CN110268063A - 利用自动化遗传操作和菌株纯化步骤建立真菌生产菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了一种利用自动化来转化、筛选和选择丝状真菌细胞的高通量HTP微生物基因组工程化改造方法和系统。所述方法和系统利用HTP选择和反选择来纯化同核转化丝状真菌细胞。此外，本公开提供了一种生产和长期储存源自丝状真菌细胞的原生质体的方法。

Description

利用自动化遗传操作和菌株纯化步骤建立真菌生产菌株的 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年12月30日提交的美国临时申请序列号62/441,040的优先权，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
技术领域
本公开涉及自动化真菌基因组工程化改造。所公开的自动化基因组工程化改造平台需要对丝状真菌进行遗传操作以生成真菌生产菌株并促进其纯化。所得的真菌生产菌株非常适用于在浸没培养物中生长，例如适用于大规模生产用于商业应用的目标产物(例如，抗生素、代谢物、蛋白质等)。
背景技术
真核细胞是生产多肽和次级代谢物的优选有机体。事实上，丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，使其非常适用于大规模生产工业、制药、动物健康和食品和饮料应用的酶和其它蛋白质。然而，使用丝状真菌大规模生产目标产物通常需要对所述真菌进行遗传操作以及使用自动化机械和设备，并且丝状真菌生命周期的某些方面可能使遗传操作和处理变得困难。
例如，引入真菌中的DNA在基因组内随机整合，从而产生在大多数情况下随机整合的DNA片段，其通常可以整合为多个串联重复(参见例如卡斯凯罗(Casqueiro)等人，1999年，细菌学杂志(J.Bacteriol.)，181:1181-1188)。表达盒的这种不受控制的“随机多重整合”可能是潜在的有害过程，其可能导致宿主基因组的不希望的修饰。
另外，目前用于丝状真菌的转染系统可能非常吃力(综述参见芬查姆(Fincham)，1989年，微生物学评论(Microbiol.Rev.)，53:148-170)并且实际上规模较小。这可能涉及原生质体形成、粘性液体处理(即聚乙二醇溶液)、玻璃管的逐个旋动和随后的选择性平板接种。此外，原生质体形成(protoplasting)的条件可能难以确定，并且产量通常可能非常低。此外，原生质体可以含有多个核，使得引入所需的遗传操作可能导致形成异核原生质体，所述异核原生质体可能难以与同核原生质体分离。
此外，典型的丝状真菌细胞(包含源自原生质体的那些)生长为被称为菌丝的长纤维，其可以形成被称为菌丝体的密集菌丝网络。这些菌丝可以含有多个核，这些核在基因型上可以彼此不同。菌丝可以分化并形成无性孢子，其可以很容易地分散在空气中。如果菌丝含有不同基因型的核，则孢子也会含有核的混合物。由于真菌生长的这一方面，遗传操作固有地产生混合群体，其必须被纯化至同质性，以便评估所进行的遗传变化的任何影响。此外，在自动化环境中，孢子会导致设备污染，这可能会对纯化菌株的能力产生负面影响，并可能污染在设备上执行的任何其它工作。
为了减轻孢子的空中分散，可以使丝状真菌在浸没培养物中生长。然而，在浸没培养物中通过菌丝丝状真菌生长形成的菌丝体可能影响培养液的流变学性质。通常，培养液的粘度越高，氧和营养物的分布越不均匀，并且搅拌培养物所需的能量越多。在一些情况下，由菌丝丝状真菌生长引起的培养液粘度变得足够高以显著干扰氧和营养物的溶解，从而不利地影响真菌的生长并最终影响任何所需目标产物的产量和产率。
因此，本领域迫切需要对丝状真菌进行工程化改造的新方法，其不具有传统真菌菌株建立程序所固有的上述缺点，并且极大地加速了发现和合并有益突变的过程。
本公开克服了在自动化高通量平台中遗传操作丝状真菌所固有的许多挑战。本文提供的方法被设计成通过使用自动化共转化或自动化分裂标记设计转化并结合转化体的自动筛选来并入遗传变化，从而允许在不经历有性杂交的情况下在两个菌株之间交换遗传性状以生成真菌生产菌株。本公开还提供了一种生成大量原生质体的程序和一种存储它们以供以后使用的装置。大批容易获得的感受态细胞可以极大地促进自动化。
发明内容
在一个方面，本文提供了一种生产丝状真菌菌株的方法，所述方法包括：a.)提供多个原生质体，其中所述原生质体由丝状真菌细胞培养物制备；b).用第一构建体和第二构建体转化所述多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第一基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第二基因座同源的核苷酸侧接，其中转化引起所述第一构建体通过同源重组整合到所述第一基因座中并且所述第二构建体通过同源重组整合到所述第二基因座中，其中至少所述第二基因座是所述原生质体基因组中的第一可选择标记基因，并且其中所述第一多核苷酸包括突变和/或遗传控制元件；c.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和d.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。在另一方面，本文提供了一种生产丝状真菌菌株的方法，所述方法包括：a.)提供多个原生质体，其中所述原生质体由丝状真菌细胞培养物制备；b.)用第一构建体和第二构建体转化所述多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸由与所述原生质体的基因组中的基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸由与所述原生质体的基因组中的所述基因座同源的核苷酸侧接，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸包括可选择标记的互补部分，并且其中所述第一构建体和/或所述第二构建体进一步包括突变或遗传控制元件，其中转化引起所述第一和第二多核苷酸以及所述突变或遗传控制元件通过同源重组整合到所述基因座中；c.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和d.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。
在一些情况下，来自所述多个原生质体的每个原生质体用来自多个第一构建体的单个第一构建体和来自多个第二构建体的单个第二构建体转化，其中来自所述多个第一构建体的每个第一构建体中的所述第一多核苷酸包括不同的突变和/或遗传控制元件；并且其中来自所述多个第二构建体的每个第二构建体中的所述第二多核苷酸是相同的。在一些情况下，所述方法进一步包括重复步骤a-d以生成丝状真菌细胞文库，其中所述文库中的每个丝状真菌细胞包括具有不同突变和/或遗传控制元件的第一多核苷酸。在一些情况下，所述第一多核苷酸编码靶丝状真菌基因或异源基因。在一些情况下，所述突变是单核苷酸多态性。在一些情况下，所述遗传控制是启动子序列和/或终止子序列。在一些情况下，所述多个原生质体分布在微量滴定板的孔中。在一些情况下，步骤a-d在微量滴定板的孔中进行。在一些情况下，所述微量滴定板是96孔、384孔或1536孔微量滴定板。在一些情况下，所述丝状真菌细胞选自绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属物种或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。在一些情况下，所述丝状真菌细胞是黑曲霉。在一些情况下，所述丝状真菌细胞具有非菌丝体形成表型。在一些情况下，其中所述真菌细胞具有非功能性非同源末端连接(NHEJ)途径。在一些情况下，通过将所述细胞暴露于针对所述NHEJ途径的组分的抗体、化学抑制剂、蛋白质抑制剂、物理抑制剂、肽抑制剂或反义或RNAi分子来使所述NHEJ途径为非功能性的。在一些情况下，所述第一基因座用于所述靶丝状真菌基因。在一些情况下，所述第一基因座用于所述原生质体基因组中的第二可选择标记基因。在一些情况下，所述第二可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。在一些情况下，所述第一可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。在一些情况下，所述第二多核苷酸选自营养缺陷型标记基因、定向标记基因或抗生素抗性基因。在一些情况下，所述比色标记基因是aygA基因。在一些情况下，所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。在一些情况下，所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因、硝酸盐还原酶基因(niaD)或硫酸盐通透酶(Sut B)基因。在一些情况下，所述抗生素抗性基因是ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。在一些情况下，所述第一可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。在一些情况下，所述第一可选择标记基因是met3基因，所述第二可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。在一些情况下，通过以下制备所述多个原生质体：从所述丝状真菌细胞培养物中的所述丝状真菌细胞去除细胞壁；分离所述多个原生质体；和将所述分离的多个原生质体重悬于包括二甲基亚砜(DMSO)的混合物中，其中DMSO的最终浓度为7％v/v或更低。在一些情况下，在进行步骤a-d之前将所述混合物储存在至少-20℃或-80℃下。在一些情况下，所述培养物的体积为至少1升。在一些情况下，在制备所述原生质体之前使所述培养物生长至少12小时。在一些情况下，使所述真菌培养物在一定条件下生长，由此所述原生质体的至少70％较小并且含有较少核。在一些情况下，通过酶消化来去除所述细胞壁。在一些情况下，所述酶消化用包括β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶的酶混合物进行。在一些情况下，所述方法进一步包括在储存所述原生质体之前将40％v/v聚乙二醇(PEG)加入到所述包括DMSO的混合物中。在一些情况下，加入所述PEG至最终浓度为8％v/v或更低。在一些情况下，步骤a-d是自动化的。
在另一方面，本文提供了一种制备用于储存的丝状真菌细胞的方法，所述方法包括：由包括丝状真菌细胞的真菌培养物制备原生质体，其中所述制备所述原生质体包括从所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞去除细胞壁；分离所述原生质体；和将所述分离的原生质体重悬于以7％v/v或更低的最终浓度包括二甲基亚砜(DMSO)的混合物中。在一些情况下，将所述混合物储存在至少-20℃或-80℃下。在一些情况下，所述真菌培养物的体积为至少1升。在一些情况下，在制备所述原生质体之前使所述真菌培养物生长至少12小时。在一些情况下，使所述真菌培养物在一定条件下生长，由此所述原生质体的至少70％较小并且具有较少核。在一些情况下，通过酶消化来去除所述细胞壁。在一些情况下，所述酶消化用包括β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶的酶混合物进行。在一些情况下，所述方法进一步包括在储存所述原生质体之前将40％v/v聚乙二醇(PEG)加入到所述包括DMSO的混合物中。在一些情况下，加入所述PEG至最终浓度为8％v/v或更低。在一些情况下，所述方法进一步包括在储存所述原生质体之前将所述原生质体分布到微量滴定板中。在一些情况下，所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞具有非菌丝体形成表型。在一些情况下，所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞选自绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属物种或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。在一些情况下，所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞是黑曲霉或其有性型或无性型。
在又一方面，本文提供了一种生成真菌生产菌株的系统，所述系统包括：一或多个处理器；和一或多个存储器，所述存储器可操作地联接到所述一或多个处理器中的至少一个并且具有存储在其上的指令，当由所述一或多个处理器中的至少一个执行时，所述指令使所述系统：a.)用第一构建体和第二构建体转化源自丝状真菌细胞培养物的多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第一基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第二基因座同源的核苷酸侧接，其中转化引起所述第一构建体通过同源重组整合到所述第一基因座中并且所述第二构建体通过同源重组整合到所述第二基因座中，其中至少所述第二基因座是所述原生质体基因组中的第一可选择标记基因，并且其中所述第一多核苷酸包括突变和/或遗传控制元件；b.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和c.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。在一些情况下，来自所述多个原生质体的每个原生质体用来自多个第一构建体的单个第一构建体和来自多个第二构建体的单个第二构建体转化，其中来自所述多个第一构建体的每个第一构建体中的所述第一多核苷酸包括不同的突变和/或遗传控制元件；并且其中来自所述多个第二构建体的每个第二构建体中的所述第二多核苷酸是相同的。在一些情况下，所述系统进一步包括重复步骤a-c以生成丝状真菌细胞文库，其中所述文库中的每个丝状真菌细胞包括具有不同突变和/或遗传控制元件的第一多核苷酸。在一些情况下，所述突变是单核苷酸多态性。在一些情况下，所述遗传控制是启动子序列和/或终止子序列。在一些情况下，步骤a-c在微量滴定板的孔中进行。在一些情况下，所述微量滴定板是96孔、384孔或1536孔微量滴定板。在一些情况下，所述丝状真菌细胞选自绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属物种或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。在一些情况下，所述丝状真菌细胞是黑曲霉。在一些情况下，所述丝状真菌细胞具有非菌丝体形成表型。在一些情况下，所述真菌细胞具有非功能性非同源末端连接途径。在一些情况下，通过将所述细胞暴露于针对所述NHEJ途径的组分的抗体、化学抑制剂、蛋白质抑制剂、物理抑制剂、肽抑制剂或反义或RNAi分子来使所述NHEJ途径为非功能性的。在一些情况下，所述第一基因座用于所述靶丝状真菌基因。在一些情况下，所述第一基因座用于所述原生质体基因组中的第二可选择标记基因。在一些情况下，所述第二可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。在一些情况下，所述第一可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。在一些情况下，所述第二多核苷酸选自营养缺陷型标记基因、定向标记基因或抗生素抗性基因。在一些情况下，所述比色标记基因是aygA基因。在一些情况下，所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。在一些情况下，所述定向标记基因选自乙酰胺酶(amdS)基因、硝酸盐还原酶基因(nlaD)或硫酸盐通透酶(Sut B)基因。在一些情况下，所述抗生素抗性基因是ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。在一些情况下，所述第一可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。在一些情况下，所述第一可选择标记基因是met3基因，所述第二可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。在一些情况下，通过以下制备所述多个原生质体：从所述丝状真菌细胞培养物中的所述丝状真菌细胞去除细胞壁；分离所述多个原生质体；和将所述分离的多个原生质体重悬于以7％v/v或更低的最终浓度包括二甲基亚砜(DMSO)的混合物中。在一些情况下，在进行步骤a-c之前将所述混合物储存在至少-20℃或-80℃下。在一些情况下，所述培养物的体积为至少1升。在一些情况下，在制备所述原生质体之前使所述培养物生长至少12小时。在一些情况下，使所述真菌培养物在一定条件下生长，由此所述原生质体的至少70％较小并且具有较少核。在一些情况下，通过酶消化来去除所述细胞壁。在一些情况下，所述酶消化用包括β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶的酶混合物进行。在一些情况下，所述系统进一步包括在储存所述原生质体之前将40％v/v聚乙二醇(PEG)加入到所述包括DMSO的混合物中。在一些情况下，加入所述PEG至最终浓度为8％v/v或更低。
