CN102939382A - 丝状真菌宿主菌株和dna构建体以及它们的使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及丝状真菌宿主菌株和用于其产生和使用的重组DNA构建体。所述丝状真菌宿主菌株特别可用于实现重组酶和变体的可靠表达。

Description

丝状真菌宿主菌株和DNA构建体以及它们的使用方法
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2010年6月3日提交的美国临时申请61/351,286的优先权，所述美国临时申请的公开内容以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及丝状真菌宿主菌株和用于其产生和使用的重组DNA构建体。丝状真菌宿主菌株特别可用于以可靠或较不可变的方式表达目的蛋白质，且用于有效筛选编码重组蛋白的DNA文库。
背景技术
丝状真菌宿主细胞菌株已被工程改造为表达各种蛋白质。随后，任选在纯化后，这些蛋白质可以用于各种工业、学术或其他应用中。表达过程通常会是无法预测的。仅极少数(如果有的话)所制备的转化体实际上产生目的酶，这并非罕见情况。异源基因(例如非天然基因，或以与天然形式不同的形式存在的天然基因)的表达的可变性可由于与其核酸和/或氨基酸序列无关的因素而出现。例如，非同源整合在丝状真菌中占优势。因此，表达载体随机整合到基因组内，可能导致对转化体间表达水平的位置效应。此外，可能生成不稳定转化体，使得有必要对转化体进行进一步筛选，以获得稳定转化体。可变性还可通过由于多核原生质体的转化所导致的异核体的生成而出现。因此，以减低的可变性生产目的酶的可靠方法具有明确优点。
对于某些工业应用，由真菌宿主菌株生产的这些蛋白质通常被工程改造的，以获得新的期望特征或不同水平的某些特征。在这些情况下，通常使用现有丝状真菌宿主细胞菌株来筛选编码变体蛋白质的DNA文库。表达效力和/或水平的可变性使得难以将给定变体的特征与另一变体的特征进行比较。因此，如果变体可以被可靠地表达(如果它们可以由特定宿主细胞表达的话)，并且如果变体可以以较不可变的水平表达而使得它们的特征可以更容易地评估和比较，则明确存在特定的优点。
虽然端粒的、染色体外的复制载体可以用作基因组整合的替代物，但这种方法并不消除转化体之间的表达水平的可变性。因此，若有手段来减少丝状真菌宿主菌株基因表达中的序列依赖性差异，将给本领域带来好处。
发明内容
本发明涉及丝状真菌宿主菌株和用于其产生和使用的重组DNA构建体。丝状真菌宿主菌株能可靠地产生转化体且表达酶，其中表达水平的可变性减低。丝状真菌宿主菌株可用于有效筛选编码重组蛋白的DNA文库。
特别地，本发明提供丝状真菌宿主细胞表达系统，其包含：a)真菌宿主细胞，所述真菌宿主细胞在其染色体DNA中含有非同源重组(NHR)途径的一个或多个组分的破坏、缺乏第一可选择功能的第一可选择标记的部分、和可有效赋予第二可选择功能的第二可选择标记；和b)核酸分子，所述核酸分子含有当被引入该真菌宿主细胞中时给该第一可选择标记赋予第一可选择功能的序列、可有效表达一种或多种目的基因或变体目的基因的序列、和与侧接染色体可选择标记的序列具有实质同源性的序列；其中所述同源序列引起同源重组事件，所述同源重组事件导致有功能的第一可选择标记、导致第二可选择标记的去除和导致目的基因或变体目的基因的表达。在一些实施方案中，NHR途径的一个或多个组分包括ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4和xrs2中的一者或多者。在某些实施方案中，在b)中引入真菌宿主细胞中的核酸分子可以是非天然的分子或者以对于真菌宿主细胞非天然的形式存在的天然分子。
基因缺失可以通过使用缺失质粒来实现。例如，可以将待缺失或破坏的所需基因插入质粒中。然后在适当的限制性酶位点(在所需的基因编码区的内部)切割该缺失质粒，并且用可选择标记替换基因编码序列或其部分。来自待缺失或破坏的基因的基因座的侧翼DNA序列(优选在约0.5至2.0kb之间)保留在可选择标记基因的任一侧上。合适的缺失质粒将通常具有存在于其中的独特限制性酶位点，以使得含有该缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和可选择标记基因能够作为单一线性小片被去除。缺失质粒还可以通过使用PCR扩增所需侧翼区和可选择标记来构建，在扩增的片段的末端具有限制性酶位点以促进片段的连接。作为另外一种选择，可通过指定适当的侧翼DNA和可选择标记序列来从头合成缺失质粒。
在一些实施方案中，所述第一和第二可选择标记是不同的标记。在一些实施方案中，所述第一和第二可选择标记独立地选自alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟素抗性标记、吡啶硫胺素抗性标记、氯嘧磺隆抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因和胸苷激酶。在一些实施方案中，所述同源序列中的至少一个在pyr2序列的上游或下游。在一些实施方案中，所述同源序列在pyr2序列的上游和下游。在其他实施方案中，所述同源序列包含可有效表达一种或多种目的基因或一种或多种变体目的基因的序列和对第一可选择标记赋予第一可选择功能的序列。在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞是选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)和裸孢壳属(Emericella)的属中的种。在一些实施方案中，木霉是里氏木霉(T.reesei)，而在其他实施方案中，曲霉是黑曲霉(A.niger)。、
本发明提供丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因或变体目的基因选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶(cutinase)、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶及其混合物。目的基因或变体基因的非限制性例子编码：涉及淀粉代谢的蛋白质或酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶(pectinolytic enzyme)、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖：O2-氧化还原酶，EC 1.1.3.5)、其变体及其组合。在一些实施方案中，目的基因或变体目的基因编码选自下述的多肽：肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子和微生物抗原(例如HBV表面抗原、HPV E7等)及其变体(例如片段)。
此外，本发明提供在丝状真菌宿主细胞中表达目的基因或变体目的基因的方法，所述方法包括：将对第一可选择标记赋予第一可选择功能的核酸分子引入丝状真菌宿主细胞中，所述核酸分子可以是非天然或天然(但以非天然形式存在)分子；使宿主细胞生长；以及选择具有第一可选择功能但缺乏第二可选择功能的宿主细胞。在一些实施方案中，如此实现的表达比使用本领域的常规方法实现的那些表达更可靠。在一些实施方案中，所述方法进一步包括测定目的基因或变体目的基因的表达，和/或测定由目的基因或由变体目的基因编码的多肽的生物化学功能。
本文引用的所有专利、专利申请、文献、核苷酸和蛋白质序列数据库登记号和文章以引用方式整体并入本文。
附图说明
下述的图和表意欲举例说明而不是限制本文公开说明书或权利要求的范围和内容。
图1提供了示出从quad缺失衍生菌株衍生MAD6宿主菌株的示意图。
图2提供了里氏木霉ku80缺失盒的示意图。
图3提供了用于制备Archy2菌株的pyr2缺失盒的示意图。
图4提供了用于制备Archy3菌株的hygR缺失盒的示意图。
图5提供了里氏木霉bgl1缺失盒的示意图。
图6提供了里氏木霉egl3缺失盒的示意图。
图7提供了用于表达cre重组酶的里氏木霉端粒质粒载体的示意图。
图8示出了由于目的基因或变体目的基因(GOI)盒的多核苷酸的引入，pyr2可选择标记的失活和amdS可选择标记的活化，其中在这个实例中GOI编码CBH2变体。
图9示出了如实施例2中所述的pENTR/D-TOPO载体。
图10示出了如实施例2中所述的pTrex3gM载体。
图11示出了如实施例2中所述的Fv43B表达载体pTrex3gM-Fv43B，。
图12示出了如实施例2中所述的Fv43C表达载体pTrex3gM-Fv43C，。
图13是表征使用由fv43B转化的里氏木霉quad缺失克隆所表达的Fv43B的SDS-PAGE照片。相对于总蛋白质的蛋白质百分比依照实施例2进行定量测定，并且在相应泳道下方列出。
图14是表征使用由fv43C转化的里氏木霉quad缺失克隆所表达的Fv43C的SDS-PAGE照片。相对于加载的总蛋白质的蛋白质百分比依照实施例2进行定量测定，并且在相应泳道下方列出。
图15是表征使用MAD6构建体所表达的Fv43B和Fv43C的SDS-PAGE照片。相对于总蛋白质的蛋白质百分比依照实施例2进行定量测定，并且在相应泳道下方列出。
图16A是如实施例3中所述检查CBH2变体的4个SDS-PAGE照片。
图16B示出如实施例3中所述的CBH2变体的平均表达。
具体实施方式
本发明涉及丝状真菌宿主菌株和用于其产生和使用的重组DNA构建体。与本领域已知的其他表达方法相比较，丝状真菌宿主菌株可以用于以更高的可靠性和/或更低的表达水平可变性提供目的基因或变体在这些宿主中的表达。在一个具体的实施方案中，丝状真菌宿主菌株可用于有效筛选编码重组蛋白的DNA文库。
本文描述的方法以改善的可靠性表达目的蛋白质或目的变体。在这个意义上，术语“改善的可靠性”反映在(1)至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的转化体是稳定转化体；或者至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％)的转化体如所意图以超过本底表达水平表达目的蛋白或变体；和(2)目的蛋白或变体以变化小于60％(例如小于55％、小于50％、小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于2％)的表达水平表达，其中术语“表达水平变化”定义为最高和最低表达水平之间的差值除以最高表达水平和本底表达水平之间的差值，所述表达水平都用相同构建体和相同目的基因或变体来测定。
应当了解，前述一般描述和以下详细描述都仅是示例性和解释性的，并不限制本文所述的组合物和方法。在本专利申请中，除非另有特别说明，否则所用的单数包括复数。除非另有说明，否则所用的“或”意指“和/或”。同样，术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”并非意图进行限制。本文提及的所有专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的所有氨基酸和核苷酸序列明确地以引用方式并入。本文提供的标题并不对本发明的各个方面或实施方案构成限制，可通过参考整篇说明书了解本发明的各个方面或实施例。因此，通过参考整篇说明书，本文的术语得到更全面的定义。
除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人，DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(微生物学和分子生物学词典)，第2版，纽约州的约翰威立父子出版公司(John Wiley and Sons，NewYork)(1994年)，和Hale&Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARYOF BIOLOGY(哈珀柯林斯生物学辞典)，纽约州的Harper Perennial，(1991年)为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般词典。虽然任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明，但描述的是优选的方法和材料。数值范围包括限定该范围的数值。除非另有说明，否则分别地，核酸从左至右以5′至3′方向书写；氨基酸序列从左至右以氨基至羧基方向书写。关于本领域定义和术语，从业者可具体参考Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(分子克隆实验指南)(第二版)，纽约州普莱恩维尔市的冷泉港出版社(ColdSpring Harbor Press，Plainview，N.Y.)，1989年，和Ausubel FM等人，CurrentProtocols in Molecular Biology(分子生物学实验手册)，纽约州纽约市的约翰&威立父子出版公司，1993年。应当了解，本公开内容不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为它们可变化。
1.定义
以下术语通过参考整篇说明书得到更全面的定义。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基的单链构成的化合物或分子。如本文所用，术语“蛋白质”可与术语“多肽”同义。
“变体”意指通过向C和N末端的任一者或二者添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列中的一个位点或多个不同位点处置换一个或多个氨基酸、或在蛋白质的任一或两个末端处或在氨基酸序列中的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸而从前体蛋白质(例如天然蛋白质)衍生的蛋白质。目的蛋白(例如由“目的基因”编码的)的变体或“目的变体”(例如由“变体目的基因”编码的)的制备可以通过本领域已知的任何手段进行。例如，通过以下方式制备目的变体：修饰编码天然蛋白质的DNA序列(例如目的基因)，将经修饰的DNA序列转化到合适宿主中，并表达经修饰的DNA序列以形成目的变体。在一个非限制性实例中，目的纤维素酶的变体可以通过本领域已知的任何手段进行。例如，通过以下方式制备纤维素酶变体：修饰编码其天然的(或天然存在的)相对物(counterpart)的DNA序列，将经修饰的DNA序列转化到合适宿主中，并表达经修饰的DNA序列以形成变体纤维素酶。本发明的变体目的酶包括这样的多肽：与天然目的酶的氨基酸序列相比较，所述多肽包含改变的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体目的酶可保留天然目的酶的一些特征，但同时具有某些相对于天然目的酶而言改变的特征。例如，本发明的变体纤维素酶包括这样的肽：与前体酶氨基酸序列相比较，所述肽包含改变的氨基酸序列，其中所述变体纤维素酶保留前体酶的特征性纤维素分解性质，但在某个具体方面可以具有改变的特性。例如，变体纤维素酶可以具有增加的最适pH或增加的温度或氧化稳定性或者减低的与非纤维素材料的亲和力或结合，但将保留其特征性纤维素分解活性。
在一个非限制性实例中，设想到根据本发明的目的变体可以衍生自编码变体的核苷酸序列，其中所表达的变体的功能活性得到保留。例如，纤维素酶变体可以衍生自编码纤维素酶变体的DNA片段，其中所表达的变体的纤维素酶活性得到保留。在一些实施方案中，编码纤维素酶的DNA片段可进一步包括在5′端或3′端附着至纤维素酶DNA序列的编码铰链或接头的DNA序列或其部分，其中所编码的纤维素酶结构域的功能活性得到保留。术语“变体”和“衍生物”在本文中可互换使用。
“等价残基”可以通过测定前体或参考酶的三级结构水平上的同源性进行定义，所述前体或参考酶的三级结构已通过X射线晶体学进行测定。例如，等价残基定义为这样的残基：在比对后，纤维素酶和红褐肉座菌(Hypocreajecorina)CBH2的特定氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子坐标(N对N，CA对CA，C对C和O对O)相差在0.13nm内且优选在0.1nm内。比对是在使最佳模型定向和定位以给出所讨论的酶和前体/参考酶的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大限度重叠后实现的。例如，合适的模型包括对在可获得的最高分辨率下的实验衍射数据给出最低R因子的晶体学模型。参见例如，美国专利申请No.2006/0205042。
与前体或参考酶的特定残基功能上类似的等价残基定义为那些可呈这样的构象的残基，该构象使得它们改变、修饰或促成酶的结构、底物结合或以预定方式进行的催化。例如，红褐肉座菌CBH2的等价残基是纤维素酶的那些呈这样的构象的氨基酸，该构象使得它们改变、修饰或促成蛋白质结构、底物结合或以限定方式进行的催化。在一些实施方案中，等价残基可以是那些占据类似位置达这样的程度的残基：尽管给定残基的主链原子可能不满足在占据同源位置的基础上的等价标准，但残基的超过一个(例如2、3个或更多个)侧链原子的原子坐标与前体/参考酶的相应侧链原子相差在短距离内(例如在约0.02nm内、在约0.05nm内、在约0.08nm内、在约0.10nm内、在约0.12nm内、在约0.13nm内、在约0.14nm内、在约0.15nm内、在约0.17nm内、在约0.18nm内、在约0.20nm内、在约0.25nm内等)。例如，已通过X射线晶体学获得三级结构的纤维素酶可以适当地包含等价残基，其中残基的至少两个侧链原子的原子坐标与红褐肉座菌CBH2的相应侧链原子相差在0.13nm内，即使给定残基的主链原子不满足在占据同源位置的基础上的等价标准。红褐肉座菌CBH2的晶体结构显示于Zou等人(1999)Structure(结构)7(9)：1035-45中。
术语“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，由于遗传密码的简并性，可以产生多个编码给定蛋白质和/或其变体的核苷酸序列。本发明设想了编码变体目的酶的每种可能的变体核苷酸序列，考虑到遗传密码的简并性，所有这些变体核苷酸序列都是可能的。例如，由于遗传密码的简并性，多个核苷酸序列可以编码纤维素酶例如CBH2和/或其变体，其可以通过本文描述的方法或过程产生。
“异源”核酸构建体或序列具有对于它在其中表达的细胞而言并非天然的或并非以天然形式存在的序列部分。就控制序列而言的异源是指这样的控制序列(即启动子或增强子)，对于其目前调节表达的同一基因，在自然界中其是不起到这个调节作用的。一般来讲，异源核酸序列对其所在的细胞或基因组部分不是内源的，而是已通过感染、转染、转化、微注射、电穿孔等添加至细胞。“异源”核酸构建体可含有与天然细胞中发现的控制序列/DNA编码序列组合相同或不同的控制序列/DNA编码序列组合。
如本文所用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指能够将异源DNA片段掺入外来细胞中并在该细胞中表达异源DNA片段的载体。许多原核和真核表达载体是可商购获得的。适当表达载体的选择在本领域技术人员的知识范围之内。
因此，“表达盒”或“表达载体”是通过重组或合成方式生成的核酸构建体，其具有一系列能让特定核酸在靶细胞中转录的指定核酸元件。可将重组表达盒掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子等序列。
如本文所用，术语“质粒”是指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，并且其在许多细菌和一些真核生物中形成染色体外自我复制遗传元件。
如本文所用，术语“编码可选择标记的核苷酸序列”是指能够在细胞中表达的核苷酸序列，并且可选择标记的表达使得含有所表达基因的细胞能够在相应选择性试剂存在下或在相应选择性生长条件下生长。
如本文所用，术语“启动子”是指起到指导下游基因转录的作用的核酸序列。启动子一般将适于靶基因在其中被表达的宿主细胞。启动子连同其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)通常用于表达给定基因。一般来讲，转录和翻译调控核酸序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活序列。
如本文所定义，“嵌合基因构建体”是指可由不同基因的部分(包括调控元件)构成的非天然基因(即已被引入到宿主中的基因或不以其在宿主中的天然形式存在的基因)。用于转化宿主细胞的嵌合基因构建体通常由这样的转录调控区(启动子)组成，所述转录调控区有效连接至蛋白编码序列，或者，在可选择标记嵌合基因中，其有效连接至编码例如给被转化的细胞赋予抗生素抗性的蛋白质的可选择标记基因。用于转化到宿主细胞中的本发明典型嵌合基因包含组成型或诱导型转录调控区、蛋白编码序列和终止子序列。如果期望分泌靶蛋白，则嵌合基因构建体还可包含编码信号肽的第二DNA序列。例如，本文描述的某些构建体，例如Archy 3里氏木霉菌株是嵌合基因构建体。
核酸当被置于与另一核酸序列发生功能关系时，该核酸是“有效连接的”。例如，编码分泌前导区的DNA与编码某多肽的DNA有效连接，如果该编码分泌前导区的DNA作为参与该多肽的分泌的前蛋白表达的话；启动子或增强子与某编码序列有效连接，如果该启动子或增强子影响该序列的转录的话；或者，核糖体结合位点与某编码序列有效连接，如果该核糖体结合位点被定位为有利于翻译的话。一般来讲，“有效连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导区的情况下，被连接的DNA序列是连续的并在阅读框中。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在便利的限制性位点处的连接来实现。如果不存在此类位点，那么根据常规做法使用合成的寡核苷酸衔接子、接头或PCR引物。
当选择标记具有完全选择功能时，那么该选择标记在本文中被称为是“可操作的”。
如本文所用，术语“基因”是指DNA的参与产生多肽链的区段，其可包括或不包括在编码区之前和之后的区域，例如5′非翻译(5′UTR)或“前导”序列和3′UTR或“尾随”序列以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
