGCTAGGTAGGCCAATACTGACATAGGAAAGGAGAAGAGGCTAACTGTTGCAGCTATACCAAGGATATGTCCCAGGCCAAGGCTGTTATTAGCTATGTCATACTATCGGACGGAATCCCCATCATCTATTCTGGACAGGAGCAGCACTACTCTGGTGGAAATGACCCGTACAACCGCGAAGCTATCTGGTTGTCGGGTTACTCTACCACCTCAGAGCTGTATAAATTCATTGCCACCACGAACAAGATCCGTCAGCTCGCCATTTCAAAGGATTCAAGCTATCTTACTTCACGAGTATGTGTTCTGGCCAGACTCACACTGCAATACTAACCGGTATAGAACAATCCCTTCTACACTGATAGCAACACCATTGCAATGCGAAAGGGCTCCGGGGGCTCGCAGGTCATCACTGTACTTTCCAACTCTGGTTCCAACGGTGGATCGTACACGCTCAACTTGGGTAACAGCGGATACTCGTCTGGAGCCAATCTAGTGGAGGTGTACACCTGCTCGTCTGTCACGGTCGGTTCCGACGGCAAGATCCCCGTCCCCATGGCATCTGGTCTTCCCCGTGTCCTTGTTCCGGCATCTTGGATGTCCGGAAGTGGATTGTGCGGCAGCTCTTCCACCACTACCCTCGTCACCGCCACCACGACTCCAACTGGCAGCTCTTCCAGCACTACCCTCGCCACCGCCGTCACGACTCCAACTGGTAGCTGCAAAACTGCGACGACCGTTCCAGTGGTCCTTGAAGAGAGCGTGAGAACATCCTACGGCGAGAACATCTTCATCTCCGGCTCCATCCCTCAGCTCGGTAGCTGGAACCCGGATAAAGCAGTCGCTCTTTCTTCCAGCCAGTACACTTCGTCGAATCCTTTGTGGGCCGTCACTCTCGACCTCCCCGTGGGAACTTCGTTTGAATACAAATTCCTCAAGAAGGAGCAGAATGGTGGCGTCGCTTGGGAGAATGACCCTAACCGGTCTTACACTGTTCCCGAAGCGTGTGCCGGTACCTCCCAAAAGGTGGACAGCTCTTGGAGGTGA

该蛋白质具有67千道尔顿(kDa)的计算质量，并且与EC 3.2.1.1类中的其他蛋白质类似，能够水解α-连接的较大多糖(例如淀粉)的α-键。如对PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼)作为底物测量的，最佳pH为4.5，而在pH 3-7的宽范围内发现高酶活性。酶活性最佳的温度为66℃。

设计了pTrex3gM-AclAmy1载体以驱动来自其天然编码序列的AclAmy1的表达，该AclAmy1被置于强cbhI启动子的控制下。使用以下引物，采用PCR从棒曲霉染色体扩增编码AclAmy1的AclAmy1基因：

引物1(5’-ggggcggccgccaccATGAAGCTTCTAGCTTTGACAAC-3’)(SEQ ID NO:3)；以及

引物2(5'-cccggcgcgccttaTCACCTCCAAGAGCTGTCCAC-3')(SEQ ID NO:4)。

用限制酶NotI和AscI消化之后，将PCR产物克隆到pTrex3gM表达载体中(如在美国公开申请2011/0136197A1中所述)，用相同的限制酶消化，并将所得的质粒标记为pTrex3gM-AclAmy1。在图1中提供了pTrex3gM-AclAmy1的质粒图谱。在图1中还提供了质粒的功能元件的完整列表。

通过DNA测序确认AclAmy1基因的序列。

2.pENTRY-AclAmy1

为了构建表达载体pTrex8gM-AclAmyl1，根据供应商(生命技术公司(LifeTechnologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad CA))的建议，经由BP反应，首先将棒曲霉(A.clavatus)Amy1编码片段从质粒pTrex3gM-AclAmy1(如上所述)重新克隆到pDonor221载体中。所得的pEntry-AclAmy1质粒及其功能元件显示于图2中。

3.pTrex8gM-AclAmy1

编码棒曲霉α淀粉酶的ENTRY载体DNA片段经由LR反应进一步转移到pTREX8gM中，产生质粒pTREX8gM-AclAmy1(图3)。将pTrex8gM-AclAmy1的功能元件列于图3中。

通过对编码区进行测序来验证克隆。

B.异位表达的转化

1.原生质体制备

将木霉属菌株的孢子接种到50mL的YEG培养基(5g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖)中，并且在振摇培养箱(Infors-HT公司，瑞士)中，在28℃下以180rpm的速度在250mL摇瓶中生长过夜，移动距离(throw)为50mm。在一些实验中，使用具有cbh1、cbh2、egl1和egl2基因缺失的里氏木霉菌株RL-P37的衍生物，在一些其他实验中，使用其他里氏木霉菌株。任何合适的木霉属菌株将效劳于如本文披露的那些实验。