附图说明
图1A描绘了本文提供和实例1中描述的同核原生质体的自动转化、筛选和纯化的概述。
图1B是如何使用分裂标记系统将SNP靶向丝状真菌中的特异性基因座的表示。标记基因(在本实例中为pyrG)被扩增成两个组分，这两个组分不能在没有同源重组的情况下补充靶菌株中的突变，而同源重组会恢复基因功能。侧接于这些片段上是DNA的直接重复，其中每个都含有靶向基因座的SNP。每个构建体上的非重复DNA序列通过天然同源重组途径促进适当整合。在图1D的步骤2期间将这些构建体置于目标菌株中。
图1C示出了侧接于标记基因上的直接重复是不稳定的，并且将导致通过直接重复之间的同源重组的标记去除。使用含有图1D的步骤6中表示的标记的反选择的培养基进行标记去除。本过程通常被称为“环出(loopout/looping out)”。
图1D示出了在丝状真菌中SNP交换过程中的步骤。
图1E示出了筛选转化体以进行适当整合的过程中的步骤。
图2描绘了如实例2中描述的在自动化转化和筛选后，通过观察有和没有精氨酸的基本培养基上的黑曲霉突变菌株的生长，利用argB标记进行的黑曲霉突变菌株的筛选。
图3描绘了如实例3中描述的在自动化转化和筛选后，通过观察在基本培养基上的黑曲霉突变菌株的生长，利用aygA比色基因标记进行的黑曲霉突变菌株的筛选。源自同核原生质体的集落为纯黄色并且缺少黑色孢子。
图4A-B描绘了根据本公开的方法的黑曲霉转化和验证的结果。图4A是黑曲霉转化体的96孔培养基平板的图片。转化培养物包括aygA中的突变，其使细胞呈现较浅的黄色而不是黑色(转化孔用白色圈出)。图4B描绘了转化黑曲霉突变体的下一代测序的结果。X轴表示靶DNA与未转化亲本菌株的序列同一性。Y轴表示靶DNA与预期突变的序列同一性。朝向图表右下方的数据点表现出与亲本菌株的高相似性以及与预期转化序列的低相似性。朝向图表左上方的数据点表现出与预期转化序列的高相似性以及与亲本菌株的低同一性。中间的数据点可能表示具有多个核的异核体。
图4C描绘了根据本公开的方法的黑曲霉分裂标记设计转化和验证的结果。使用转化(经由分裂标记)黑曲霉突变体的下一代测序生成数据，并且所述数据是标靶处与突变的匹配相对于标靶处与亲本的匹配的分布。本图左上角的每个样品都是正确的并且已通过QC。圆内的样品在基因座处含有突变体和亲本，并且可以通过图1D的步骤4和5再次处理，以便生成可以通过QC的分离体。
图5描绘了黑曲霉中的一个SNP交换实施方案。图5的左侧示出了SNP交换的每个SNP的设计遗传编辑。所述图进一步示出了共转化，其中pyrG基因被引入aygA野生型基因的基因座。图5的右侧示出了用于筛选黑曲霉转化体的96孔培养基平板的两个图片。淡黄色集落表示其中aygA基因已被成功破坏的转化体。用于建立图5中描绘的突变菌株的黑曲霉菌株是具有降低的NHEJ途径活性的菌株。
图6是来自SNPSWP活动的下一代测序数据的图示。在本实例中，使用如图1B中所示设计的构建体靶向31个基因座。通过对来自所有个体样品的每个扩增子群体进行测序来筛选1264个总分离体。本数据集含有超过一百万个测序扩增子。有119个样品通过了所有QC要求。质量控制包含检查基因座处是否存在亲本突变，并且来自孔的所有扩增子必须与整个扩增子上的靶DNA匹配。红色(+符号)的样品是正确的，蓝色的样品(点符号)可能含有亲本和突变。
图7描绘了本公开的自动化系统的一个实施例。本公开教导了自动化机器人系统的用途，所述自动化机器人系统具有能够克隆、转化、培养、筛选和/或测序宿主有机体的各种模块。
图8图示了根据本公开的实施例的计算机系统的一个实施例。
具体实施方式
定义
尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是对以下定义进行阐述以便于解释本发明公开的主题。
术语“一个/一种(a/an)”是指一或多个所述实体，即可以是指复数指示物。因此，术语“一个/一种”，“一或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。此外，由不定冠词(a/an)引导的对“一个元件(an element)”的引用并不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求有且仅有一个元件。
如本文使用，术语“细胞有机体”、“微小有机体”或“微生物”应以广义采用。这些术语可互换使用，包含但不限于两个原核生物域(细菌和古菌)以及某些真核真菌和原生生物。在一些实施例中，本公开是指本公开中存在的列表/表格和附图的“微小有机体”或“细胞有机体”或“微生物”。本表征不仅可以指表格和附图的标识分类学属，而且可以指标识分类学物种，以及所述表格和附图中的任何有机体的各种新菌株和新标识或设计的菌株。对于在说明书的其它部分中(例如，在实例中)的对这些术语的叙述，相同的表征同样适用。
术语“原核生物”是本领域公认的并且是指不含有核或其它细胞器的细胞。原核生物通常分为两个生物域之一：细菌和古菌。古菌和细菌生物域的有机体之间的确定差异基于16S核糖体RNA中的核苷酸碱基序列的基本差异。
术语“古菌”是指疵壁菌门的有机体的分类，通常见于不寻常环境，并且通过若干标准(包含核糖体蛋白的数量和细胞壁中胞壁酸的缺少)区别于其它原核生物。基于ssrRNA分析，古菌由两个系统发育不同的群组成：泉古菌门和广古菌门。基于其生理学，古菌可以分为三种类型：产甲烷菌(生产甲烷的原核生物)；极端嗜盐菌(生活在极高盐(NaCl)浓度下的原核生物)；极端(超)嗜热链球菌(生活在极高温度下的原核生物)。除了统一的区别于细菌的古菌特征(即细胞壁中没有胞壁质，酯连接的膜脂质等)，这些原核生物表现出独特的结构或生化特性，使其适应其特定的生境。泉古菌门主要由超嗜热硫依赖性原核生物组成，广古菌门含有产甲烷菌和极端嗜盐菌。
“细菌”或“真细菌”是指原核有机体的生物域。细菌包含如下的至少11个不同群组：(1)革兰氏阳性(革兰氏+)细菌，其中有两个主要亚门：(1)高G+C群组(放线菌、分枝杆菌、微球菌等等)(2)低G+C群组(芽孢杆菌、梭菌、乳酸杆菌、葡萄球菌、链球菌、支原体)；(2)变形菌，例如紫色光合作用+非光合作用革兰氏阴性细菌(包含大多数“常见的”革兰氏阴性细菌)；(3)蓝细菌，例如产氧光养生物；(4)螺旋菌及相关物种；(5)浮霉状菌；(6)拟杆菌、黄杆菌；(7)衣原体；(8)绿色硫细菌；(9)绿色非硫细菌(也称为厌氧光养生物)；(10)抗辐射微球菌及其亲缘物；(11)嗜热栖热袍菌和嗜热栖热腔菌。
“真核生物”是指其细胞含有核和膜内包附的其它细胞器的任何有机体。真核生物属于真核或真核生物分类。将真核细胞与原核细胞(上述细菌和古菌)区分开来的决定性特征是它们具有膜结合细胞器，尤其是含有遗传物质并被核被膜包附的核。
术语“遗传修饰的宿主细胞”、“重组宿主细胞”和“重组菌株”在本文中可互换使用，并且是指通过本公开的克隆和转化方法进行遗传修饰的宿主细胞。因此，所述术语包含经遗传改变、修饰或工程化改造的宿主细胞(例如，真菌细胞等)，使得相较于其所源自的天然存在的有机体或亲本有机体，其表现出改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响编码微小有机体的核酸序列时)。应当理解，所述术语不仅指所讨论的特定重组宿主细胞，而且还指此宿主细胞的后代或潜在后代。
术语“野生型微小有机体”或“野生型菌株”描述了天然存在的细胞，即未经遗传修饰的细胞。
术语“亲本菌株(parent strain/parental strain)”或“亲本”可以是指突变菌株所源自的宿主细胞。因此，“亲本菌株”是其基因组被本领域已知和/或本文提供的任何方式扰动以生成一或多种突变菌株的宿主细胞或细胞。“亲本菌株”可以具有或不具有与野生型菌株相同的基因组。
术语“遗传工程化改造”可以是指宿主细胞基因组的任何操作(例如，通过核酸的插入、缺失、突变或替换)。
术语“对照”或“对照宿主细胞”是指用于确定遗传修饰或实验处理的效果的合适的比较宿主细胞。在一些实施例中，对照宿主细胞是野生型细胞。在其它实施例中，对照宿主细胞在遗传上与遗传修饰的宿主细胞相同，分化处理宿主细胞的遗传修饰除外。在一些实施例中，本公开教导了亲本菌株作为对照宿主细胞的用途。在其它实施例中，宿主细胞可以是缺少在处理宿主细胞中测试的特异性SNP的遗传上相同的细胞。
如本文使用，术语“等位基因”是指基因的一或多种替代形式中的任何一种，所有这些等位基因涉及至少一种性状或特性。在二倍体细胞中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。由于本公开在实施例中涉及QTL(即可以包括一或多个基因或调节序列的基因组区域)，因此在一些情况下，其更准确地是指“单倍型”(即染色体节段的等位基因)而不是“等位基因”，然而在这些情况下，术语“等位基因”应当被理解为包括术语“单倍型”。
如本文使用，术语“基因座”(locus，复数形式为loci)是指可见例如基因或遗传标记的染色体上的具体位置或位点。
如本文使用的“重组”或“重组事件”是指染色体互换或独立分配。术语“重组体”是指具有由于重组事件而产生的新遗传组成的有机体。
如本文使用，术语“表型”是指由所述个体的遗传组成(即基因型)与环境之间的相互作用而产生的个体细胞、细胞培养物、有机体或有机体群组的可观察特性。
如本文使用，术语“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物)的聚合形式。本术语是指分子的初级结构，因此包含双链和单链DNA以及双链和单链RNA。它还包含修饰的核酸，例如甲基化和/或加帽的核酸、含有修饰的碱基的核酸、骨架修饰等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换使用。
如本文使用，术语“基因”是指与生物学功能相关的任何DNA节段。因此，基因包含但不限于编码序列和/或其表达所需的调节序列。基因还可以包含非表达的DNA节段，所述非表达的DNA节段例如形成其它蛋白质的识别序列。基因可以从多种来源获得(包含从目标来源克隆或从已知或预测序列信息合成)，并且可以包含被设计成具有所需参数的序列。
如本文使用，术语“同源的”或“同源物”或“直向同源物”是本领域已知的，并且是指共有共同祖先或家族成员并且基于序列同一性程度确定的相关序列。术语“同源性”、“同源的”、“基本上相似的”和“基本上相应的”在本文中可互换使用。它们是指核酸片段，其中一或多个核苷酸碱基的变化不影响核酸片段介导基因表达或产生某一表型的能力。这些术语还指本公开的核酸片段的修饰，例如一或多个核苷酸的缺失或插入，其相对于初始的未修饰片段基本上不改变所得核酸片段的功能性质。因此，如本领域技术人员将理解，本公开涵盖的不仅仅是具体的示范性序列。这些术语描述了在一个物种、亚种、品种、栽培种或菌株中可见的基因与另一物种、亚种、品种、栽培种或菌株中的相应或等同基因之间的关系。出于本公开的目的，对同源序列进行比较。“同源序列”或“同源物”或“直向同源物”被认为、相信或已知在功能上相关。功能关系可以以多种方式中的任何一种指示，包含但不限于：(a)序列同一性程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，指示(a)和(b)二者。可以使用本领域容易获得的软件程序确定同源性，所述软件程序例如现代分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编辑，1987年)副刊30，节7.718，表7.71中讨论的那些。一些比对程序是MacVector(OxfordMolecular Ltd，牛津，英国)、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software，宾夕法尼亚州)和AlignX(Vector NTI，Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)。另一个比对程序是Sequencher(Gene Codes，安阿伯，密歇根州)，使用默认参数。
如本文使用，术语“内源的”或“内源基因”是指天然存在的基因，其位于宿主细胞基因组中其天然可见的位置。在本公开的背景中，将异源启动子与内源基因可操作地连接是指在天然存在所述基因的位置将异源启动子序列遗传地插入现有基因的前面。如本文所述的内源基因可以包含已根据本公开的任何方法突变的天然存在的基因的等位基因。
如本文使用，术语“外源的”与术语“异源的”可互换使用，并且是指来自除其天然来源之外的某一来源的物质。例如，术语“外源蛋白质”或“外源基因”是指来自非天然来源或位置的蛋白质或基因，并且其已经人工供应给生物系统。
如本文使用，术语“核苷酸变化”是指例如核苷酸取代、缺失和/或插入，如本领域所熟知。例如，突变包含产生沉默取代、加入或缺失但不改变编码蛋白质的性质或活性或蛋白质制备方式的改变。
如本文使用，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”是指具有此些序列的最小尺寸特性的部分或全长分子的任何更大的片段(大至且包含全长分子)。本公开的多核苷酸的片段可以编码遗传调节元件的生物活性部分。遗传调节元件的生物活性部分可以通过分离包括遗传调节元件的本公开的一种多核苷酸的一部分并如本文所述评估活性来制备。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸等，直至全长多肽。待使用的部分的长度将取决于特定应用。可用作杂交探针的核酸的一部分可以短至12个核苷酸；在一些实施例中，它是20个核苷酸。可用作表位的多肽的一部分可以短至4个氨基酸。执行全长多肽功能的多肽的一部分通常长于4个氨基酸。
变体多核苷酸还囊括源自诱变和重组程序(例如，DNA改组)的序列。此DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见例如斯坦默(Stemmer)(1994年)，美国国家科学院院刊(PNAS)，91:10747-10751；斯坦默(1994年)，自然(Nature)370:389-391；克拉梅里(Crameri)等人(1997年)，自然生物技术(Nature Biotech.)，15:436-438；摩尔(Moore)等人(1997年)，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，272:336-347；张(Zhang)等人(1997年)，美国国家科学院院刊，94:4504-4509；克拉梅里等人(1998年)，自然，391:288-291；和美国专利第5,605,793号和第5,837,458号。
