CN112981002B

CN112981002B - 高通量筛选构巢曲霉启动子与启动子库的构建方法

Info

Publication number: CN112981002B
Application number: CN201911272845.5A
Authority: CN
Inventors: 尹文兵; 马紫卉; 余婧雯; 周爽; 李伟
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2019-12-12
Filing date: 2019-12-12
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2039-12-12
Also published as: CN112981002A

Abstract

本发明公开了高通量筛选构巢曲霉启动子与启动子库的构建方法。本发明公开的高通量筛选构巢曲霉启动子的构建方法包括：A1)将n个表达盒分别导入丝状真菌中，获得n个重组丝状真菌；n大于等于2；n个表达盒中，每个表达盒均含有一个丝状真菌的待测启动子以及与之相连的报告基因；A2)将每个重组丝状真菌利用VinoTaste Pro处理，获得由n个重组丝状真菌的原生质体组成的启动子库，检测各个原生质体中报告基因的表达情况，报告基因得到表达的重组丝状真菌中所含待测启动子即为具有启动子活性的启动子，即实现丝状真菌启动子的筛选。本发明的方法对于研发具有工业价值或潜在的真菌天然药物具有实际意义。

Description

高通量筛选构巢曲霉启动子与启动子库的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，高通量筛选构巢曲霉启动子与启动子库的构建方法。

背景技术

启动子是一段通常位于转录起始位点附近的能被RNA聚合酶识别、结合并开启转录的DNA序列，一般启动子的大小大约为100-1000bp，在转录起始上起着重要的作用。借助异源表达系统是时下新兴的挖掘真菌次级代谢的手段，在异源表达系统的工具库中，启动子的地位不可撼动。几乎在建立每个天然的或者人工合成的基因电路或者合成通路中启动子都起着关键的作用。这些启动子调控元件可以综合传递控制，调节，诱导，反应或协调电路的功能。这种精确的控制对于各种各样的合成应用是至关重要的。它可以平衡反应电路中的其他元件，防止有毒的中间代谢物沿着通路积聚。然而，在真菌领域，启动子的开发仍然有限。

在链霉菌(Streptomycete)中基于流式细胞技术和超级折叠绿色荧光蛋白(sfGFP)可以定量鉴定启动子。通过原生质体制备技术从链霉菌的菌丝体上释放原生质体，获得单细胞。利用碘化丙酸(PI)染色可将死细胞与活细胞区分开来。通过该方法，可以一次性对数百个启动子进行筛选评价。该方法通过流式细胞技术对单细胞的绿色荧光蛋白表达强度进行测量，克服传统生化策略中绿色荧光蛋白强度低难以检测的弊病，实现启动子的高通量测量，同时保证了高效性和准确性，是一个十分值得借鉴的启动子筛选方法。

异源表达策略通常是一种将培养困难，遗传操作难以建立的真菌的基因或者基因簇转移到操作简便、遗传背景清晰的异源宿主中的表达策略。丝状真菌作为异源表达用的基因工程菌具有菌体易培养、生长快、结构及遗传背景相对简单，且在分子操作上具有易杂交、易转化、易分析等优点，并且相较于常用的基因工程受体菌如细菌和酵母菌，丝状真菌在生化、遗传背景、内含子剪切以及遗传操作上占据优势。丝状真菌宿主属于真核生物，能完整表达真菌天然产物的基因簇，对于细菌、酵母菌宿主难以剪切的内含子，丝状真菌能实现自我剪切，获得目标产物。为了充分挖掘丝状真菌作为天然宿主细胞产生异源基因产物的能力，需要获取更多的丝状真菌基因表达调控元件，构建不同的异源表达系统来满足异源基因的表达需求。构巢曲霉(Aspergillus nidulans)作为丝状真菌中研究较多的模式真菌，其基因组测序工作已然完成，为开发其基因表达调控元件提供了便利。启动子调控元件的挖掘在真菌异源表达系统中占据重要地位。开发构巢曲霉启动子，评价不同表达强度的启动子调控元件工具库有助于更加精细的控制、调节构巢曲霉异源表达系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何筛选丝状真菌启动子。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了丝状真菌启动子的筛选方法，所述方法包括：