一般来讲，编码目的变体的核酸分子将在中等至高度严格性条件下与野生型前体/参考序列杂交。例如，编码变体纤维素酶(如CBH2)的核酸分子将在中等至高度严格性条件下与野生型序列(如本文提供的SEQ ID NO：7)杂交。然而，在某些实施方案中，编码目的酶的核苷酸序列可以反映实质上不同的密码子使用，但仍旧编码相同目的酶。例如，依照特定密码子被宿主利用的频率(参见例如，Te′o等人，FEMS Microbiology Letters(欧洲微生物学会联合会微生物学快报)，190：13-19，2000年，描述了用于在丝状真菌中表达的基因的最佳化)，编码序列可以进行修饰，以利于目的酶或变体在特定原核或真核表达系统中的更强表达。
如果某核酸序列与参考核酸序列在中等至高度严格性杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，那么认为这两个序列“可选择性杂交”。杂交条件基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，“最大限度严格性”通常在约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)下发生；“高严格性”在比Tm低约5至约10℃下发生；“中等”或“中间严格性”在比探针的Tm低约10至约20℃下发生；“低严格性”在比Tm低约20至约25℃下发生。在功能上，可以使用最大限度严格性条件来鉴定与杂交探针具有严格的同一性或接近严格的同一性的序列；而高严格性条件用于鉴定与探针具有约80％或更高序列同一性的序列。
中等和高严格性杂交条件是本领域众所周知的(参见例如，Sambrook，等人，1989年，第9和11章，以及Ausubel，F.M.，等人，1993年，将它们明确地以引用方式并入本文)。高严格性条件的一个例子包括在约42℃下，在50％甲酰胺、5xSSC、5xDenhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/mL变性载体DNA中杂交，然后在室温下在2xSSC和0.5％SDS中洗涤两次，并且在42℃下在0.1xSSC和0.5％SDS中再洗涤两次。
当用来指涉例如细胞或核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示该细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者表示该细胞衍生自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的该细胞内未发现的基因，或者表达原本会异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
如本文所用，指涉细胞的术语“转化的”、“稳定转化的”或“转基因的”意指该细胞有非天然(或未以其天然形式存在)的核酸序列整合到其基因组内或作为附加型质粒存在，该附加型质粒经过多代都得到维持。
如本文所用，术语“表达”是指基于基因的核酸序列而产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。
在将核酸序列插入细胞中的语境下的术语“引入的”，是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指涉将核酸序列掺入真核或原核细胞内，在其中核酸序列可被掺入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中、被转变成自主复制子或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
术语“目的蛋白或变体的表达”是指目的基因或目的变体的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽及其衍生物。例如，“CBH2表达”是指cbh2基因或其变体的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽及其衍生物，包括来自相关菌种例如康宁木霉(Trichoderma koningii)、红褐肉座菌(也称为长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride))和施氏肉座菌(Hypocrea schweinitzii)的CBH2。表达水平可以通过各种已知方法进行测定，包括例如用于目的蛋白或变体的蛋白质印迹、用于目的基因或变体基因的mRNA的RNA印迹分析和逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测定、和在合适底物上进行酶促活性测定。举例说，用于CBH2表达的测定包括如以下所述的用于CBH2蛋白质的蛋白质印迹、用于cbh2mRNA的RNA印迹分析和逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)测定、和磷酸膨胀纤维素酶(PASC)和对羟基苯甲酸酰肼(PAHBAH)测定：(a)PASC：(Karlsson，J.等人(2001年)，Eur.J.Biochem(欧洲生物化学杂志)，268，6498-6507，Wood，T.(1988年)于Methods in Enzymology(酶学方法)，第160卷。Biomass Parta Cellulose and Hemicellulose(生物量部分纤维素和半纤维素)(Wood，W.&Kellog，S.编辑)，第19-25页，美国加利福尼亚州圣地亚哥市的美国学术出版社(Academic Press，San Diego，Calif.，USA))和(b)PAHBAH：(Lever，M.(1972年)Anal.Biochem.(分析生物化学)，47，273，Blakeney，A.B.&Mutton，L.L.(1980年)J.Sci.Food&Agriculture(食品科学与农业杂志)，31，889，Henry，R.J.(1984年)J.of the Institute ofBrewing(酿造学会志)，90，37)。
术语“宿主细胞”是指这样的细胞，其含有载体，且支持表达构建体的复制和/或转录或转录和翻译(表达)。在本发明中使用的宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)细胞，或真核细胞如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞适当地是丝状真菌细胞。
术语“丝状真菌”意指本领域技术人员所了解的任何和所有丝状真菌。优选的真菌选自曲霉属、木霉属、镰刀菌属、金孢子菌属、青霉属、腐质霉属、链孢霉属(Neurospora)、或其另外的有性形式，例如裸孢壳属、肉座菌属(Hypocrea)。目前已证实无性工业真菌里氏木霉是子囊菌纲红褐肉座菌的克隆衍生物(参见，Kuhls等人，PNAS(美国国家科学院院刊)，93：7755-7760，1996年)。
许多微生物能产生水解纤维素的酶，包括木腐真菌木霉属，堆肥菌高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属(Bacillus)和纤维单胞菌属(Cellulomonas)；链霉菌属(Streptomyces)；和真菌腐质霉属、曲霉属和镰刀菌属。
如本文所用，术语“分离的”或“纯化的”是指从与其天然结合的至少一种组分中移出的核酸或氨基酸。
“丝状真菌”包括亚门真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状形式。例如，丝状真菌包括但不限于枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属、裸孢壳属、镰刀菌属、腐质霉属、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、链孢霉属、柱霉属(Scytalidium)、草根霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)或木霉属的种。在一些实施方案中，丝状真菌可以是棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构果曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉或米曲霉(Aspergillus oryzae)。在一些实施方案中，丝状真菌是拟杆镰刀菌(Fusarium bactridioides)、纹枯镰刀菌(Fusarium cerealis)、克地镰刀菌(Fusarium crookwellense)、黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、禾赤镰刀菌(Fusarium graminum)、异孢镰刀菌(Fusarium heterosporum)、荆条镰刀菌(Fusarium negundi)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、网状镰刀菌(Fusarium reticulatum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、接骨木镰刀菌(Fusarium sambucinum)、肤色镰刀菌(Fusarium sarcochroum)、拟枝孢镰刀菌(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰刀菌(Fusarium sulphureum)、簇囊镰刀菌(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusarium trichothecioides)或镶片镰刀菌(Fusarium venenatum)。在一些实施方案中，丝状真菌是特异腐质霉(Humicola insolens)、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)、米赫毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、嗜热柱霉菌(Scytalidium thermophilum)或土生梭孢壳(Thielavia terrestris)。在一些实施方案中，丝状真菌是哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉、长梗木霉、里氏木霉，例如，RL-P37(Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology(应用微生物学与生物技术)，20(1984年)，第46-53页；Montenecourt B.S.，Can.，1-20，1987年)，QM9414(ATCC No.26921)，NRRL 15709，ATCC 13631、56764、56466、56767或绿色木霉例如ATCC 32098和32086。在一些实施方案中，丝状真菌是里氏木霉RutC30，其作为里氏木霉ATCC 56765得自美国典型培养物保藏中心。关于这点，在一些实施方案中，本发明提供本文描述的任何一种丝状真菌的全细胞肉汤制备物。
一般来讲，在适合于产生酶的细胞培养基中培养微生物。使用本领域已知的程序，在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的营养培养基中进行培养。适于生长和产酶的合适培养基、温度范围和其他条件在本领域是已知的。作为一个非限制性实例，里氏木霉产纤维素酶的正常温度范围是24℃至28℃。
一般来讲，“全细胞肉汤制备物”经发酵产生后不进行回收和/或纯化或者进行最低限度的回收和/或纯化即加以使用。例如，一旦目的酶或变体(或超过一种目的酶或变体)被细胞分泌到细胞培养基中，就将含有目的酶或变体的细胞培养基加以使用。在一些实施方案中，全细胞肉汤制备物包含发酵材料的未分级内容物，所述内容物包括细胞培养基、胞外酶和细胞在内。作为另外一种选择，全细胞肉汤制备物可通过任何便利的方法来处理，例如，通过沉淀、离心、亲和力、过滤或本领域已知的任何其他方法。在一些实施方案中，例如，可将全细胞肉汤制备物浓缩且随后在不进行进一步的纯化的情况下使用。在一些实施方案中，全细胞肉汤制备物包含降低细胞活力或杀死细胞的化学试剂。在一些实施方案中，使用本领域已知的方法对细胞进行裂解或透化处理。例如，目的纤维素酶或变体(例如CBH2或其变体Fv43B，Fv43A)可以由细胞分泌到细胞培养基中，所述细胞培养基含有纤维素酶或变体。细胞培养基可以作为全细胞肉汤制备物使用。
2.分子生物学
在某些实施方案中，本发明提供目的酶或变体的表达。在某些实施方案中，将编码目的酶或变体的基因置于在丝状真菌中起作用的启动子控制下。在这个实施方案的一个实例中，本文提供表达处于在丝状真菌中起作用的合适启动子控制下的变体cbh2基因的方法。可以应用在重组遗传学领域中的已知技术(参见例如，Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第2版，1989年；Kriegler，Gene Transfer andExpression：A Laboratory Manual(基因转移和表达实验指南)，1990年；和Ausubel等人，编辑，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(分子生物学实验手册)，纽约州的格林出版社和威立出版公司(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York)，1994年)。
3.重组蛋白的表达
本发明的方法涉及被工程改造来表达重组蛋白的宿主细胞，而不将表达方法限制于任何具体方法。目的重组蛋白或变体优选从细胞分泌。本发明提供已用包含蛋白编码核酸序列的表达载体转导、转化或转染的宿主细胞。培养条件(例如温度、pH等)是以前在转导、转化或转染之前用于亲本宿主细胞的那些条件，并且对于本领域技术人员将显而易见。
在一种方法中，用表达载体转染丝状真菌细胞或酵母细胞，所述表达载体具有在宿主细胞系中起作用、与编码目的蛋白或变体的DNA区段有效连接的启动子或生物学活性的启动子片段或一种或多种(例如一系列)增强子，从而使目的蛋白或变体在细胞系中被表达。
A.核酸构建体/表达载体。
编码目的蛋白或变体的天然或合成多核苷酸片段可以掺入嵌合构建体或载体中，所述嵌合构建体或载体能够被引入丝状真菌或酵母细胞中且在该丝状真菌或酵母细胞中复制。本文所公开的载体和方法适用于在宿主细胞中表达蛋白质或变体。任何载体都可以使用，只要它能够在它被引入的细胞中复制并且存活。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购获得的。克隆和表达载体在以下文献中也有描述：Sambrook等人，1989；Ausubel F M等人，1989和Strathern等人，The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyces(酵母属的分子生物学)，1981，所述每篇文献明确地以引用方式并入本文。适用于真菌的表达载体在van den Hondel，C.A.M.J.J.等人(1991年)于：Bennett，J.W.和Lasure，L.L.(编辑)More GeneManipulations in Fungi(真菌中的更多基因操作)，美国学术出版社(AcademicPress)，第396-428页中有描述。可通过多种程序将适当的DNA序列插入到质粒或载体(本文统称为“载体”)中。在一些情况下，使用已知程序将DNA序列插入合适的限制性核酸内切酶位点中。在其他情况下，可适当地应用不涉及限制性消化和/或连接的载体构建方法。此类程序和相关的亚克隆程序被认为是在本领域的技术人员的知识范围内。
包含目的蛋白或变体的编码序列的重组丝状真菌可以通过将包含该目的蛋白或变体的编码区的嵌合构建体引入选定的丝状真菌菌株的细胞中而产生。
一旦获得所需形式的核酸序列，其就可以多种方式进行修饰。例如，当该序列涉及非编码侧翼区时，可对侧翼区实施切除、诱变等。因而，可对天然存在的序列进行转换、颠换、缺失和插入。
可根据已知的重组技术将选定的编码序列插入合适的载体中，并用于转化丝状真菌。由于遗传密码固有的简并性，编码实质上相同或功能上等同的氨基酸序列的其他核酸序列也可用于克隆且表达目的蛋白或变体。因此，编码区中的此类置换属于本发明所涵盖的序列变体。这些序列变体中的任何和全部都可以与本文描述相同的方式进行利用。例如，当目的蛋白或变体是纤维素酶时，可以使用纤维二糖水解酶的序列变体例如CBH2。
术语“纤维素酶”或“纤维素分解酶”是指一类能够将纤维素聚合物水解成较短的纤维寡糖低聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的酶。纤维素酶的许多实例，诸如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和葡糖苷酶已经从纤维素分解生物中获得，尤其包括真菌、植物和细菌。由这些微生物产生的酶是蛋白质的混合物，其具有三类在纤维素向葡萄糖的转化中有用的作用：内切葡聚糖酶(EG)、纤维二糖水解酶(CBH)和β-葡糖苷酶。这三种不同类型的纤维素酶协同作用以将纤维素及其衍生物转化成葡萄糖。
来自红褐肉座菌的CBH2是糖基水解酶家族6(从而为Cel6)的成员，并且具体来说是该家族在红褐肉座菌(从而为Cel6A)中鉴定的首个成员。糖基水解酶家族6含有内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶/外切葡聚糖酶两者，而CBH2是纤维二糖水解酶/外切葡聚糖酶。因而，词语CBH2、CBH2型蛋白质和Cel6纤维二糖水解酶在本文中通常可互换使用。因而，术语“变体cbh2基因”意指已通过去除、添加和/或操纵编码序列而被改变的红褐肉座菌cbh2基因的核酸序列。
本发明还包括包含一个或多个如上所述的编码蛋白质的核酸序列的重组核酸构建体。所述构建体包含其中已正向或反向插入了本发明的序列的载体，例如质粒或病毒载体。
嵌合构建体可以包括目的蛋白或变体的编码序列。在一些实施方案中，编码序列可以按以下方式存在：(i)处于分离状态；(ii)与附加编码序列(例如融合蛋白或信号肽编码序列)相组合，其中所述编码序列是主导编码序列；(iii)与对于所述编码序列在合适的宿主中的表达有效的非编码序列相组合，所述非编码序列例如内含子和控制元件(包括例如启动子和终止子元件、或5′和/或3′非翻译区)；和/或(iv)处于所述编码序列在其中为天然或非天然基因的载体或宿主环境中。
在某些方面，嵌合构建体用于将编码蛋白质的核酸序列在体外转移到细胞中。优选地，编码蛋白质的核酸序列被转移到其中的细胞是已建立的丝状真菌或酵母系。对于目的蛋白或变体的长期生产，稳定表达是优选的。有效生成稳定转化体的各种已知方法可以用于实施本发明。
合适的载体通常配有编码可选择标记的核酸序列、插入位点和合适的控制元件，例如启动子和终止序列。载体可包含调控序列，包括例如非编码序列，如内含子和控制元件，例如，启动子和终止子元件或5′和/或3′非翻译区，其有效连接至所述编码序列，并且对于所述编码序列在宿主细胞中(和/或在其中通常不表达经修饰的可溶性蛋白编码序列的载体或宿主细胞环境中)的表达是有效的。许多合适的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购获得的和/或在Sambrook等人(同上)中描述的。
合适启动子的例子包括组成型启动子和诱导型启动子，包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1a启动子、如所描述(ClonTech和BASF)含有tet-on或tet-off系统中的四环素应答元件(TRE)的启动子、β肌动蛋白启动子和可通过加入某些金属盐进行上调的金属硫蛋白启动子。启动子序列是被特定丝状真菌识别以实现表达目的的DNA序列。它被有效连接至编码目的蛋白或变体的DNA序列。这种连接包括将启动子相对于编码目的蛋白的DNA序列的起始密码子进行定位。启动子序列含有介导目的蛋白或变体的表达的转录或翻译控制序列。非限制性例子包括来自以下基因的启动子：黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶-或α-葡糖苷酶编码基因；构巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙链孢霉cbh1或trp1基因；黑曲霉或米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶编码基因；红褐肉座菌(里氏木霉)cbh1、cbh2、egl1、egl2、或其他纤维素酶编码基因。
适当的可选择标记的选择将取决于宿主细胞，并且适合不同宿主的标记是本领域熟知的。合适的可选择标记基因的例子包括来自构巢曲霉或里氏木霉的argB，来自构巢曲霉的amdS，来自粗糙链孢霉或里氏木霉的pyr4，来自黑曲霉或构巢曲霉的pyrG。合适的可选择标记的另外例子包括但不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，其包括在用于转化突变株(如trp-、pyr-、leu-等)的嵌合构建体中。
此类可选择标记赋予转化株利用通常不被丝状真菌代谢的代谢物的能力。例如，来自红褐肉座菌的编码乙酰胺酶的amdS基因能让转化株细胞以乙酰胺作为氮源生长。可选择标记(例如pyrG)可恢复营养缺陷型突变株在选择性基本培养基上生长的能力，或者可选择标记(例如olic31)可赋予转化株在抑制性药物或抗生素的存在下生长的能力。
使用本领域一般采用的方法将可选择标记编码序列克隆到任何合适的质粒中。合适质粒的例子包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX质粒含有来自构巢曲霉的AMAL序列，这使得它可以在黑曲霉中复制。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。此类技术在文献中充分阐明。参见例如，Sambrook等人，1989年；Freshney，Animal CellCulture(动物细胞培养)，1987年；Ausubel，等人，1993年；和Coligan等人，Current Protocols in Immunology(免疫学实验手册)，1991年。
B.用于重组蛋白生产的丝状真菌和培养条件
可以为了重组蛋白表达进行处理和/或修饰的亲本丝状真菌菌种的例子包括但不限于木霉属(例如里氏木霉、长梗木霉、绿色木霉、康宁木霉)；青霉菌属菌种，腐质霉属菌种(包括特异腐质霉)，曲霉属菌种，金孢子菌属菌种，镰刀菌属菌种，肉座菌属菌种和裸孢壳属菌种。