通过10min离心(3000g)收集发芽孢子，并用10mL的1.2MgSO₄、10mM磷酸钠(pH5.8)洗涤两次。将沉淀重新悬浮在补充有1.2g裂解酶(西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St Louis MO))的40mL相同缓冲液中。

将其在振摇培养箱中于28℃下孵育，以100-200rpm的速度振摇直至形成原生质体。

将悬浮液通过Miracloth过滤以除去菌丝体，并且将等体积的0.6M山梨糖醇、0.1MTris-HCl(pH 7.0)温和地添加到原生质体溶液的顶部。将其以4000rpm离心15min。

原生质体发现于中间相中，然后将其小心收集并转移到新管子中。根据需要重复该步骤，直到收集必需的原生质体。将等体积的1.2M山梨糖醇、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl(pH 7.5)添加到原生质体中。原生质体以4000rpm、在4℃下沉淀15min，并且在1.2M山梨糖醇、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl(pH 7.5)中洗涤两次。最后，将原生质体重新悬浮在相同的缓冲液中至浓度为1x 10⁸原生质体/mL，并且每200μL原生质体中添加50μL的25％PEG6000、50mM CaCl₂、10mM Tris-HCl(pH 7.5)。然后将所得材料储存在-80℃。

2.异位表达的转化

在一些实验中，将PCR产物直接用于转化原生质体。将约5-20μg的DNA(PCR产物)添加到200μL原生质体中，并且在冰上孵育20min。之后，将转化混合物转移至室温，并且添加2mL的25％PEG 6000、CaCl₂、10mM Tris-HCl(pH 7.5)和4mL的1.2M山梨糖醇、10mM CaCl₂、10mM Tris-HCl(pH 7.5)。

如果将限制酶介导的整合(REMI)应用于样品，那么将20个单位的限制性内切核酸酶添加到该样品的DNA中。

在一些其他实验中，将质粒DNA用于转化木霉属原生质体，并且在一些情况下，使用限制性内切核酸酶将质粒DNA线性化。在孵育消化混合物之后，质粒DNA未从限制性内切核酸酶纯化。

在一个实验中，使用以下引物获得PCR片段，该PCR片段涵盖来自质粒pTrex8gM-AclAmy1的从cbhI启动子穿过AclAmy1编码区至pyr2的3’部分的区域：

引物1：5’GAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTG(SEQ ID NO:5)；以及

引物2：3’CGATACACGCACCAGGTACCCCAGTGGGGAAGC(SEQ ID NO:6)。

不添加任何限制酶或者使用PacI限制酶，使用PcbhI-AclAmy1-pyr2 PCR产物来转化里氏木霉原生质体。在补充有10mM NH₄Cl的AmdS培养基上选择转化体的尿苷原养型。为了制作该培养基，将2X AmdS溶液(30g/L KH₂PO4、20mM乙酰胺、1.2g/L MgSO₄*7H₂O、1.2g/LCaCl₂*2H₂O、0.48g/L柠檬酸*H₂O、0.5g/L FeSO₄*7H₂O、40mg/L ZnSO₄*7H₂O、8mg/LCuSO₄.5H₂O、3.5mg/L MnSO₄.H₂O、2mg/L H₃BO₃(硼酸)、40g/L葡萄糖，pH 4.5)与等体积的含有2M山梨糖醇的4％琼脂混合。

木霉属转化的一个实例显示于图4A-4E中。图4A、4C和4D显示了在没有REMI的典型转化实验中里氏木霉转化体的图片和百分比—约10％-20％的转化体在形态上是稳定的。图4B和4E显示了在应用REMI的典型转化实验中里氏木霉转化体的图片和百分比-约80％-90％的转化体在形态上是稳定的

3.转化体选择

在葡萄糖/槐糖(sophorose)生产培养基中生长后，用来自英国梅格泽姆公司(Megazyme，UK)的α-淀粉酶活性试剂盒使用活性测定法分析发酵样品中棒曲霉α淀粉酶的表达水平(“Ceralpha方法”)。

平行地，通过SDS-PAGE分析(生命技术公司(Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad CA))来确认表达。

C.木霉属发酵和淀粉酶活性测定

将来自上述里氏木霉菌株RL-P37的衍生物的木霉属转化体接种在配置为从固体、多孔基质释放乳糖的24孔板中。每个孔含有1.25mL的NREL培养基(9g/L酪蛋白氨基酸、5g/L(NH₄)₂SO₄、4.5g/L KH₂PO4、1g/L MgSO₄*7H₂O、1g/L CaCl₂*2H₂O、33g/L PIPPS缓冲液(pH5.5)、0.25％里氏木霉微量元素(100％：175g/L柠檬酸(无水)、200g/L FeSO₄*7H₂O、16g/LZnSO₄*7H₂O、3.2g/L CuSO₄.5H₂O、1.4g/L MnSO₄.H₂O、0.8g/L H₃BO₃(硼酸)、16g/L葡萄糖)。使用Ceralpha方法(英国梅格泽姆公司(Megazyme，UK))分析澄清的上清液的α-淀粉酶活性。