对于本文公开的多核苷酸的PCR扩增，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从从目标有机体提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。设计PCR引物和PCR克隆的方法通常是本领域已知的，并且公开于萨姆布鲁克(Sambrook)等人(2001年)，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第3版，冷泉港实验室出版社，普莱恩维尤，纽约州)中。另外参见因尼斯(Innis)等人编辑(1990年)，PCR实验室指南：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications)(学术出版社，纽约州)；因尼斯和盖尔范德(Gelfand)编辑(1995年)，PCR策略(PCR Strategies)(学术出版社，纽约州)；以及因尼斯和盖尔范德编辑(1999年)，PCR方法手册(PCR Methods Manual)(学术出版社，纽约州)。已知的PCR方法包含但不限于使用配对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
如本文使用的术语“引物”是指能够与扩增靶标退火的寡核苷酸，其允许DNA聚合酶附着，从而当其被置于在诱导引物延伸产物的合成的条件下时(即在存在核苷酸和聚合剂(例如，DNA聚合酶)的情况下，并且在合适的温度和pH下)作为DNA合成的起始点。(扩增)引物优选是单链的，以获得最大的扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在存在聚合剂的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包含引物的温度和组成(A/T与G/C含量)。一对双向引物由一个正向引物和一个反向引物组成，如DNA扩增(例如，PCR扩增)领域中所常用。
术语“严格性”或“严格杂交条件”是指影响杂交体稳定性的杂交条件，例如温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。根据经验优化这些条件以使引物或探针与其靶核酸序列的特异性结合最大化且非特异性结合最小化。使用的术语包含对探针或引物以高于其它序列的可检测程度(例如，本底的至少2倍)与其靶序列杂交的条件的提及。严格条件依赖于序列，并且在不同情况下会有所不同。较长的序列在较高温度下特异性地杂交。通常，严格条件选择为在限定离子强度和pH下比特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的互补靶序列与完美匹配探针或引物杂交的温度(在限定离子强度和pH下)。通常，严格条件是盐浓度小于约1.0M Na+离子(通常约0.01到1.0M Na+离子浓度(或其它盐))，pH为7.0到8.3，温度为至少约30℃(对于短探针或引物(例如，10到50个核苷酸))和至少约60℃(对于长探针或引物(例如，大于50个核苷酸))的条件。还可以通过加入去稳定剂(例如，甲酰胺)达到严格条件。示范性的低严格条件或“严格性降低的条件”包含在37℃下用30％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液杂交并在40℃下在2x SSC中洗涤。示范性的高严格条件包含在37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交并在60℃下在0.1x SSC中洗涤。杂交程序是本领域熟知的，并且例如由奥苏贝尔等人(1998年)和萨姆布鲁克等人(2001年)描述。在一些实施例中，严格条件是在45℃下在含有1mM Na2EDTA、0.5-20％十二烷基硫酸钠(例如，0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％)的0.25M Na2HPO4缓冲液(pH 7.2)中杂交，然后在55℃到65℃下在含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的5x SSC中洗涤。
如本文使用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的DNA序列，并且可以是启动子的先天元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体源自天然基因，或由源自天然存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至包括合成DNA阶段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件的表达。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全确定，因此一些变异的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
如本文使用，“终止子”通常是指DNA序列的一部分，其标记基因组DNA中基因或操纵子的末端并且能够阻止转录。终止子可以整体源自天然基因，或由源自天然存在的不同终止子的不同元件构成，或甚至包括合成DNA片段。本领域技术人员应理解，不同的终止子可以指导基因在不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件的表达。
如本文使用，短语“重组构建体”、“表达构建体”、“表达盒”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包括核酸片段的人工组合，例如在自然界中非共同可见的调节和编码序列。例如，嵌合构建体可以包括源自不同来源的调节序列和编码序列，或源自相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调节序列和编码序列。此构建体可以单独使用，也可以与载体一起使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法，如本领域技术人员所熟知。例如，可以使用质粒载体。技术人员充分了解必须存在于载体上的遗传元件，以便成功转化、选择和繁殖包括本公开的任何分离核酸片段的宿主细胞。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(琼斯(Jones)等人(1985年)，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)，4:2411-2418；德·阿尔梅达(De Almeida)等人(1989年)，分子遗传学(Mol.Gen.Genetics)，218:78-86)，因此必须筛选多个事件，以便获得表现出所需表达水平和模式的品系。此筛选可以通过DNA的南方分析、mRNA表达的西方分析、蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来完成。载体可以是自主地复制或可整合到宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、前病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体也可以是并不自主地复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一链内的DNA和RNA构成的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀合的DNA等。如本文使用，术语“表达”是指功能性终产物(例如，mRNA或蛋白质(前体蛋白质或成熟蛋白质))的生产。
“可操作地连接”在本背景中是指根据本公开的启动子多核苷酸与另外的寡核苷酸或多核苷酸的顺序排列，导致所述另外的多核苷酸的转录。
如本文使用的术语“目标产物”或“生物分子”是指由来自原料的微生物生产的任何产物。在一些情况下，目标产物可以是小分子、酶、肽、氨基酸、有机酸、合成化合物、燃料、醇、药物等。例如，目标产物或生物分子可以是任何初级或次级细胞外代谢物。初级代谢物尤其可以是乙醇、柠檬酸、乳酸、谷氨酸、谷氨酸盐、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸和其它氨基酸、维生素、多糖等。次级代谢物尤其可以是抗生素化合物(例如，盘尼西林)、或免疫抑制剂(例如，环孢菌素A)、植物激素(例如，赤霉素)、他汀类药物(例如，洛伐他汀)、杀真菌剂(例如，灰黄霉素)等。目标产物或生物分子也可以是由微生物生产的任何细胞内成分，例如：微生物酶，包含：过氧化氢酶、淀粉酶、蛋白酶、果胶酶、葡萄糖异构酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、乳糖酶、链激酶等。细胞内组分还可以包含重组蛋白，例如：胰岛素、乙型肝炎疫苗、干扰素、粒细胞集落刺激因子、链激酶等。目标产物也可以是指“目标蛋白质”。
术语“目标蛋白质”通常是指需要在丝状真菌中表达的任何多肽。此蛋白质可以是酶、底物结合蛋白质、表面活性蛋白质、结构蛋白质等，并且可以以高水平表达，并且可以用于商业化的目的。目标蛋白质可以由相对于变体菌株和/或亲本菌株的内源基因或异源基因编码。目标蛋白质可以在细胞内表达或作为分泌蛋白质表达。如果目标蛋白质不是天然分泌的，则可以根据本领域已知的技术修饰编码蛋白质的多核苷酸以具有信号序列。分泌的蛋白质可以是天然表达的内源蛋白质，但也可以是异源的。异源是指由蛋白质编码的基因不是在丝状真菌宿主细胞中的天然条件下生产的。可以由本公开的丝状真菌生产的酶的实例是糖酶，例如纤维素酶(例如，内切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或β-葡糖苷酶)、半纤维素酶或果胶分解酶(例如，木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳糖醛酸酶、裂解酶或淀粉分解酶)；磷酸酶(例如，植酸酶)、酯酶(例如，脂肪酶)、蛋白水解酶、氧化还原酶(例如，氧化酶、转移酶或异构酶)。
术语“碳源”通常是指适合用作细胞生长的碳的来源的物质。碳源包含但不限于生物质水解产物、淀粉、蔗糖、纤维素、半纤维素、木糖和木质素，以及这些底物的单体组分。碳源可以包括各种形式的各种有机化合物，包含但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽等。这些包含例如各种单糖，例如葡萄糖、右旋糖(D-葡萄糖)、麦芽糖、低聚糖、多糖、饱和或不饱和脂肪酸、琥珀酸盐、乳酸盐、乙酸盐、乙醇等，或其混合物。光合有机体可以另外产生碳源作为光合作用的产物。在一些实施例中，碳源可以选自生物质水解产物和葡萄糖。
术语“原料”被定义为供应给微小有机体或可以制备其它产物的发酵过程的原材料或原材料混合物。例如，碳源(例如，生物质或源自生物质的碳化合物)是在发酵过程中生产目标产物(例如，小分子、肽、合成化合物、燃料、醇等)的微小有机体的原料。然而，原料可以含有除碳源之外的营养物。
术语“体积产率”或“生产率”被定义为每单位时间每体积培养基形成的产物的量。体积产率可以以克每升每小时(g/L/h)为单位报告。
术语“比产率”被定义为产物的形成速率。比产率在本文被进一步定义为以克产物每克细胞干重(CDW)每小时(g/g CDW/h)为单位的比产率。对于给定的微小有机体比产率，使用CDW与OD600的关系也可以被表达为克产物每升培养基每培养液600nm的光密度(OD)每小时(g/L/h/OD)。
术语“产量”被定义为每单位重量原材料获得的产物的量，并且可以被表达为g产物每g底物(g/g)。产量可以被表达为理论产量的百分比。“理论产量”被定义为每给定量的底物可以生成的最大产物量，如由用于制备产物的代谢途径的化学计量所示。
术语“滴定量(titre/titer)”被定义为溶液的强度或物质在溶液中的浓度。例如，目标产物(例如，小分子、肽、合成化合物、燃料、醇等)在发酵培养液中的滴定量被描述为g溶液中的目标产物每升发酵培养液(g/L)。
术语“总滴定量”被定义为在过程中生产的所有目标产物的总和，包含但不限于溶液中的目标产物、气相中的目标产物(如果适用)以及从过程去除和相对于过程中的初始体积或过程中的操作体积回收的任何目标产物。
如本文使用，术语“文库”是指根据本公开的遗传扰动的集合。在一些实施例中，本公开的文库可以表现为i)编码上述一系列遗传元件的遗传构建体的集合，或ii)包括所述遗传元件的宿主细胞株。在一些实施例中，本公开的文库可以指个体元件的集合(例如，SNP交换文库的SNP的终止子集合)。
如本文使用，术语“SNP”是指小核多态性。在一些实施例中，本公开的SNP应广义地解释，并且包含单核苷酸多态性、序列插入、缺失、倒位和其它序列替换。如本文使用，术语“非同义的”或“非同义SNP”是指编码宿主细胞蛋白质中的变化的突变。
概述
本公开通过提供一种转化丝状真菌细胞或源自其的原生质体，纯化同核转化体和筛选经过纯化的转化体的高通量方法来克服上述限制。通常，本文所述的方法和系统需要由丝状真菌细胞制备原生质体，转化制备的原生质体，通过改变用于制备菌丝体(用于原生质体制备)的生长条件来纯化含有单核的原生质体。菌株纯化通过选择和反选择以及任选的对具有正确表型和/或生产目标产物的经过纯化的转化体的筛选来实现。目标产物可以以所需产量、产率或滴定量生产。优选使用原生质体，但所述方法也适用于其它真菌细胞类型。在一些情况下，本文提供的方法和系统是高通量的。在一些情况下，本文提供的方法和系统包括半自动化的步骤(例如，转化或选择、反选择)。在一些情况下，本文提供的方法和系统包括完全自动化的步骤。在一些情况下，本文提供的方法和系统是高通量的，并且其中的步骤是半自动化的(例如，转化或选择、反选择)或完全自动化的。如本文使用，高通量可以是指能够每天评价约1,000或更多个转化体的本文提供的任何部分或完全自动化的方法，特别是指能够每天评价5,000或更多个转化体的那些方法，最特别是指能够每天评价10,000或更多个转化体的方法。此外，进行所述方法的合适体积是市售(深孔)微量滴定板的那些，即小于1ml，优选小于500ul，更优选小于250ul，最优选从1.5ul到250ul，更最优选从10ul到100ul。
用于制备原生质体的丝状真菌细胞可以是本领域已知的或本文描述的任何丝状真菌菌株，包含其全型、有性型或无性型。原生质体的制备可以使用本文所述的那些或本领域任何已知的制备原生质体的方法进行。