A1)将n个表达盒分别导入丝状真菌中，获得n个重组丝状真菌；n大于等于2；所述n个表达盒中，每个表达盒均含有一个丝状真菌的待测启动子以及与之相连的报告基因；

A2)将每个重组丝状真菌利用VinoTaste Pro处理，获得由n个重组丝状真菌的原生质体组成的启动子库，检测各个原生质体中所述报告基因的表达情况，所述报告基因得到表达的重组丝状真菌中所含待测启动子即为具有启动子活性的启动子，即实现丝状真菌启动子的筛选；

所述VinoTaste Pro为由活性成分为多聚半乳糖醛酸酶和1,3-β-葡聚糖外切酶组成的复合酶制剂。

所述VinoTaste Pro中，多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)的含量可为2500PGNU/g，1,3-β-葡聚糖外切酶(Beta-glucanase(exo-1,3-))的含量可为75BGXU/g。

具体的，所述VinoTaste Pro可为novozymes公司产品，2860-689-2。VinoTastePro含有。

上述方法中，所述将每个重组丝状真菌利用VinoTaste Pro处理可包括将每个重组丝状真菌的菌丝利用所述VinoTaste Pro处理。

上述方法中，所述将每个重组丝状真菌利用VinoTaste Pro处理可包括利用VinoTaste Pro酶解液处理每个重组丝状真菌；所述VinoTaste Pro酶解液中多聚半乳糖醛酸酶的含量为35500PGNU/100mL，1,3-β-葡聚糖外切酶的含量为1065BGXU/100mL。

进一步，所述VinoTaste Pro酶解液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在该溶液中的浓度为14.2g/100mL VinoTaste Pro；所述溶剂为KCl-柠檬酸溶液，所述KCl-柠檬酸溶液由溶质和溶剂组成，所述溶质及其在所述KCl-柠檬酸溶液中的浓度分别为41g/500mL KCl和10.5g/500mL柠檬酸，溶剂为水，pH 5.8。

上述方法中，所述处理还可包括向含有所述VinoTaste Pro与重组丝状真菌的体系中添加YG溶液，所述YG溶液由溶质和溶剂组成，所述溶质及其在所述YG溶液中的浓度分别为2g/100mL葡萄糖和0.5g/100mL酵母抽取物，所述溶剂为微量元素母液，每100mL所述微量元素母液含有硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 2.2g，硼酸H₃BO₃ 1.1g，氯化锰MnCl₂·4H₂O 0.5g，硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 0.16g，氯化钴CoCl₂·5H₂O 0.16g，硫酸铜CuSO₄·5H₂O 0.16g，钼酸铵(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.11g，EDTA钠Na₂EDTA 5.0g，余量为水。

所述VinoTaste Pro酶解液与所述YG溶液的体积可相同。

上述方法中，所述处理的温度可为30℃。

上述方法中，所述处理的时间可为4小时。

所述处理可在摇床中进行。

上述方法中，所述检测各个原生质体中所述报告基因的表达情况可利用流式细胞仪进行。

所述丝状真菌可为构巢曲霉。

所述报告基因可为sfGFP基因。

所述方法还可包括在检测各个原生质体中所述报告基因的表达情况利用碘化丙酸(PI)对原生质体进行染色，筛选活细胞。进一步，所述检测各个原生质体中所述报告基因的表达情况包括检测所述活细胞中所述报告基因的表达情况。

本发明还提供了下述甲或乙的方法：

甲、丝状真菌原生质体的制备方法，包括：将丝状真菌利用所述VinoTaste Pro处理，获得丝状真菌的原生质；

乙、丝状真菌启动子库的构建方法，包括：

B1)将n个表达盒分别导入丝状真菌中，获得n个重组丝状真菌；n大于等于2；所述n个表达盒中，每个表达盒均含有一个丝状真菌的启动子以及与之相连的报告基因；

B2)将每个重组丝状真菌利用所述VinoTaste Pro处理，获得由n个重组丝状真菌的原生质体组成的启动子库，即获得丝状真菌启动子库。

本发明还提供了成套试剂，所述成套试剂由所述VinoTaste Pro或所述VinoTastePro酶解液与所述YG溶液组成。

所述成套试剂可用于制备构巢曲霉原生质体。

所述丝状真菌原生质体的制备方法或所述丝状真菌启动子库的构建方法在筛选丝状真菌启动子中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述成套试剂的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

X1、制备丝状真菌原生质体；

X2、制备制备丝状真菌原生质体的产品；

X3、筛选丝状真菌启动子；

X4、制备筛选丝状真菌启动子的产品。

本发明中，所述丝状真菌可为构巢曲霉。

本发明中，所述VinoTaste Pro中，多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)的含量可为2500PGNU/g，1,3-β-葡聚糖外切酶(Beta-glucanase(exo-1,3-))的含量可为75BGXU/g。