用对硝基苯基α-D-麦芽庚糖苷、加上过量的α-葡糖苷酶和葡糖淀粉酶阻断Ceralpha，用于测量谷物、真菌和细菌α-淀粉酶。将澄清的上清液在36mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中稀释100-500倍(这取决于预期的α-淀粉酶活性)。

可替代地，将澄清的上清液在10mM NaCl、0.1mM CaCl₂、0.005％吐温80的溶液中稀释100-500倍(这将再次取决于预期的α-淀粉酶活性)。将四十(40)μL稀释的澄清的上清液与等体积的Ceralpha底物混合，并在28℃下孵育10min。通过添加100μL的200mM硼酸钠溶液(pH 10.2)来停止反应。在405nM下测量吸光度并将其针对稀释因子进行校正，并且表示为每分钟的α-淀粉酶活性。通过SDS-PAGE(生命技术公司(Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad CA))分析澄清的上清液。

图5显示了α-淀粉酶生产水平的差异。在活性PacI酶的存在下获得的稳定的木霉属iRNAxyn1,3转化体显示出更高的绝对α-淀粉酶活性水平和更高数量的具有升高的α-淀粉酶表达的稳定转化体。REMI增加了稳定转化体的百分比(与不稳定转化体相比)，并且稳定转化体也产生更高的α-淀粉酶滴度。

在限制酶SspI的存在下，使用另一种质粒pTrex8gM AGL2(表达α-半乳糖苷酶)，用里氏木霉iRNAxyn1,3的转化实验确认了这些结果。

一旦添加限制酶，不稳定转化体的背景就显著地下降，并且稳定的α-半乳糖苷酶产生转化体的百分比增加。

实例2：使用I-SCEI来改善在里氏木霉中的靶向整合

A.构建报告菌株来测量在里氏木霉中的I-SCEI活性

1.构建I-SceI着陆位点盒：方法

具有I-SceI着陆位点的质粒pBJP6被设计和构建如下，并且如图6所示。

分别使用引物GSP1和GSP2、PP1和PP2、GSP3和GSP4(表2)和本文下面的列表，从里氏木霉菌株QM6A的基因组DNA(可公开获得自各种来源，包括但不限于http://www.uniprot.org/taxonomy/431241)扩增5’UTR cbh2、Pcbh1和Tcbh2。使用Phusion DNA聚合酶(富酶泰斯公司(Fermentas))将PCR片段融合，并克隆到pBluescriptSK(+)的XbaI和KpnI限制位点以产生质粒pBJP4(图6)。

另外，构建另一个质粒pGFPrep以携带具有600-bp重叠的GFP序列(阴影线条区)的编码C末端截短的GFP(GFPn*或GFPΔC)的DNA片段(GFPn*-GFPc*构建体)和编码N-末端截短的GFP(GFPc*或ΔNGFP)的DNA片段。GFPn*-GFPc*构建体基于Ptilosarcus属物种的GFP序列设计，并从德国的Geneart公司合成订购。然后将GFPn*-GFPc*构建体克隆到在cbhI启动子和cbhI终止子之间的pBJP4的NdeI限制位点，得到质粒pBJP5。最终的pBJP6质粒通过用两个引物(FwpGAN-ISceIPmeI和RevpGAN-ISceIPmeI)从质粒扩增构巢曲霉的pyrG标记、并且将其克隆到pBJP5的PmeI位点(在GFPn*-GFPc*构建体的两个600-bp重叠的GFP序列之间)来获得。将引物设计为在PCR扩增期间在pyrG标记的下游和上游掺入I-SceI限制性位点和PmeI位点，产生携带侧翼有两个I-SceI位点的pyrG标记的PCR扩增片段。所得的质粒pBJP6含有如图6所示的5’UTR cbh2-Pcbh1-GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc*-Tcbh2构建体。通过限制性分析和测序来确认pBJP6质粒的序列。

在本实例中使用的引物序列提供如下并且还如表2所示。

GSP1(正向)5’-TCTAGAGGCTGTGCATTTCCGTTCTC-3’(SEQ ID NO:7)

GSP2(反向)5’-TGGTTACGGCAACAAACCTG-3’(SEQ ID NO:8)

PP1(正向)

5’-CAGGTTTGTTGCCGTAACCAATTTGCCTGCTTGACCGACTG-3’(SEQ ID NO:9)

PP2(反向)

5’-GGAACGATGGGTTTGCGTCCATATGGGGTAAGTCACTTACGGCAGC-3’(SEQ ID NO:10)

GSP3(正向)5’-CCATATGGACGCAAACCCATCGTTCC-3’(SEQ ID NO:11)

GSP4(反向)5’-GGTACCGGTTCACCGCCTTATGTGAG-3’(SEQ ID NO:12)