原生质体的转化可以使用至少一种被设计成整合到本文提供的丝状真菌基因组中的预定基因座中的多核苷酸。在一个优选实施例中，原生质体与本文提供的至少两种多核苷酸共转化，使得每种多核苷酸构建体被设计成整合到丝状真菌基因组中的不同预定基因座中。在另一个优选实施例中，使用分裂标记转化系统。预定基因座可以是靶丝状真菌基因(例如，其蛋白质产物参与柠檬酸生产的基因)的或者是存在于丝状真菌基因组中的可选择标记基因的。用于使用本文提供的方法或系统转化(例如，经由分裂标记设计系统)或共转化原生质体的多核苷酸可以包括包括或含有突变和/或遗传控制元件的靶丝状真菌基因(例如，其蛋白质产物参与柠檬酸生产的基因)的序列。突变可以是小核多态性，例如单核苷酸多态性、序列插入、缺失、倒位和其它序列替换。遗传控制元件可以是启动子序列(内源或异源)和/或终止子序列(内源或异源)。用于使用本文提供的方法或系统转化(例如，经由分裂标记设计系统)或共转化原生质体的多核苷酸可以包括可选择标记基因的序列。在一个实施例中，本文提供的方法和系统需要将本文提供的原生质体与两种多核苷酸共转化，使得第一多核苷酸包括包括或含有突变和/或遗传控制元件的靶丝状真菌基因(例如，其蛋白质产物参与柠檬酸生产的基因)的序列，而第二多核苷酸包括可选择标记基因的序列。进一步对于本实施例，第二多核苷酸可以被设计成整合到原生质体基因组中的另外的可选择标记基因中，而第一多核苷酸可以被设计成整合到靶丝状真菌基因的基因座中，或者可替代地整合到另一个可选择标记基因的基因座中。本文提供的任何实施例中的可选择标记基因可以是本文所述的任何可选择标记基因。在其它实施例中，使用分裂标记设计代替共转化方法。
本公开还提供了一种由丝状真菌细胞制备多个原生质体和储存所述多个原生质体的方法。所述方法可能需要从真菌培养物中的丝状真菌细胞去除细胞壁，分离原生质体，并将分离的原生质体重悬于包括至少二甲基亚砜(DMSO)的混合物中并且储存分离的原生质体。储存可以持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或24小时。储存可以持续至少1、7、14、30或更多天。储存可以持续至少3、6、12或更多个月。储存可以在4℃、-20℃或-80℃下。真菌培养物可以是体积为至少500ml、1升、2升、3升、4升或5升的培养物。丝状真菌细胞可以是本文提供的或本领域已知的任何丝状真菌。在制备原生质体之前，真菌培养物可以生长至少6、8、10、12、14、16、18、20、22或24小时。在一个实施例中，真菌培养物在一定条件下生长，由此在制备原生质体后至少70％的原生质体是同核的。在另一个实施例中，通过酶消化来去除细胞壁。酶消化可以用包括β-葡聚糖酶和多聚半乳糖醛酸酶的酶混合物进行。酶消化可以用VinoTaste浓缩物进行。在又一个实施例中，所述方法进一步包括在储存原生质体之前将聚乙二醇(PEG)加入到包括DMSO的混合物中。可以加入PEG至终浓度为50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或更低。在再一个实施例中，所述方法进一步包括在储存原生质体之前将原生质体分布到微量滴定板中。微量滴定板可以是6孔、12孔、24孔、96孔、384孔或1536孔板。
丝状真菌宿主细胞
在一个实施例中，本文提供的方法和系统使用源自丝状真菌的真菌元件，其能够容易地与培养基中的其它此类元件分离并且能够自我复制。例如，真菌元件可以是孢子、繁殖体、菌丝片段、原生质体或微丸。在一个优选实施例中，本文提供的系统和方法利用源自丝状真菌的原生质体。合适的丝状真菌宿主细胞包含例如子囊菌门、半知菌门、接合菌门或不完全真菌门的任何丝状形式。合适的丝状真菌宿主细胞包含例如真菌亚门的任何丝状形式。(参见例如霍克斯沃思(Hawksworth)等人，安斯沃思-比斯比真菌词典(Ainsworth andBisby's Dictionary of The Fungi)，第8版，1995年，国际农业和生物研究中心(CABInternational)，大学出版社，剑桥，英国，其通过引用并入本文)。在某些说明性但非限制性的实施例中，丝状真菌宿主细胞可以是以下物种的细胞：绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、线黑粉菌属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。在一个实施例中，丝状真菌选自由以下组成的群组：构巢曲霉、米曲霉、酱油曲霉和黑曲霉群的曲霉。在一个优选实施例中，丝状真菌是黑曲霉。
在另一个实施例中，本公开提供了用于本文提供的方法和系统的真菌物种的特异性突变体。在一个实施例中，使用适合于本文提供的高通量和/或自动化方法和系统的真菌物种的特异性突变体。此些突变体的实例可以是原生质体形成非常好的菌株；主要生产或更优选地仅生产具有单核的原生质体的菌株；在微量滴定板中有效再生的菌株、更快地再生的菌株和/或有效吸收多核苷酸(例如，DNA)分子的菌株、生产低粘度培养物(诸如例如在培养物中生产不那么缠结的菌丝以防止单个克隆的分离和/或提高培养物粘度的细胞)的菌株、具有降低的随机整合(例如，禁用非同源末端连接途径)的菌株或其组合。在又一个实施例中，用于本文提供的方法和系统的特异性突变菌株可以是缺少可选择标记基因的菌株，例如需要尿苷的突变菌株。这些突变菌株可以分别缺少由pyrG或pyrE基因编码的乳清酸核苷5磷酸脱羧酶(OMPD)或乳清酸磷酸核糖转移酶(OPRT)(T.古森(T.Goosen)等人，当代遗传学(Curr Genet.)，1987年，11:499 503；J.贝盖列特(J.Begueret)等人，基因(Gene.)，1984年，32:487 92。
在一个实施例中，用于本文提供的方法和系统的特异性突变菌株是具有紧密细胞形态的菌株，其特征在于较短的菌丝和更类似于酵母的外观。此些突变体的实例可以是具有改变的gas1表达的丝状真菌细胞，如US20140220689中所述。
在再一个实施例中，用于本文提供的方法和系统的突变菌株在其DNA修复系统中以一定方式进行修饰，使得它们在同源重组中极其有效和/或在随机整合中极其低效。通过同源重组将核酸构建体靶向整合到宿主细胞的基因组中(即在预定靶基因座中的整合)的效率可以通过宿主细胞的增强的同源重组能力和/或减少的非同源重组能力来提高。可以通过过表达参与同源重组的一或多个基因(例如，Rad51和/或Rad52蛋白)来实现同源重组的增强。本公开的宿主细胞中的一或多种非同源重组途径(例如，规范非同源末端连接(NHEJ)途径、替代NHEJ或微同源介导的末端连接(Alt-NHEJ/MMEJ)途径和/或聚合酶θ介导的末端连接(TMEJ)途径)的活性的去除、破坏或降低可以通过本领域已知的任何方法实现，诸如例如通过使用针对特异性非同源重组(NHR)途径(例如，NHEJ途径、Alt-NHEJ/MMEJ途径和/或或TMEJ途径)的组分的抗体、化学抑制剂、蛋白质抑制剂、物理抑制剂、肽抑制剂或反义或RNAi分子。在一个实施例中，抑制或降低单个非同源末端连接途径的活性。在另一个实施例中，抑制或降低非同源末端连接途径的组合的活性，使得非同源末端连接途径之一的活性保持完整。在又一个实施例中，降低或抑制每种非同源末端连接途径的活性。
可以单独地或组合地靶向活性的抑制或降低的NHEJ途径的组分的实例可以包含但不限于酵母KU70或酵母KU80或其同源物或直向同源物。可以单独地或组合地靶向活性的抑制或降低的Alt-NHEJ/MMEJ途径的组分的实例可以包含但不限于Polq基因、Mre 11基因、XPF-ERCC1基因或其同源物或直向同源物。可以靶向活性的抑制或降低的TMEJ途径的组分的实例可以包含但不限于Polq基因或其同源物或直向同源物。在一些情况下，用于本文提供的方法的宿主细胞可能缺少NHEJ途径的一或多种基因(例如，酵母ku70、ku80或其同源物或直向同源物)。此些突变体的实例是具有缺陷hdfA或hdfB基因的细胞，如WO 05/95624中所述。在一些情况下，用于本文提供的方法的宿主细胞可能缺少替代NHEJ或微同源介导的末端连接(Alt-NHEJ/MMEJ)途径和/或TMEJ途径的一或多种基因。此些突变体的实例是缺少Polq基因或具有突变Polq基因的细胞，如怀亚特(Wyatt)等人，聚合酶θ介导的末端连接在染色体断裂修复中的重要作用(Essential roles for Polymeraseθmediated end-joining in repair of chromosome breaks)，分子细胞(Mol Cell.)，2016年8月18日；63(4):662–673中所述。
用于本文提供的方法的用于抑制宿主细胞中的一或多种NHR途径(例如，NHEJ途径、Alt-NHEJ/MMEJ途径和/或TMEJ途径)的化学抑制剂的实例可以是W7、氯丙嗪、香草醛、Nu7026、Nu7441、mirin、SCR7、AG14361或其组合。此外，可以使用化学抑制剂实现对NHEJ途径的抑制，例如阿拉斯SMD(Arras SMD)、弗雷泽JA(Fraser JA)(2016年)，“非同源末端连接的的化学抑制剂增加新型隐球菌的靶向构建体整合(Chemical Inhibitors of Non-Homologous End Joining Increase Targeted Construct Integration inCryptococcus neoformans)”，公共科学图书馆·综合(PloS ONE)，11(9):e0163049中所述，其内容通过引用并入本文。
在一个优选实施例中，用于本文提供的方法和系统的丝状真菌细胞的突变菌株具有失活或减少的非同源末端连接途径(NHEJ途径、Alt-NHEJ/MMEJ途径或TMEJ途径或其组合)，并且当在培养物(例如，浸没培养物)中生长时具有类似于酵母的非菌丝体形成表型。
原生质体形成方法
在一个实施例中，本文提供的方法和系统需要由丝状真菌细胞生成原生质体。用于制备原生质体的合适程序可以是本领域已知的任何程序，包含例如EP 238,023和耶尔顿(Yelton)等人(1984年，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，81:1470-1474)中所述的那些。在一个实施例中，通过用一或多种分解酶或其混合物处理丝状真菌细胞培养物来生成原生质体。分解酶可以是β-葡聚糖酶和/或多聚半乳糖醛酸酶。在一个实施例中，用于生成原生质体的酶混合物是VinoTaste浓缩物。酶处理后，可以使用本领域已知的方法分离原生质体。例如，可以通过将混合物过滤通过多孔隔板(例如，神奇滤布(Miracloth))来去除未消化的菌丝片段，所述多孔隔板的孔的尺寸范围为20-100微米。然后可以以中等速度离心含有原生质体的滤液，以使原生质体沉淀到离心管的底部。可替代地，可以将具有基本上较低渗透强度的缓冲液轻轻地施加到过滤的原生质体的表面。然后可以将本分层制剂离心，这可以使原生质体积聚在管中的某一层，原生质体在所述层中具有平衡的浮力。然后可以从本层中分离原生质体以用于进一步处理。在原生质体分离后，可以通过将原生质体重悬于渗透缓冲液(通常是使用TRIS缓冲的1M山梨糖醇)中去除剩余的含酶缓冲液并通过离心重新收集。可以重复本步骤。在充分去除含酶缓冲液后，可以将原生质体重悬于还含有氯化钙的渗透稳定缓冲液中。在一个实施例中，将原生质体重悬至最终浓度为每ml 1-3*107个原生质体。
可以改变预培养和实际原生质体形成步骤以优化原生质体的数量和转化效率。典型的制备可以是接种100ml丰富培养基，例如含有106个孢子/ml的YPD，并温育14-18小时。许多这些参数可以改变。例如，可以改变接种量、接种方法、预培养基、预培养时间、预培养温度、混合条件、洗涤缓冲液组成、稀释比、分解酶处理期间的缓冲液组成、所使用的分解酶的类型和/或浓度、与分解酶一起温育的时间、原生质体洗涤程序和/或缓冲液、在实际转化期间中的原生质体和/或多核苷酸和/或转化试剂的浓度、转化期间中的物理参数、转化至获得的转化体后的程序。
原生质体可以重悬于渗透稳定缓冲液中。此些缓冲液的组成可能取决于物种、应用和需要而不同。然而，这些缓冲液通常含有有机成分，例如蔗糖、柠檬酸盐、甘露醇或山梨糖醇，在0.5和2M之间，更优选在0.75和1.5M之间；最优选1M。除此之外，这些缓冲液含有无机渗透稳定组分，例如KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、NaCl或MgCl2，浓度在0.1和1.5M之间，优选在0.2和0.8M之间；更优选在0.3和0.6M之间，最优选0.4M。最优选的稳定缓冲液是STC(山梨糖醇，0.8M；CaCl2，25mM；Tris，25mM；pH 8.0)或KCl-柠檬酸盐(KCl，0.3-0.6M；柠檬酸盐，0.2％(w/v))。原生质体可以以1x 105和1x 1010个细胞/ml之间的浓度使用。优选地，浓度在1x 106和1x 109之间；更优选第，浓度在1x 107和5x 108之间；最优选地，浓度为1x 108个细胞/ml。DNA的使用浓度在0.01和10ug之间；优选在0.1和5ug之间，甚至更优选在0.25和2ug之间；最优选在0.5和1ug之间。为了提高转染效率，可以将载体DNA(例如，鲑鱼精DNA或非编码载体DNA)加入转化混合物中。
在一个实施例中，在生成和随后分离后，将原生质体与一或多种冷冻保护剂混合。冷冻保护剂可以是二醇、二甲基亚砜(DMSO)、多元醇、糖、2-甲基-2,4-戊二醇(MPD)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、甲基纤维素、C-连接的抗冻糖蛋白(C-AFGP)或其组合。在本文提供的方法和系统中用作冷冻保护剂的二醇可以选自乙二醇、丙二醇、聚丙二醇(PEG)、甘油或其组合。在本文提供的方法和系统中用作冷冻保护剂的多元醇可以选自丙烷-1,2-二醇、丙烷-1,3-二醇、1,1,1-三-(羟甲基)乙烷(THME)和2-乙基-2-(羟甲基)-丙烷-1,3-二醇(EHMP)或其组合。在本文提供的方法和系统中用作冷冻保护剂的糖可以选自海藻糖、蔗糖、葡萄糖、棉子糖、右旋糖或其组合。在一个实施例中，原生质体与DMSO混合。DMSO可以以一定最终浓度与原生质体混合，所述最终浓度至少，最多，小于，大于，等于，或约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％w/v或v/v。可以在储存之前将原生质体/冷冻保护剂(例如，DMSO)混合物分布到微量滴定板。原生质体/冷冻保护剂(例如，DMSO)混合物可以在本文提供的任何温度下储存，用于如本文提供的长期储存(例如，几小时、一或多天、一或多周、一或多月、一或多年)，所述温度诸如例如-20℃或-80℃。在一个实施例中，将另外的冷冻保护剂(例如，PEG)加入到原生质体/DMSO混合物中。在又一个实施例中，在储存之前将另外的冷冻保护剂(例如，PEG)加入到原生质体/DMSO混合物中。PEG可以是本文提供的任何PEG，并且可以以本文提供的任何浓度(例如，w/v或v/v)加入。在一个实施例中，在STC缓冲液中将PEG溶液制备成40％w/v。然后可将本40％PEG-STC的20％v/v加入到原生质体中。例如，800微升1.25x107个原生质体将得到200微升40％PEG-STC，最终体积为1ml。然后可以向本1ml中加入七十微升DMSO，使本制剂达到7％v/v DMSO。
转化方法