在通常用于培养亲本真菌系的条件下培养经转化的细胞。例如，可以在含有生理盐和营养素的标准培养基中培养细胞，例如如在Pourquie，J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation(纤维素降解的生物化学和遗传学)，Aubert，J.P.等人编辑，美国学术出版社，第71-86页，1988年和Ilmen，M.等人，Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)63：1298-1306，1997年中所描述。多种常用培养条件可以是合适的，例如培养物在28℃下在振荡器培养物或发酵罐中温育，直至达到所需水平的重组蛋白表达。
适合于给定丝状真菌的培养条件可在科学文献中找到和/或得自真菌的来源，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC；www.atcc.org/)。在真菌生长已确立后，使细胞暴露于能有效引起或允许重组蛋白表达的条件。
在编码序列处于诱导型启动子的控制下的情况中，向培养基中以能有效诱导重组蛋白表达的浓度加入诱导剂，例如糖、金属盐或抗生素。
在一些实施方案中，丝状真菌是黑曲霉，其是可用于获得过表达的目的蛋白的有用菌株。例如，已知黑曲霉变种泡盛曲霉(A.niger var awamori)dgr246分泌升高的量的纤维素酶(Goedegebuur等人，Curr.Genet(当代遗传学)(2002年)41：89-98)。黑曲霉变种泡盛曲霉的其他菌株例如GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4也是已知的。参见例如，Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学和生物技术)39：738-743。
在一些实施方案中，丝状真菌是里氏木霉，其是用于获得过表达的目的蛋白的另一种有用菌株在一些实施方案中，这种丝状真菌宿主细胞可以具有某些与被缺失或减少的有害活性或性状(例如对于表达、稳定性有害的，将使得某些性质的查询或测定变得困难的混杂活性等)相联系的基因(或本文称“有害基因”)。在一些实施方案中，这种真菌宿主细胞可以进行修饰，使得它获得或增强与某些有利的活性或性状相联系的基因(或本文称“有利基因”)，所述某些有利的活性或性状例如增加的分泌、增加的稳定性、增加的可溶性等。
例如，由Sheir-Neiss，等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(应用微生物学和生物技术)20：46-53(1984年)描述的里氏木霉菌株RL-P37已知能分泌升高的量的纤维素酶。RL-P37的功能等价物包括里氏木霉菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。设想到这些菌株还将可用于过表达蛋白质及其变体，包括但不限于某些纤维二糖水解酶，例如CBH1或CBH2，或某些内切葡聚糖酶。
举例说，当重组蛋白是CBH2变体时，优选在不存在潜在有害的天然纤维素分解活性的情况下产生变体。因此，获得这样的木霉属宿主菌株是有用的，其在引入含有编码变体CBH2的DNA片段的DNA构建体或质粒前已缺失一个或多个纤维素酶基因。像这样的合适多重缺失菌株可以通过公开于例如美国专利No.5,246,853和PCT公开WO 92/06209的方法进行制备，所述专利的公开内容以引用方式并入本文。通过在缺少一个或多个纤维素酶基因的宿主微生物中表达变体CBH2纤维素酶，简化了鉴定和随后的纯化程序。任何来自木霉属的种的已克隆的基因可以如此进行缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因以及编码EG III和/或EGV蛋白质的那些基因可以从木霉属宿主菌株中缺失(分别参见例如，美国专利No.5,475,101和PCT公开WO94/28117)。
可通过将某种形式的待缺失或破坏的所需基因插入质粒中来实现基因缺失。然后在适当的限制性酶位点(在所需的基因编码区的内部)消化该缺失质粒，并且用可选择标记替换基因编码序列或其部分。来自待缺失或破坏的基因的基因座的侧翼DNA序列(优选具有约0.5至约2.0kb之间的大小)可以保留在可选择标记基因的任一侧上。合适的缺失质粒将通常具有存在于其中的独特的限制性酶位点，以使得含有该缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和可选择标记基因能够作为单一线性小片被去除。
在一些实施方案中，挑选可选择标记以使得经转化的微生物的检测成为可能。任何在选定的微生物中被表达的可选择标记基因都可以是合适的。例如，对于曲霉属菌种，可以挑选可选择标记，以使得可选择标记在转化株中的存在不会显著改变微生物的性质。合适的可选择标记的例子是编码可测定的产物的基因。例如，可使用曲霉属的种的这样的基因的功能拷贝，如果该基因在宿主菌株中缺乏，会导致该宿主菌株显示营养缺陷型表型。对于木霉属的种也存在可选择标记。
在一些实施方案中，用功能性pyrG基因转化曲霉属的种的pyrG衍生菌株，该基因提供用于转化的可选择标记。通过选择对氟乳清酸(FOA)有抗性的曲霉属的种菌株可获得pyrG衍生菌株。pyrG基因编码乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶，该酶是尿苷生物合成所需要的酶。具有完整pyrG基因的菌株能在缺乏尿苷的培养基中生长但对氟乳清酸敏感。因此，FOA抗性选择可以用于选择缺乏功能性乳清酸核苷单磷酸脱羧酶并且因而需要尿苷进行生长的pyrG-衍生菌株。使用FOA选择技术，还可以获得缺乏功能性乳清酸焦磷酸核糖基转移酶的需要尿苷的菌株。这些细胞可以用编码这个酶的基因的功能拷贝进行转化(Berges&Barreau，Curr.Genet.(当代遗传学)19：359-365(1991年)和van Hartingsveldt等人，(1986年)Mol.Gen.Genet.(分子遗传学与普通遗传学)206：71-75)。使用上文描述的FOA抗性技术来进行衍生菌株的选择。在一些实施方案中，将pyrG基因用作可选择标记。
在一些实施方案中，用功能性pyr4基因转化肉座菌属的种(木霉属的种)的pyr4-衍生菌株，所述功能性pyr4基因提供用于转化的可选择标记。通过选择对氟乳清酸(FOA)有抗性的肉座菌属的种(木霉属的种)菌株，可获得pyr4衍生菌株。pyr4基因编码乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶，该酶是尿苷生物合成所需要的酶。具有完整pyr4基因的菌株能在缺乏尿苷的培养基中生长但对氟乳清酸敏感。因此，FOA抗性可以用于选择缺乏功能性乳清酸核苷单磷酸脱羧酶并且因而需要尿苷进行生长的pyr4衍生菌株。使用FOA选择技术，还可以获得缺乏功能性乳清酸焦磷酸核糖基转移酶的需要尿苷的菌株。这些细胞可以用编码这个酶的基因的功能拷贝进行转化(Berges&Barreau，1991年)。使用如上文描述的FOA抗性技术来进行衍生菌株的选择。在一些实施方案中，将pyr4基因用作可选择标记。
随后从缺失质粒中分离包含被破坏或缺失的有害基因(例如上文例示的一个)的单一DNA片段，并用于转化适当的pyrG-曲霉属或pyr4-木霉属宿主。转化株基于它们分别表达pyrG或pyr4基因产物从而补充宿主菌株的尿苷营养缺陷型的能力进行鉴定和选择。可适当地对所得到的转化株进行DNA印迹分析，以鉴定和证实双交换整合事件，在该事件的过程中该基因的基因组拷贝的部分或全部编码区被缺失且替换为适当的pyr可选择标记。
虽然上文描述的特定质粒载体涉及pyr转化株的制备，但本发明并不限于这些载体。使用上文描述的以上技术可在曲霉属的种或肉座菌属的种(木霉属的种)中缺失和替换各种基因。另外，如本文讨论的，有许多可选择标记是合适的。事实上，任何已被鉴定的基因都可使用上述策略从任何宿主的基因组中适当地缺失，所述宿主例如曲霉属的种或肉座菌属的种。
在某些实施方案中，使用的宿主菌株可以是肉座菌属的种(木霉属的种)的这样的衍生物，其缺乏或具有与所挑选的可选择标记对应的一个或多个非功能性基因。例如，如果挑选pyrG可选择标记用于曲霉属的种，则将特定的pyrG衍生菌株用作转化程序中的受体。在另一个实例中，如果挑选pyr4可选择标记用于肉座菌属的种，则将特定的pyr4衍生菌株用作转化程序中的受体。在一些实施方案中，可以使用包含类似于构巢曲霉基因的肉座菌属的种(木霉属的种)基因的可选择标记，包括例如amdS、argB、trpC或niaD。对应的受体菌株相应地为衍生菌株，例如分别为amdS-、argB-、trpC-或niaD-菌株。
随后可以制备编码目的蛋白或变体的DNA以用于插入适当的微生物中。根据本发明，编码目的蛋白或变体的DNA可以包含编码具有野生型蛋白质的活性的蛋白质或变体的DNA。可将编码目的蛋白或变体的DNA片段功能连接至真菌启动子序列，例如，曲霉属中的glaA基因的启动子，或木霉属中的cbh1或egl1基因的启动子。
可通过构建携带编码目的蛋白或目的变体的DNA的表达载体来制备编码该蛋白或变体的DNA。携带编码目的蛋白或变体的插入DNA片段的表达载体可以是例如任何这样的载体，其能够在给定宿主生物中自主复制，或能够整合到宿主的DNA中，通常为质粒的形式。在某些实施方案中，设想到两种类型的表达载体来获得基因的表达。第一类含有这样的DNA序列，其中启动子、基因编码区和终止子序列都源于待表达的基因。如有需要，可通过缺失不需要的DNA序列(例如，编码不希望有的结构域的DNA序列)来获得基因截短，以使待表达的结构域处于其自身转录和翻译调控序列的控制下。可选择标记也可作为载体的一部分被包含，从而允许对多个拷贝的所需基因序列在宿主中的整合情况进行选择。
第二类表达载体是预先装配的，含有对于高水平转录有用的序列并含有可选择标记。设想到可将基因或其部分的编码区插入这种通用表达载体中，将其置于表达盒启动子和终止子序列的转录控制下。这种通用表达载体的一个非限制性例子是曲霉属中的pRAX。可将目的基因或变体基因或其部分插入强glaa启动子的下游。这种通用表达载体的一个非限制性例子是肉座菌属中的pTEX。可将目的基因或变体基因或其部分插入强cbh1启动子的下游。
在某些实施方案中，在载体中，将编码目的蛋白或变体的DNA序列有效连接至转录和翻译序列，例如合适的启动子序列和信号序列，与结构基因同阅读框。启动子适当地是任何在特定宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，并且可源自编码对宿主细胞而言同源或异源的蛋白质的基因。可以提供任选的信号肽以用于目的蛋白或变体的胞外生产。编码信号序列的DNA优选是与待表达的基因天然结合的DNA。然而，设想到来自任何合适来源的信号序列，例如来自外切纤维二糖水解酶或来自木霉属的内切葡聚糖酶。
可以用于将编码目的蛋白或变体的DNA序列连接至启动子和将这种构建体插入合适载体中的方案是本领域已知的。
可按照已知的技术如转化、转染、微注射、微穿孔、生物射弹轰击等，将本文描述的DNA载体或构建体引入宿主细胞中。
例如，当本文描述的DNA载体或构建体用于转化真菌宿主细胞时，肉座菌属的种(木霉属的种)的细胞壁对于DNA的透性可能很低。因此，所需的DNA序列、基因或基因片段的摄取通常是极微。有许多方法可用来在转化过程前增加衍生菌株(例如，缺乏对应于所使用的可选择标记的功能性基因的衍生菌株)中肉座菌属的种(木霉属的种)细胞壁的透性。
在某些实施方案中，为了制备用于转化的曲霉属的种或肉座菌属的种(木霉属的种)，制备来自真菌菌丝体的原生质体。参见Campbell等人Curr.Genet.(当代遗传学)16：53-56；1989年。菌丝体可从萌发的营养孢子获得。用能消化细胞壁的酶处理菌丝体，从而得到原生质体。然后通过在悬浮介质中存在的渗透稳定剂来保护原生质体。合适的稳定剂包括例如山梨糖醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，稳定剂的浓度可以在0.8M至1.2M之间(例如在0.9M至1.2M之间、在1,0M至1.2M之间、在1.1M至1.2M之间等)变化。在一个具体的实施例中，1.2M山梨糖醇用作悬浮介质中的稳定剂。
DNA向宿主菌株(例如曲霉属的种或肉座菌属的种(木霉属的种)中的摄取通常可依赖于钙离子浓度。一般来讲，在摄取溶液中使用约10mMCaCl2至约50mM CaCl2(例如约15mM至约45mM、约20mM至约40mM、约25mM至约35mM)。除了在摄取溶液中包括钙离子外，通常还包括的其他东西是缓冲系统如TE缓冲液(10mM Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或10mMMOPS，pH 6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。据认为，这个缓冲液中的聚乙二醇的作用是融化细胞膜，从而让介质的内容物被递送至宿主菌株(例如曲霉属的种或肉座菌属的种)的细胞质中，并且质粒DNA被转移至细胞核。在某些实施方案中，这个融化过程使得质粒DNA的多个拷贝整合到宿主染色体内。
通常，将含有密度为105至106/mL(优选2×105/mL)、已进行透化处理的曲霉属的种的原生质体或细胞的悬浮液用于转化。类似地，将含有密度为108至9/mL(优选2×108/mL)、已进行透化处理的肉座菌属的种(木霉属的种)的原生质体或细胞的悬浮液用于转化。将这些原生质体或细胞在适当的溶液(例如，1.2M山梨糖醇；50mM CaCl2)中的100μL体积与所需DNA混合。在一些实施方案中，将大量PEG加入摄取溶液。例如，可将约0.1至约1体积的25％PEG 4000加入原生质体悬浮液。在一个具体的实例中，将约0.25体积的25％PEG 4000加入原生质体悬浮液。也可向摄取溶液加入添加剂例如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等，帮助转化。
在某些实施方案中，将混合物在约0℃下温育约10至约30分钟的时间。然后向混合物加入另外的PEG以进一步增强所需的基因或DNA序列的摄取。在某些实施方案中，可以以转化混合物体积的5至15倍的体积加入25％PEG 4000；然而，更大和更小的体积也可以是合适的。例如，在一些实施方案中，以转化混合物体积的10倍体积加入25％PEG 4000。加入PEG后，接着使转化混合物在室温下或冰上温育，然后加入山梨糖醇和CaCl2溶液。然后将原生质体悬浮液进一步加入到生长培养基的熔化等分试样。这个生长培养基能使转化株生长。有许多生长培养基可以适当地用于生长本发明的所需转化株。在某些实施方案中，例如，如果选择Pyr+转化株，那么优选使用不含尿苷的生长培养基。例如，菌落在耗尽尿苷的生长培养基上进行转移并纯化。
在这个阶段，稳定转化株可以通过其更快的生长速率区别于不稳定转化株。此外，对于许多丝状真菌宿主，例如木霉属，在缺乏尿苷的固体培养基上具有平滑轮廓而不是凹凸不平轮廓的圆形菌落的形成可以用作区别特征。在一些实施方案中，可以通过以下方式对稳定性进行进一步测试和选择：在固体非选择性培养基(例如含有尿苷的培养基)上生长转化株，从这个培养基收获孢子，并测定这些孢子的百分比。所选孢子可在缺乏尿苷的选择性培养基上萌发并生长。
C.将重组蛋白编码核酸序列引入宿主细胞中。
本发明进一步提供经遗传修饰以包含重组蛋白编码核酸序列的细胞和细胞组合物。可用克隆载体或表达载体对亲本细胞或细胞系进行遗传修饰(即，转导、转化或转染)。如上进一步描述，载体可以是例如质粒、病毒粒子、噬菌体等的形式。
本发明的转化方法可导致转化载体的全部或部分稳定整合到丝状真菌的基因组中。还设想到导致自主复制的染色体外转化载体得以维持的转化。
有许多标准的转染方法可用于生产能表达大量非天然或天然蛋白质的丝状真菌(例如里氏木霉)细胞系。例如，有许多已公布的方法可用于将DNA构建体引入木霉属的产酶菌株中，包括Lorito等人，1993年，Curr.Genet.(当代遗传学)24：349-356；Goldman等人，1990年，Curr.Genet.(当代遗传学)17：169-174；Penttila等人，1987年，Gene(基因)6：155-164；用于将DNA构建体引入曲霉属的产酶菌株中，包括Yelton等人，1984年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)81：1470-1474；用于将DNA构建体引入镰刀菌属的产酶菌株中，包括Bajar等人，1991年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)88：8202-8212；和用于将DNA构建体引入链霉菌属的产酶菌株中，包括Hopwood等人，1985年，英国诺里奇的约翰恩斯基金会(The John Innes Foundation，Norwich，UK)，和用于芽孢杆菌属，包括Brigidi等人，1990年，FEMS Microbiol.Lett.(欧洲微生物学会联合会微生物学快报)55：135-138)。
用于将嵌合构建体(表达载体)引入丝状真菌(例如红褐肉座菌)中的其他方法包括但不限于使用粒子枪或基因枪、在转化过程之前透化丝状真菌细胞壁(例如，通过使用高浓度碱，例如，0.05M至0.4M CaCl2或乙酸锂)、原生质体融合或农杆菌介导的转化。这种通过用聚乙二醇和CaCl2处理原生质体或原生质球来转化丝状真菌的方法的一个例子在Campbell，E.I.等人，Curr.Genet.(当代遗传学)16：53-56，1989年；和Penttila，M.等人，Gene(基因)，63：11-22，1988年中描述。
可使用任何已知的用于将外来核苷酸序列引入宿主细胞中的程序。这些程序包括例如使用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、生物射弹(biolistics)、脂质体、微注射、细胞质载体(plasma vector)、病毒载体和任何其他已知的用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外来遗传材料引入宿主细胞中的方法(参见，例如，Sambrook等人，同上)。同样有用的是在美国专利No.6,255,115中描述的农杆菌介导的转染方法。重要的是具体使用的遗传工程程序能够将至少一种基因成功引入能够表达非天然或内源(但为非天然形式)的基因的宿主细胞中。
在一些实施方案中，可以在体外转录包含重组蛋白编码核酸序列的嵌合构建体，并且可通过已知方法例如注射将所得到的RNA引入宿主细胞中。
本发明进一步包括用于生产真菌酶、其变体和包含这些分子的组合物的丝状真菌(例如红褐肉座菌和黑曲霉)的新型和有用的转化株。本发明包括丝状真菌尤其是包含某些重组蛋白编码序列或缺失某些内源编码序列的真菌的转化株。
在引入包含目的蛋白或其变体的编码序列的嵌合构建体后，可将经遗传修饰的细胞在经适当改良的常规营养培养基中培养，所述改良是为了激活启动子、选择转化株或扩增重组蛋白编码核酸序列的表达。培养条件(例如温度、pH等)是先前用于被选择进行表达的宿主细胞的那些条件，并且对于本领域的技术人员将显而易见。
这种嵌合构建体已引入其中的细胞的后代一般视为包含在嵌合构建体中存在的蛋白编码核酸序列。
本发明进一步包括用于生产真菌酶、其变体或包含这些分子的组合物中的丝状真菌(例如红褐肉座菌)的新型和有用的转化株。例如，黑曲霉也可用于生产重组蛋白及其变体。本发明包括丝状真菌尤其是包含目的蛋白或其变体的编码序列或缺失某些内源蛋白编码序列的真菌的转化株。
实施例
在以下实施例中更详细地描述本发明，所述实施例不是旨在以任何方式限制受权利要求书保护的本发明的范围。附图意在被认为是说明书的组成部分并且是对本发明的描述。提供以下实施例以举例说明，但不限制受权利要求书保护的本发明。
在以下实验公开内容中，将应用以下缩写：M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；nM(纳摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml或mL(毫升)μl或μL(微升)cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h或hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(足量)；ND(未进行)；NA(不适用)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝DNA或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)；RNA(核糖核酸)；mgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积比)；v/v(体积比)；g(重力)；OD(光密度)；HPLC(高压液相色谱)、PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；和SEL(位点估计文库)
实施例1
里氏木霉表达菌株的产生
产生改良的菌株，以提高目的变体(在这种情况下，CBH2变体)的表达一致性，使得表达水平在相同氨基酸序列的各变体间变化较小。具体而言，开发了与靶向载体组合的里氏木霉菌株，该靶向载体迫使cbh2变体基因(例如与调控序列有效组合的编码区)整合。在本发明的开发过程中制备的新菌株组合了对于筛选变体文库有利的几种突变。遗传工程步骤的示意图显示于图1中。
从里氏木霉quad缺失衍生菌株中缺失ku80
quad缺失衍生菌株在PCT公开WO 2005/001036中有描述。通过在红褐肉座菌QM6a(里氏木霉)的基因组序列中进行TBLASTN搜索鉴定MUS52的单个直向同源物即人KU80的粗糙链孢霉直向同源物，并且因而命名为里氏木霉ku80，蛋白质id 58213，可在美国能源部联合基因组研究所(U.S.Department of Energy Joint Genome Institute)获得。里氏木霉ku80基因的核苷酸序列作为SEQ ID NO：13提供：