FwpGAN-ISceIPmel(正向)

5’-GGTTTAAACCTAGGGATAACAGGGTAATTCGCCCTTGCTCTAGATAAC-3’(SEQ ID NO:13)

RevpGAN-ISCELPmel(反向)

5’-GGTTTAAACCTAGGGATAACAGGGTAATAATTCGCCCTTGACTAGTGC-3’(SEQ ID NO:14)

GSP5(正向)5’-GCGATCGCACGCAAACCCATCGTTCC-3’(SEQ ID NO:15)

GPS6(反向)5’-GCGATCGCGGTTCACCGCCTTATGTGAG-3’(SEQ ID NO:16)

表2.在实例2中使用的引物。

2.设计标记切除方法来监测I-SceI活性：机制

为了监测里氏木霉中的大范围核酸酶I-SceI的活性，使用报告构建体pBJP6，并且在图8中描绘测定的方法。

如图7的顶部图解所描绘的，pBJP6包含5’UTR cbh2-Pcbh1-GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc*-Tcbh2构建体。包含5’UTR cbh2和Tcbh2，用于宿主细胞中cbh2基因座处的靶向整合。使用在选择标记pyrG侧翼的两个I-SceI识别位点(上面描绘有剪刀的灰色框)来监测I-SceI的活性。

该策略的基本原理是在含有GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc*构建体的里氏木霉菌株中活性I-SceI的表达将导致pyrG标记的切除和由GFP重复序列引起的双链断裂的修复(用阴影线框表示)。经由重复，完美修复将导致表达GFP的尿苷营养缺陷型菌株(pyrG-)(描绘于图7中)。

3.构建在cbh2基因座处具有I-SceI限制位点的里氏木霉菌株：结果

用引物GSP1和GSP4(在图6中所示的引物位置)PCR扩增pBJP6，并且将如上所述用于监测I-SceI活性的7.5kb PCR产物/盒(5’UTRcbh2-Pcbh1-GFPn*-I-SceI-pyrG-I-SceI-GFPc*-Tcbh2构建体)通过PEG介导的原生质体转化方法转化到里氏木霉菌株P37ΔcbhIpyrG^-26。

将尿苷原养型转化体纯化并通过DNA印迹分析其中整个盒整合在cbh2基因座处的转化体。基于初步诊断PCR(结果未显示)，选择9个转化体进行DNA印迹分析。三(3)个不同的探针用来选择单拷贝转化体并确认在cbh2基因座处将完整盒适当地整合到基因组中。

DNA印迹分析揭示了3个转化体，它们在cbh2基因座处具有单拷贝的完整I-SceI盒(JP7.7、JP7.9和JP7.12)(图8)。

剩余的6个转化体中，5个被显示为具有多个拷贝的整合的盒(JP7.10、JP7.11、JP7.13、JP7.14、JP7.15)，或看起来不具有整合到基因组中的完整盒(JP7.8)。

将转化体JP7.7用于后续实验。

B.构建I-SCEI表达构建体

1.I-SceI表达载体的构建

创建了I-SceI序列(基因库登记号GU 575293.1)的密码子优化的合成基因，用于在里氏木霉中的表达(Geneart公司，德国)。合成的I-sceI核苷酸序列如下面所示(SEQ IDNO:17)：

ATGAAGAACATCAAGAAGAACCAGGTCATGAACCTCGGCCCCAACAGCAAGCTCCTCAAGGAGTACAAGAGCCAGCTCATCGAGCTCAACATCGAGCAGTTCGAGGCCGGCATCGGCCTCATCCTCGGCGACGCCTACATCCGCAGCCGCGACGAGGGCAAGACCTACTGCATGCAGTTCGAGTGGAAGAACAAGGCCTACATGGACCACGTCTGCCTCCTCTACGACCAGTGGGTCCTCAGCCCCCCCCACAAGAAGGAGCGCGTCAACCACCTCGGCAACCTCGTCATCACCTGGGGCGCCCAGACCTTCAAGCACCAGGCCTTCAACAAGCTCGCCAACCTCTTCATCGTCAACAACAAGAAGACCATCCCCAACAACCTCGTCGAGAACTACCTCACCCCCATGAGCCTCGCCTACTGGTTCATGGACGACGGCGGCAAGTGGGACTACAACAAGAACAGCACCAACAAGAGCATCGTCCTCAACACCCAGAGCTTCACCTTCGAGGAGGTCGAGTACCTCGTCAAGGGCCTCCGCAACAAGTTCCAGCTCAACTGCTACGTCAAGATCAACAAGAACAAGCCCATCATCTACATCGACAGCATGAGCTACCTCATCTTCTACAACCTCATCAAGCCCTACCTCATCCCCCAGATGATGTACAAGCTCCCCAACACCATCAGCAGCGAGACCTTCCTCAAGTAA