在一个实施例中，本文提供的方法和系统需要将核酸转移到源自如本文所述的丝状真菌细胞的原生质体。在另一个实施例中，本文提供的方法和系统使用的转化本质上是高通量的和/或如本文所述是部分或完全自动化的。进一步对于本实施例，通过将如本文所述的构建体或表达构建体加入到微量滴定板的孔中并然后将通过本文提供的方法生成的原生质体等分到微量滴定板的每个孔来进行转化。用于转化/转染原生质体的合适程序可以是本领域已知的任何程序，包含例如国际专利申请PCT/NL99/00618，PCT/EP99/202516，芬克尔斯坦(Finkelstein)和鲍尔(Ball)(编辑)，丝状真菌生物技术(Biotechnology offilamentous fungi)，技术和产品(technology and products)，巴特沃斯-海内曼出版社(1992年)，本内特(Bennett)和来苏尔(Lasure)(编辑)，真菌中更多的基因操作(More GeneManipulations in fungi)，学术出版社(1991年)，特纳(Turner)，于派勒(Puhler)(编辑)，生物技术(Biotechnology)，第二完整修订版，VHC(1992年)中，原生质体融合，以及如EP635574B中所述的Ca-PEG介导的原生质体转化中描述的那些。可替代地，丝状真菌宿主细胞或源自其的原生质体的转化也可以通过电穿孔(诸如例如查克拉博蒂(Chakraborty)和卡普尔(Kapoor)，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，18:6737(1990年)，根癌农杆菌介导的转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)所述的电穿孔)、DNA的生物射弹引入(诸如如克里斯蒂安森(Christiansen)等人，当前遗传学(Curr.Genet.)，29:100 102(1995年)；杜兰德(Durand)等人，当前遗传学，31:158 161(1997年)；和巴塞罗斯(Barcellos)等人，加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)，44:1137 1141(1998年)中所述)或细胞的“磁-生物射弹”转染(诸如例如美国专利第5,516,670号和第5,753,477号中所述)进行。在一个实施例中，使用利用冲击波的方法进行丝状真菌宿主细胞或源自其的原生质体的转化。冲击波方法可以是本领域已知的任何冲击波方法，诸如例如单脉冲水下冲击波方法，如丹尼斯·马加尼亚-奥尔蒂斯(Denis-Ortíz)、南希·科科尼-莱纳雷斯(Nancy Coconi-Linares)、伊丽莎白·奥尔蒂斯-巴斯克斯(Elizabeth Ortiz-Vazquez)、弗朗西斯科·费尔南德斯(Francisco Fernández)、阿奇姆·M·洛克(Achim M.Loske)、米格尔·A·戈麦斯-林(Miguel A.Gómez-Lim)(2013年)，一种利用冲击波对真菌进行遗传转化的新颖而高效的方法(A novel and highly efficient method for genetictransformation of fungi employing shock waves)，真菌遗传学和生物学(FungalGenetics and Biology)，56:9-16所述。用于本文方法的冲击波方法也可以是双脉冲冲击波，如洛克AM(Loske AM)、费尔南德斯F(Fernández F)、马加尼亚-奥尔蒂斯(-Ortíz)、科科尼-莱纳雷斯N(Coconi-Linares N)、奥尔蒂斯-巴斯克斯E(Ortiz-Vazquez E)、戈麦斯-林MA(Gómez-Lim MA)(2014年)，用于增强黑曲霉的遗传转化的串联冲击波(Tandemshock waves to enhance genetic transformation of Aspergillus niger)，超声波学(Ultrasonics)，54(6):1656-62所述。在一个实施例中，本文提供的方法和系统中使用的转化程序是可修正为如本文提供的高通量和/或自动化的转化程序，诸如例如PEG介导的转化。
通过使用本领域已知的任何转化试剂可以促进使用本文所述方法生成的原生质体的转化。合适的转化试剂可以选自聚乙二醇(PEG)、HD(购自Roche)、或(购自Invitrogen)、D1(购自NewEngland Biolabs)、或(购自Invivogen)。在一个实施例中，PEG是最优选的转化/转染试剂。PEG可以不同的分子量获得，并且可以以不同的浓度使用。优选地，使用的PEG 4000在10％和60％之间，更优选在20％和50％之间，最优选40％。在一个实施例中，如本文所述，在储存之前将PEG加入到原生质体中。
用于转化的构建体
在一个实施例中，本文提供的方法和系统需要用至少一种核酸转化或转染丝状真菌细胞或源自其的原生质体。转化或转染可以使用本文描述的方法和试剂。原生质体的生成可以使用本文提供的任何方法进行。如本文提供，原生质体生成和/或转化可以是高通量和/或自动化的。核酸可以是DNA、RNA或cDNA。核酸可以是多核苷酸。用于使用本文提供的方法和系统转化丝状真菌细胞或源自其的原生质体的核酸或多核苷酸可以是相对于变体菌株和/或亲本菌株的内源基因或异源基因。内源基因或异源基因可以编码如本文所述的目标产物或蛋白质。如本文所述，目标蛋白质可以是指需要在丝状真菌中表达的多肽。此蛋白质可以是酶、底物结合蛋白质、表面活性蛋白质、结构蛋白质等，并且可以以高水平表达，并且可以用于商业化的目的。目标蛋白质可以在细胞内表达或作为分泌蛋白质表达。内源基因或异源基因可以包括突变和/或在一或多种遗传控制或调节元件的控制下或与其可操作地连接。突变可以是本文提供的任何突变，例如插入、缺失、取代和/或单核苷酸多态性。一或多种遗传控制或调节元件可以是启动子序列和/或终止子序列。
相对于变体菌株和/或亲本菌株，启动子序列和/或终止子序列可以是内源的或异源的。启动子序列可以与待表达序列的5'端可操作地连接。多种已知的真菌启动子可能在所公开的宿主菌株中具有功能性，例如C1内切葡聚糖酶的启动子序列、55kDa纤维二糖水解酶(CBH1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶A、鲁克文金孢子菌(C.lucknowense)GARG 27K和来自金孢子菌属的30kDa木聚糖酶(Xy1F)启动子，以及例如美国专利第4,935,349号；第5,198,345号；第5,252,726号；第5,705,358号；和第5,965,384号；和PCT申请WO 93/07277中描述的曲霉属启动子。终止子序列可以与待表达序列的3'端可操作地连接。多种已知的真菌终止子可能在所公开的宿主菌株中具有功能性。实例是构巢曲菌trpC终止子、黑曲霉α-葡糖苷酶终止子、黑曲霉葡糖淀粉酶终止子、米黑毛霉羧基蛋白酶终止子(参见美国专利第5,578,463号)、金孢子菌属终止子序列(例如，EG6终止子)和里氏木霉纤维二糖水解酶终止子。
在一个实施例中，由丝状真菌细胞生成的原生质体与两种或两种以上核酸或多核苷酸共转化。进一步对于本实施例，两种或两种以上多核苷酸中的至少一种是相对于生成原生质体的丝状真菌菌株的内源基因或异源基因，并且两种或两种以上多核苷酸中的至少一种是可选择标记的基因。可选择标记基因可以是本文提供的任何可选择标记。在其它实施例中，使用分裂标记系统。
在一个实施例中，用于转化或转染丝状真菌细胞或源自其的原生质体的每种核酸或多核苷酸包括与丝状真菌细胞或源自其的原生质体的基因组的预定靶基因座中存在的DNA序列同源的序列，其在核酸或多核苷酸的5'端、3'端或5'和3'端转化。核酸或多核苷酸可以是相对于用于转化的丝状真菌细胞的内源基因或异源基因或可选择标记基因，使得与丝状真菌宿主细胞基因组中的预定基因座同源的序列侧接于内源、异源或可选择标记基因上。在一个实施例中，使用本领域已知的任何方法将每种核酸或多核苷酸克隆到克隆载体中，例如(Stratagene)。合适的克隆载体可以是能够在所使用的丝状真菌宿主细胞的染色体中的预定靶基因座整合的载体。优选的整合克隆载体可以包括DNA片段，其与待缺失或替换的DNA序列同源，用于靶向克隆载体与本预定基因座的整合。为了促进靶向整合，可以在转化宿主细胞或源自其的原生质体之前将克隆载体线性化。优选地，进行线性化，使得克隆载体的至少一端(但优选任一端)由与待缺失或替换的DNA序列同源的序列侧接。在一些情况下，可以例如经由PCR在待整合的核酸或多核苷酸的两侧加入DNA的短同源段。侧接于待整合的核酸或多核苷酸序列上的同源序列的长度优选小于2kb，甚至优选小于1kb，甚至更优选小于0.5kb，甚至更优选小于0.2kb，甚至更优选小于0.1kb，甚至更优选小于50bp，最优选小于30bp。侧接于待整合的核酸或多核苷酸序列上的同源序列的长度可以为约30bp到约1000bp、约30bp到约700bp、约30bp到约500bp、约30bp到约300bp、约30bp到约200bp和约30bp到约100bp。用于转化丝状真菌细胞或源自其的原生质体的核酸或多核苷酸可以作为表达盒存在。在一个实施例中，克隆载体是pUC19。进一步对于本实施例，通过使用本领域已知的吉布森组装建立构建体，可以将含有本文提供的标记序列的克隆载体与靶向序列相关联。可替代地，可以通过融合PCR加入靶向序列。可以从基因组DNA扩增未与标记连接的用于共转化的靶向序列。
理论上，可以选择丝状真菌基因组中的所有基因座用于包括本文提供的核酸或多核苷酸的表达盒的靶向整合。优选地，其中将发生靶向的基因座使得当存在于所述基因座的野生型基因已被表达盒中包括的基因替换时，获得的突变体将表现出可由给定测定(诸如例如本文所述的选择/反选择方案)检测到的变化。在一个实施例中，如本文所述的由丝状真菌细胞生成的原生质体与第一构建体或表达盒和第二构建体或表达盒共转化，使得第一构建体或表达盒被设计成整合到原生质体基因组的第一基因座中，而第二构建体或表达盒被设计成整合到原生质体基因组的第二基因座中。为了促进整合到第一基因座和第二基因座中，第一构建体或表达盒由与第一基因座同源的序列侧接，而第二构建体或表达盒由与第二基因座同源的序列侧接。在一个实施例中，第一构建体或表达盒包括内源基因的序列，而第二构建体包括可选择标记基因的序列。进一步对于本实施例，第二基因座含有在本文提供的方法和系统中使用的原生质体基因组中存在的另外的可选择标记基因的序列，而第一基因座含有在本文提供的方法和系统中使用的原生质体基因组中存在的内源靶基因的序列。在一个单独的实施例中，第一构建体或表达盒包括内源基因或异源基因的序列，而第二构建体包括第一可选择标记基因的序列。进一步对于本单独的实施例，第二基因座含有存在于本文提供的方法和系统中使用的原生质体基因组中的第二可选择标记基因的序列，而第一基因座含有存在于本文提供的方法和系统中使用的原生质体基因组中的第三可选择标记基因的序列。在每个上述实施例中，内源基因和/或异源基因可以包括本文提供的突变(例如，SNP)和/或遗传控制或调节元件。在另一方面，使用分裂标记系统。
分裂标记转化
“分裂标记”转化(如卡特利特,N.L.(Catlett,N.L.)、B.李(B.Lee)、O.C.约德(O.C.Yoder)和B.G.特金(B.G.Turgeon)(2003年)“用于有效靶向缺失真菌基因的分裂标记重组(Split-Marker Recombination for Efficient Targeted Deletion of FungalGenes)”，真菌遗传学报告(Fungal Genetics Reports)：第50卷，第4条中所述)利用赋予可选择表型的基因片段。当它们单独整合到菌株中时，个体片段不与靶菌株中的突变互补或者不赋予抗生素抗性。当两个片段重组并修复抗性基因或营养缺陷型标记时，发生选择标记的适当表达。
分裂标记的一个实例如图1B中所示。在本实例中，标记基因是pyrG。所表示的DNA片段是pyrG基因的5'半部“pyr”和3'半部“yrG”。这些构建体用于补充靶菌株中的pyrG突变。如果pyr部分整合而未与yrG部分重组，则没有互补。加入含有所需SNP的序列区域的直接重复
当与靶基因座相同的DNA与两种组分中的每一种融合时，发生使用分裂标记构建体的基因靶向。例如，通过将对应于SNP上游的5'区域的DNA与分裂标记的5'半部融合来进行单碱基对改变的靶向。相应的3'DNA与3'分裂标记融合。当这些通过同源整合在细胞中重组时，两个直接重复位于与SNP文库中相匹配的靶菌株中的SNP基因座处。当通过两个直接重复之间的同源重组环出标记时，发生SNP交换的完成。
同核原生质体的纯化
如本领域技术人员所理解，源自丝状真菌的原生质体通常可以含有一个以上的核，使得随后用本文提供的表达构建体转化可以生产异核的原生质体，使得表达构建体仅并入原生质体中存在的多个核的子集中。可以采用策略来增加转化前在来自丝状真菌宿主细胞的原生质体群中的单核原生质体的百分比，诸如例如如隆塞罗(Roncero)等人，1984年，突变研究(Mutat.Res.)，125:195中所述。
可选择标记通常可以编码基因产物，其提供并非非转化菌株所原有的特异类型的抗性。这通常可以是对重金属、抗生素或杀生物剂的抗性。原养型也可以是非抗生素品种的有用可选择标记。营养缺陷型标记可以在宿主细胞中生成营养缺乏，并且可以使用矫正这些缺陷的基因来进行选择。
存在广泛的本领域中使用的选择标记，并且这些中的任何一个或全部可以应用于本文提供的方法和系统。用于本文的可选择标记基因可以是营养缺陷型标记、原养型标记、显性标记、隐性标记、抗生素抗性标记、分解代谢标记、酶标记、荧光标记、发光标记或其组合。用于本文提供的方法的可选择/可反选择标记的实例包含但不限于：amdS(在乙酰胺上选择/在氟乙酰胺上反选择)、tk(来自疱疹病毒的胸苷激酶；在5-氟-2'-脱氧尿苷上反选择)、ble(博来霉素-腐草霉素抗性)、hyg(潮霉素R)、nat(链丝菌素R)、pyrG(在尿嘧啶+尿苷上选择/在5'FOA上反选择)、niaD或niaA(在硝酸盐上选择/在氯酸盐上反选择)、sutB(在硫酸盐上选择/在硒酸盐上反选择)、eGFP(绿色荧光蛋白)和所有不同的颜色变体、aygA(比色标记)、met3(在蛋氨酸上选择/在硒酸盐上反选择)、sC/metA(在硫酸盐上选择/在硒酸盐上反选择)、pyrE(乳清酸磷酸核糖转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合成酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、突变乙酰乳酸合成酶(磺酰脲抗性)和新霉素磷酸转移酶(氨基糖苷抗性)。
本公开的另一个实施例需要使用两种或两种以上在丝状真菌中有活性的选择标记。存在广泛的可以使用的选择标记的组合，并且所有这些均可以应用于本文提供的选择/反选择方案中。例如，选择/反选择方案可以利用营养缺陷型标记、原养型标记、显性标记、隐性标记、抗生素抗性标记、分解代谢标记、酶标记、荧光标记和发光标记的组合。可以使用第一标记以正向模式中选择(即如果已发生有效整合)，同时可以使用另外的标记以反向模式中选择(即如果已发生适当基因座处的有效整合)。选择/反选择可以通过共转化进行，使得选择标记可以在单独的载体上，或者可以在与本文所述的内源或异源基因相同的核酸片段或载体中。
在一个实施例中，本公开的同核原生质体纯化方案需要用包括内源基因或异源基因的序列的第一构建体和包括第一可选择标记基因的序列的第二构建体共转化由丝状真菌宿主细胞生成的原生质体，使得第一构建体针对包括待去除或失活的靶基因的序列的原生质体基因组的第一基因座，而第二构建体针对包括第二可选择标记基因的序列的原生质体基因组的第二基因座。在一个实施例中，第一构建体包括内源基因或异源基因的序列，并且待去除或失活的靶基因用于第三可选择标记基因。在一个单独的实施例中，第一构建体包括内源基因的序列，并且待去除或失活的靶基因是在转化前存在于原生质体基因组中的内源基因的拷贝。如本文所述，第一构建体的内源基因或异源基因可以包括突变(例如，SNP)和/或遗传调节或控制元件(例如，启动子和/或终止子)。第一、第二和/或第三可选择标记可以是本领域已知和/或本文所述的任何营养缺陷型标记、原养型标记、显性标记、隐性标记、抗生素抗性标记、分解代谢标记、酶标记、荧光标记、发光标记。为了针对特异性基因座，每个构建体由与如本文所述的原生质体基因组中的所需基因座同源的核苷酸侧接。
其中第一构建体包括内源基因或异源基因的序列并且待去除或失活的靶基因是第三可选择标记基因的实施例的一个实例示出于图4A中。在本实例中，第一构建体包括包括SNP的参与丝状真菌中柠檬酸生产的内源基因的序列，其整合到比色可选择标记基因aygA的基因座中，而第二构建体包括营养缺陷型标记基因pyrG的序列，其整合到营养缺陷型标记基因met3的基因座中。在本实例中，丝状真菌宿主细胞是pyrG阴性或尿嘧啶营养缺陷型。因此，纯化同核原生质体转化体需要在缺少尿嘧啶的基本培养基上使所述转化体生长。如图4A中所示，同核转化体不仅是尿嘧啶原养型，而且还是纯黄色的，表明pyrG基因的并入和aygA基因的去除。通过随后将转化体平板接种在含有硒酸盐的基本培养基(含或不含尿嘧啶)上，可以实现对任何残留的异核集落的反选择和去除，由此具有met3+核的转化体将在存在硒酸盐的情况下死亡。与met3基因类似地操作的另一种标记可以是例如编码硝酸盐还原酶的niaA基因，其可以用于本实施例中描述的选择/反选择方案。对于niaA基因，丝状真菌宿主细胞可以是niaA+，由此第二构建体的正确整合生成niaA-后代，其对反选择期间使用的氯酸盐具有抗性。在一个实施例中，通过使用诸如例如下一代测序(NGS)对原生质体的基因组进行测序来对第一和/或第二构建体正确整合到原生质体基因组中进行确认。