ATGGCGGACAAGGAAGCAACCGTCTTCATCATCGACCTCGGCGCGTCCATGGCAGCTGTCAATGGGGGTCGAGAAGAATCCGACCTTGATTGGAGCATGAGCTACGTCTGGGACAAGATCAGCAACGTCGTGGCCTCGAATCGCAAGACGCTGTGCGTTGGCGTCGTGGGGTTCAGAACCGACGAGACAAACCACACGCTGAGCGAGGATGGGTACGAGAACATCTCCATATTGCAGCCCCTGGGGCCGATGAGCATGTCCAGCCTCAAGGCTCTTCAGCCCAAGGTGAAGCCGAGCAGGACGGTGGAAGGCGATGCCATCTCGGCGATTGTCATTGCCGTCGACATGATTGACAAGTACACGAAGAAGAACAAATGGAAGCGGCAGATTGTTCTCATTACCGACGGCCAAGGCGAGATTGATCCAGATGATATTGGCGACATTGCTAGAAAGATGCGCGACTCGAATATTGAATTGACAGTCTTGTGAGTTGGCGAGACCGTTTGGCGGACGGTAATGGTGCTGACGGTGATGCAAGGGGCGTCGACTTTGATGCTCCCGATTACGGCTTCAAAGAGGAGGACAAACCTTCAGTCAAGGTACTCCATATGTTCACTTCTTTTCTTTTTCTTCTTTATTTTCTTTTCTTTTGAAGCTTTCATTAACCTCTTCGTTAGAAGCAAAACGAAGAGACCCTAAAAAAGCTCGTGGATGGCTGTGGCGACGACTCAAGGTTCGCCTCCATGGTCGAGGCCATTGACGACTTGAATGAGCCACGAGCAAAGTCGGTCAAGCCTTACAAAACGTACGAAGGTCTCTTGACCTTGGGAGATCCGAAAAACGCTCCCGCAGTGGTGGAAATCCGCGTCGAGAGATACTTCAAGACCCATCTAGCCAGGCCACCTGCCGCCAGCACCGTGGTGGTCAAGGAGGAGCAAGCTGGGCCGTCTCAGGCAGACGAGGACGAACAGATGGACGGAGCGGAACTTACAGCTGTGAGGCAGGCCAGGACATACAAGGTCAATGATCCAGATGCCCCTGGCGGTAAGCGTGACGTTGAGTTTGAGTCTCTGGCCAAAGGGTACGAGTACGGCAGGACGGCAGTCCACATCAGCGAGTCTGATCAAAACGTCACCAAGCTCGCGACAGAAAAGAGCTTCAAGATCATCGGCTTCGTCCAGAAAGAAAAGGTATTGGCTTGGCTCTCAGCATTTGACCCGTTGCTCTTGGCTAACCCTTGTTTAGTATGAAATGCTCCTTAATCTTGGCGAAACCTGCGTTACCGTTGCATCCAAGTACGATGAAAAGTCTGAGCTGGCTTTTAGCTCTCTGGTGTGGGCGCTCTCGGAGCTCGACGCCTACGCCGTGGCCCGCCTAGTAACTAAGGACCAAAAGGACCCCATGCTGGTGTTACTGATGCCGTATATGGAGCCTGATTATGTTTGTCTCTATGATGTGCCTCTGCCTTTCGCAGAGGACATCAGGACGTACCAGTTTCCTCCCTTGGACAGAGTCGTTACCGTCAGTGGCCAAACGCTCACCAACCATCGCCTATTGCCATCCGACGAGCTCAACCAAGCGATGAGCGACTACGTAGATGCCATGGACATTTCAAGTTATGGTATCGATGAAGATGGGTGAGTATAGAAGATGATTGTTCAAATCTTTCACTTCTAAGCATTGCTTCTGATCTAGGCAACCGGCTGAATATGCCACCATCGATGAGTTATACAACCCTGCGATACATCGCATAGGCCATGCGATCAAACAACGAGCGATCCACCCAGAGAAACCCGTGCCCGAGATCCCCCCAGTCTTGCTTAGATTCGCAGCACCCCCGACAGAACTCGTCGAGACTGTGCAGCCTCATATCGATGCACTGATTCACGCTGCAGACGTGAAGAAAGGTACTGATTCCATTACATATGCTTCTCTGCACACTGATGTTTGATTTGTGCTAACGCCCCCCTTAGTGCCGCCCAAGGCCAAGGGCAAGCGCCAAAGAGAAACAGTTAAACCCATCTCGGGACTGGATGTGGATGCCCTTCTGGGAGAAGAGCAGAAAGGTTCCATTAGTCCGGAGAATGCCATTCCGGACTTCAAACGAGCCCTCAACTCGTCCGAAGAAGTCGAGCAGATTGCCGACGCCACAAAACAAATGGGGGCCATTGTGCGGTCTCTCATTACGGACAGCTTCGGGGATAGCAAATATGCCCAGGCAATGGAAGGCATTGGTGCGATGCGTGAGGAGCTGATCAACCTGGAAGAGCCTGGCCTGTACAACGACTTTGTGCGCGACTTGAAGAAAAGTTTGCTATCTGGAGCCTTGGGTGGTGACAGGCGAGATTTCTGGTTCAAGATGAGGTGGGCGAAGCTGGGCCTGATTGACAAGAAACAGTCGGAGGTGTCTTCGGTCACTCTTGAGGAGGCGGACGAGGTGAGTGGTGCAGCATGCTGTCGGATTATACGGACGTTGTTTGCTAACTTGTGGGATAGTTTTACAAGTCGAGGTGAGGTATCTACGTTGACCAAGAATGGGACCATGTATATGAGCGGTGTAACAACAGAATCCTGTGCTTTGAGCATTGTATGA
为从quad缺失衍生菌株中缺失里氏木霉ku80基因，将如在例如PCT公开WO 2005/001036中一般描述的标准方法为了这个目的进行改编。简言之，利用ku80缺失盒，其采用在1.3kb的5’ku80序列和2.3kb的3’ku80序列之间侧接的可选择标记，如图2中示意性显示。赋予对于除草剂氯嘧磺隆的抗性的变体里氏木霉als用作可选择标记。参见例如，PCT公开WO2008/039370。ku80敲除盒的核苷酸序列的长度为7685个碱基对：碱基1-1271对应于5′ku80同源区；碱基1280-7685对应于als-氯嘧磺隆抗性变体(A190D)；碱基5381-7685对应于3′ku80同源区。ku80敲除盒的核苷酸序列作为SEQ ID NO：1提供：
GGCCGCCTCAACACCCACACTCGAGGCACACGAGTTCATCGGCGGCTTCCCCCACAAGCTCTCGGCCAACCTGCTACCGGCTCTCTCGCGAGACTTCCCAAAGCCTACAAACGAGGTCGACGTCAAGGAGGCCCTCGAGCGCCAGCCCGGCAGATGGAGCCTCCAGGGCCAGATCAAGGCCAACAACATGAGAGCCCAGAGCGCCGCACTCCGGCTCGACGACAAGGAGGGCAAGGCGAGAGCCTTTGAGGAGGCCAAGCGCGAGCTACTGGCGTATCACCACAGCGCCCTGCGGAAGCCTTCCGGCGCAAGATAATGAGCTTGATCGCAATGACGAGTTCACGTACGCTTTGCCATATTGTTGTTGCTTTTTGTTTGGTCCTACATGTACGGCGCATTGGTTGGGAGGATATACCCACGGAGAGTGTCCGAGTGGCTTCTGGGATTTAGAGCGTCATTAGCAGGATAGAGATGGTTGGCCAGGGGAATGGAATTGACTTTTCACTACAAGGAACTTGTTCACTCTGGTGTTGATTCCCATTGCGTGACTGGTAGTAGGGAGGAATGCTTTTACTTTGTGCCACTAGACCGCAGAGAAGGGTTGGTTGCAAGCGGGGTCCGTGTATACCGACCAAGAGTGATGGGCATACAGCAACGTTTCTGAACGACTTCATTTTGTCCGAGTCTACTGGATGCGAGATGCCAGCGTGAAGCCGTACGCCACCAGGGCGACGAACTCGACAAGGTTGACGAGGGAGGAGATGCCGTGCAGCATGCCAAACTTCTTGTTGAGGGCACGCATCTCATCCGACTGTGCATCCTTGTCATACCACTCCTTTCCGTCTCGCTTGGCTGGTGGGAGGGTTCAACAAATCCATCGTCAGCCATCCGGGGTCTCAAATCAATGGCGTGCATGCGGAGTCGGGCTTGAGGCTAACCTTGTCCATGGCGGTCCTTCATGGTCTTGACAGTGGCGGGAAGCAGCACGGCGAGGTTGACGAGGCCGCTGACGAACATGGTTGCGATGGGCACCAAGGAGCTCCACTTGTTGGGAGCGTCGACGAGGCCGCCGATGCCGCCCTTGATGCCCAAGAGGGCGTTTCCGGGGAACGTGAGGGCGAGCAGCGCGGGGATGGCCGTCTGCATGCCAAAGTAGATGGGGAACAGCTTGCTCTGGATGGCGGAGAAGGAGGGCCGGCTGACGGTGCGGAACATGACGATGCCGTTGACGAAGGACTGCAGTAGCGTAGTGTGATGGTAAGCAGCTGGCCGGCGCGCCTGAGACAATGGCCGGCAATGGTAAAAAGGACCAAGATGTACTAGGTAGTTGCAATGTGGCTTATTACCTACCTACTACCTGGTAGGCACCTACTAGGTACTTGGGTAGACGGACAATGAAATTTGAAGTCGGGGTTGCAGGAAAGCAGGGCGCTGGACACATTGTGCTTCAGGCGGTACCCGTCGTCATCGTCAGCCAATGTCGAGGCCCGGCAGCCCGAGGAGCGAGACAACCTTGGCCGGAGGAGCCCGCAGGTACCTGCCAAAGCGCGGCTGGTACCTCTCAACCCTCTCAGGCCTGTTGGATGCCCTATGACATGCCCTGGGGGATGCAGCTGTTGCCCCGGCCCCGCACTTTCGGGTGACCGCGAGGCTGCTGATTGGCTGGTTGCCACGGGCTGGGCGGTCCCTGAAGTTGTTGCCATCTGAACTCTGTCGGCGCTGGCGTCGGCTGCGCCCAATGGGAGGCGAGACAACTCAGGGTACTAGAATCACTGACAGAAGAAGAGAATCGAAAGTAGGTAGACAGCCAATTCGTTGCATGGCAGGCAACCGCACAGGAGAAAAATTGACTACCCCACAATCAGGCACAGTAAGTAGGGCACAGTACGTATGTACAGACAAGGCGCAAGCGATACTGCGCGACCCGGTACCTCGCCGGCTTGACACGTGCGACAGGCTACTTTACTAGTATTCGCAGCGGCGGGTCGCGCATTATTACATGTACTGTGCCGCCATTTGATGACTGGGCTGCTGCAGTATTAGTAGATCTGCCCGGCATCGCCCTTCCATGGGCGCGACCCGGGACTGGACCCTCTGACTCTACCTACATGTACCTAGGCCGGGCCGGGCTTGGTGACTTTTGTCCGATCAGGTCGTTCGCCTGGCTACCTATTATTTCTCTTTCTTCTTCTCCATCCTGCTTCTGGCCTTGCAATTCTTCTTCGCCACTCCTCCCTCTTCCCCCCGCGATACCCTTGAATTCGTCAGAGAGGAAAAGACGAGAAAAAAAAGGGCAGCAGAGACGTCGGTCTGGCTCACGTGCTGCATCTCTGCGCACTCTCATTTTTTTTATTGTCCGACCCCTCCCTCAACCTTCTCCTTCGTTGACAGGCTAAGCCTTGCTTCGACGCTCTCTCTTTGAATTTTTCTACTTCTACCTTCTTTTCTTGCGTGTTACCCACCATAGCTCGATTCACGATGCTCCGAAGTCGCCAAGTCACAGCCAGGGCCGTCCGGGCTCTGGGCCAGGCGCGCGCCTTTACCTCGACGACCAAGCCTGTCATGATCCAGAGCAGCCAGAGGAAACAGGCCAACGCCAGCGCTGCTCCGTAAGTCGCCCATTGCCATTGCATCTTCTGTTTGATATATACTTCCTGCTGCTTGCGTGGCGTCGTCTCTCGGTTATGCGTGTCAAGGACCAGGTGTGTTCGCATCGTGGTTTTCCAGCGCCGATTACCGGGGGACGAATTTTTGGCTGCTCAACTCGCGCGCGCGCATTCTGATTCTTCGTTTTCAATCTTGAGCGACAACTGGCTAACATAATGGCCATTGGCAATTGCTTCACACAGACAAGTCCGCCCTGTACCGAGCCCTGCTTTCAACGCTGAAGACAAAGACCGCAGCCATGTGCAGCCTCTGGTCAACCCGTCGAAGCCCGACATGGATGAATCGTATGTCCACGTCCCCTCGTCCCGCCCTACAAAATGAACACGATTACACCAGAATTTTTGCAACAATCGACACTTCTATAACAGACCAATTGAGCTTTGTTCTGACCAATCATGTTGCTCTAGATTCATTGGCAAAACCGGAGGCGAAATCTTCCACGAGATGATGCTGCGACAGGGTGTCAAGCACATTTGTAGGTTCCGATGCCGGCCGCCCACACGGGCTCCATCCTTGCTCCATCTCTCCAGCTAGGCAAATCTCGCTAACCTTGAGTCACCATCCAGTCGGATACCCTGGCGGCGCTATCCTGCCCGTCTTCGACGCCATCTACAACTCAAAACACTTCGACTTCATCCTGCCCCGTCATGAGCAGGGAGCTGGCCATATGGCCGAGGGCTATGCCCGTGCCTCGGGCAAACCCGGTGTCGTCCTGGTGACTTCCGGCCCCGGTGCTACCAATGTCATCACGCCCATGCAGGATGCCCTGTCGGACGGAACGCCCTTGGTCGTCTTCTGCGGCCAGGTCCCCACCACGGCCATCGGCAGCGATGACTTCCAAGAGGCCGACGTCGTGGGCATCTCGCGGGCCTGCACCAAGTGGAACGTCATGGTCAAGAGCGTTGCTGAGCTGCCGCGGAGAATCAACGAGGCCTTTGAGATTGCCACCAGCGGCCGCCCTGGCCCCGTCCTCGTCGACCTGCCCAAGGATGTCACGGCTGGTATCCTGAGGAGAGCCATCCCTACGGAGACTGCTCTGCCGTCTCTGCCCAGTGCCGCCTCCCGCGCCGCCATGGAGCTGAGCTCCAAGCAGCTCAACGCCTCCATCAAGCGTGCCGCCGACCTCATCAACATCGCCAAGAAGCCCGTCATCTACGCCGGTCAGGGTGTCATCCAGTCCGAGGGCGGCGTTGAGCTCCTGAAGCAGCTGGCGGACAAGGCCTCCATCCCCGTCACCACCACCCTCCATGGCCTGGGTGCCTTTGATGAGCTGGACGAGAAGTCGCTGCACATGCTGGGCATGCACGGCTCGGCGTATGCCAACATGGCCATGCAGCAGGCCGACCTCATCATCGCCCTCGGCAGCCGATTCGACGACCGTGTTACTCTGAATGTCTCCAAATTTGCGCCTGCAGCCAGGCAAGCTGCTGCCGAGGGCCGCGGCGGCATCATTCACTTTGAGATCATGCCCAAGAACATCAACAAGGTCATCCAGGCGACCGAGGCCGTCGAGGGCGACGTCGCCACCAACCTGAAGCACCTCATTCCCCAGATTGCCGAAAAGTCCATGGCGGACCGAGGAGAGTGGTTCGGCCTCATCAATGAGTGGAAGAAGAAGTGGCCCCTGTCAAACTACCAGCGCGCGGAGCGGGCTGGCCTCATCAAGCCGCAGACGGTCATGGAGGAGATTAGCAACCTGACGGCCAACCGAAAGGACAAGACGTACATTGCCACGGGTGTCGGCCAGCACCAGATGTGGGTTGCCCAGCACTTCCGCTGGAGGCACCCTCGATCCATGATTACCTCTGGTGGTCTGGGCACCATGGGCTACGGTCTCCCCGCGGCCATTGGCGCCAAGGTGGCCCAGCCCGACGCTCTCGTAATTGACGTTGATGGCGATGCCTCGTTTAACATGACGCTGACGGAGCTGTCGACTGCTGCACAGTTCAACATTGGCGTCAAGGTGGTTGTGCTCAACAACGAGGAGCAGGGCATGGTGACGCAGTGGCAGAACCTCTTTTACGAGGACCGATATGCCCACACGCACCAGAAGAACCCCGACTTCATGAAGCTGGCCGACGCCATGGGCGTTCAGCACCAGCGCGTGACGGAGCCGGAGAAGCTGGTCGATGCCCTGACGTGGCTGATCAACACCGATGGCCCGGCCCTGTTGGAGGTTGTCACGGACAAGAAGGTGCCTGTCCTGCCCATGGTGCCCGCCGGATCGGCCCTGCACGAGTTCCTCGTCTTTGAACCTGGTGAGTCTACTTCAGACATATTGCTTGCGCATTGCAGATACTAACACTCTCACAGAAAAGGATAAGCAGCGCCGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGGGTGTGCACTCCTAAAGCGATGATGTCTGCGAGGGGTTCTTCGTTGAACCCTAGTTCAGGCACCATCTTACCCTCTTATTTTTTCCCGTGGGCTTTCATTTTGTGTCATCCGAGCATGACGTTGTAGGGTTGGAGTTTCTTCCTTTTTATCTTGTCATTTACTGGTACCCATAGGCGCGAGACTAGGCTTCCATGTTTTGTTTTGCGACTTTCAAAAAGTACTTTTAGTGGTTTGGGGCACGACGAGGGGGGGCAACCTCTTCTGTCGAAAAAGGTGGCTGGATGGATGAGATGAGATGAGATGAGGGTGAAGATAGATACCTGCAGTGTTTTTGACGCGACGGGATGGCGATCGCAGCACCCCCGACAGAACTCGTCGAGACTGTGCAGCCTCATATCGATGCACTGATTCACGCTGCAGACGTGAAGAAAGGTACTGATTCCATTACATATGCTTCTCTGCACACTGATGTTTGATTTGTGCTAACGCCCCCCTTAGTGCCGCCCAAGGCCAAGGGCAAGCGCCAAAGAGAAACAGTTAAACCCATCTCGGGACTGGATGTGGATGCCCTTCTGGGAGAAGAGCAGAAAGGTTCCATTAGTCCGGAGAATGCCATTCCGGACTTCAAACGAGCCCTCAACTCGTCCGAAGAAGTCGAGCAGATTGCCGACGCCACAAAACAAATGGGGGCCATTGTGCGGTCTCTCATTACGGACAGCTTCGGGGATAGCAAATATGCCCAGGCAATGGAAGGCATTGGTGCGATGCGTGAGGAGCTGATCAACCTGGAAGAGCCTGGCCTGTACAACGACTTTGTGCGCGACTTGAAGAAAAGTTTGCTATCTGGAGCCTTGGGTGGTGACAGGCGAGATTTCTGGTTCAAGATGAGGTGGGCGAAGCTGGGCCTGATTGACAAGAAACAGTCGGAGGTGTCTTCGGTCACTCTTGAGGAGGCGGACGAGGTGAGTGGTGCAGCATGCTGTCGGATTATACGGACGTTGTTTGCTAACTTGTGGGATAGTTTTACAAGTCGAGGTGAGGTATCTACGTTGACCAAGAATGGGACCATGTATATGAGCGGTGTAACAACAGAATCCTGTGCTTTGAGCATTGTATGATATGATTATTGATGAACCGGACAAAAGGGGGTAGGGGATTGATGCCATCACGACCGATTGACCAGACCTGGATTCTCGCACAGCATGGCTGCTGATTTTGTTGACCTTGCGACGTAACATCCCTGAAGAACAACCTACTATTAACCTATCATTTAGCAGAAGCTCTGTAACCTTCTTGATTCTTGTATTCAGCTTCTGAGTCTGTCAAATGTAATCATTTCGAGGTTGTGTAATTCCGGCCAAGCAGGCGGCCGTCTGCCAGCGCCTGCCTAGGCTGCACCGCAATCTGCCCAATCAGCTGCCCTTCAGTTTCGTTTGACCTTGCAGCTGCCCTTCATCCTTTATCTGCACACAATTCTTTTTCCTCTGCTCTGCGCATTCTTCTCTCTCTCGTCTCCCTTCTCAAGCTCAACTTCACCTCATCCGCTCCACTACAAGCCCTCCCGTCGTCGTCTCGCATCCTCATCTCGACTGCGGCCAGCAAAACAAGCAAAGCCGTGATCGATCCTCAGCATGGCTACCTTCAACCTCACCGTCCGCCTGGAGATGCTCAAAGAAATTGGAATCACCGTCCAATACGGCGAGCATGTAGCGAAAGAAGCAGCCAGCAACGAAGCAGCGATGGCATTCGAAGAAGAAGAAGAGTTCCCCGCCGTTGTGCCGCCCAAGGCAGAACAGCACGCCTCTGAACACGACGCTGGCCACGATGCTTGGGACGCGGCTGCCCACATCTCGACTTCGGCGCAAGAACAGCAGAAGCCCCAGGAGATGGACGACTCGTCTATCGTGATGCCGCTGGACTACTCCAAGTTTGTCGTTGGAGAGCCTGCGGACGAATCCATCAGCTTTTGCTCGTGGAAGGTCGTCGAGGCTTATCCTGACCAGTTTATCGGCAAGGCAAACAGGCCTCGTGTATGTAGCGATTGCTTTCTCTGCATTATGGGAATCTCAAGAGAGTATGGTAGAAGATAACTGACAACTTGCAGGCCAAGCCGTACTTTGACAAGATTTTGGAAGACAGAGTCTGGGATTTGTGAGGATCTTGATTGATGTGCATATGGCGACATGCCTGCTAATATCATTGTAGCTTCTATCTCTACAACCCCGAGAAGCCTTCAGAGAAGCCTCGCGTGCTGGTGCCCACTGTTCAGCTCGAAGGCTTTCTCAAAAGCATCAACAGAGCGCTCGGTACTTCTCTCACCATTCCAGGAGGGGCAAACCAGGACCGTTTTTATCTGAGGTTCGGCCAGGGAGACACCCCAAGGCCTCGATATCTACAGAGGTCGAGAGACCAGAAATCCCTAAAGATTGAAACGTTCCCCGATTTTCAACAGGCGGACTACGACAGCTTTAGGAACGCGCATGGCGCCATCCAGGAGGACTGGTTGAAGAACTGGCAGATGCTGGTACCTCGGCCGAGTTTCGACAAGAAGAAAAATGCAGACAAAAGAGCAGCCAAGAGAAGGCTCGAGCGAGAGCGAATGCTTCACAATACGCAGGAATTTCTTCATTTGGCAGGTAAGGGCAAAGGGGCTGACGTGG。