为了构建I-SceI表达载体，根据供应商(美国生命技术公司(Life technologies，USA))的建议，经由Gateway重组将I-SceI基因克隆到已公开的专利申请US 20110020899中示例的端粒质粒pTTT中。使用cbhI基因的乳糖诱导型启动子来诱导pTTT质粒中I-SceI基因的表达。另外，pTTT质粒携带构巢曲霉的amdS选择标记，该标记允许使用乙酰胺作为氮源在里氏木霉中转化和选择

在所得的表达盒pTTT-I-SceI(图16)中，cbhI基因的乳糖诱导型启动子驱动I-SceI基因的表达。另外，pTTT质粒携带构巢曲霉的amdS选择标记，该标记允许使用乙酰胺作为氮源在里氏木霉中转化和选择。

2.里氏木霉中的I-SceI表达诱导在靶向染色体基因座处的DSB

将pTTT-I-SceI构建体用于转化含有着陆I-SceI位点的菌株以及不含着陆I-SceI位点的阴性对照菌株。转化后，将amdS阳性转化体在含有葡萄糖和乙酰胺作为氮源的基本培养基上纯化，并点接种于含有2％葡萄糖(非诱导条件)或2％乳糖(诱导条件)作为碳源的9cm培养皿中间。转化结果显示于图9中。

如在图9中所示，在表达I-SceI并含有I-SceI盒的菌株中通过乳糖诱导产生显示扇形形成的菌落。这些扇形用箭头示出，指向没有生长的区域。该扇区被解释为I-SceI活性产生双链断裂，该双链断裂经由GFP重复序列修复，该GFP重复序列导致pyrG标记的丢失。

作为丢失了pyrG标记的结果，这部分菌落将不再在没有尿苷的平板上生长，产生了扇形。如图9中所示，当乳糖用作碳源时，这些扇形大多存在，尽管在葡萄糖平板上也观察到扇形，表明即使在葡萄糖上也表达了一些I-SceI。

对于表达pTTT-ISceI的转化体但不是对照菌株观察到在乳糖上的扇区(图9)。当将尿苷添加到乳糖平板中时，不再有可见扇区，表明由于丢失pyrG标记引起了扇形(图9)。转化体在乳糖平板上的扇区表明酿酒酵母I-SceI在里氏木霉中表达并且有活性。

还在液体培养物中监测了重组。转化体在具有尿苷的基本培养基中的液体培养物中生长，并且由槐糖诱导I-SceI表达。所得转化体的显微镜观察显示于图10中。菌丝的荧光显微镜显示GFP荧光，表明作为环出的结果的功能性GFP的重构。在诱导后仅在含有I-SceI表达盒(JP7.7.12、JP7.7.14和JP7.7.16)的菌株中观察到GFP，结果进一步表明I-SceI在诱导时被积极表达(图10)。

C.葡糖淀粉酶的改善的转化和靶向整合效率

1.用于靶向整合的葡糖淀粉酶表达盒的构建

将如在美国专利号US 8138321中所述的、携带在cbhI启动子的控制下的里氏木霉的野生型葡糖淀粉酶基因的质粒ptrex6gGA/wt作为起始点，以构建可以整合在I-SceI着陆位点处的葡糖淀粉酶表达盒。

为了允许葡糖淀粉酶盒在I-SceI着陆位点处的同源整合，将cbh2终止子区(Tcbh2)克隆到ptrex6gGA/wt中(图11)。使用引物GSP5和GSP6(如表2中提供的)和QM6a的基因组DNA作为模板，通过PCR获得Tcbh2。

将PCR产物用AsiSI消化，并克隆到ptrex6gGA/wt的相同限制位点，以给出质粒pJP8。10-kb葡糖淀粉酶表达盒用PsiI从pJP8切出，并用于转化。经由赋予氯嘧磺隆乙酯抗性的alS标记选择转化体。

2.在I-SceI表达下靶向整合的转化频率、稳定性和效率

为了确定由I-SceI介导的DSB(双链断裂)是否可以增加在里氏木霉中的转化和重组效率，转化葡糖淀粉酶表达盒，用于作为线性片段靶向整合到携带I-SceI限制位点和I-SceI表达盒(JP7.7.12)的菌株中。

将转化体涂板在选择培养基中，该选择培养基含有氯嘧磺隆乙酯底物并含有葡萄糖(I-SceI非诱导条件)或含有乳糖和葡萄糖(I-SceI诱导条件)的混合物。作为阴性对照，还用相同量的线性质粒转化仅携带I-SceI限制位点而不携带I-SceI表达盒(JP7.7)的菌株。接下来，分析在每组转化中获得的转化体的稳定性。转化结果和稳定性分析结果显示于表3和图12中。

表3.I-SceI诱导对转化体数目和稳定性的影响

^a在分别称为I-SceI的诱导和非诱导型表达的含有1％乳糖和1％葡萄糖的转化平板(TrMMsorb+尿苷+氯嘧磺隆乙酯)上的初级转化体的数量。使用亲本菌株JP7.7使用转化培养基进行对照转化。