本发明基于原核生物链霉菌中的启动子筛选方法，构建真核生物构巢曲霉中启动子的高效筛选方法，构建构巢曲霉启动子突变株库，对于研发具有工业价值或潜在的真菌天然药物具有实际意义。

附图说明

图1为不同构巢曲霉启动子控制的sfGFP表达载体的构建验证。a.不同构巢曲霉启动子控制的sfGFP表达载体的示意图；b.pYZM7酶切验证结果，泳道Hind III表示载体用HindIII酶切后的条带，所得条带大小分别为4895、2445、216、133bp；泳道Xho I表示载体用Xho I酶切后的条带,所得条带大小分别为5858、1831bp。c.PCR验证95个含有不同构巢曲霉启动子的重组载体，编号相同的载体表示进行了两次验证，m04.1和m04.2均为m04的检测结果。

图2为部分含有不同构巢曲霉启动子的重组载体的重组菌株PCR验证图。

图3为流式细胞仪定量分析的不同菌株的sfGFP相对表达水平。图中，gpdA表示gpdA重组菌，ANP1表示AN11891，ANP2表示AN2919。

图4为HPLC定量分析构巢曲霉neosartoricins表达工程菌的产物情况。LO4389表示阴性对照构巢曲霉LO4389；gpdA表示含有gpdA启动子的工程菌；P1-P4、P6-P11、ANP1分别表示含有P1-P4、P6-P11、ANP1的构巢曲霉neosartoricins表达工程菌。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。下文所用培养基均为无菌培养基。

下述实施例中的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)LO4389(Ahuja,M.,Chiang,Y.M.,Chang,S.L.,Praseuth,M.B.,Entwistle,R.,Sanchez,J.F.,Lo,H.C.,Yeh,H.H.,Oakley,B.R.,and Wang,C.C.C.(2012).Illuminating the diversity of aromaticpolyketide synthases in Aspergillus nidulans.J Am Chem Soc 134,8212–8221.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pYH-wA-pyrG载体(Yin WB,Chooi YH,Smith AR,etal.Discovery of Cryptic Polyketide Metabolites from DermatophytesUsingHeterologous Expression in Aspergillus nidulans[J].ACS Synthetic Biology,2013,2(11):629-634.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pYWB2载体记载在文献“Zhang,P.,Wang,X.,Fan,A.,Zheng,Y.,Liu,X.,Wang,S.,Zou,H.,Oakley,B.R.,Keller,N.P.,and Yin,W.-B*.2017.A cryptic pigmentbiosynthetic pathway uncovered by heterologous expression is essential forconidial development in Pestalotiopsis fici.Mol.Microbiol.105:469-483.”中，pYWB2载体将pYH-wA-pyrG载体上的pyrG序列替换为了烟曲霉基因组的Ribo序列(2305bp)，pYWB2含有Ribo营养筛选标记基因。

实施例1、构巢曲霉启动子突变株库的构建

1、重组载体的构建

首先利用高保真酶扩增trpC终止子(其序列为序列表中序列1，527bp)序列；然后利用Quick-change载体构建方法，转化大肠杆菌，构建到含有wA基因上下游片段及pyrG营养缺陷基因序列的载体(pYH-wA-pyrG载体)，获得载体pYZM7。利用高保真酶扩增sfGFP基因(序列表中序列2，717bp)序列，利用Gibson载体组装方法在载体pYZM7中插入sfGFP基因获得sfGFP表达载体pYZM8(wA up-sfGFP-trpC(t)-pyrG-wA down)，以构巢曲霉LO4389基因组DNA为模板，利用高保真酶进行PCR扩增，分别扩增95个构巢曲霉LO4389启动子序列(1000bp)，同样利用Quick-change方法将不同的启动子元件结合到含有sfGFP表达盒的表达载体pYZM8上，获得不同启动子控制的sfGFP表达载体(图1中a)。

pYZM7的构建：

以构巢曲霉LO4389基因组DNA为模板，利用QC-7-TrpC-F和QC-7-TrpC-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物(含有trpC终止子)；