由里氏木霉Δku80 quad缺失衍生菌株产生Archy2菌株
首先，从ku80敲除菌株中缺失pyr2基因。图3中示意性描述的pyr2缺失盒含有里氏木霉cbh1启动子、潮霉素抗性基因和侧翼为5’和3’pyr2序列的部分amdS可选择标记。这使得可以在pyr2敲除转化株中筛选对于潮霉素和氟乳清酸的抗性。部分amdS基因含有该基因的3′部分，但缺乏编码区的启动子和氨基末端部分，因而是无功能的。pyr2敲除盒的核苷酸序列的长度为9259碱基对：碱基1-1994对应于pyr2 3′同源区；碱基2002-3497对应于里氏木霉cbh1启动子；碱基3563-5449对应于潮霉素抗性可选择标记；碱基5450-7440对应于构巢曲霉amdS 3′部分标记；碱基7441-9259对应于pyr25′同源区。pyr2敲除盒的核苷酸序列作为SEQ ID NO：2提供：
ATCACGCCCTCGCATAAAAGACCCTCAAGAGTCCATGTGCCCTATCTGCCTGATCTTCCTAACCCTTATTTAACATTGGCCCTATCACAACCTAGTTCTTCTTCAGCCTGCTTTGTCAACACTTGTCACGGTTCAACTCAACGTAATCAGCAGGTAGCAGGACGAGGATAGGGAGAGAAACGAAGAGAAGAAGAGGAGAGAGGAAGAAAAAAAAAAGAAAAGAAAGAAAAAGGGAAAAGGAAAGAAGGAGGAAAAGAGAAGAAAGTCAGATGAAGAAGCAAGAAGACGCCATGGTAGCCACCGCTTGTCAGGGCTCCTTAGCAACGAACAACTCTAGCTTGGGGACTTGTCGATGTGTCGTTTCCTTCCTACCCATCAGCACCAACGATGAGTTCGATATAGACGAGGACCTCATGGAAGTAGAGACCATTGGGTTCGACAGGATCTCTCAGTTTCACTTCTATGAGGTCTGTCGCTCGGATGACTTTTTGAGGAGCTTCCCCTTCTGCTTCAACCCCAAACTCTCTTTCCTGAAACCGCAGCACGTTGGCACGGCCGTGTTGCTGGAGCAGTTTGCTTTCGAGCACTCTCAGCGTGGTTTCAGCAGCCCACTGGTGAGTGGCCTCCTTTGACGTCCACACCTTGCTCCTGTCGCATGCGTATCTGGTGGGAACGACTGCTCCAAGGAGGATTGCTAACGAGGTTGTAGGCCGAATATCGCATCAGATTCTCCGGTAACCTTAGCTACGGCCTCTTCAACATCTGTGACATGACGGAGCGCAAGTACTGGTGGTTGGCGACCAAGATGCGCGGCTGGAACATCGACGGCTGCCCCGAAGACGTCAGGAGACTCATGTTTGTTCACATCATCGCCACCCTGGGATGCAGCCCCGTCGTGACGGATGAAGACATGGACTACCCCAAGAACTGGGCGGCAATTCTCCACGGTAGAGACAGATATCCGAGTGAACCTGTGGGCCACCGGCCTCATGGGCGCACCATCTGCCTCCACTCGGTGGCCGTCTGCCCTCGTCTCCAGGGCTTGGGTCTCGGTACTGCGACTCTGAAGTCGTATGTGCAGCGCATGAACAGCCTCGGCGCCGCGGACCGTGTTGCTCTCGTTTGCCGCAAGCCCGAGACGAGATTTTTTGAAAGATGCGGCTTCAGGAACAGCGGCCGGAGTAGTATCAAGACTCTGGTCGGCGAATACTACAACATGGTGTGTGCTTCCACATCGACTTGGCCAGACTCTATACGATTTTCAAACCTCGCTATACGTCATATTGACTTGTTTCTTTAGGTCTTCGATTTGCCCGGGCCCAAAGACTTTATCGACTGGAATAGCATTGCCGACGCTGCCAAGAAGATGTGAACCATTTGACTGATACGATGTGTGCTACGCATGTCGACCTTCTTTGTTTGTTTCTTTGGCGGCTCTTTGTATACCTTGGGACACGGCAGACGCATGTCTATGTGAAGAAAACGTTCACGGCGCTGTTTGCATCAGGAATATGATCATTAAACATGGAGCGTAATGGTATTAATGATCAACTAGAAAAATGGTATGGAAGGGCGAGAGGGCGATCAACAAAGCAGCCCGGGGCATAGTCTGGAAGCAGCAGGAATTGGAAGGGAAAAGGAAGCTGCACAATGAAGGGATATCGTGAGCGGAGTGGCTCACGAGAGTATCAACAGACTGGCGAAAGCAAGCAATTGCCAACGCCGGCTATTAGGCCATAAGATGGCCTGTTGTGAGTCCCAGTTGCACGTATCCCCATATGACTGCTCTGTCGCTGACTTGAAAAAAAATAGGGAGGATAAAGGAGAAAGAAAGTGAGACAACCCGTGAGGGACTTGGGGTAGTAGGAGAACACATGGGCAACCGGGCAATACACGCGATGTGAGACGAGTTCAACGGCGAATGGAAAATCTTGAAAAACAAAATAAAATAACTGCCCTCCATACGGGTATCAAATTCAAGCAGTTGTACGGAGGCTAGCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACACCTCGTGCTAGACTAGGCGCGCCAGGAAGCCCGGAAGGTAAGTGGATTCTTCGCCGTGGCTGGAGCAACCGGTGGATTCCAGCGTCTCCGACTTGGACTGAGCAATTCAGCGTCACGGATTCACGATAGACAGCTCAGACCGCTCCACGGCTGGCGGCATTATTGGTTAACCCGGAAACTCAGTCTCCTTGGCCCCGTCCCGAAGGGACCCGACTTACCAGGCTGGGAAAGCCAGGGATAGAATACACTGTACGGGCTTCGTACGGGAGGTTCGGCGTAGGGTTGTTCCCAAGTTTTACACACCCCCCAAGACAGCTAGCGCACGAAAGACGCGGAGGGTTTGGTGAAAAAAGGGCGAAAATTAAGCGGGAGACGTATTTAGGTGCTAGGGCCGGTTTCCTCCCCATTTTTCTTCGGTTCCCTTTCTCTCCTGGAAGACTTTCTCTCTCTCTCTTCTTCTCTTCTTCCATCCTCAGTCCATCTTCCTTTCCCATCATCCATCTCCTCACCTCCATCTCAACTCCATCACATCACAATCGATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTAC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由Archy2里氏木霉菌株产生Archy3菌株。
用潮霉素缺失盒转化Archy 2菌株，以在相同pyr2基因座整合且用pyr2基因的编码区替换潮霉素抗性基因。潮霉素缺失盒在图4中示出。这种将pyr2基因再引入回到pyr2基因座的做法使pyr2基因被置于里氏木霉cbh1启动子和部分amdS可选择标记之间。通过尿苷原养型和对潮霉素的敏感性来选择这个菌株。hygR敲除盒的核苷酸序列的长度为9088碱基对：碱基1-1994对应于pyr2 3′同源区；碱基1995-3497对应于里氏木霉cbh1启动子；碱基3564-5137对应于pyr2可选择标记；碱基5280-7270对应于构巢曲霉amdS3′部分标记；碱基7271-9088对应于pyr2 5′同源区。hygR敲除盒的核苷酸序列作为SEQ ID NO：3提供：
ATCACGCCCTCGCATAAAAGACCCTCAAGAGTCCATGTGCCCTATCTGCCTGATCTTCCTAACCCTTATTTAACATTGGCCCTATCACAACCTAGTTCTTCTTCAGCCTGCTTTGTCAACACTTGTCACGGTTCAACTCAACGTAATCAGCAGGTAGCAGGACGAGGATAGGGAGAGAAACGAAGAGAAGAAGAGGAGAGAGGAAGAAAAAAAAAAGAAAAGAAAGAAAAAGGGAAAAGGAAAGAAGGAGGAAAAGAGAAGAAAGTCAGATGAAGAAGCAAGAAGACGCCATGGTAGCCACCGCTTGTCAGGGCTCCTTAGCAACGAACAACTCTAGCTTGGGGACTTGTCGATGTGTCGTTTCCTTCCTACCCATCAGCACCAACGATGAGTTCGATATAGACGAGGACCTCATGGAAGTAGAGACCATTGGGTTCGACAGGATCTCTCAGTTTCACTTCTATGAGGTCTGTCGCTCGGATGACTTTTTGAGGAGCTTCCCCTTCTGCTTCAACCCCAAACTCTCTTTCCTGAAACCGCAGCACGTTGGCACGGCCGTGTTGCTGGAGCAGTTTGCTTTCGAGCACTCTCAGCGTGGTTTCAGCAGCCCACTGGTGAGTGGCCTCCTTTGACGTCCACACCTTGCTCCTGTCGCATGCGTATCTGGTGGGAACGACTGCTCCAAGGAGGATTGCTAACGAGGTTGTAGGCCGAATATCGCATCAGATTCTCCGGTAACCTTAGCTACGGCCTCTTCAACATCTGTGACATGACGGAGCGCAAGTACTGGTGGTTGGCGACCAAGATGCGCGGCTGGAACATCGACGGCTGCCCCGAAGACGTCAGGAGACTCATGTTTGTTCACATCATCGCCACCCTGGGATGCAGCCCCGTCGTGACGGATGAAGACATGGACTACCCCAAGAACTGGGCGGCAATTCTCCACGGTAGAGACAGATATCCGAGTGAACCTGTGGGCCACCGGCCTCATGGGCGCACCATCTGCCTCCACTCGGTGGCCGTCTGCCCTCGTCTCCAGGGCTTGGGTCTCGGTACTGCGACTCTGAAGTCGTATGTGCAGCGCATGAACAGCCTCGGCGCCGCGGACCGTGTTGCTCTCGTTTGCCGCAAGCCCGAGACGAGATTTTTTGAAAGATGCGGCTTCAGGAACAGCGGCCGGAGTAGTATCAAGACTCTGGTCGGCGAATACTACAACATGGTGTGTGCTTCCACATCGACTTGGCCAGACTCTATACGATTTTCAAACCTCGCTATACGTCATATTGACTTGTTTCTTTAGGTCTTCGATTTGCCCGGGCCCAAAGACTTTATCGACTGGAATAGCATTGCCGACGCTGCCAAGAAGATGTGAACCATTTGACTGATACGATGTGTGCTACGCATGTCGACCTTCTTTGTTTGTTTCTTTGGCGGCTCTTTGTATACCTTGGGACACGGCAGACGCATGTCTATGTGAAGAAAACGTTCACGGCGCTGTTTGCATCAGGAATATGATCATTAAACATGGAGCGTAATGGTATTAATGATCAACTAGAAAAATGGTATGGAAGGGCGAGAGGGCGATCAACAAAGCAGCCCGGGGCATAGTCTGGAAGCAGCAGGAATTGGAAGGGAAAAGGAAGCTGCACAATGAAGGGATATCGTGAGCGGAGTGGCTCACGAGAGTATCAACAGACTGGCGAAAGCAAGCAATTGCCAACGCCGGCTATTAGGCCATAAGATGGCCTGTTGTGAGTCCCAGTTGCACGTATCCCCATATGACTGCTCTGTCGCTGACTTGAAAAAAAATAGGGAGGATAAAGGAGAAAGAAAGTGAGACAACCCGTGAGGGACTTGGGGTAGTAGGAGAACACATGGGCAACCGGGCAATACACGCGATGTGAGACGAGTTCAACGGCGAATGGAAAATCTTGAAAAACAAAATAAAATAACTGCCCTCCATACGGGTATCAAATTCAAGCAGTTGTACGGAGGCTAGATAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACACCTCGTGCTAGACTAGGCGCGTCAATATGTGGCCGTTACTCGAGTTTATAAGTGACAACATGCTCTCAAAGCGCTCATGGCTGGCACAAGCCTGGAAAGAACCAACACAAAGCATACTGCAGCAAATCAGCTGAATTCGTCACCAATTAAGTGAACATCAACCTGAAGGCAGAGTATGAGGCCAGAAGCACATCTGGATCGCAGATCATGGATTGCCCCTCTTGTTGAAGATGAGAATCTAGAAAGATGGCGGGGTATGAGATAAGAGCGATGGGGGGGCACATCATCTTCCAAGACAAACAACCTTTGCAGAGTCAGGCAATTTTTCGTATAAGAGCAGGAGGAGGGAGTCCAGTCATTTCATCAGCGGTAAAATCACTCTAGACAATCTTCAAGATGAGTTCTGCCTTGGGTGACTTATAGCCATCATCATACCTAGACAGAAGCTTGTGGGATACTAAGACCAACGTACAAGCTCGCACTGTACGCTTTGACTTCCATGTGAAAACTCGATACGGCGCGCCTCTAAATTTTATAGCTCAACCACTCCAATCCAACCTCTGCATCCCTCTCACTCGTCCTGATCTACTGTTCAAATCAGAGAATAAGGACACTATCCAAATCCAACAGAATGGCTACCACCTCCCAGCTGCCTGCCTACAAGCAGGACTTCCTCAAATCCGCCATCGACGGCGGCGTCCTCAAGTTTGGCAGCTTCGAGCTCAAGTCCAAGCGGATATCCCCCTACTTCTTCAACGCGGGCGAATTCCACACGGCGCGCCTCGCCGGCGCCATCGCCTCCGCCTTTGCAAAGACCATCATCGAGGCCCAGGAGAAGGCCGGCCTAGAGTTCGACATCGTCTTCGGCCCGGCCTACAAGGGCATCCCGCTGTGCTCCGCCATCACCATCAAGCTCGGCGAGCTGGCGCCCCAGAACCTGGACCGCGTCTCCTACTCGTTTGACCGCAAGGAGGCCAAGGACCACGGCGAGGGCGGCAACATCGTCGGCGCTTCGCTCAAGGGCAAGAGGGTCCTGATTGTCGACGACGTCATCACCGCCGGCACCGCCAAGAGGGACGCCATTGAGAAGATCACCAAGGAGGGCGGCATCGTCGCCGGCATCGTCGTGGCCCTGGACCGCATGGAGAAGCTCCCCGCTGCGGATGGCGACGACTCCAAGCCTGGACCGAGTGCCATTGGCGAGCTGAGGAAGGAGTACGGCATCCCCATCTTTGCCATCCTCACTCTGGATGACATTATCGATGGCATGAAGGGCTTTGCTACCCCTGAGGATATCAAGAACACGGAGGATTACCGTGCCAAGTACAAGGCGACTGACTGATTGAGGCGTTCAATGTCAGAAGGGAGAGAAAGACTGAAAAGGTGGAAAGAAGAGGCAAATTGTTGTTATTATTATTATTCTATCTCGAATCTTCTAGATCTTGTCGTAAATAAACAAGC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由Archy3里氏木霉菌株A5D产生菌株。
使用本领域已知的双交换重组基因替换载体从Archy 3菌株中缺失天然里氏木霉bgl1，例如M.Ward，等人(1990年).Gene(基因)86(2)：153-62。潮霉素抗性用作bgl1缺失的可选择标记。此外，潮霉素抗性标记侧接着loxP位点。bgl1缺失盒在图5中示出。分析随后的潮霉素抗性转化株的bgl1缺失情况。随后用编码cre重组酶的端粒载体和用于选择转化株的功能性amdS转化已证实缺失bgl1的菌株，以促进通过cre重组酶表达进行的潮霉素去除和促进loxP位点的环出。编码cre重组酶的端粒载体在图7中示意性显示。转化株首先在乙酰胺培养基上获得，随后转移至马铃薯右旋糖琼脂并复制铺板到潮霉素培养基上，以筛选潮霉素敏感性。将对潮霉素敏感的菌株再次转移至马铃薯右旋糖培养基并复制铺板到乙酰胺培养基。选择已丧失其在乙酰胺上生长的能力(这指示端粒载体的丧失)的菌株。bgl1敲除盒的核苷酸序列作为SEQ ID NO：4提供：
AATGGTAGGAATGCTGGGATATAGGCTCTGTGCTGGCAAGTTGATGGATCCTCGAATGAGGCCGCCCTGCAAGGGGAACATCAGAGATCTACCATTGCCTCCTTGGCCCAATCCACTATCATACCTACCTCATGATCATTCCTGCGAAGGTCTACCAGTAAATATTTCCTCGTCCCGTGTTTCATCATGTCCAGAACCTCATCTCGCCAAATTGACTTTGCCACAGTGTCTGGAGCTGGGTAAGCAGCGTGCCAAGGAATTGTTGTCGAGTCTGTGCCAGGCATTGTGCCCGACATTGTGAACTTCAGCCAGGAGAACTTTTCGATCGCACCTATGCTGAGCACCGTGGGCATGCGATGGCTTCAATAATGCAGTTCGAGAGGGAGTGTGTCATGCCCTAAAGCTCATTGGCCACCTCCACAGGCTAGCTCTACCTGCATCTGTAGATGGACTTTCCTTGTCCTCCTCCTTCAGAAAACCTCTTGGTCGCTCGCAGGTAACTGTTGTTGCCGTCATTGTTTGACAGTGGATAGCCAAGGCAAAACCGTCTGCTTTCAACGGAAGCATTCGGCGGTTGTTTGTCATCGTGTTATCGATCGACCAGGAGAACCCAGACGAGTGTTGTTCGAGAGAATCATCGACGATGTGAAGAGGCGACGACTAGTATCTAGAAGATTATAATCGAACAAATCAGCGTTTGTCTGTCGGGCGTTTGAGGGCGCAGTTGCCCGCCAAAGCAGCGTCGCAATATATAGGCAGCGAGAGACTGTCAACAGCCAGCCGCCATGTGATCGATCGTAGCCGTCTTCCCGATCTTCCCTAAACCCCTTTCTTTGGGGGGCGGGGGCAGCGGCGTTCTAATATTTGCTGGCTGTCTGGATAACGTGAATGGTAGACATGGTAATGTTCGGTCTGCGAAACATTTGTACAATTGGAGTTTACGATCGAGATGGAAGGAAACGCTCCACAAACTCGGTGACTGGGTTGCCATCAGGTGCTCAGGGCATAGCGTTCTCTGCAAATAGAGGAAAGAGAATAGCACTAGTGAAAGTGTGAATCACAATGAAGAGGAGGTTGTTGCCGGAATGCTTTGAGCAGCGTCAAAGTTGAACTTGAAGCTATCACAAATTGCAGGGTAAAGTACATGTTGGTGCCAGTTTGACAGCACAGTGCGCGGAGCGGAGGATGTCGCGGAAGAGGCGCGACGCTAACCCGGGCCTTCTTCTCAGTGAGCAGAACTCCTGCTGCAAGAGTTCCTTCTCTCTGCGAGATGACGTGAGGCCCAATTTGCAGCTTCCCTCGAACAAGGTGATTGAACATCTCTCTTCCCTCACATTTCATCATCACTACCTCCTCAATTCACTTCTGCTTCGGCCGTCTTCATCATTCATGTTACTGCTCTGATGCCTATCCTGAAGATTGTATTCCTGCAGTATTCACGCCATCCCACCTTCGGTCCTCACTCACAGTCACAGGTCAACCGCCTTCACCCTCCTCGCGATGATGTCGGCAATCTGGTGGATCAATGTGCGGTTGAGGGCCGCCGTAGTGAGGATGGGCATGGGGAACGAGGTCGCCCATTCGCCCACAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCCTGGGCTTGTGACTGGTCGCGAGCTGCCACTAAGTGGGGCAGTACCATTTTATCGGACCCATCCAGCTATGGGACCCACTCGCAAATTTTTACATCATTTTCTTTTTGCTCAGTAACGGCCACCTTTTGTAAAGCGTAACCAGCAAACAAATTGCAATTGGCCCGTAGCAAGGTAGTCAGGGCTTATCGTGATGGAGGAGAAGGCTATATCAGCCTCAAAAATATGTTGCCAGCTGGCGGAAGCCCGGAAGGTAAGTGGATTCTTCGCCGTGGCTGGAGCAACCGGTGGATTCCAGCGTCTCCGACTTGGACTGAGCAATTCAGCGTCACGGATTCACGATAGACAGCTCAGACCGCTCCACGGCTGGCGGCATTATTGGTTAACCCGGAAACTCAGTCTCCTTGGCCCCGTCCCGAAGGGACCCGACTTACCAGGCTGGGAAAGCCAGGGATAGAATACACTGTACGGGCTTCGTACGGGAGGTTCGGCGTAGGGTTGTTCCCAAGTTTTACACACCCCCCAAGACAGCTAGCGCACGAAAGACGCGGAGGGTTTGGTGAAAAAAGGGCGAAAATTAAGCGGGAGACGTATTTAGGTGCTAGGGCCGGTTTCCTCCCCATTTTTCTTCGGTTCCCTTTCTCTCCTGGAAGACTTTCTCTCTCTCTCTTCTTCTCTTCTTCCATCCTCAGTCCATCTTCCTTTCCCATCATCCATCTCCTCACCTCCATCTCAACTCCATCACATCACAATCGATATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGAGTAGATGCCGACCGGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCATCAAACAGCTTGACGAATCTGGATATAAGATCGTTGGTGTCGATGTCAGCTCCGGAGTTGAGACAAATGGTGTTCAGGATCTCGATAAGATACGTTCATTTGTCCAAGCAGCAAAGAGTGCCTTCTAGTGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAGAATAAAACGCGTTTCGGGTTTACCTCTTCCAGATACAGCTCATCTGCAATGCATTAATGCATTGGACCTCGCAACCCTAGTACGCCCTTCAGGCTCCGGCGAAGCAGAAGAATAGCTTAGCAGAGTCTATTTTCATTTTCGGGAGACGAGATCAAGCAGATCAACGGTCGTCAAGAGACCTACGAGACTGAGGAATCCGCTCTTGGCTCCACGCGACTATATATTTGTCTCTAATTGTACTTTGACATGCTCCTCTTCTTTACTCTGATAGCTTGACTATGAAAATTCCGTCACCAGCCCCTGGGTTCGCAAAGATAATTGCACTGTTTCTTCCTTGAACTCTCAAGCCTACAGGACACACATTCATCGTAGGTATAAACCTCGAAAATCATTCCTACTAAGATGGGTATACAATAGTAACCATGGTTGCCTAGTGAATGCTCCGTAACACCCAATACGCCGGCCGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACTTGGCGCGCCTAGTGGAACACGAGCACATAAGCTTTTACCTATGGTTATCGCTTGCATCTACGCGCCGTTGATGGTGGAGGATGGTGGACGTTCCCGAGACCCCTACGAGCTGTGGCATCGTCAAACTGTGCCCACAGACCTTTGTCTTGCTTTCATAACCTCGAGGAGTGTTTCCAGACTCATCATCCATACACAAGCAGTATTAATCAAAGAAACTCGGTCGCAATGGCAAAAATGGTTTGCAAACAGAAAACTATGGCCTCTTCCTATTCCATCATTAACTACTCTACCCGTTTGTCATAACAACATCATTAAAACCCTTATGCGTCAGGTGTAGCATCCTTGATCTGTTGCTCCTCCAACGGCCAGTTCTCAATCGTTACCTCTTCTCCCACCAACTCAAACTCAAGCTTCACAGACTCGTCGGTGTTCAAGGCTAGCTCATACTTGCCGGGGTATACAATCCGGTTTCCGTGAGAATCAACACGGGCGAGAGCACTGACAGGGATGGGGATGCTGAGCTTGGAAGAGTGACCAGGCTTGATGTCGGCAAGTCGGTCGAATCCGACGAGCCACTTGTTCGGGTACGGGGCTGGGCCAGCGTTGCTTGTGCGAACAAACAGCATGGCCGTATATGGGGACTCCGTCTTGCCCGAGTTCTTGATGTTGGCCTCGAAGGTGAAGACGGGAATCTGCTCGCTGTAAGTGTATCCGGGGTGAGGAGCAGAGAGGATCGATGAGGTGTTGAACTTGAGGCTCTTGGGGTGGCTGGCGAGAGTCTCCTTGAAGGTGGTGTAGAAGAGACCACTGCCAAACTCGTAGACGGGTTTGCCGGTGTACCAGATGTAAGTCTGTCCAGGGTTTGACTTTCCATCGGGTCGGAGGTTCATGTCATTCTGGGGGAATTGGTGAACATACTCAGCCGGGTACTGAGTGGTGACCAGTCGGCCGGCAGGAGCACGCTTGCCAGAGAGAATGTCGAAGAGGGCAACGCCTCCCGACTGGCCGGGATATCCGCCCCAGACGAGGGAGTTGACCTTCTTGTTGCTCTTGAGCGAGGATGAGTCTACCTGACCACCGCCCATTTGCAGGACGACAAGGGGTTTGCCGACCTCGCTGAGCTGCTTGATGAGATCCAGCTGATTACCGGGCCAAGCAATGTCCGTGCGGTCAGCGCCCTCCTGTTCAATGGTGTTGTCAATTCCACCGAGGTAGATGATGGCATCCGACTTCTTGGCGGCAGCAATGGCCTTGGCAAAGCCAGTGGTGCTGTTGCCGGCGATCTCTGTGCCGAGTTCAAAGTTGACGTGATAGCCGGCCTTCTTAGCAGCTTCCAGAGGGCTGATGAGGTATGGGGCAGGGCCATAGTAGTTGCCTTGCATTTGGGTTGTGGCATTGGCCCATGGTCCGATCAGAGCAATGCTGCGCACCTTCTTGGACAGAGGGAGAGTGCCATCGTTCTTGAGCAGGACGATGCCCTCAACAGCAGCCTCGTACGAGATGTT
端粒质粒pTTT-cre的核苷酸序列作为SEQ ID NO：5提供：
TTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTCTAGACACGTATAACGGCACAAGTGTCTCTCACCAAATGGGTTATATCTCAAATGTGATCTAAGGATGGAAAGCCCAGAATATCGATCGCGCGCAGATCCATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGAAATAGCTTTAAGTAGCTTATTAAGTATTAAAATTATATATATTTTTAATATAACTATATTTCTTTAATAAATAGGTATTTTAAGCTTTATATATAAATATAATAATAAAATAATATATTATATAGCTTTTTATTAATAAATAAAATAGCTAAAAATATAAAAAAAATAGCTTTAAAATACTTATTTTTAATTAGAATTTTATATATTTTTAATATATAAGATCTTTTACTTTTTTATAAGCTTCCTACCTTAAATTAAATTTTTACTTTTTTTTACTATTTTACTATATCTTAAATAAAGGCTTTAAAAATATAAAAAAAATCTTCTTATATATTATAAGCTATAAGGATTATATATATATTTTTTTTTAATTTTTAAAGTAAGTATTAAAGCTAGAATTAAAGTTTTAATTTTTTAAGGCTTTATTTAAAAAAAGGCAGTAATAGCTTATAAAAGAAATTTCTTTTTCTTTTATACTAAAAGTACTTTTTTTTTAATAAGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTAAGGGTTTAAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGTTTAAACCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCT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由A5D里氏木霉菌株产生MAD6菌株。
使用与先前针对bgl1缺失描述的方法相似的方法，从A5D菌株(上文)中缺失天然egl3(参见上文)。egl3缺失盒的示意图在图6中示出。潮霉素抗性用作egl3缺失的可选择标记。潮霉素抗性标记侧接着loxP位点。转化株被证实缺失了egl3。如针对A5D菌株的产生所描述的，从这个菌株中去除潮霉素标记。如针对A5D菌株的产生所描述的，从这个菌株中去除编码cre重组酶的端粒载体。egl3敲除盒的核苷酸序列作为SEQ ID NO：6提供：
GGGAGGTAGGCGCAGATACGGTGCATGGGACCCGAACCCGTAACCGGAACACGACCTTATCAGCCCTCCAACTCACACCCTCTCGCCTATCACTATCCTAGATAGTTCATCGGCCAACTCATGTAACCTAGCTACCTACCTACCTGGTAAGAATGCGGGCTATCATGTCTCACGGCGCGGTACATGTCGGTATCTCGCTGCTTCCCCGCAGGTTGACGTCGGAATCCATGCAAGTACTCCCTGAAATCGAGACGACAGAGAGAACAACCAACGCGCTTAAACGCTTCATGTTCATCTAAGAGGCACATTCGAAGAACTAGCTTAACACACTAGACCTGGCTTTTCGACCCCCTCCGCAGAAAGCCGTTTTCTCCTCAATCCTCCCGGGCTTGGCTTTTGTCAGTCCGTACTTGCTGCGCTAACAGAGTCTTGGACGCAGCGTTTGCGCATCAGTCTTGCAGGCGGTTCACGGGACTAGGACAACAGGGGATGTGACAGGCCGGATAGTAATTATGGGTTATCCGGGGTAAGCAGGGAATTTACGAGGCCGCTTTACGTGGGGGAACAGCCACTTGCGGGGGGAAGAGGAGTAGTAGGCGACTCGGTCGATGAGCTCGAGGTGTCTGGTTGACTTGGACTGCAGAGCGTAGGTAATTGAGATCGGGCAACATTATCGGTGTTCGGCTCGGTATGGCCGAGTTGCGACTGCTTGGTCATTCGGCGAAGCTGATGTCGTGGTATCCTGAAGCATCGATATCGGAAACCATGATGGTCAGTCTATCTGACGTGTGCGGTGACAAGCGAGTCCGGATTTTGTGACATGACGTTCAACTTCAGTCAATGCCTTAGGGCTCGATAAGATTAAGATTGGGTTCTGGCAGCGGTCTAGAACACCGCCACAAATTCTGTCCATTGAGGAGCGTGATGTCTAGGCGCATCACTAACACGGAGCTGTATGACCGGCAGCTCAACGGACTTCTCTTCGTTCAACGGCAGTCTATTTGCGGTACACGAATGGATCTTTCTTCCTGGTCTTGAAGTGCCGCAGTGGCGTGCGAATGTATAGATGTCTCGCTACCTAGAAAAGCTGGCTTTTCTGACAGGGTCCCTTCCACCTCTCCTACCAACGACAAACTGAACAAGTATCTGGCGGTTTCCCAACGCCGAATAGGCCAGTCGCCAATACTCCCTCCAGCCCTGATTGGGCCCCTCGAAGTATCGCCATGTCTGTGTGTTGAGATTATTCGATGGACGTCACTCCCCCAACCTACAGGAAGAGCAAAATGGGAGCAGTGTTCTGCAATGAGCTATATAATAGATCGCTCGATCTCATACAAATTGTATGCTCAGTCAATACAACGAGCGGTTCCAAGATCCCTTCTCCAACGACCCTCGAAACATTGCAACCCGGTGCAGCCTGAACTTGTTCGTATAGCCTAGAAAGCGACGCCATCTTCATCTTTTACGCGATTAGCCTCATGGCTATTTGTGCCGAAGTGGGAGTTGTATGGTAGCAGTGAGGAGATTGTGGCTACGACACAGGCGGGTTCTCTTGAGCGGCTTACATCTCCGCATTAGGCCTGCGTACGATCCAGATCATGGGAAACTTTACAATGGCTTACTCGTTTTATCTCAACACTGAGCTTCCAATTCACTCTATGCATTGATTAACACGTTTGGTCATGTGGTTCTTCAGCTGTAAATCTTCAGCTTCCCAAGAATTGCAACCTCGCTGATTGCTAATAGTGTTGCATGCGTTGCATCCTGGTGCGGCAGTGCAAAGGAGAGTCAAAGTAGCCGGCAGATTAATTTAAGCTTATATCACTCAGGGGTAAACAGCCGTAAAGGACCTTTTGATCTAACATGCCGATGTGTATGTAGATCACGCAATGCCCACCATATCTTGGCAGTCAGATTTGTCCGTGGCGCGCCAAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGGCCGGCGTATTGGGTGTTACGGAGCATTCACTAGGCAACCATGGTTACTATTGTATACCCATCTTAGTAGGAATGATTTTCGAGGTTTATACCTACGATGAATGTGTGTCCTGTAGGCTTGAGAGTTCAAGGAAGAAACAGTGCAATTATCTTTGCGAACCCAGGGGCTGGTGACGGAATTTTCATAGTCAAGCTATCAGAGTAAAGAAGAGGAGCATGTCAAAGTACAATTAGAGACAAATATATAGTCGCGTGGAGCCAAGAGCGGATTCCTCAGTCTCGTAGGTCTCTTGACGACCGTTGATCTGCTTGATCTCGTCTCCCGAAAATGAAAATAGACTCTGCTAAGCTATTCTTCTGCTTCGCCGGAGCCTGAAGGGCGTACTAGGGTTGCGAGGTCCAATGCATTAATGCATTGCAGATGAGCTGTATCTGGAAGAGGTAAACCCGAAACGCGTTTTATTCTTGTTGACATGGAGCTATTAAATCACTAGAAGGCACTCTTTGCTGCTTGGACAAATGAACGTATCTTATCGAGATCCTGAACACCATTTGTCTCAACTCCGGAGCTGACATCGACACCAACGATCTTATATCCAGATTCGTCAAGCTGTTTGATGATTTCAGTAACGTTAAGTGGATCCCGGTCGGCATCTACTCTATTCCTTTGCCCTCGGACGAGTGCTGGGGCGTCGGTTTCCACTATCGGCGAGTACTTCTACACAGCCATCGGTCCAGACGGCCGCGCTTCTGCGGGCGATTTGTGTACGCCCGACAGTCCCGGCTCCGGATCGGACGATTGCGTCGCATCGACCCTGCGCCCAAGCTGCATCATCGAAATTGCCGTCAACCAAGCTCTGATAGAGTTGGTCAAGACCAATGCGGAGCATATACGCCCGGAGCCGCGGCGATCCTGCAAGCTCCGGATGCCTCCGCTCGAAGTAGCGCGTCTGCTGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATGGCCTCCGCGACCGGCTGCAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTGAATTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACATATCCACGCCCTCCTACATCGAAGCTGAAAGCACGAGATTCTTCGCCCTCCGAGAGCTGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAACTTTTCGATCAGAAACTTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTCATATCGATTGTGATGTGATGGAGTTGAGATGGAGGTGAGGAGATGGATGATGGGAAAGGAAGATGGACTGAGGATGGAAGAAGAGAAGAAGAGAGAGAGAGAAAGTCTTCCAGGAGAGAAAGGGAACCGAAGAAAAATGGGGAGGAAACCGGCCCTAGCACCTAAATACGTCTCCCGCTTAATTTTCGCCCTTTTTTCACCAAACCCTCCGCGTCTTTCGTGCGCTAGCTGTCTTGGGGGGTGTGTAAAACTTGGGAACAACCCTACGCCGAACCTCCCGTACGAAGCCCGTACAGTGTATTCTATCCCTGGCTTTCCCAGCCTGGTAAGTCGGGTCCCTTCGGGACGGGGCCAAGGAGACTGAGTTTCCGGGTTAACCAATAATGCCGCCAGCCGTGGAGCGGTCTGAGCTGTCTATCGTGAATCCGTGACGCTGAATTGCTCAGTCCAAGTCGGAGACGCTGGAATCCACCGGTTGCTCCAGCCACGGCGAAGAATCCACTTACCTTCCGGGCTTCCGCCAGCTGGCAACATATTTTTGAGGCTGATATAGCCTTCTCCTCCATCACGATAAGCCCTGACTACCTTGCTACGGGCCAATTGCAATTTGTTTGCTGGTTACGCTTTACAAAAGGTGGCCGTTACTGAGCAAAAAGAAAATGATGTAAAAATTTGCGAGTGGGTCCCATAGCTGGATGGGTCCGATAAAATGGTACTGCCCCACTTAGTGGCAGCTCGCGACCAGTCACAAGCCCAGGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTGTGGGCGTTATGAATAATAGACTGGAACCGGGCCCTTTGATTGACGACTCCATATTTTGTAGATGTAGCAACTCGGCAAGAGCATTATGTGCAATACATTTGTTACCATACAAAGGCAGCTGCCAGACGACTTGTATTGCGTACAATTCTCACGGCAAGCTTTCCAGGTGTTATGCATTATGCGCAAATGCTTGATGCTTACCGCAGGATTAATCTCGGAAGAAGCGCTGCAAGCTATATGGGTGTAGTAGATATGTAGATGTACCAACCAATGAAGAACATTTATGGTCTAGAACGTAGTGATGAAGGTTTTGAGTAATTTGTATCAAGTAAGACGATATTATTGATATAATACCAAGCATATATTCATGATAAATTACTTGGAACCACCCTTGCGTCCGGCCTCACGAGCCTTCTCACTGCCGGGCTCGAAGGAGCCACTGGAGGCCTGTCCACCCTTGGATGCGATTTCCTGCACCTTTTCCTTGGGCCTGCACGTCGATTAGACATGATTCAAATCGAGATCTTGGAATATCTTACATGCTGGCGAA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实施例2
酶表达比较：Qnad缺失菌株与MAD6菌株比较
1.载体的制备
在里氏木霉菌株、Archy3和quad缺失菌株中表达两种糖基水解酶家族43蛋白质。使用
Figure BDA00002493634900681
克隆系统(英杰公司(Invitrogen))，由拟轮生镰刀菌(Fusarium verticillioides)基因组DNA克隆基因fv43B和fv43C，并装配成表达载体pTrex3gM。如图9中所示，最初将这两个基因克隆到pENTR/D-TOPO载体(英杰公司)中。
随后将基因重组到载体pTrex3gM中，在其中cbhI启动子处于目的基因的编码序列的上游，并且cbhI终止子处于目的基因的终止密码子的下游。该载体另外含有位于cbhI终止子3′的构巢曲霉酰胺酶(amdS)可选择标记。该载体在图10中示出。
所得到的Fv43B表达载体pTrex3gM-Fv43B，示意性显示于图11中。
表达载体pTrex3gM中的Fv43B糖基水解酶的完全核苷酸序列作为SEQID NO：14提供如下。
TTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTCTAGAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGGCCATTTAGGCCTCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATA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所得到的Fv43C表达载体pTrex3gM-Fv43C，示意性显示于图12中。
表达载体pTrex3gM中的Fv43C糖基水解酶的完全核苷酸序列作为SEQID NO：15提供如下。
TTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACCGTGACCCCGTGGACGCCATACAAGCACGATTTCGGCCACGATCTCATCTCCCATATCTACGCGGCTGACGGCAGCGCCGACGTAATGCGCGATATCAGTGCATCCGGCGAGCCGGCGATTCCAAATATCAAAGACCTACTGAACCCGAACATCAAAGCTGTTAACATGAACGAGCTCTGGGACACGCATCTCCAGAAGTGGAATTACCAGATGGAGTACCTTGAGAAATGGCGGGAGGCTGAAGAAAAGGCCGGGAAGGAACTGGACGCCATCATCGCGCCGATTACGCCTACCGCTGCGGTACGGCATGACCAGTTCCGGTACTATGGGTATGCCTCTGTGATCAACCTGCTGGATTTCACGAGCGTGGTTGTTCCGGTTACCTTTGCGGATAAGAACATCGATAAGAAGAATGAGAGTTTCAAGGCGGTTAGTGAGCTTGATGCCCTCGTGCAGGAAGAGTATGATCCGGAGGCGTACCATGGGGCACCGGTTGCAGTGCAGGTTATCGGACGGAGACTCAGTGAAGAGAGGACGTTGGCGATTGCAGAGGAAGTGGGGAAGTTGCTGGGAAATGTGGTGACTCCATAGCTAATAAGTGTCAGATAGCAATTTGCACAAGAAATCAATACCAGCAACTGTAAATAAGCGCTGAAGTGACCATGCCATGCTACGAAAGAGCAGAAAAAAACCTGCCGTAGAACCGAAGAGATATGACACGCTTCCATCTCTCAAAGGAAGAATCCCTTCAGGGTTGCGTTTCCAGTCTAGAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGGCCATTTAGGCCTCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAATCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGAAAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTCCATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGCGATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGACATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCACTATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGCGTCTTCTATCGTTTCCCAGCCATCTCCTCGTGGCCTTCCTAACCCTCAAAGAGGCTTCATCCCTCGCCCTCAGCAAACGGGATAGCCCTGTCCTCCCCGGCCTCTGGGCGGACCCCAACATCGCCATCGTCGACAAGACATACTACATCTTCCCTACCACCGACGGTTTCGAAGGCTGGGGCGGCAACGTCTTCTACTGGTGGAAATCAAAAGATCTCGTATCATGGACAAAGAGCGACAAGCCATTCCTTACTCTCAATGGTACGAATGGCAACGTTCCCTGGGCTACAGGTAATGCCTGGGCTCCTGCTTTCGCTGCTCGCGGAGGCAAGTATTACTTCTACCATAGTGGGAATAATCCCTCTGTGAGTGATGGGCATAAGAGTATTGGTGCGGCGGTGGCTGATCATCCTGAGGGGCCGTGGAAGGCACAGGATAAGCCGATGATCAAGGGAACTTCTGATGAGGAGATTGTCAGCAACCAGGCTATCGATCCCGCTGCCTTTGAAGACCCTGAGACTGGAAAGTGGTATATCTACTGGGGAAACGGTGTCCCCATTGTCGCAGAGCTCAACGACGACATGGTCTCTCTCAAAGCAGGCTGGCACAAAATCACAGGTCTTCAGAATTTCCGCGAGGGTCTTTTCGTCAACTATCGCGATGGAACATATCATCTGACATACTCTATCGACGATACGGGCTCAGAGAACTATCGCGTTGGGTACGCTACGGCGGATAACCCCATTGGACCTTGGACATATCGTGGTGTTCTTCTGGAGAAGGACGAATCGAAGGGCATTCTTGCTACGGGACATAACTCCATCATCAACATTCCTGGAACGGATGAGTGGTATATCGCGTATCATCGCTTCCATATTCCCGATGGAAATGGGTATAATAGGGAGACTACGATTGATAGGGTACCCATCGACAAGGATACGGGTTTGTTTGGAAAGGTTACGCCGACTTTGCAGAGTGTTGATCCTAGGCCTTTGTAGAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTC
Fv43B，(来自拟轮生镰刀菌的GH43家族酶)的核苷酸序列作为SEQ IDNO：16提供如下：
ATGCGCTTCTCTTGGCTATTGTGCCCCCTTCTAGCGATGGGAAGTGCTCTTCCTGAAACGAAGACGGATGTTTCGACATACACCAACCCTGTCCTTCCAGGATGGCACTCGGATCCATCGTGTATCCAGAAAGATGGCCTCTTTCTCTGCGTCACTTCAACATTCATCTCCTTCCCAGGTCTTCCCGTCTATGCCTCAAGGGATCTAGTCAACTGGCGTCTCATCAGCCATGTCTGGAACCGCGAGAAACAGTTGCCTGGCATTAGCTGGAAGACGGCAGGACAGCAACAGGGAATGTATGCACCAACCATTCGATACCACAAGGGAACATACTACGTCATCTGCGAATACCTGGGCGTTGGAGATATTATTGGTGTCATCTTCAAGACCACCAATCCGTGGGACGAGAGTAGCTGGAGTGACCCTGTTACCTTCAAGCCAAATCACATCGACCCCGATCTGTTCTGGGATGATGACGGAAAGGTTTATTGTGCTACCCATGGCATCACTCTGCAGGAGATTGATTTGGAAACTGGAGAGCTTAGCCCGGAGCTTAATATCTGGAACGGCACAGGAGGTGTATGGCCTGAGGGTCCCCATATCTACAAGCGCGACGGTTACTACTATCTCATGATTGCCGAGGGTGGAACTGCCGAAGACCACGCTATCACAATCGCTCGGGCCCGCAAGATCACCGGCCCCTATGAAGCCTACAATAACAACCCAATCTTGACCAACCGCGGGACATCTGAGTACTTCCAGACTGTCGGTCACGGTGATCTGTTCCAAGATACCAAGGGCAACTGGTGGGGTCTTTGTCTTGCTACTCGCATCACAGCACAGGGAGTTTCACCCATGGGCCGTGAAGCTGTTTTGTTCAATGGCACATGGAACAAGGGCGAATGGCCCAAGTTGCAACCAGTACGAGGTCGCATGCCTGGAAACCTCCTCCCAAAGCCGACGCGAAACGTTCCCGGAGATGGGCCCTTCAACGCTGACCCAGACAACTACAACTTGAAGAAGACTAAGAAGATCCCTCCTCACTTTGTGCACCATAGAGTCCCAAGAGACGGTGCCTTCTCTTTGTCTTCCAAGGGTCTGCACATCGTGCCTAGTCGAAACAACGTTACCGGTAGTGTGTTGCCAGGAGATGAGATTGAGCTATCAGGACAGCGAGGTCTAGCTTTCATCGGACGCCGCCAAACTCACACTCTGTTCAAATATAGTGTTGATATCGACTTCAAGCCCAAGTCCGATGATCAGGAAGCTGGAATCACCGTTTTCCGCACGCAGTTCGACCATATCGATCTTGGCATTGTTCGTCTTCCTACAAACCAAGGCAGCAACAAGAAATCTAAGCTTGCCTTCCGATTCCGGGCCACAGGAGCTCAGAATGTTCCTGCACCGAAGGTAGTACCGGTCCCCGATGGCTGGGAGAAGGGCGTAATCAGTCTACATATCGAGGCAGCCAACGCGACGCACTACAACCTTGGAGCTTCGAGCCACAGAGGCAAGACTCTCGACATCGCGACAGCATCAGCAAGTCTTGTGAGTGGAGGCACGGGTTCATTTGTTGGTAGTTTGCTTGGACCTTATGCTACCTGCAACGGCAAAGGATCTGGAGTGGAATGTCCCAAGGGAGGTGATGTCTATGTGACCCAATGGACTTATAAGCCCGTGGCACAAGAGATTGATCATGGTGTTTTTGTGAAATCAGAATTGTAG
Fv43B的蛋白质序列作为SEQ ID NO：17提供如下：
MRFSWLLCPLLAMGSALPETKTDVSTYTNPVLPGWHSDPSCIQKDGLFLCVTSTFISFPGLPVYASRDLVNWRLISHVWNREKQLPGISWKTAGQQQGMYAPTIRYHKGTYYVICEYLGVGDIIGVIFKTTNPWDES SWSDPVTFKPNHIDPDLFWDDDGKVYCATHGITLQEIDLETGELSPELNIWNGTGGVWPEGPHIYKRDGYYYLMIAEGGTAEDHAITIARARKITGPYEAYNNNPILTNRGTSEYFQTVGHGDLFQDTKGNWWGLCLATRITAQGVSPMGREAVLFNGTWNKGEWPKLQPVRGRMPGNLLPKPTRNVPGDGPFNADPDNYNLKKTKKIPPHFVHHRVPRDGAFSLSSKGLHIVPSRNNVTGSVLPGDEIELSGQRGLAFIGRRQTHTLFKYSVDIDFKPKSDDQEAGITVFRTQFDHIDLGIVRLPTNQGSNKKSKLAFRFRATGAQNVPAPKVVPVPDGWEKGVISLHIEAANATHYNLGASSHRGKTLDIATASASLVSGGTGSFVGSLLGPYATCNGKGSGVECPKGGDVYVTQWTYKPVAQEIDHGVFVKSEL
Fv43C，(来自拟轮生镰刀菌的GH43家族酶)的核苷酸序列作为SEQ IDNO：18提供如下：
ATGCGTCTTCTATCGTTTCCCAGCCATCTCCTCGTGGCCTTCCTAACCCTCAAAGAGGCTTCATCCCTCGCCCTCAGCAAACGGGATAGCCCTGTCCTCCCCGGCCTCTGGGCGGACCCCAACATCGCCATCGTCGACAAGACATACTACATCTTCCCTACCACCGACGGTTTCGAAGGCTGGGGCGGCAACGTCTTCTACTGGTGGAAATCAAAAGATCTCGTATCATGGACAAAGAGCGACAAGCCATTCCTTACTCTCAATGGTACGAATGGCAACGTTCCCTGGGCTACAGGTAATGCCTGGGCTCCTGCTTTCGCTGCTCGCGGAGGCAAGTATTACTTCTACCATAGTGGGAATAATCCCTCTGTGAGTGATGGGCATAAGAGTATTGGTGCGGCGGTGGCTGATCATCCTGAGGGGCCGTGGAAGGCACAGGATAAGCCGATGATCAAGGGAACTTCTGATGAGGAGATTGTCAGCAACCAGGCTATCGATCCCGCTGCCTTTGAAGACCCTGAGACTGGAAAGTGGTATATCTACTGGGGAAACGGTGTCCCCATTGTCGCAGAGCTCAACGACGACATGGTCTCTCTCAAAGCAGGCTGGCACAAAATCACAGGTCTTCAGAATTTCCGCGAGGGTCTTTTCGTCAACTATCGCGATGGAACATATCATCTGACATACTCTATCGACGATACGGGCTCAGAGAACTATCGCGTTGGGTACGCTACGGCGGATAACCCCATTGGACCTTGGACATATCGTGGTGTTCTTCTGGAGAAGGACGAATCGAAGGGCATTCTTGCTACGGGACATAACTCCATCATCAACATTCCTGGAACGGATGAGTGGTATATCGCGTATCATCGCTTCCATATTCCCGATGGAAATGGGTATAATAGGGAGACTACGATTGATAGGGTACCCATCGACAAGGATACGGGTTTGTTTGGAAAGGTTACGCCGACTTTGCAGAGTGTTGATCCTAGGCCTTTGTAG
Fv43C的蛋白质序列作为SEQ ID NO：19提供如下：
MRLLSFPSHLLVAFLTLKEASSLALSKRDSPVLPGLWADPNIAIVDKTYYIFPTTDGFEGWGGNVFYWWKSKDLVSWTKSDKPFLTLNGTNGNVPWATGNAWAPAFAARGGKYYFYHSGNNPSVSDGHKSIGAAVADHPEGPWKAQDKPMIKGTSDEEIVSNQAIDPAAFEDPETGKWYIYWGNGVPIVAELNDDMVSLKAGWHKITGLQNFREGLFVNYRDGTYHLTYSIDDTGSENYRVGYATADNPIGPWTYRGVLLEKDESKGILATGHNSIINIPGTDEWYIAYHRFHIPDGNGYNRETTIDRVPIDKDTGLFGKVTPTLQSVDPRPL
将pTrex3gM-Fv43B和pTrex3gM-Fv43C载体各自独立地通过PEG介导的原生质体融合转化到MAD6菌株中，并通过粒子轰击转化到quad缺失的菌株中。
2.quad缺失的里氏木霉菌株的转化。
根据制造商的说明书且如美国专利申请公开US 2006/0003408的实施例2中所述，通过PDS-1000/氦系统(位于加利福尼亚州Hercules的伯乐公司(Biorad，Hercules，CA))，使用生物射弹粒子轰击，将载体pTrex3gM-Fv43B和载体pTrex3gM-Fv43C独立地转化到里氏木霉quad缺失的菌株中。
3.用fv43B和fv43C转化的里氏木霉quad缺失克隆的SDS-PAGE
如PCT公开WO 2011/038019中所述，将稳定转化株在96孔微量滴定板中生长。将培养上清液在SDS-PAGE上跑胶，然后用Simply Blue染剂(英杰公司)进行考马斯蓝染色。通过密度测定法扫描并分析凝胶。使用ImageJ(来自美国国立卫生研究院(National Institutes of Health))并通过采用Analyze Gel子菜单功能(如用户指南的小节27.13中所述)，完成图像处理和条带亮度定量。将对应于Fv43B蛋白的条带进行定量并以占总蛋白质的百分比报告。图13提供了从用fv43B转化的里氏木霉quad缺失克隆表达的蛋白质的SDS-PAGE照片。
将对应于Fv43C蛋白的条带进行定量并以占总蛋白质的百分比报告。Fv43C在凝胶上跑出代表不同糖形的两个条带，将这两个条带汇总在密度测定法分析中。从用Fv43C转化的里氏木霉quad缺失克隆表达的蛋白质的SDS-PAGE显示于图14中。
4.PEG介导的MAD6里氏木霉菌株的原生质体融合转化
使用引物1061F和1085R，通过PCR各自扩增载体pTrex3gM-Fv43B和pTrex3gM-Fv43C的表达盒部分，以分别生成5.1kb和4.4kb的线性DNA片段，将它们用于PEG介导的MAD6菌株的原生质体融合转化(参见例如，Pentilla，M.，等人(1987)Gene(基因)61(2)：155-164)。
1061F：5’-GACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT-3’(SEQ ID NO：20)
1085R：5’-GTGTGACCGGCTTTGGCGAGTG-3’(SEQ ID NO：21)
为了制备原生质体，使用10mg/mL的来自哈茨木霉的裂解酶(西格玛公司(Sigma)目录号L1412)。在与转化DNA和PEG一起温育后，将原生质体加到冷却的具有0.5％尿苷的熔化山梨糖醇/乙酰胺琼脂。将板在30℃下温育。24小时后，将相等体积的补充有0.5％尿苷和1.2g/L 5-氟乳清酸(FOA)的相同培养基以覆盖层的形式加入板中。将板在30℃下温育一周。熔化的山梨糖醇/乙酰胺琼脂使用下述配方制备：
山梨糖醇/乙酰胺琼脂
第I部分
Figure BDA00002493634900831
用milliQ H2O定容到300mL
第II部分
山梨糖醇218g
低熔点琼脂糖20g
定容到700mL
将第I部分和第II部分分别高压灭菌，随后合并。
1000x盐(每L)
过滤灭菌(0.22微米)
5.用fv43B或fv43C转化的里氏木霉MAD6克隆的SDS-PAGE
如PCT公开WO 2011/038019中所述，使Fv43B的三个转化株和Fv43C的两个转化株在96孔微量滴定板中生长。将培养上清液在SDS-PAGE上跑胶，然后用Simply Blue染剂(英杰公司)进行考马斯蓝染色。通过密度测定法扫描并分析凝胶。使用ImageJ(来自美国国立卫生研究院)且通过采用Analyze Gel子菜单功能(如用户指南的小节27.13中所述)，完成图像处理和条带亮度定量。图15显示了用fv43B和fv43C转化的里氏木霉MAD6克隆的SDS-PAGE。将对应于Fv43C蛋白质的条带定量并以占总蛋白质的百分比报告。Fv43C蛋白质在凝胶上跑出代表不同糖形的两个条带，将这两个条带汇总在密度测定法分析中。
6.所表达蛋白质的量的定量测量
将quad缺失菌株所表达的蛋白质的量与通过MAD6菌株达到的量进行比较。如上所述，通过密度测定法扫描并分析相关凝胶，图13、14和15。使用ImageJ(来自美国国立卫生研究院)且通过采用Analyze Gel子菜单功能(如用户指南的小节27.13中所述)，完成图像处理和条带亮度定量。将对应于每种目的蛋白的条带进行定量并以占总蛋白质的百分比报告。Fv43C在凝胶上跑出代表不同糖形的两个条带，将这两个条带汇总在密度测定法分析中。这个分析的结果汇总于下表2-1中：
  泳道   Fv43B/Quad缺失   泳道   Fv43C/Quad缺失   Fv43B/MAD6   Fv43C/MAD6
  1   3％   1   21％   38％
  2   11％   2   30％   38％
  3   23％   3   27％   36％
  4   17％   4   2％   26％
  5   7％   5   2％   26％
  6   9％   6   21％
  7   3％   7   4％
  8   17％   8   40％
  M   (宿主)   9   28％
  M   (宿主)   10   19％
  M   (宿主)
这个比较明确表明，使用MAD6菌株进行的表达导致可靠得多的表达，表达水平的可变性很低(例如小于20％可变性)。相比之下，使用quad缺失菌株，大部分的转化株未能表达目的蛋白，并且表达的可变性很大(例如大于50％可变性)。
实施例3
红褐肉座菌CBH2DNA文库的生成
含有红褐肉座菌CBH2蛋白编码序列的pTTTpyrG-cbh2质粒(参见例如，PCT公开WO 2010/141779)用作参考序列，以用于产生编码CBH2变体酶的DNA文库。
SEQ ID NO：7示出参考红褐肉座菌CBH2编码DNA序列：
ATGATTGTCGGCATTCTCACCACGCTGGCTACGCTGGCCACACTCGCAGCTAGTGTGCCTCTAGAGGAGCGGCAAGCTTGCTCAAGCGTCTGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACATGCGTCTACTCCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCGTCGACGACTTCTCGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGCTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTACTACTACCAGAGTACCTCCAGTCGGATCGGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCTTTTGTTGGGGTCACTCCTTGGGCCAATGCATATTACGCCTCTGAAGTTAGCAGCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCTGCAGCAGCTGTCGCAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCACCGCCAACAAGAATGGCGGTAACTATGCCGGACAGTTTGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAATATTCCGATATCCGGACCCTCCTGGTTATTGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAGTGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCTTGAGTGCATCAACTACGCCGTCACACAGCTGAACCTTCCAAATGTTGCGATGTATTTGGACGCTGGCCATGCAGGATGGCTTGGCTGGCCGGCAAACCAAGACCCGGCCGCTCAGCTATTTGCAAATGTTTACAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCTCTTCGCGGATTGGCAACCAATGTCGCCAACTACAACGGGTGGAACATTACCAGCCCCCCATCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACCTCTTCTTGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAACAGTGGGGAGACTGGTGCAATGTGATCGGCACCGGATTTGGTATTCGCCCATCCGCAAACACTGGGGACTCGTTGCTGGATTCGTTTGTCTGGGTCAAGCCAGGCGGCGAGTGTGACGGCACCAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTTGACTCCCACTGTGCGCTCCCAGATGCCTTGCAACCGGCGCCTCAAGCTGGTGCTTGGTTCCAAGCCTACTTTGTGCAGCTTCTCACAAACGCAAACCCATCGTTCCTGTAA.