^b在TrMM+尿苷+氯嘧磺隆乙酯上纯化初级转化体。转化体的稳定性是由它们在双重纯化后在选择性TrMM中生长的能力来定义的。稳定转化体在这些选择平板上生长良好。失败的转化体(不稳定的)不生长。

^c在基于微量滴定的生长/活性测定中测试稳定转化体的葡糖淀粉酶活性。显示高于背景的Gla活性的转化体被认为是Gla阳性转化体。

^d通过在具有尿苷的TrMM上或不含尿苷的TrMM上接种每种转化体的孢子来测试Gla阳性转化体的pyrG表型。当在TrMM+尿苷上生长，但是在没有尿苷的TrMM上不生长时，菌株被认为是pyrG减(尿苷营养缺陷型)。

^eGlaA表达和pyrG减菌株通过DNA印迹进行分析，并确认了指示glaA表达盒在I-SceI着陆位点处同源整合的整合模式。

在表3和图12中的结果显示，分别与非诱导条件和对照相比，I-SceI诱导增加转化体的数量超过三倍和六倍(表3)。另外，在I-SceI诱导后几乎所有的JP7.7.12转化体都是稳定的(90％)，而没有I-SceI诱导的情况下只有44％的JP7.7.12转化体是稳定的，并且只有53％或58％的阴性对照菌株JP7.7的转化体(无I-SceI表达盒)是稳定的(表3)。这表明I-SceI的表达增加了转化效率，并还增加了转化体的稳定性。

通过在如上述实例中描述的24孔从多孔基质中缓慢释放乳糖的MTP中的NREL培养基上生长纯化的转化体，从每组中筛选约40个稳定转化体。在I-SceI诱导条件下约55％的转化体表达葡糖淀粉酶，而与之相对，非诱导I-SceI条件和对照下分别为37％和30％。

随后分析了表达葡糖淀粉酶的转化体的pyrG表型。经由双交叉，葡糖淀粉酶表达盒在预期的基因座处的靶向整合预期将导致氯嘧磺隆乙酯抗性(alS+)和pyrG标记的损失，产生尿苷营养缺陷型(图11)。

如表3中所示，当I-SceI被诱导时，68％的表达葡糖淀粉酶的转化体以靶向方式整合，与之相对，在非诱导的I-SceI和对照中分别仅为46％和16％。

所选择的表达葡糖淀粉酶的pyrG减转化体的DNA印迹分析显示它们如所预期地，在I-SceI着陆位点处含有GlaA表达盒(图13)。不表达葡糖淀粉酶或表达葡糖淀粉酶而不是pyrG减的菌株显示出改变的整合模式(图13)。

3.在靶向与非靶向整合之间葡糖淀粉酶表达的比较

为了将具有靶向整合的葡糖淀粉酶表达盒的转化体的葡糖淀粉酶活性的变异性与来源于随机整合的那些进行比较，将菌株在微量滴定板中生长，并测试培养基的葡糖淀粉酶活性。

将每种转化体在三个微量滴定板孔中单独生长，并测定该生物一式三份的平均葡糖淀粉酶活性，并且给出高度可重复的结果，标准偏差<10％。

如在图14中所示，与葡糖淀粉酶盒的非靶向整合的表达相比，具有葡糖淀粉酶盒的靶向整合的转化体显示了更少的葡糖淀粉酶表达的变异性(在0.9和1.35之间的相对单位的葡糖淀粉酶活性)(图14)。显然，表达盒的非靶向整合产生了转化体之间GA活性水平的显著变化。

总之，该数据表明由I-SceI产生的双链断裂刺激了含有感兴趣的基因的盒的靶向整合，并增加了转化体之间蛋白质表达的均一性。

D.通过将I-SCEI直接添加到原生质体混合物中产生DSB之后，葡糖淀粉酶表达盒的改善的转化和靶向整合

1.经由I-SceI添加的靶向整合

还已经通过将I-SceI限制酶直接添加到携带I-SceI限制位点的原生质体(JP7.7)与线性化葡糖淀粉酶靶向整合的盒(pJP8)的混合物中来测试由I-SceI介导的靶向整合。

简言之，向200μL的JP7.7原生质体中添加不同量的I-SceI酶加线性化pJP8盒，并在室温下孵育15分钟，接着在冰上孵育20分钟。从赛默科技公司(Thermo scientific)获得I-SceI。通过向原生质体添加I-SceI和DNA混合物、1X终浓度的酶缓冲液(例如，采用270μL总体积的原始质体、I-SceI和DNA混合物，添加30μL的10X酶缓冲液)，通过PEG介导的原生质体方法进行转化。在孵育35min后，将原生质体混合物涂板在含有10μM尿苷和5μg/ml氯嘧磺隆乙酯的转化平板上。结果总结在表4中：