引物如下(下划线为trpC终止子上的部分序列)：

QC-7-TrpC-F：

5′-ttgactctccttctcctgatcgctagctgatttaatagctccatgtcaac-3′；

QC-7-TrpC-R：

5′-catatttcgtcagacacagaataactctcggtaaacgactcataggagag-3′。

利用Quick-change载体构建方法，将所得PCR产物中的trpC终止子(其序列为序列表中序列1)重组至pYH-wA-pyrG载体中，将得到的序列正确的重组载体记为pYZM7。利用Hind III和Xho I对pYZM7进行酶切检测，见图1中b，结果显示均获得了大小正确的DNA片段。pYZM7为在pYH-wA-pyrG载体中插入trpC终止子得到的重组载体。

sfGFP表达载体pYZM8的构建：

以链霉菌sfGFP基因为原始基因，通过密码子优化获得适合于构巢曲霉表达的sfGFP基因(717bp，如序列2所示)。人工合成序列2所示的DNA片段，以其为模板，利用QC-sfGFP-F和QC-sfGFP-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物(含有优化后的sfGFP基因)；

引物如下(下划线为优化后的sfGFP基因上的部分序列)：

QC-sfGFP-F：

5′-gacttgactctccttctcctgatcgctagcatgcgcaagggcgaggag-3′；

QC-sfGFP-R：

5′-ttcttgttgacatggagctattaaatcatcacttgtagagctcgtccatg-3′。

利用Gibson载体构建方法，利用所得PCR产物将优化后的sfGFP基因重组至pYZM7中，将得到的序列正确的重组载体记为pYZM8，pYZM8为在pYZM7中trpC终止子前插入优化后的sfGFP基因得到的重组载体。

不同构巢曲霉启动子控制的sfGFP表达载体的构建：

以构巢曲霉LO4389基因组DNA为模板，利用扩增不同启动子的引物对进行PCR扩增，得到95种PCR产物；

扩增每个启动子的上游引物由两部分连接得到，其5′端为“5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcg-3′(所示DNA片段记为片段1)”，3′端为启动子上游特异序列；下游引物也由两部分连接得到，其5′端为“5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccat-3′(所示DNA片段记为片段2)”，3′端为同一启动子下游特异序列，利用同一启动子的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物均含有相应的启动子序列，且启动子上下游分别连接有片段1和2。如扩增名称为P1的启动子的引物(下划线为启动子中的部分序列)如下：

QC-AN4034 F(上游引物)：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcggcccagcagtagctggtaatatatg-3′；

QC-AN4034 R(下游引物)：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatggttttagctgttggcgaaggtg-3′；

利用Gibson组装方法，利用所得95种PCR产物将95种启动子分别重组至pYZM8中，所得95种序列正确的重组载体即为95个含有构巢曲霉启动子的重组载体，每个重组载体含有一种启动子，这些重组载体中的构巢曲霉启动子均位于优化后的sfGFP基因前(图1中a)，将这些重组载体分别记为g01～g45和m01～m50，依次含有名称为P01～P95的启动子(表1)。利用相应的引物进行PCR扩增进行验证，结果显示(图1中c)均得到了正确的重组载体。

表1、启动子、载体与菌株的对应关系

2、重组菌株的构建

将步骤1构建的95个含有不同构巢曲霉启动子的重组载体通过PEG介导的原生质体转化法分别转化作为出发菌株的构巢曲霉LO4389获得构巢曲霉启动子突变株库的基因工程菌，利用pYZM8-gpdA作为对照。

pYZM8-gpdA的构建方法如下：

人工合成gpdA启动子(其序列为序列表中序列3)，以gpdA启动子为模板，利用gpdAF(上游引物)和gpdAR(下游引物)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物(含有gpdA启动子)。

其中，gpdAF(上游引物)由两部分连接得到，其5′端为“5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcg-3′(所示DNA片段为片段1)”，3′端为gpdA启动子上游特异序列；下游引物也由两部分连接得到，其5′端为“5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccat-3′(所示DNA片段为片段2)”，3′端为gpdA启动子下游特异序列，gpdAF(上游引物)和gpdAR(下游引物)组成的引物对进行PCR扩增，所得PCR产物含有gpdA启动子序列，且启动子上下游分别连接有片段1和2。

利用Gibson组装方法，利用所得PCR产物将gpdA启动子重组至pYZM8中，将得到的序列正确的重组载体记为pYZM8-gpdA。

构巢曲霉的PEG介导的原生质体转化法方法如下：

所用的构巢曲霉菌种活化培养基为GMM培养基，每1L所述固体培养基按如下方法配制：葡萄糖10g，硝酸盐母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值调至6.5，然后添加琼脂15-20g，121℃高压湿热灭菌20-30分钟，倒90mm培养皿。