SEQ ID NO：8是红褐肉座菌CBH2全长蛋白序列：
MIVGILTTLATLATLAASVPLEERQACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWTQAYFVQLLTNANPSFL
SEQ ID NO：9是红褐肉座菌CBH2成熟蛋白序列：
QACSSVWGQCGGQNWSGPTCCASGSTCVYSNDYYSQCLPGAASSSSSTRAASTTSRVSPTTSRSSSATPPPGSTTTRVPPVGSGTATYSGNPFVGVTPWANAYYASEVSSLAIPSLTGAMATAAAAVAKVPSFMWLDTLDKTPLMEQTLADIRTANKNGGNYAGQFVVYDLPDRDCAALASNGEYSIADGGVAKYKNYIDTIRQIVVEYSDIRTLLVIEPDSLANLVTNLGTPKCANAQSAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWPANQDPAAQLFANVYKNASSPRALRGLATNVANYNGWNITSPPSYTQGNAVYNEKLYIHAIGPLLANHGWSNAFFITDQGRSGKQPTGQQQWGDWCNVIGTGFGIRPSANTGDSLLDSFVWVKPGGECDGTSDSSAPRFDSHCALPDALQPAPQAGAWFQAYFVQLLTNANPSFL
合成的CBH2组合文库由GeneOracle(加利福尼亚州山景城(MountainView，CA))制备。用多个其他氨基酸残基置换CBH2的多个氨基酸残基。表3-1列出了CBH2组合文库的成员的置换(编号根据CBH2成熟氨基酸序列)。
Figure BDA00002493634900871
文库作为纯化的PCR产物提供，其中引物
GACCGGACGTGTTTTGCCCTTCAT(SEQ ID NO：10)和
GTGTGACCGGCTTTGGCGAGTG(SEQ ID NO：11)
用于扩增cbh2基因，该基因上游侧接着约1.1kb的cbh1启动子且下游侧接着约1.85kb的amdS标记，以在红褐肉座菌宿主菌株的pyr2基因座中强迫整合。该表达盒同源重组到筛选菌株中的示意图在图8中示出。使用以上引物从pTTTpyrG-CBH2扩增的PCR片段(部分cbh1启动子、cbh2基因和部分amdS基因)的核苷酸序列作为SEQ ID NO：12提供如下：
GACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGCTTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATCTGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAAGCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATACCAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAACGGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTGTTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTGATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGTCTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAAGTCGGCACTGAACAGGCAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCGGGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGTTCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAAACGGAATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCCCCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCCACCATGATTGTCGGCATTCTCACCACGCTGGCTACGCTGGCCACACTCGCAGCTAGTGTGCCTCTAGAGGAGCGGCAAGCTTGCTCAAGCGTCTGGTAATTATGTGAACCCTCTCAAGAGACCCAAATACTGAGATATGTCAAGGGGCCAATGTGGTGGCCAGAATTGGTCGGGTCCGACTTGCTGTGCTTCCGGAAGCACATGCGTCTACTCCAACGACTATTACTCCCAGTGTCTTCCCGGCGCTGCAAGCTCAAGCTCGTCCACGCGCGCCGCGTCGACGACTTCTCGAGTATCCCCCACAACATCCCGGTCGAGCTCCGCGACGCCTCCACCTGGTTCTACTACTACCAGAGTACCTCCAGTCGGATCGGGAACCGCTACGTATTCAGGCAACCCTTTTGTTGGGGTCACTCCTTGGGCCAATGCATATTACGCCTCTGAAGTTAGCAGCCTCGCTATTCCTAGCTTGACTGGAGCCATGGCCACTGCTGCAGCAGCTGTCGCAAAGGTTCCCTCTTTTATGTGGCTGTAGGTCCTCCCGGAACCAAGGCAATCTGTTACTGAAGGCTCATCATTCACTGCAGAGATACTCTTGACAAGACCCCTCTCATGGAGCAAACCTTGGCCGACATCCGCACCGCCAACAAGAATGGCGGTAACTATGCCGGACAGTTTGTGGTGTATGACTTGCCGGATCGCGATTGCGCTGCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACTCTATTGCCGATGGTGGCGTCGCCAAATATAAGAACTATATCGACACCATTCGTCAAATTGTCGTGGAATATTCCGATATCCGGACCCTCCTGGTTATTGGTATGAGTTTAAACACCTGCCTCCCCCCCCCCTTCCCTTCCTTTCCCGCCGGCATCTTGTCGTTGTGCTAACTATTGTTCCCTCTTCCAGAGCCTGACTCTCTTGCCAACCTGGTGACCAACCTCGGTACTCCAAAGTGTGCCAATGCTCAGTCAGCCTACCTTGAGTGCATCAACTACGCCGTCACACAGCTGAACCTTCCAAATGTTGCGATGTATTTGGACGCTGGCCATGCAGGATGGCTTGGCTGGCCGGCAAACCAAGACCCGGCCGCTCAGCTATTTGCAAATGTTTACAAGAATGCATCGTCTCCGAGAGCTCTTCGCGGATTGGCAACCAATGTCGCCAACTACAACGGGTGGAACATTACCAGCCCCCCATCGTACACGCAAGGCAACGCTGTCTACAACGAGAAGCTGTACATCCACGCTATTGGACCTCTTCTTGCCAATCACGGCTGGTCCAACGCCTTCTTCATCACTGATCAAGGTCGATCGGGAAAGCAGCCTACCGGACAGCAACAGTGGGGAGACTGGTGCAATGTGATCGGCACCGGATTTGGTATTCGCCCATCCGCAAACACTGGGGACTCGTTGCTGGATTCGTTTGTCTGGGTCAAGCCAGGCGGCGAGTGTGACGGCACCAGCGACAGCAGTGCGCCACGATTTGACTCCCACTGTGCGCTCCCAGATGCCTTGCAACCGGCGCCTCAAGCTGGTGCTTGGTTCCAAGCCTACTTTGTGCAGCTTCTCACAAACGCAAACCCATCGTTCCTGTAAAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCGCGCCGCGCGCCAGCTCCGTGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGCTACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCACTGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCTTAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTCATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCAGTTTATTTTGAATAGCTCGCCCGCTGGAGAGCATCCTGAATGCAAGTAACAACCGTAGAGGCTGACACGGCAGGTGTTGCTAGGGAGCGTCGTGTTCTACAAGGCCAGACGTCTTCGCGGTTGATATATATGTATGTTTGACTGCAGGCTGCTCAGCGACGACAGTCAAGTTCGCCCTCGCTGCTTGTGCAATAATCGCAGTGGGGAAGCCACACCGTGACTCCCATCTTTCAGTAAAGCTCTGTTGGTGTTTATCAGCAATACACGTAATTTAAACTCGTTAGCATGGGGCTGATAGCTTAATTACCGTTTACCAGTGCCATGGTTCTGCAGCTTTCCTTGGCCCGTAAAATTCGGCGAAGCCAGCCAATCACCAGCTAGGCACCAGCTAAACCCTATAATTAGTCTCTTATCAACACCATCCGCTCCCCCGGGATCAATGAGGAGAATGAGGGGGATGCGGGGCTAAAGAAGCCTACATAACCCTCATGCCAACTCCCAGTTTACACTCGTCGAGCCAACATCCTGACTATAAGCTAACACAGAATGCCTCAATCCTGGGAAGAACTGGCCGCTGATAAGCGCGCCCGCCTCGCAAAAACCATCCCTGATGAATGGAAAGTCCAGACGCTGCCTGCGGAAGACAGCGTTATTGATTTCCCAAAGAAATCGGGGATCCTTTCAGAGGCCGAACTGAAGATCACAGAGGCCTCCGCTGCAGATCTTGTGTCCAAGCTGGCGGCCGGAGAGTTGACCTCGGTGGAAGTTACGCTAGCATTCTGTAAACGGGCAGCAATCGCCCAGCAGTTAGTAGGGTCCCCTCTACCTCTCAGGGAGATGTAACAACGCCACCTTATGGGACTATCAAGCTGACGCTGGCTTCTGTGCAGACAAACTGCGCCCACGAGTTCTTCCCTGACGCCGCTCTCGCGCAGGCAAGGGAACTCGATGAATACTACGCAAAGCACAAGAGACCCGTTGGTCCACTCCATGGCCTCCCCATCTCTCTCAAAGACCAGCTTCGAGTCAAGGTACACCGTTGCCCCTAAGTCGTTAGATGTCCCTTTTTGTCAGCTAACATATGCCACCAGGGCTACGAAACATCAATGGGCTACATCTCATGGCTAAACAAGTACGACGAAGGGGACTCGGTTCTGACAACCATGCTCCGCAAAGCCGGTGCCGTCTTCTACGTCAAGACCTCTGTCCCGCAGACCCTGATGGTCTGCGAGACAGTCAACAACATCATCGGGCGCACCGTCAACCCACGCAACAAGAACTGGTCGTGCGGCGGCAGTTCTGGTGGTGAGGGTGCGATCGTTGGGATTCGTGGTGGCGTCATCGGTGTAGGAACGGATATCGGTGGCTCGATTCGAGTGCCGGCCGCGTTCAACTTCCTGTACGGTCTAAGGCCGAGTCATGGGCGGCTGCCGTATGCAAAGATGGCGAACAGCATGGAGGGTCAGGAGACGGTGCACAGCGTTGTCGGGCCGATTACGCACTCTGTTGAGGGTGAGTCCTTCGCCTCTTCCTTCTTTTCCTGCTCTATACCAGGCCTCCACTGTCCTCCTTTCTTGCTTTTTATACTATATACGAGACCGGCAGTCACTGATGAAGTATGTTAGACCTCCGCCTCTTCACCAAATCCGTCCTCGGTCAGGAGCCATGGAAATACGACTCCAAGGTCATCCCCATGCCCTGGCGCCAGTCCGAGTCGGACATTATTGCCTCCAAGATCAAGAACGGCGGGCTCAATATCGGCTACTACAACTTCGACGGCAATGTCCTTCCACACCCTCCTATCCTGCGCGGCGTGGAAACCACCGTCGCCGCACTCGCCAAAGCCGGTCACACC。
如美国专利申请公开US 2006/0094080所描述，用线性DNA文库转化实施例1中所述的AD5红褐肉座菌菌株(Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2、Δbgl1)的原生质体，并且在含有乙酰胺的选择性琼脂上在28℃下生长7天(0.6g/L乙酰胺、1.68g/L CsCl、20g/L葡萄糖、6g/L KH2PO4、0.6g/L MgSO4·7H20、0.6g/L CaCl2·2H2O、0.5g/L尿苷、微量元素盐、10g/L低熔点琼脂糖)。24小时后，将琼脂用补充有1.2g/L氟乳清酸(FOA)的选择性琼脂覆盖。将总共380个菌落转移至含有1.2g/L FOA的马铃薯右旋糖琼脂板，并在28℃下温育4-5天。将孢子转移至新鲜的马铃薯右旋糖琼脂板，将琼脂板在28℃下温育3天。
作为另一种选择，可以采用实施例1中所述的MAD6菌株的原生质体代替AD5以用于变体文库成员的表达。同样地，其中另外的纤维素酶已被灭活的MAD6菌株衍生物的原生质体也可以用于这个目的。这种衍生物将显示更少的本底纤维素酶活性。
对于CBH2变体蛋白生产，使用96针复制器将孢子转移至在PVDF滤板中的补充有2％葡萄糖/槐糖混合物的200μL甘氨酸基本培养基：6.0g/L甘氨酸、4.7g/L(NH4)2SO4；5.0g/L KH2PO4；1.0g/L MgSO4·7H2O；33.0g/L PIPPS；pH 5.5；并无菌添加作为碳源的2％葡萄糖/槐糖混合物、10ml/L的100g/L的CaCl2、2.5mL/L里氏木霉微量元素(400X)：175g/L无水柠檬酸；200g/LFeSO4·7H2O；16g/L ZnSO4·7H2O；3.2g/L CuSO4·5H2O；1.4g/L MnSO4·H2O；0.8g/L H3BO3。使每种CBH2变体一式四份地生长。在用透氧膜将板密封后，将板在28℃下温育6天，同时以200rpm振荡。通过在低压下将培养基转移至微量滴定板收获上清液。
针对目的性质测试CBH2变体。使用SDS PAGE检查各个变体的表达。图16A是四个SDS-PAGE的照片，显示多个变体的表达；图16B示出了这些变体的平均生产水平，其中误差条指示表达的可变性。测定了对于洗涤的稀酸预处理的玉米秸秆(PCS 50℃)、对于在50℃下的玉米穗轴(CC 50℃)和对于在57℃下的玉米穗轴(CC 57℃)的比活性。分离了对57℃玉米穗轴显示改善的活性的总共十个变体。分离这些菌株的基因组DNA并测定其cbh2基因序列。组合文库变体的置换以及对玉米穗轴和玉米秸秆的比活性的性能指数在表3-2中显示。基于变体的归一化蛋白质表达水平测定比活性的性能指数。
Figure BDA00002493634900921
PCS 50℃。如所描述(Schell等人，J Appl Biochem Biotechnol(应用微生物学与生物技术期刊)，105：69-86，2003年)，将玉米秸秆用2％w/w H2SO4预处理，然后用去离子水多次洗涤，以获得具有pH 4.5的糊。然后加入乙酸钠缓冲液(pH 5.0)至50mM乙酸钠的最终浓度，并且如果适当的话，使用1N NaOH将这个混合物滴定至pH5.0。反应混合物中的纤维素浓度为大约7％。向96孔微量滴定板(Nunc Flat Bottom PS)中每孔加入65μL的这个纤维素悬浮液。向每个孔加入10μL酶样品，每个样品含有在来自quad缺失菌株(Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2)的上清液中的49μg蛋白质。
加入最多20μL来自表达野生型CBH2或CBH2变体的红褐肉座菌细胞的培养上清液。加入补偿体积的乙酸盐缓冲液以补足在总体积方面的差异。将板密封后，将其在50℃下温育，同时在200rpm震荡。2天后，将板置于冰上5分钟并加入100μL 100mM甘氨酸pH 10.0。在混合后，将板以3000rpm离心5分钟。将体积10μL上清液在190μL水中稀释。将10μL稀释溶液转移至新的96孔微量滴定板(Costar Flat Bottom PS)，在每个孔中含有100μLABTS葡萄糖测定混合物(2.74mg/mL 2，2’连氮基-双-(3-乙基苯并-噻唑啉-6-磺酸)、1U/mL辣根过氧化物酶VI型、1U/mL葡萄糖氧化酶)，并在微量滴定板分光光度计(Spectramax Plus 384，分子仪器公司(Molecular Devices))中记录A420的增加。在每块板上包括一系列葡萄糖浓度作为标准品(0；0.008；0.016；0.031；0.063；0.125；0.25；0.5；1mg/mL)。测定一式两份地进行。通过使数据与Temkin等温方程(y＝a+b(ln(1+c*x)))拟合生成野生型CBH2的剂量响应曲线，并将CBH2变体的活性除以相同板的野生型CBH2的计算活性，以获得性能指数。
玉米穗轴50℃。将玉米穗轴磨碎以通过0.9mm筛，然后依照PCT公开WO 2006/110901的实施例4中所述方法进行预处理。将经预处理的玉米穗轴作为在50mM乙酸钠pH 5.0中的7％纤维素悬浮液使用。向96孔微量滴定板(Nunc Flat Bottom PS)中每孔加入70μL的悬浮液。向每个孔中加入10μL溶液，其含有来自quad缺失菌株(Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2)的上清液的46.55μg蛋白质，补充有4.90μg里氏木霉CBH1、6.84μg里氏木霉Xyn2Y5(Xiong等人，Extremophiles(极端微生物)8：393-400，2004年)、2.28μg拟轮生镰刀菌(Fv)51A、5.32μg Fv3A，、0.76μg Fv43D，和2.45μg里氏木霉BGL1。拟轮生镰刀菌的酶已在PCT公开WO/2011/038019中描述。
将最多20μL来自表达野生型CBH2或CBH2变体的红褐肉座菌细胞的上清液加入每个孔中。加入补偿体积的乙酸盐缓冲液以补足在总体积方面的差异。将板在50℃下温育，同时在200rpm震荡。2天后，将板置于冰上5分钟并加入100μL 100mM甘氨酸pH 10.0。在混合后，将板以3000rpm离心5分钟。将体积10μL上清液在190μL水中稀释。将10μL稀释溶液转移至含有100μL ABTS葡萄糖测定混合物的新的96孔微量滴定板(Costar FlatBottom PS)，并如上所述进行测定和分析。
玉米穗轴57℃。将玉米穗轴磨碎以通过0.9mm筛，然后依照PCT公开WO 2006/110901的实施例4中所述方法进行预处理。将经预处理的玉米穗轴作为在50mM乙酸钠pH 5.0中的7％纤维素悬浮液使用。向96孔微量滴定板(Nunc Flat Bottom PS)中每孔加入70μL的悬浮液。向每个孔中加入10μL溶液，其含有来自quad缺失菌株(Δegl1、Δegl2、Δcbh1、Δcbh2)的上清液的46.55μg蛋白质、4.90μg CBH1变体(S8P/T41I/N89D/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/E295K/T296P/T332Y/V403D/S411F/T462I)、6.84μg里氏木霉Xyn2Y5(Xiong等人，Extremophiles(极端微生物)8：393-400，2004年)、2.28μg Fv51A，、5.32μgFv3A，、0.76μg Fv43D，、2.45μg埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)β-葡糖苷酶。加入最多20μL来自表达野生型CBH2或CBH2变体的红褐肉座菌细胞的上清液。加入补偿体积的乙酸盐缓冲液以补足在总体积方面的差异。将板在57℃下温育，同时在200rpm震荡。在2天后，将板置于冰上5分钟并加入100μL 100mM甘氨酸pH 10.0。在混合后，将板以3000rpm离心5分钟。将体积10μL上清液在190μL水中稀释。将10μL稀释溶液转移至含有100μL ABTS葡萄糖测定混合物的新的96孔微量滴定板(Costar FlatBottom PS)，并如上所述进行测定和分析。

Claims (12)

1.一种丝状真菌宿主细胞表达系统，包含：
a.真菌宿主细胞，所述真菌宿主细胞在其染色体DNA中含有非同源重组(NHR)途径的一个或多个组分中的破坏、缺乏第一可选择功能的第一可选择标记、和可有效赋予第二可选择功能的第二可选择标记；和
b.核酸分子，所述核酸分子含有当引入所述真菌宿主细胞中时给所述第一可选择标记赋予所述第一可选择功能的序列、可有效表达一种或多种目的基因的序列、和与侧接所述染色体可选择标记的序列具有实质同源性的序列；
其中所述同源序列引起同源重组事件，所述同源重组事件导致有功能的第一可选择标记、导致所述第二可选择标记的去除和导致所述目的基因的表达。
2.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述NHR途径的一个或多个组分选自ku80、ku70、rad50、mre11、xrs2、lig4和xrs。
3.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述第一可选择标记和所述第二可选择标记是选自alsR、amdS、hygR、pyr2、pyr4、pyrG、sucA、博来霉素抗性标记、杀稻瘟素抗性标记、吡啶硫胺素抗性标记、氯嘧磺隆抗性标记、新霉素抗性标记、腺嘌呤途径基因、色氨酸途径基因和胸苷激酶的不同标记。
4.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述真菌宿主细胞来自选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、腐质霉属(Humicola)、金孢子菌属(Chrysosporium)、镰刀菌属(Fusarium)、链孢霉属(Neurospora)和裸孢壳属(Emericella)的属。
5.根据权利要求4所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述木霉是里氏木霉(T.reesei)。
6.根据权利要求4所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述曲霉是黑曲霉(A.niger)。
7.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因选自半纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶及其混合物。
8.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因选自乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、差向异构酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶解聚酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、奇异果甜蛋白、转移酶、转运蛋白、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶及其组合。
9.根据权利要求1所述的丝状真菌宿主细胞表达系统，其中所述目的基因选自肽激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、细胞因子、淋巴因子、抗体、受体、粘附分子、微生物抗原及其片段。
10.一种在根据权利要求1至9中任一项所述的丝状真菌宿主细胞中表达目的基因的方法，所述方法包括将所述核酸分子引入所述丝状真菌宿主细胞中，使所述宿主细胞生长，并选择具有所述第一可选择功能但缺乏所述第二可选择功能的宿主细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括测定所述目的基因的表达。
12.根据权利要求11所述的方法，还包括测定由所述目的基因编码的多肽的生物化学功能。
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