表4.I-SceI添加对转化效率和靶向整合的影响。

^a转化平板(trMMsorb+尿苷+氯嘧磺隆乙酯)上的初级转化体的数量。显示了对于相同的原生质体批次，能够比较效率的初级转化体的数量。显示典型实验的结果。

^b在trMM+尿苷+氯嘧磺隆乙酯上纯化初级转化体。稳定转化体在这些平板上生长良好。

失败的转化体(不稳定的)不生长。

^c在基于微量滴定的生长/活性测定中测试稳定转化体的葡糖淀粉酶活性。

显示高于背景的Gla活性的转化体被认为是Gla阳性转化体。

^f将转化体直接涂板在含有尿苷、氯嘧磺隆乙酯培养基和0.8mg/ml 5’氟-乳清酸(5’FOA)的trMM-Sorb上。在含有尿苷和Als底物培养基的trMM上将菌落纯化一次。

如表4所示，I-SceI酶的直接添加增加了转化频率和靶向整合转化体的数量。当将100个单位的I-SceI添加到原生质体中时，获得的转化体数量增加了3倍。

当添加I-SceI时，发现大量的初级转化体是稳定的。

转化体的数量和稳定转化体的百分比两者随着I-SceI浓度的增加而增加。在I-SceI存在下，约75％的转化体含有Gla表达盒，而在I-SceI不存在下，只有约25％的转化体显示葡糖淀粉酶活性。

在表达葡糖淀粉酶的大多数转化体中，表达盒经由同源重组事件整合(当分别添加50个单位和100个单位的I-SceI时分析了78％和85％的转化体)。来自对照转化(不添加I-SceI)的表达葡糖淀粉酶的转化体都不是靶向整合的(表4)。

通过在转化平板中将I-SceI添加与0.8mg/mL的FOA组合，我们能够直接选择靶向的整合转化体(表4)。在FOA抗性转化体纯化之后，所有测试的稳定转化体表达葡糖淀粉酶，并且葡糖淀粉酶表达盒经由同源重组在cbh2基因座处适当整合(图9)。

2.使用I-SceI表达比较靶向与非靶向整合，葡糖淀粉酶表达的遗传特征和比较

如图15所示，与随机转化体的表达相比，从添加I-SceI获得的具有葡糖淀粉酶盒的靶向整合的转化体直接显示更少的葡糖淀粉酶表达的变异性。通过使用FOA选择获得的转化体也显示出相似的表达模式，表明FOA的选择和FOA的可能突变效应不影响葡糖淀粉酶的表达水平。

实例3：使用REMI构建其他稳定的里氏木霉菌株

A.具有两个不同DNA片段的里氏木霉的转化

构建两个不同的线性DNA片段以表达另一种感兴趣的蛋白质，并通过共转化将这些DNA片段引入里氏木霉中。一个片段具有pyr2基因作为可选择标记，另一个片段具有amdS基因作为可选择标记。不用任何限制酶或用限制酶SwaI或PacI进行转化。由于两种标记的存在，同时选择转化体。进行几个转化以确定与不添加限制酶相比在转化期间包含多个量的不同限制酶的影响。以下是显示获得的转化体的数量和稳定的％的结果的总结。

表5.用两种不同线性DNA片段进行里氏木霉共转化的结果。

B.用多种限制酶处理的里氏木霉的转化

为了看到使用多种限制酶对转化效率和转化体的稳定性的影响，用含有裂解纤维素单加氧酶(EG4)编码序列和pyr2可选择标记的PCR片段转化里氏木霉菌株，该菌株未用任何限制酶处理、仅用20个单位的AsiSI处理、用AsiSI、PacI和SwaI中每一种的7个单位处理、或者用AsiSI、PacI和PmeI中每一种的7个单位处理。根据如在上文所述的标准PEG方案进行转化，并将转化体在含有1M山梨糖醇的基本培养基平板上生长。结果显示于图17A和17B中。通过相同总量的限制酶消化，与仅用一种限制酶(50％)消化相比，用三种不同酶消化增加了稳定的里氏木霉转化体的百分比(至80％)，尽管它似乎降低转化效率。

虽然前述组合物和方法已经通过说明和实例的方式出于清楚理解的目的在一些细节方面进行了描述，但是对于本领域的普通技术人员而言根据本文的传授内容显而易见的是可以对其进行某些改变和修改而不偏离所附权利要求的精神或范围。

因此，前面仅仅举例说明了本发明组合物和方法的原理。将了解的是本领域技术人员将能够设计不同的安排，这些不同的安排虽然没有在此明确地描述或显示，但体现本发明组合物和方法的原理并且被包括在其精神和范围之内。此外，本文叙述的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解诸位发明人所贡献的本发明的组合物和方法的原理和概念以推动本领域发展，并且将被视为而不限于这些具体叙述的实例和条件。此外，本文中叙述本发明组合物和方法的原理、方面、以及实施例的所有陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能等效物两者。另外，预期此类等效物包括当前已知的等效物以及将来开发的等效物两者，即不论结构如何而执行相同功能的任何开发的要素。因此，本发明的组合物和方法的范围不是旨在受限于本文显示和描述的示例性实施例。