其中，硝酸盐母液配制(1L)方法如下：硝酸钠NaNO₃ 120g，氯化钾KCl 10.4g，硫酸镁MgSO₄·7H₂O 10.4g,磷酸氢二钾K₂HPO₄·3H₂O 30.4g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值自然，121℃高压湿热灭菌20-30分钟，室温保存；

微量元素母液配制(100mL)方法如下：硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 2.2g，硼酸H₃BO₃ 1.1g，氯化锰MnCl₂·4H₂O 0.5g，硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 0.16g，氯化钴CoCl₂·5H₂O 0.16g，硫酸铜CuSO₄·5H₂O 0.16g，钼酸铵(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.11g，EDTA钠Na₂EDTA 5.0g，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至100mL，121℃高压湿热灭菌20-30分种，室温保存。

转化培养基为SMM培养基，每1L所述固体培养基按如下方法配制：GMM培养基添加山梨醇218.6g。

具体转化步骤如下：

构巢曲霉活化：现将构巢曲霉孢子悬液划线至无菌GMM培养基1上，37℃培养箱黑暗条件下培养3天；然后用0.1％吐温80水溶液收集孢子，经过滤布过滤后，取适量孢子悬液到含30mL的LMM培养基的三角瓶中，37℃，250rpm，摇床培养4-6小时进行孢子萌发；收集萌发好的孢子，4℃保存备用。

GMM培养基1：葡萄糖10g，硝酸盐母液(20X Nitrate Salts)50mL，微量元素母液(1000X Trace Elements)1mL，1％(质量百分比含量)吡哆醇水溶液1mL/L,0.025％(质量百分比含量)核黄素水溶液5mL/L,尿苷尿嘧啶(Uridine，Uracil，简写UU)0.5g/L，16g琼脂，定容到1L，调节pH至6.5。

LMM培养基：葡萄糖10g，硝酸盐母液(20X Nitrate Salts)50mL，微量元素母液(1000X Trace Elements)1mL，酵母抽提物5g，1％(质量百分比含量)吡哆醇水溶液1mL/L,0.025％(质量百分比含量)核黄素水溶液5mL/L,尿苷尿嘧啶(Uridine，Uracil，简写UU)0.5g/L，上述成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值调至6.5。

原生质体制备：挑取适量萌发的孢子加入到含有无菌的10mL酶解液(该溶液的制备方法如下：在10ml Osmotic medium缓冲液中加入50mg Lysing Enzymes和30mgYatalase，0.22μm滤膜过滤除菌)的三角瓶中，80rpm，37℃摇床培养2-4小时进行细胞壁裂解，获得原生质体，保存于STC缓冲液(该缓冲液的制备方法如下：向超纯水中依次添加218.6g山梨醇，1.47gCaCl₂·2H₂O，加入10毫升1M Tris-HCl(pH 7.5)，用超纯水补足至1L，灭菌后4℃保存)中，获得原生质体悬液。

其中，Osmotic medium缓冲液的制备方法：向超纯水中依次添加MgSO₄·7H₂O147.9g，Na₂HPO₄·2H₂O 0.53g，然后用1M Na₂HPO₄将pH值调至5.8，用超纯水补足至500mL，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

Lysing Enzymes为SIGMA产品，货号L1412，产品详情https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIGMA/L1412？lang＝

ion＝US；Yatalase为Takara产品，货号T017。

原生质体转化：将3-5μg步骤1构建的含有构巢曲霉启动子的重组载体(体积控制在15μL之内)加入到100μL原生质体悬液中混合均匀，冰浴50分钟后加入1.25mL60％PEG溶液，轻轻颠倒转动，室温横放静置20分钟，加入5mL STC缓冲液，轻轻混匀，平均加至5个含有相应营养缺陷成分的SMM培养基上:从烘箱取出事先化好的培养基，各加5mL，立即晃动培养皿，使混合均匀，最后放入37℃培养箱，过夜后倒置培养2-3天，即可得到相应重组载体的转化子。

60％PEG溶液(100mL)：将60g PEG 4000和2.35g CaCl₂及5ml 1M Tris-HCl(pH7.5)溶解在超纯水中并定容到100mL。