其中第一构建体包括内源基因的序列并且待去除或失活的靶基因是在转化前存在于原生质体基因组中的内源基因的拷贝的实施例的一个实例示出于图5中。在本实例中，第一构建体包括包括SNP的参与丝状真菌中柠檬酸生产的内源基因的序列，其整合到缺少所述SNP的所述内源基因的基因座中，而第二构建体包括营养缺陷型标记基因pyrG的序列，其整合到比色标记基因aygA的基因座中。在本实例中，丝状真菌宿主细胞是pyrG阴性或尿嘧啶营养缺陷型。因此，纯化同核原生质体转化体需要在缺少尿嘧啶的基本培养基上使所述转化体生长。如图5中所示，同核转化体不仅是尿嘧啶原养型，而且还是纯黄色的，表明pyrG基因的并入和aygA基因的去除。在一个实施例中，通过使用诸如例如下一代测序(NGS)对原生质体的基因组进行测序来对第一和/或第二构建体正确整合到原生质体基因组中进行确认。
在一个实施例中，第二构建体包括编码可循环或可逆标记的表达盒。可循环或可逆标记可以是破坏neo-pyrG-neo表达盒。neo-pyrG-neo构建体可以与上述实施例中所述的第一构建体在丝状真菌宿主细胞(例如，黑曲霉)的ura-菌株中共转化，并且可以通过在尿嘧啶缺陷型培养基上进行平板接种并选择如上所述的纯黄色尿嘧啶原养型来选择同核转化体。随后，可以通过在含有5-FOA的培养基上平板接种所述同核转化体并选择在所述5-FOA培养基上生长的转化体来再生pyrG选择的使用，这表明所述转化体已在导致pyrG基因的切除的neo重复之间经历了染色体内重组。
文库生成
本公开的另一方面可以包含真菌突变体文库的构建和筛选，以及通过本文公开的方法制备的真菌突变体文库。可以使用本领域技术人员已知的方法，借助于任何整合转化装置，通过转化根据本公开的真菌宿主来获得文库。可以在小型化和/或高通量形式筛选方法中处理基于使用本文提供的方法和系统生成的优选宿主菌株的真菌文库，并对其进行筛选以筛出外源蛋白质的所需性质或活性。目标性质或活性可以是指与文库成员的外源蛋白质相关的任何物理、物理化学、化学、生物学或催化性质，或此性质的任何改善、增加或减少。还可以对文库进行筛选以筛出代谢物，或筛出由于存在外源和/或内源蛋白质而产生的与代谢物相关的性质或活性。还可以对文库进行筛选以筛出产生增加或减少量的此蛋白质或代谢物的真菌。
在一个实施例中，本文提供的方法和系统生成多个原生质体，使得来自多个原生质体的每个原生质体用来自多个第一构建体的单个第一构建体和来自多个第二构建体的单个第二构建体转化。进一步对于本实施例，来自多个第一构建体的每个第一构建体中的第一多核苷酸包括不同的突变和/或遗传控制或调节元件，而来自多个第二构建体的每个第二构建体中的第二多核苷酸是相同的。所述方法进一步包括使用如本文所述的选择/反选择两次或更多次来转化并纯化同核转化体，以便生成丝状真菌细胞文库，使得文库中的每个丝状真菌细胞包括具有不同突变和/或遗传控制或调节元件的第一多核苷酸。在一个实施例中，第一多核苷酸包括包括突变的靶丝状真菌基因或异源基因的序列，使得迭代过程在原生质体再生时生成丝状真菌细胞文库，使得文库的每个成员包括具有不同突变的靶丝状真菌基因或异源基因。在一个实施例中，突变是SNP，因此所述方法产生SNP交换文库。在一个实施例中，靶丝状真菌基因是参与柠檬酸生产的基因，并且多个第一构建体是表1中提供的SNP文库。在另一个实施例中，第一多核苷酸包括与遗传控制或调节元件可操作地连接的靶丝状真菌基因或异源基因的序列，使得本文所述的迭代过程在原生质体再生时生成丝状真菌细胞文库，使得文库的每个成员包括与不同遗传控制或调节元件可操作地连接的靶丝状真菌基因或异源基因。在一个实施例中，遗传控制或调节元件是启动子，因此所述方法产生启动子或PRO文库。在一个实施例中，遗传控制或调节元件是终止子，因此所述方法产生终止子或STOP文库。启动子和/或终止子序列可以是本文提供的和/或本领域已知的启动子或终止子序列，用于在本文提供的方法和系统中使用的丝状真菌宿主细胞中表达。
表1.可能参与黑曲霉中柠檬酸生产的SNP。
SNP交换
在一个实施例中，本文提供的方法和系统用于SNP交换，以便生成包括具有个体SNP或SNP组合的丝状真菌的丝状真菌文库。
经由本过程工程化改造的所得微生物形成HTP遗传设计文库。
HTP遗传设计文库可以是指经由本过程形成的实际物理微生物菌株集合，其中每个成员菌株表示给定SNP的存在或不存在，在其它方面相同的遗传本底中，所述文库被称为“SNP交换微生物菌株文库”。
此外，HTP遗传设计文库可以是指遗传扰动的集合——在这种情况下，存在给定的SNP或不存在给定的SNP——所述集合被称为“SNP交换文库”。
因此，SNP交换涉及利用具有标识有益性能效果的靶SNP“积木”的最佳组合对宿主有机体进行重新构建。因此，在一些实施例中，SNP交换涉及将多个有益突变合并到单个菌株本底中，或在迭代过程中一次合并一个，或在单个步骤中作为多个变化合并。多个变化可以是一组具体的限定变化，也可以是部分随机化的组合变异文库。
在其它实施例中，SNP交换还涉及从菌株去除标识为有害的多个突变，或在迭代过程中一次去除一个，或在单个步骤中作为多次变化去除。多个变化可以是一组具体的限定变化，也可以是部分随机化的组合变异文库。在一些实施例中，本公开的SNP交换方法包含检入有益SNP和去除有害和/或中性突变。
在一些实施例中，本公开的SNP交换方法包括将在突变菌株(例如，S2-nGen2-n中的菌株)中标识的一或多个SNP引入参考菌株(S1Gen1)或野生型菌株的步骤。
在其它实施例中，本公开的SNP交换方法包括去除在突变菌株(例如，S2-nGen2-n中的菌株)中标识的一或多个SNP的步骤。
在一些实施例中，在本公开的一或多个标准(例如，生产目标化学品或产物)下培养并分析包括一或多个SNP变化(引入或去除)的每个生成的菌株。将来自每个分析的宿主菌株的数据与宿主菌株中存在的特定SNP或SNP组关联或相关，并记录以供将来使用。因此，本公开使得能够创建大且高度注释的HTP遗传设计微生物菌株文库，其能够标识给定SNP对任何数量的目标微生物遗传或表型性状的影响。存储在这些HTP遗传设计库中的信息通知HTP基因组工程化改造平台的机器学习算法并指导所述过程的未来迭代，这最终产生具有非常期望的性质/性状的进化微生物有机体。
HTP自动化系统
在一些实施例中，本文提供的方法和系统包括自动化步骤。例如，原生质体生成、原生质体转化和/或本文所述的经由选择/反选择的同核原生质体纯化可以是自动化的。如本文所述，所述方法和系统可以包含筛选纯化同核转化体的另一步骤，用于生产目标蛋白质或代谢物。本公开的自动化方法可以包括机器人系统。本文概述的系统通常可以涉及96孔或384孔微量滴定板的使用，但是如本领域技术人员将理解，可以使用任何数量的不同板或配置。此外，本文概述的任何或所有步骤可以是自动化的；因此，例如，系统可以是完全或部分自动化的。自动化方法和系统可以是高通量的。出于本公开的目的，高通量筛选可以是指能够每天评价约1,000或更多个转化体的任何部分或完全自动化的方法，特别是指能够每天评价5,000或更多个转化体的那些方法，最特别是指能够每天评价10,000或更多个转化体的方法。
如本文所述，本文提供的方法和系统可以包括筛选步骤，使得筛选或测试如本文所述的经过生成和纯化的转化体以生产目标产物。目标产物可以是本文提供的任何目标产物，诸如例如醇、药物、代谢物、蛋白质、酶、氨基酸或酸(例如，柠檬酸)。因此，本文提供的方法和系统可以进一步包括在允许表达和分泌目标产物并回收随后生产的目标产物的条件下培养根据本公开的方法纯化的克隆集落或培养物。如本文所述，目标产物可以是外源和/或异源蛋白质或由于外源和/或异源蛋白质的表达而产生的代谢物。
在一些实施例中，本公开的自动化系统包括一或多个工作模块。例如，在一些实施例中，本公开的自动化系统包括DNA合成模块、载体克隆模块、菌株转化模块、筛选模块和测序模块(参见图7)。
如本领域技术人员所理解，自动化系统可以包含各种组件，包含但不限于：液体处理器；一或多个机器人臂；用于定位微孔板的平板处理器；平板密封器、平板穿孔器、用于去除和更换非交叉污染平板上的孔的盖子的自动化盖子处理器；具有一次性尖端的用于样品分布的一次性尖端组合件；用于样品分布的可洗涤尖端组合件；96孔加载块；集成热循环仪；冷却试剂架；微量滴定板移液管位置(任选地冷却)；平板和尖端的堆叠塔；磁珠加工站；过滤系统；平板振动器；条形码阅读器和敷贴器；和计算机系统。
在一些实施例中，本公开的机器人系统包含自动化液体和颗粒处理，实现高通量移液以执行基因靶向和重组应用过程中的所有步骤。这包含液体和颗粒操作，例如吸入、分配、混合、稀释、洗涤、准确体积转移；收回并丢弃移液管尖端；以及相同体积的重复移液，以通过单次样品吸入进行多次递送。这些操作是无交叉污染的液体、颗粒、细胞和有机体转移。所述仪器将微孔板样品自动化复制到过滤器、膜和/或子平板，并且进行高密度转移、全板连续稀释和高容量操作。
自动化系统可以是本领域已知的任何已知自动化高通量系统。例如，自动化系统可以是日本专利申请公开第11-304666号中描述的自动化微小有机体处理工具。本装置能够转移含有个体细胞的微滴，并且预期本公开的真菌菌株凭借其形态将适于用本装置对个体克隆进行显微操作。用于本公开的方法和系统的自动化系统的另一个实例是贝东(Beydon)等人，生物分子筛选杂志(J.Biomol.Screening)，5:13 21(2000年)中描述的自动化微生物高通量筛选系统。本文使用的自动化系统可以是定制自动化液体处理系统。在一个实施例中，本公开的定制自动化液体处理系统是TECAN机器(例如，定制的TECAN FreedomEvo)。
在一些实施例中，本公开的自动化系统与用于多孔板、深孔板、方孔板、试剂槽、试管、微型管、微量离心管、冷冻小瓶、过滤器、微阵列芯片、光纤、珠子、琼脂糖和丙烯酰胺凝胶的平台兼容，并且其它固相基质或平台被安置在可升级的模块化甲板上。在一些实施例中，本公开的自动化系统包含多位置工作表面的至少一个模块化甲板，用于放置源和输出样品、试剂、样品和试剂稀释液、测定板、样品和试剂储存器、移液管尖端和活跃的尖端洗涤站。
在一些实施例中，本公开的自动化系统包含用于转化原生质体的高通量电穿孔系统。在一些实施例中，高通量电穿孔系统能够转化96孔或384孔板中的细胞。在一些实施例中，高通量电穿孔系统包含高通量电穿孔系统、BTXTM、Bio-基因脉冲器MXcellTM或其它多孔电穿孔系统。
在一些实施例中，自动化系统包括集成的热循环仪和/或热调节器，其用于稳定热交换器(例如，受控块或平台)的温度，以提供从0℃到100℃温育样品的精确温度控制。
在一些实施例中，本公开的自动化系统与具有单个或多个磁性探针、亲和探针、复制器或移液器的可互换机器头(单通道或多通道)兼容，能够机械地操作液体、颗粒、细胞和多细胞有机体。多孔或多管磁性分离器和过滤站以单个或多个样品形式操作液体、颗粒、细胞和有机体。
在一些实施例中，本公开的自动化系统与相机视觉和/或光谱仪系统兼容。因此，在一些实施例中，本公开的自动化系统能够检测并记录进行中的细胞培养物中的颜色和吸收变化。
在一些实施例中，本公开的自动化系统被设计成是灵活的并且可适应多个硬件附件以允许系统执行多个应用。用于本文提供的方法的自动化系统可以包括软件程序模块。软件程序模块可以允许创建、修改和运行方法。所述系统可以进一步包括诊断模块。诊断模块可以允许设置、仪器比对和电机操作。所述系统还可以进一步包括定制工具、实验室器具、液体和颗粒转移模式和/或数据库。定制工具、实验室器具以及液体和颗粒转移模式可以允许编程和执行不同的应用。数据库可以允许方法和参数存储。此外，系统中存在的机器人和计算机接口可以允许仪器之间的通信。
本领域技术人员将认识到能够执行本公开的HTP方法的各种机器人平台。
计算机系统硬件
图8示出了根据本公开的实施例的可以用于执行存储在非暂时性计算机可读介质(例如，存储器)中的程序代码的计算机系统800的一个实例。计算机系统包含输入/输出子系统802，其可以用于根据应用与人类用户和/或其它计算机系统相连接。I/O子系统802可以包含例如键盘、鼠标、图形用户界面、触摸屏或用于输入的其它接口，以及例如LED或其它平面屏幕显示器或用于输出的其它接口，包含应用程序接口(API)。本公开的实施例的其它元件，例如LIMS系统的组件，可以用类似于计算机系统800的计算机系统来实现。
程序代码可以存储在非暂时性介质(例如，辅助存储器810或主存储器808或两者中的永久存储)中。主存储器808可以包含易失性存储器(例如，随机存取存储器(RAM))或非易失性存储器(例如，只读存储器(ROM))，以及用于更快地访问指令和数据的不同级别的高速缓冲存储器。辅助存储器可以包含永久存储，例如固态驱动器、硬盘驱动器或光盘。一或多个处理器804从一或多个非暂时性媒体读取程序代码并执行所述代码以使计算机系统能够完成由本文的实施例执行的方法。本领域技术人员将理解，处理器可以摄取源代码，并将源代码解释或编译成在处理器804的硬件门级可理解的机器代码。处理器804可以包含用于处理计算密集型任务的图形处理单元(GPU)。特别是在机器学习中，一或多个CPU 804可以将大量数据的处理卸载到一或多个GPU 804。
处理器804可以经由一或多个通信接口807(例如，网络接口卡、WiFi收发器等)与外部网络通信。总线805通信地联接I/O子系统802、处理器804、外围装置806、通信接口807、存储器808和永久存储810。本公开的实施例不限于本代表性架构。替代实施例可以采用不同的布置和类型的组件，例如用于输入-输出组件和存储器子系统的单独的总线。
本领域技术人员将理解，本公开的实施例的一些或所有元件及其伴随操作可以全部地或部分地由包含一或多个处理器和一或多个存储器系统(类似于计算机系统800的那些)的一或多个计算机系统实现。特别地，本文描述的任何机器人和其它自动化系统或装置可以是计算机实现的。一些元件和功能可以在本地实现，而其它元件和功能可以例如通过不同的服务器在网络上以分布式方式(例如，以客户端-服务器方式)实现。特别地，服务器端操作可以以软件即服务(SaaS)方式提供给多个客户端。
在本背景中，术语组件泛指软件、硬件或固件(或其任何组合)组件。组件通常是可以使用指定输入生成有用的数据或其它输出的功能组件。组件可以是或不是独立的。应用程序(也被称为“应用”)可以包含一或多个组件，或者组件可以包含一或多个应用程序。
除了其它模块或应用组件外，一些实施例包含所述组件中的一些或全部，或者不包含任何所述组件。此外，各个实施例可以将这些组件中的两个或两个以上并入单个模块中和/或将这些组件中的一或多个的一部分功能与不同的组件相关联。
术语“存储器”可以是用于存储信息的任何装置或机构。根据本公开的一些实施例，存储器旨在涵盖但不限于以下任何类型：易失性存储器、非易失性存储器和动态存储器。例如，存储器可以是随机存取存储器、存储器存储装置、光存储器装置、磁介质、软盘、磁带、硬盘驱动器、SIMM、SDRAM、DIMM、RDRAM、DDR RAM、SODIMMS、可擦除可编程只读存储器(EPROM)、电可擦除可编程只读存储器(EEPROM)、压缩盘、DVD等。根据一些实施例，存储器可以包含一或多个磁盘驱动器、闪存驱动器、数据库、本地高速缓冲存储器、处理器高速缓存存储器、关系数据库、平面数据库、服务器、基于云的平台等。另外，本领域普通技术人员将理解，用于存储信息的多种另外的装置和技术可以用作存储器。
存储器可以用于存储用于在处理器上运行一或多个应用或模块的指令。例如，在一些实施例中可以使用存储器来容纳执行本申请中公开的一或多个模块和/或应用的功能所需的全部或一些指令。