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Claims

1.一种构建遗传稳定的、转化的木霉属菌株的方法，该方法包括：

a)使用线性化或环状DNA和限制酶的混合物转化木霉属细胞，其中该限制酶能够在该木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；以及

b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用该限制酶处理的稳定转化体的百分比高于不用该限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

2.一种构建遗传稳定的、转化的木霉属菌株的方法，该方法包括：

a)用线性化或环状DNA转化木霉属细胞，其中该木霉属细胞被诱导以产生限制酶，其中该限制酶能够在该木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)；以及

b)选择在a)中产生的遗传稳定的、转化的木霉属菌株，其中用该限制酶诱导的稳定转化体的百分比高于不用该限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中用该限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比高于不用该限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

4.如权利要求3所述的方法，其中用该限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比高于不用该限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍或6倍。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用该限制酶处理或诱导的稳定转化体的百分比为至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用该限制酶处理或诱导的转化效率比不用该限制酶处理或诱导的转化效率高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该限制酶识别至少8个碱基对的限制位点。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该限制酶识别至少12个碱基对的限制位点。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该限制酶是大范围核酸酶。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该限制酶是LAGLIDADG归巢大范围核酸酶。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该限制酶选自下组，该组由以下各项组成：I-SceI、I-CreI、I-MsoI、I-AniI、I-DmiI、和PI-PfuI。

12.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中该限制酶是锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或RNA引导的内切核酸酶。

13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该限制酶能够在转化的木霉属细胞的染色体DNA中产生相容的粘性末端。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用线性化DNA转化该木霉属细胞。

15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中用环状DNA转化该木霉属细胞。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该线性化或环状DNA包含一种或多种感兴趣的基因。

17.如权利要求16所述的方法，其中该感兴趣的基因编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其变体、其功能片段或其两种或更多种的混合物。

18.如权利要求16所述的方法，其中该感兴趣的基因编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的混合物。

19.如权利要求16所述的方法，其中该线性化或环状DNA进一步包含选择标记。

20.如权利要求19所述的方法，其中该选择标记是als1、amdS、hygR、pyr2、pyr4、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟菌素抗性标记、吡啶硫胺抗性标记、氯嘧磺隆乙酯抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因、或胸苷激酶标记。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该方法不包括使用与木霉属基因组序列同源的DNA或RNA序列。

22.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中该方法包括使用与木霉属基因组序列同源的DNA或RNA序列。

23.如权利要求22所述的方法，其中该方法包括使用与木霉属基因组序列同源的DNA序列，该DNA序列在由限制酶切割的位点处通过同源重组与木霉属染色体DNA重组。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该木霉属菌株是里氏木霉菌株。

25.一种使用如前述权利要求中任一项所述的方法获得的遗传稳定的、转化的木霉属菌株。

26.如权利要求25所述的木霉属菌株，该木霉属菌株包含一种或多种感兴趣的基因。

27.如权利要求26所述的木霉属菌株，其中该感兴趣的基因编码半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的混合物。

28.如权利要求26所述的木霉属菌株，其中该感兴趣的基因编码肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原、其变体、其功能片段、或其两种或更多种的混合物。

29.如权利要求25-28中任一项所述的木霉属菌株，其中该木霉属菌株是里氏木霉菌株。

30.一种改善木霉属转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化或环状DNA和限制酶的混合物转化木霉属细胞，其中该限制酶能够在该木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)，并且其中用该限制酶处理所得到的稳定转化体的百分比高于不用该限制酶处理可获得的稳定转化体的百分比。

31.一种改善木霉属转化体的稳定性的方法，该方法包括使用线性化或环状DNA转化木霉属细胞，其中该木霉属细胞被诱导以生产能够在该木霉属细胞的染色体DNA中产生双链断裂(DSB)的限制酶，并且其中用该限制酶诱导所得到的稳定转化体的百分比高于不用该限制酶诱导可获得的稳定转化体的百分比。

32.如权利要求31所述的方法，该方法进一步包括将构建体导入木霉属细胞中，该构建体在转化步骤之前一经诱导即能生产该限制酶。

33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，该方法进一步包括选择遗传稳定的木霉属转化体。

34.一种表达感兴趣的蛋白质的方法，该方法包括：

a)使用如权利要求26所述的木霉属菌株，其中该感兴趣的基因编码该感兴趣的蛋白质；以及

b)从该木霉属菌株生产该感兴趣的蛋白质。

35.如权利要求34所述的方法，其中该感兴趣的蛋白质是分泌性蛋白。

36.一种感兴趣的蛋白质，该蛋白质通过应用如权利要求1-24或30-35所述的方法生产。

37.一种组合物，该组合物包含如权利要求36所述的感兴趣的蛋白质。

38.如权利要求37所述的组合物在木质纤维素生物质底物的水解、在清洁应用、谷物和淀粉加工、动物营养、食品组合物或纺织品处理中的用途。