然后提取转化子并提取基因组DNA,利用步骤1中构建相应载体的PCR引物进行PCR扩增，对转化子进行验证和鉴定，获得95个含有不同构巢曲霉启动子的重组载体的重组菌株，构成构巢曲霉启动子突变株库，部分菌株的鉴定结果如图2所示，各菌株名称及其含有的启动子见表1。将pYZM8-gpdA得到的重组菌记为gpdA重组菌。

3、筛选构巢曲霉启动子

利用24孔板、96孔板分别培养步骤2得到的95个重组菌株获得菌丝体，通过菌丝制备原生质体的方法获得待检测单细胞，利用流式细胞仪对待检测单细胞进行定量评价，并利用作为出发菌株的构巢曲霉作为对照，并以步骤2的gpdA重组菌作为阳性对照。

3.1原生质体制备

所用的构巢曲霉培养用培养基为CM液体培养基，每1L CM液体培养基按如下方法配制：葡萄糖10g，蛋白胨2g，酵母抽取物1g，酪氨酸1g，步骤1的硝酸盐母液50mL，步骤1的微量元素母液1mL，维生素母液1mL，上述各成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至1L，pH值调至6.5，121℃高压湿热灭菌20-30分钟。

其中，维生素母液配制(100mL)方法如下：biotin(生物素),pyridoxine(吡哆醇)，thiamin(硫胺(维生素B1))，riboflavin(核黄素(维生素B2)，light sensitive)、PABA(p-aminobenzoic acid，对氨基苯甲酸)和nicotinic acid(烟酸)各100mg，上述各成分依次添加，最后补加蒸馏水终体积至100mL，使用0.22μm的滤头过滤，避光4℃保存。

具体原生质体制备方法如下：

构巢曲霉菌丝培养：构巢曲霉重组菌株的活化及孢子的获取与步骤2相同，获得孢子后，在24孔板每格孔中加入1mL的CM液体培养基，然后将各重组菌株的孢子分别添加至24孔板中，每孔一种菌株的孢子，每孔2×10⁶个孢子，每个菌株3个平行。最后于100rpm，37℃黑暗培养16小时。

原生质体制备：使用移液枪吸取去24孔板中的培养基，再分别向每孔培养的菌丝球中加入0.5mL VinoTaste Pro酶解液(VinoTaste Pro酶解液由溶质和溶剂组成，溶质为VinoTaste Pro，溶剂为KCl-柠檬酸溶液，VinoTaste Pro在酶解液中的浓度为14.2g/100mL)和0.5mL YG溶液，于100rpm，30℃摇床培养4小时进行细胞壁裂解，得到酶解产物。将所得酶解产物加至塞有脱脂棉的96孔过滤柱中(经高温灭菌，无菌)，使用冷冻离心机于1800rcf、4℃下离心10min，收集沉淀即获得各菌株的原生质体。

其中，KCl-柠檬酸溶液为无菌溶液，该溶液的溶质及其在该溶液中的浓度分别为41g/500mL KCl，10.5g/500mL柠檬酸，溶剂为水，pH 5.8。

其中，YG溶液为无菌溶液，该溶液的溶质及其在该溶液中的浓度分别为2g/100mL葡萄糖，0.5g/100mL酵母抽取物，溶剂为步骤1的微量元素母液，。

其中，VinoTaste Pro为novozymes公司产品，2860-689-2。VinoTaste Pro含有2500PGNU/g Polygalacturonase(多聚半乳糖醛酸酶)和75BGXU/g Beta-glucanase(exo-1,3-)(1,3-β-葡聚糖外切酶)。上述酶解液中多聚半乳糖醛酸酶的含量为35500PGNU/100mL，1,3-β-葡聚糖外切酶的含量为1065BGXU/100mL。

3.2构巢曲霉原生质体流式细胞仪检测

然后将步骤3.1获得的原生质体进行染色，利用流式细胞仪对不同的启动子表达的sfGFP进行定量测量，以构巢曲霉LO4389作为负对照。

原生质体染色：将步骤3.1得到的原生质体利用100μL 0.6M KCl溶液重悬，得到原生质体重悬液，再将原生质体重悬液转移至加有900μL 0.6M KCl溶液的流式管中，再加入5μL 1mg/mL PI(propidium iodide，碘化丙啶)对死细胞进行染色(黑暗冰浴5min)，获得染色后的原生质体。