实例
实例1：丝状真菌的HTP基因组工程化改造：丝状真菌原生质体的生成和储存
原生质体的生成
如图1A所示，用106个分生孢子/ml的黑曲霉接种100毫升完全培养基，并使其在30℃下以150rpm生长过夜。生长过夜后，通过神奇滤布过滤培养物来收获菌丝体。随后，用无菌水彻底冲洗菌丝体。对于以下实例中描述的实验，使用两种黑曲霉菌株，黑曲霉菌株1015和黑曲霉菌株11414。然后用VinoTaste Pro(VTP)酶混合液对收获并洗涤的菌丝体进行酶消化。
对于黑曲霉菌株1015，通过首先在原生质体形成缓冲液(1.2M硫酸镁、50mM磷酸盐缓冲液，pH 5)中制备50ml 60mg/ml VTP进行酶消化。溶解VTP后，将缓冲液置于干净的奥克里奇(Oakridge)管中，以15,000x g旋转15分钟。然后在离心后将溶液过滤灭菌。一旦制成，将一些收获的菌丝体加入到VTP溶液中，并将菌丝体在30℃下以80rpm消化2-4小时。在VTP消化期间以不同间隔对小样品在400x放大率下进行检查以确定原生质体(即大于分生孢子且对渗透溶解敏感的大圆形细胞)的存在。当大部分或全部菌丝体被消化时，将培养物通过无菌神奇滤布过滤，使得25ml含有原生质体的流过物分离到2个50ml Falcon管中的1个中。向每一个25ml样品中轻轻地覆盖5ml 0.4M ST缓冲液(0.4M山梨糖醇、100mM Tris，pH 8)。然后将覆盖后的样品在4℃下以800x g旋转15分钟，以便在ST和消化缓冲液之间形成可见层。然后用移液管去除原生质体，并与25ml ST溶液(1.0M山梨糖醇、50mM Tris，Ph 8.0)轻轻地混合，并且以800x g重新旋转10分钟。原生质体应在管底部沉淀。然后将原生质体重悬于25ml ST溶液中，并通过以800x g离心10分钟收集。
对于黑曲霉菌株11414，通过首先在原生质体形成缓冲液(0.6M硫酸铵、50mM马来酸，pH 5.5)中制备40ml 30mg/ml VTP进行酶消化。将所有收获的菌丝体加入到VTP溶液中，并将菌丝体在30℃下以70rpm消化3-4小时。在VTP消化期间以不同间隔对小样品在400x放大率下进行检查以确定原生质体的存在。当大部分或全部菌丝体被消化时，将培养物通过无菌神奇滤布过滤。然后将滤液在4℃下以800x g旋转10分钟以沉淀细胞。加入25ml ST溶液(1.0M山梨糖醇、50mM Tris，pH 8.0)，并且将细胞重悬并重新旋转。然后将细胞在10mlSTC缓冲液(1.0M山梨糖醇、50mM Tris，pH 8.0、50mM CaCl2)中洗涤，并通过以800x g离心10分钟收集。对原生质体(～108/ml)进行计数并调节至1.2x 107/ml。
对于由黑曲霉菌株(即1015或11414)生成的原生质体，在酶消化后，将20％v/v的40％PEG溶液(40％PEG-4000的STC缓冲液溶液)加入到原生质体中并轻轻地混合，然后加入7％v/v的二甲基亚砜(DMSO)，制成8％PEG/7％DMSO溶液。重悬后，使用如图1中描绘的自动化液体处理器将原生质体分布到96孔(25-50微升)微量滴定板，然后在转化前在至少-80℃下储存。
实例2：丝状真菌的HTP基因组工程化改造：丝状真菌原生质体的共转化的证明——原理验证。
靶向DNA的制备
为了提供图1A中描绘的自动化丝状真菌转化和筛选方法的概念证明(POC)，获得黑曲霉argB基因的DNA序列并确定适当的阅读框。然后设计一组SNP，使得任何所述SNP整合到黑曲霉基因组的argB基因座中将导致argB基因的无效突变。所述设计被生成为计算机实施构建体，其预测了一组用于使用吉布森组装建立构建体的寡聚体。
原生质体的自动化转化
然后使用自动化液体处理器，对如实例1中所述生成并储存在96孔板(100微升原生质体/孔)中的源自黑曲霉菌株1015的原生质体进行传统PEG钙介导的转化，以将SNP DNA构建体与96孔板中的原生质体-PEG/DMSO混合物组合。更具体地，向100微升原生质体中加入1-10微克SNP DNA构建体(体积为10微升或更少)，并将混合物在冰上温育15分钟。向本混合物中加入1ml 40％PEG并在室温下温育15分钟。随后，加入10ml基础培养基和1M山梨糖醇，并在30℃下以80rpm摇动1小时。本次温育后，将原生质体以800x g旋转5分钟，然后重悬于12ml含有1M山梨糖醇和0.8％琼脂的基本培养基中。第二天，使用另外的自动化液体处理步骤，将原生质体平板接种到选择性培养基(即基本培养基+精氨酸)和非选择性培养基(即基础培养基)上。用自动化转化方案生成的原生质体的成功转化预期是精氨酸营养缺陷型，因此不会由于SNP构建体靶向argB基因而在缺少精氨酸的基本培养基上生长。
如图2中所示，约3％的转化子表现出靶向DNA构建体在正确(即argB)基因座处的整合，如在缺少精氨酸的基本培养基中没有生长所证明。将经由下一代测序来对含SNP的构建体整合在正确基因座处进行确认
实例3：丝状真菌的HTP基因组工程化改造：丝状真菌原生质体的共转化的证明——使用比色选择/反选择的原理验证。本实例证明了丝状真菌细胞的自动化HTP共转化的另一个原理验证，并进一步证明了选择/反选择用于分离所需转化体的用途。
黑曲霉原生质体的形成和转化
使用如实例1中所述的含有β-葡聚糖酶活性的市售酶混合物生成大量(500ml)黑曲霉ATCC 1015真核真菌菌株的原生质体。通过离心从酶混合物分离原生质体，并且最后通过实例1中描述的方法将其重悬于含有氯化钙的缓冲液中。
如实例1中所述，将原生质体等分并在含有二甲基亚砜和聚乙二醇(PEG)的混悬液的容器中在负80摄氏度下冷冻。在一些实施例中，本公开教导了可以制备每孔中含有25-50微升原生质体的96孔微量滴定板原液，并将其大批量冷冻以用于使用本技术进行大规模基因组编辑活动。
传统PEG钙介导的转化通过自动化液体处理器进行，其将DNA与96孔中的原生质体-PEG混合物组合。使用另外的自动化液体处理步骤在转化后将转化体平板转化到选择性培养基上。
转化体的自动话筛选
如下面更详细讨论，在本实例中使用的黑曲霉细胞缺少功能性pyrG基因(即pyrG-)，用功能性pyrG基因转化，这使得转化细胞在不存在尿嘧啶的情况下生长。如图4A-B中所示，本实例的pyrG基因被进一步设计成并入黑曲霉的野生型met3基因的位置中，从而并入对天然存在的met3基因的破坏。met3基因的破坏进一步导致转化体是蛋氨酸营养缺陷型，从而提供了一种标识转化体的辅助筛选方法。
分离在不含尿嘧啶的选择性培养基上生长的转化体，并将其置于第二微量滴定板的各孔中。使第二微量滴定板中的转化体生长并形成孢子2-3天，然后重悬于由水和少量洗涤剂组成的液体中，以生成适于储存和下游自动化筛选的孢子原液。
然后使用每种上述孢子原液的小等分部分接种第三96孔PCR板中的液体培养基。使这些小培养物在固定培养箱中生长过夜，使得含有黄色色素的孢子发芽并形成更适于选择和下游步骤的菌丝。
在培养步骤之后，通过加入市售缓冲液并将培养物加热到99摄氏度20分钟来溶解第三PCR板的菌丝。然后将平板离心以从细胞/细胞器沉淀中分离DNA混悬上清液。然后将DNA提取用于PCR分析以标识包括所需DNA修饰的细胞系。
用于SNP的整合的共转化——SNP的设计
获得黑曲霉基因aygA的DNA序列并确定适当的阅读框。设计了四种不同类型的突变，如果整合，这将导致无效突变。
突变包含单碱基对变化，其并入同框终止密码子、小的两碱基对缺失、三碱基对整合和更大的100碱基对缺失，如果适当整合，所有这些将消除aygA活性。缺少aygA活性的菌株具有黄色孢子表型。所述设计被生成为计算机实施构建体，其预测了一组用于使用吉布森组装建立构建体的寡聚体。
通过共转化进行的SNP的整合
使用上述转化方法，将含有小变化的扩增子并入黑曲霉菌株1015的基因组中。如前所讨论，本黑曲霉菌株包括非功能性pyrG基因，因此在不存在外源尿嘧啶的情况下不能生长。已成功整合pyrG基因的细胞现在能够在不存在尿嘧啶的情况下生长。在这些pyrG+转化体中，还整合了aygA基因中的小突变的分离体表现出黄色孢子表型。(参见图3和4A)。还通过对含有SNP交换靶向区域的小扩增子进行测序来检测突变的存在(图4B)。
实例4：丝状真菌的HTP基因组工程化改造：实施HTP SNP文库菌株改良计划以改善真核生物黑曲霉ATCC 11414中的柠檬酸生产
以上实例3描述了以高通量方式使本公开的遗传工程化改造技术自动化的技术。本实例将上述技术应用于黑曲霉菌株ATCC11414的特异性HTP菌株改良。
黑曲霉是一种丝状真菌物种，用于通过发酵大规模生产柠檬酸。已经分离出本物种的多个菌株，并示出其具有不同的柠檬酸和其它有机酸生产能力。本公开的HTP菌株工程化改造方法可以用于组合致病等位基因并消除有害等位基因以改善柠檬酸生产。
使用分裂标记方法的遗传工程化改造
分裂标记介导的SNP交换的初始步骤与实例3中的相同，并且在图1D中表示为步骤1和2。在步骤2中，转化DNA由两个单独的线性片段组成，其含有融合至同源DNA的标记的非互补半部，以将SNP靶向适当的基因座。将转化体置于选择性培养基上并使其生长。具有稳定DNA整合的适当补充的菌株将形成集落。用手或通过自动化平台将这些集落挑选到含有100-200微升选择性琼脂培养基的微量滴定板中的各孔中。如步骤4中所示，使挑选的转化体生长并繁殖孢子。黑曲霉的孢子是单核的并且固有地是克隆的。通过取少量孢子并将它们再次平板接种到选择性培养基上，将转化菌株纯化成同核体(细胞中的所有核具有相同的基因型)。本过程由图1D中的箭头表示。将所述群体重复减少至少量克隆孔将在每个孔中产生同核体。然后将孔中的这些纯化菌株平板接种到含有反选择剂的培养基上，所述反选择剂对含有可选择标记的菌株有毒。已吸收由含有SNP的直接重复侧接的标记的菌株将以一定频率丢失标记，所述频率与直接重复的尺寸直接相关。例如，1,000碱基对直接重复不如100碱基对直接重复稳定。本环出阶段是图1D中的步骤6。然后以类似于使用NGS的实例2中所进行的方式筛选环出菌株。图4C包含来自利用分裂标记整合和环出进行的SNPSWP活动的数据。在本实例中，使用NGS筛选了超过1200个个体环出样品。从本组中生成了119个成功菌株，其在图4C的左上角显示为红点，因为来自所述孔的100％扩增子含有来自生产菌株的SNP。用蓝色标记的样品含有具有所需SNP的扩增子和本基因座处的天然碱基对。可以使用图1D中步骤4和5中所示的孢子繁殖和传代来使这些菌株是同核的。已经通过QC的119个样品可以分析它们对所需菌株改良性状的影响。各个SNP位置的SNP引入成功率如图6中所示。
来自天然黑曲霉菌株变体的SNP的遗传设计文库的文库标识。
黑曲霉菌株ATCC 1015在二十世纪初就已被标识为柠檬酸的生产者。后来发现了被称为ATCC 11414的本菌株的分离体，其表现出比其亲本更高的柠檬酸产量。例如，黑曲霉菌株ATCC 1015在含有硝酸铵的培养基中由140克葡萄糖平均生产7克柠檬酸，但缺少铁和锰阳离子。在另一方面，分离菌株ATCC 11414在相同条件下表现出10倍的产量增加(70克柠檬酸)。此外，相较于菌株1015的孢子，菌株ATCC 11414孢子在柠檬酸生产培养基中发芽并生长得更好。
为了标识这些表型差异的潜在遗传来源，对ATCC 1015和ATCC 11414菌株的基因组进行测序和分析。所得的分析标识出区分1015和11414菌株的42个SNP。
交换致病等位基因
由菌株ATCC 1015(“基础菌株”)制备原生质体用于如实例1中所述的转化。然后经由本公开的基因编辑技术将上述标识的42个SNP中的每一个单独引入基础菌株中(参见图5)。如上所述，用功能性pyrG和aygA基因突变共转化每个SNP。具有成功靶向aygA基因座的基因的转化体产生黄色孢子(图5)。
成功整合的筛选
分离含有推定SNP的转化体，并如上所述繁殖孢子原液。通过下一代测序分析包含含有推定SNP的DNA区域的扩增子。使用本方法，即使在存在亲本DNA的情况下，也可以确定每个转化体内的成功整合事件。本能力对于确定靶向(即在真菌中靶向哪些可以在同一细胞中生长为含有具有不同基因型的核的异核体)是必不可少的。
进一步验证转化体是否存在所需SNP变化。具有黄色孢子表型的共转化体在大约30％的分离体中还含有适当的柠檬酸整合SNP。
接下来，将对所创建的SNP交换微生物菌株文库进行表型筛选，以便标识对柠檬酸生产有益的SNP。所述信息将在本文所述的HTP基因组工程化改造方法的背景下使用，以得到具有增加的柠檬酸生产的黑曲霉菌株。
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通过引用并入
本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入。然而，对本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请的提及不被视为且不应被视为对以下的承认或任何形式的暗示：它们构成有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分。

Claims (81)

1.一种生产丝状真菌菌株的方法，所述方法包括：
a.)提供多个原生质体，其中所述原生质体由丝状真菌细胞培养物制备；
b.)用第一构建体和第二构建体转化所述多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第一基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第二基因座同源的核苷酸侧接，其中转化引起所述第一构建体通过同源重组整合到所述第一基因座中并且所述第二构建体通过同源重组整合到所述第二基因座中，其中至少所述第二基因座是所述原生质体基因组中的第一可选择标记基因，并且其中所述第一多核苷酸包括突变和/或遗传控制元件；
c.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和
d.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。
2.一种生产丝状真菌菌株的方法，所述方法包括：
a.)提供多个原生质体，其中所述原生质体由丝状真菌细胞培养物制备；
b.)用第一构建体和第二构建体转化所述多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸由与所述原生质体的基因组中的基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸由与所述原生质体的基因组中的所述基因座同源的核苷酸侧接，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸包括可选择标记的互补部分，并且其中所述第一构建体和/或所述第二构建体进一步包括突变或遗传控制元件，其中转化引起所述第一和第二多核苷酸以及所述突变或遗传控制元件通过同源重组整合到所述基因座中；
c.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和
d.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中来自所述多个原生质体的每个原生质体用来自多个第一构建体的单个第一构建体和来自多个第二构建体的单个第二构建体转化，其中来自所述多个第一构建体的每个第一构建体中的所述第一多核苷酸包括不同的突变和/或遗传控制元件；并且其中来自所述多个第二构建体的每个第二构建体中的所述第二多核苷酸是相同的。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其进一步包括重复步骤a-d以生成丝状真菌细胞文库，其中所述文库中的每个丝状真菌细胞包括具有不同突变和/或遗传控制元件的第一多核苷酸。
5.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一多核苷酸编码靶丝状真菌基因或异源基因。
6.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述突变是单核苷酸多态性。
7.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述遗传控制是启动子序列和/或终止子序列。
8.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述多个原生质体分布在微量滴定板的孔中。
9.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中步骤a-d在微量滴定板的孔中进行。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述微量滴定板是96孔、384孔或1536孔微量滴定板。
11.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述丝状真菌细胞选自绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属物种或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。
12.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述丝状真菌细胞是黑曲霉。
13.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述丝状真菌细胞具有非菌丝体形成表型。
14.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述真菌细胞具有非功能性非同源末端连接NHEJ途径。
15.根据权利要求14所述的方法，其中通过将所述细胞暴露于针对所述NHEJ途径的组分的抗体、化学抑制剂、蛋白质抑制剂、物理抑制剂、肽抑制剂或反义或RNAi分子来使所述NHEJ途径为非功能性的。
16.根据权利要求5到15中任一权利要求所述的方法，其中所述第一基因座用于所述靶丝状真菌基因。
17.根据权利要求1和3到15中任一权利要求所述的方法，其中所述第一基因座用于所述原生质体基因组中的第二可选择标记基因。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第二可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。
19.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第一可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。
20.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中所述第二多核苷酸选自营养缺陷型标记基因、定向标记基因或抗生素抗性基因。
21.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述比色标记基因是aygA基因。
22.根据权利要求18到20中任一权利要求所述的方法，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。
23.根据权利要求18到20中任一权利要求所述的方法，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶amdS基因、硝酸盐还原酶基因niaD或硫酸盐通透酶Sut B基因。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗生素抗性基因是ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。
25.根据权利要求16所述的方法，其中所述第一可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。
26.根据权利要求17到24中任一权利要求所述的方法，其中所述第一可选择标记基因是met3基因，所述第二可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。
27.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中通过以下制备所述多个原生质体：从所述丝状真菌细胞培养物中的所述丝状真菌细胞去除细胞壁；分离所述多个原生质体；和将所述分离的多个原生质体重悬于包括二甲基亚砜DMSO的混合物中，其中DMSO的最终浓度为7％v/v或更低。
28.根据权利要求27所述的方法，其中在进行步骤a-d之前将所述混合物储存在至少-20℃或-80℃下。
29.根据权利要求27到29中任一权利要求所述的方法，其中所述培养物的体积为至少1升。
30.根据权利要求27到29中任一权利要求所述的方法，其中在制备所述原生质体之前使所述培养物生长至少12小时。
31.根据权利要求27到30中任一权利要求所述的方法，其中使所述真菌培养物在一定条件下生长，由此所述原生质体的至少70％较小并且含有较少核。
32.根据权利要求27到31中任一权利要求所述的方法，其中通过酶消化来去除所述细胞壁。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述酶消化用包括β-葡聚糖酶和聚半乳糖醛酸酶的酶混合物进行。
34.根据权利要求27到33中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在储存所述原生质体之前将40％v/v聚乙二醇PEG加入到所述包括DMSO的混合物中。
35.根据权利要求34所述的方法，其中加入所述PEG至最终浓度为8％v/v或更低。
36.根据前述权利要求中任一权利要求所述的方法，其中步骤a-d是自动化的。
37.一种制备用于储存的丝状真菌细胞的方法，所述方法包括：
由包括丝状真菌细胞的真菌培养物制备原生质体，其中所述制备所述原生质体包括从所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞去除细胞壁；
分离所述原生质体；和
将所述分离的原生质体重悬于以7％v/v或更低的最终浓度包括二甲基亚砜DMSO的混合物中。
38.根据权利要求37所述的方法，其中将所述混合物储存在至少-20℃或-80℃下。
39.根据权利要求37到38中任一权利要求所述的方法，其中所述真菌培养物的体积为至少1升。
40.根据权利要求37到39中任一权利要求所述的方法，其中在制备所述原生质体之前使所述真菌培养物生长至少12小时。
41.根据权利要求37到40中任一权利要求所述的方法，其中使所述真菌培养物在一定条件下生长，由此所述原生质体的至少70％较小并且具有较少核。
42.根据权利要求37到41中任一权利要求所述的方法，其中通过酶消化来去除所述细胞壁。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述酶消化用包括β-葡聚糖酶和聚半乳糖醛酸酶的酶混合物进行。
44.根据权利要求37到43中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在储存所述原生质体之前将40％v/v聚乙二醇PEG加入到所述包括DMSO的混合物中。
45.根据权利要求44所述的方法，其中加入所述PEG至最终浓度为8％v/v或更低。
46.根据权利要求37到45中任一权利要求所述的方法，其进一步包括在储存所述原生质体之前将所述原生质体分布到微量滴定板中。
47.根据权利要求37到46中任一权利要求所述的方法，其中所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞具有非菌丝体形成表型。
48.根据权利要求37到47中任一权利要求所述的方法，其中所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞选自绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属物种或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述真菌培养物中的所述丝状真菌细胞是黑曲霉或其有性型或无性型。
50.一种生成真菌生产菌株的系统，所述系统包括：
一或多个处理器；和
一或多个存储器，所述存储器可操作地联接到所述一或多个处理器中的至少一个并且具有存储在其上的指令，当由所述一或多个处理器中的至少一个执行时，所述指令使所述系统：
a.)用第一构建体和第二构建体转化源自丝状真菌细胞培养物的多个原生质体，其中所述第一构建体包括第一多核苷酸，所述第一多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第一基因座同源的核苷酸侧接，并且所述第二构建体包括第二多核苷酸，所述第二多核苷酸在两侧由与所述原生质体的基因组中的第二基因座同源的核苷酸侧接，其中转化引起所述第一构建体通过同源重组整合到所述第一基因座中并且所述第二构建体通过同源重组整合到所述第二基因座中，其中至少所述第二基因座是所述原生质体基因组中的第一可选择标记基因，并且其中所述第一多核苷酸包括突变和/或遗传控制元件；
b.)通过进行选择和反选择来纯化同核转化体；和
c.)在有利于所述丝状真菌细胞的再生的培养基中使所述经过纯化的转化体生长。
51.根据权利要求50所述的系统，其中来自所述多个原生质体的每个原生质体用来自多个第一构建体的单个第一构建体和来自多个第二构建体的单个第二构建体转化，其中来自所述多个第一构建体的每个第一构建体中的所述第一多核苷酸包括不同的突变和/或遗传控制元件；并且其中来自所述多个第二构建体的每个第二构建体中的所述第二多核苷酸是相同的。
52.根据权利要求50所述的系统，其进一步包括重复步骤a-c以生成丝状真菌细胞文库的指令，其中所述文库中的每个丝状真菌细胞包括具有不同突变和/或遗传控制元件的第一多核苷酸。
53.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述突变是单核苷酸多态性。
54.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述遗传控制是启动子序列和/或终止子序列。
55.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中步骤a-c在微量滴定板的孔中进行。
56.根据权利要求55所述的系统，其中所述微量滴定板是96孔、384孔或1536孔微量滴定板。
57.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述丝状真菌细胞选自绵霉属、支顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管菌属、拟蜡菌属、头孢霉属、金孢子菌属、旋孢腔菌属、棒囊壳属、栗疫属、隐球菌属、鬼伞属、革盖菌属、色二孢属、内座壳属、镰刀菌属、赤霉菌属、粘帚霉属、腐质霉属、肉座菌属、毁丝霉属(例如，嗜热毁丝霉)、毛霉属、脉孢菌属、青霉菌属、柄孢壳菌属、射脉菌属、梨囊鞭菌属、梨孢霉属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、柱顶孢霉属、孢子丝菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、栓菌属、弯颈霉属、木霉属、轮枝菌属、小包脚菇属物种或其有性型或无性型，及其同义词或分类学等价物。
58.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述丝状真菌细胞是黑曲霉。
59.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述丝状真菌细胞具有非菌丝体形成表型。
60.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述真菌细胞具有非功能性非同源末端连接途径。
61.根据权利要求60所述的系统，其中通过将所述细胞暴露于针对所述NHEJ途径的组分的抗体、化学抑制剂、蛋白质抑制剂、物理抑制剂、肽抑制剂或反义或RNAi分子来使所述NHEJ途径为非功能性的。
62.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述第一基因座用于所述靶丝状真菌基因。
63.根据权利要求50到61中任一权利要求所述的系统，其中所述第一基因座用于所述原生质体基因组中的第二可选择标记基因。
64.根据权利要求63所述的系统，其中所述第二可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。
65.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述第一可选择标记基因选自营养缺陷型标记基因、比色标记基因或定向标记基因。
66.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中所述第二多核苷酸选自营养缺陷型标记基因、定向标记基因或抗生素抗性基因。
67.根据权利要求64或65所述的系统，其中所述比色标记基因是aygA基因。
68.根据权利要求64到66中任一权利要求所述的系统，其中所述营养缺陷型标记基因选自argB基因、trpC基因、pyrG基因或met3基因。
69.根据权利要求64到66中任一权利要求所述的系统，其中所述定向标记基因选自乙酰胺酶amdS基因、硝酸盐还原酶基因nlaD或硫酸盐通透酶(Sut B)基因。
70.根据权利要求66所述的系统，其中所述抗生素抗性基因是ble基因，其中所述ble基因赋予对腐草霉素的抗性。
71.根据权利要求62所述的系统，其中所述第一可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。
72.根据权利要求50到61中任一权利要求所述的系统，其中所述第一可选择标记基因是met3基因，所述第二可选择标记基因是aygA基因，并且所述第二多核苷酸是pyrG基因。
73.根据前述权利要求中任一权利要求所述的系统，其中通过以下制备所述多个原生质体：从所述丝状真菌细胞培养物中的所述丝状真菌细胞去除细胞壁；分离所述多个原生质体；和
将所述分离的多个原生质体重悬于以7％v/v或更低的最终浓度包括二甲基亚砜DMSO的混合物中。
74.根据权利要求73所述的系统，其中在进行步骤a-c之前将所述混合物储存在至少-20℃或-80℃下。
75.根据权利要求73到74中任一权利要求所述的系统，其中所述培养物的体积为至少1升。
76.根据权利要求73到75中任一权利要求所述的系统，其中在制备所述原生质体之前使所述培养物生长至少12小时。
77.根据权利要求73到76中任一权利要求所述的系统，其中使所述真菌培养物在一定条件下生长，由此所述原生质体的至少70％较小并且具有较少核。
78.根据权利要求73到76中任一权利要求所述的系统，其中通过酶消化来去除所述细胞壁。
79.根据权利要求78所述的系统，其中所述酶消化用包括β-葡聚糖酶和聚半乳糖醛酸酶的酶混合物进行。
80.根据权利要求50到79中任一权利要求所述的系统，其进一步包括在储存所述原生质体之前将40％v/v聚乙二醇PEG加入到所述包括DMSO的混合物中。
81.根据权利要求80所述的系统，其中加入所述PEG至最终浓度为8％v/v或更低。
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