构巢曲霉原生质体流式细胞仪检测方法如下：

将获得的染色后的原生质体用流式细胞仪(BD LSR Fortessa流式细胞仪(三激光))进行检测，每个菌株均检测5万个细胞，通过足够的样本量检测来弥补仪器测量的误差。

随后对流式细胞仪的数据结果进行处理，以负对照构巢曲霉LO4389的荧光检测值为1，对各菌株的sfGFP表达值进行归一化，计算各菌株的sfGFP相对表达水平，见图3。

结果显示，gpdA重组菌能成功表达sfGFP，平均相对表达水平为13.6；步骤2所得95个构巢曲霉重组菌株中，有多个菌株以及gpdA重组菌的sfGFP平均相对表达量均显著高于构巢曲霉LO4389，说明这些菌株中的构巢曲霉启动子均具有启动子活性，说明本发明成功筛选到了具有启动子活性的构巢曲霉启动子，这些启动子均可用于基因的表达。各菌株含有的启动子见表1。

其中，菌株AN4034(含有名称为P1的构巢曲霉启动子)、AN8111(含有名称为P2的构巢曲霉启动子)、AN6492(含有名称为P3的构巢曲霉启动子)、AN2904(含有名称为P4的构巢曲霉启动子)、AN7734(含有名称为P6的构巢曲霉启动子)、AN10378(含有名称为P7的构巢曲霉启动子)、AN4900(含有名称为P8的构巢曲霉启动子)、AN1984(含有名称为P9的构巢曲霉启动子)、AN7513(含有名称为P10的构巢曲霉启动子)、AN1052(含有名称为P11的构巢曲霉启动子)、AN11891(含有名称为ANP1的构巢曲霉启动子)、AN2919(含有名称为ANP2的构巢曲霉启动子的sfGFP平均相对表达量也均显著高于构巢曲霉LO4389，这些启动子均具有启动子活性，且ANP1与ANP2的sfGFP平均相对表达量甚至超过了gpdA重组菌，表明这两个启动子具有特强的启动子活性。

下面对这些启动子的活性进行进一步验证。

实施例2、实施例1筛选启动子活性的验证

本实施例验证了实施例1筛选得到的11个构巢曲霉启动子P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P9、P10、P11和ANP1的启动子活性，ANP1的启动子的序列为序列表中序列5。

1、构巢曲霉neosartoricins表达工程菌的构建

利用高保真酶PCR从皮肤真菌(Trichophyton tonsurans)中扩增化合物neosartoricins生物合成相关基因转录因子TESG_06706上游序列(1150bp，如序列4所示)，利用Quick-change载体构建方法，替换载体pYWB2的wA down片段,获得表达载体pYZM105(wA up-Ribo-part TESG_06706)。再利用Quick-change载体构建方法将上述11个启动子分别整合到TESG_06706上游序列，获得一系列含有构巢曲霉启动子的重组载体pYZM106-117。

pYZM105构建：

以皮肤真菌(Trichophyton tonsurans)的基因组DNA为模板，利用QC-6706F和QC-6706-R进行PCR扩增，得到PCR产物(含有TESG_06706上游序列)；引物序列如下(下划线为TESG_06706上游序列的部分序列)：

QC-6706F：

5′-gaaaactagagaccccggtcgcggccgcatggagaaacgaggcccaaaac-3′；

QC-6706-R：

5′-gctcacatgttctttcctgcgttatcccctgccagcaagcagatggctagcc-3′。

利用Quick-change载体构建方法，将所得PCR产物中的TESG_06706上游序列重组至载体pYWB2中，将得到的序列正确的重组载体记为pYZM105。

含有构巢曲霉启动子的重组载体的构建：

以构巢曲霉LO4389基因组DNA为模板，利用扩增各启动子的引物对分别进行PCR扩增，得到11种PCR产物；引物如下：

扩增P1的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN4034 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcggcccagcagtagctggtaatatatg-3′；

QC-AN4034 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatggttttagctgttggcgaaggtg-3′；

扩增P2的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN8111 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgttttatcgcggccctgag-3′；

QC-AN8111 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatggcggcctatgatctggatataatc-3′；

扩增P3的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN6492 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgtcattgtgttgtcgaacataagg-3′；

QC-AN6492 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatcgttctcaaagtgcttcttctgac-3′；

扩增P4的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN2904 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgggattggagagcagcttggtc-3′；

QC-AN2904 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccattgcgaatgtttctagctaag-3′；

扩增P6的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN7734 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcggtggttcggagtcaaccag-3′；

QC-AN7734 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatggtgagtggtctaggcgcgac-3′；

扩增P7的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN10378 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgtcagtagaagagaacgtcgc-3′；

QC-AN10378 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatggagaaacgacgagttggtgac-3′；

扩增P8的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN4900 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgtggcctctggcggatcttc-3′；

QC-AN4900 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatctgatgctaatgagggggggatatg-3′；

扩增P9的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN1984 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcggcgtttccgacaaagggg-3′；

QC-AN1984 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatcaggttgtaggtataatccag-3′；

扩增P10的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN7513 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgctttcgtgggtgggctag-3′；

QC-AN7513 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccattatggatatgctataatgtacag-3′；

扩增P11的引物(下划线为启动子上的部分序列)为：

QC-AN1052 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgcccacgacagcggcccatc-3′；

QC-AN1052 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccataatattcaatttataggtaatcttc-3′；

扩增ANP1的引物(下划线为启动子上的序列)为：

QC-AN11891 F：

5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgtggggtatgatatctaccgaac-3′；

QC-AN11891 R：

5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatgttatgatctgtgtgccgctaag-3′。

以人工合成的序列3所示的gpdA启动子为模板，利用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；所用引物为：

F：5′-ctataaattgggaaaactagagaccccggtcgaattccatccggatgtcg-3′；

R：5′-cgtcgttttgggcctcgtttctccatcatggtgatgtctgctcaag-3′。

利用Gibson组装方法，利用所得12种PCR产物将12种启动子分别重组至pYZM105中，所得12种序列正确的重组载体分别含有启动子P1、P2、P3、P4、P6、P7、P8、P9、P10、P11、ANP1、gpdA，将这12种重组载体分别记为pYZM105-P1、pYZM105-P2、pYZM105-P3、pYZM105-P4、pYZM105-P6、pYZM105-P7、pYZM105-P8、pYZM105-P9、pYZM105-P10、pYZM105-P11、pYZM105-ANP1、pYZM105-gpdA。

按照实施例1中步骤2的方法将上述12个重组载体分别导入实施例1中作为出发菌株的构巢曲霉LO4389中，得到12个构巢曲霉neosartoricins表达工程菌。

2、HPLC检测构巢曲霉neosartoricins表达工程菌的产物

将步骤1的12个构巢曲霉neosartoricins表达工程菌分别接种至PDB固体培养基中，接种量为10⁶个/20mL培养基，然后于25℃黑暗静置培养7天，得到培养产物。含有gpdA的工程菌为阳性对照，利用构巢曲霉LO4389作为阴性对照。

将培养产物分成小块至于三角瓶中，加入2倍体积MEA(将乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸按照乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸的体积比为89：10：1混合得到的溶液)后进行超声萃取(超声频率100Hz，时间为1小时)，收集有机层(即上层)，得到提取液；将提取液进行旋转蒸发(温度30℃，转速为100rpm/min，真空度<3mm Hg)，蒸干后用分析纯甲醇溶解固体物质，稀释适当浓度进样20-40μL，20-100％甲醇冲柱，进行HPLC分析，HPLC分析条件如下：

HPLC分析样品，流速为1mL/min，柱温25℃，进样量为20μL。

甲酸甲醇溶液为向甲醇中添加甲酸得到甲酸体积百分含量为0.1％的溶液，甲酸水溶液为向水中添加甲酸得到甲酸体积百分含量为0.1％的溶液。

0-20min(包括第20min)：甲酸甲醇溶液的体积含量由20％匀速增加至100％，甲酸水溶液的体积含量由80％匀速降低至0％；

20-25min(不包括第20min，包括第25min)：甲酸甲醇溶液；

25-30min(不包括第25min，包括第30min)：甲酸甲醇溶液的体积含量由100％匀速降低至20％，甲酸水溶液的体积含量由0％匀速增加至80％。

不同工程菌产生neosartoricin化合物的情况结果见图4，含有构巢曲霉启动子P1、P6、P9、P11、ANP1的工程菌均能生产neosartoricin化合物，表明，这些启动子均具有启动子活性，且可以用于外源基因的表达以及生产neosartoricin化合物，neosartoricin化合物具有免疫抑制活性。

对比例、

利用24孔板、96孔板培养实施例1步骤2得到的各重组菌株获得菌丝体，然后利用菌丝制备原生质体。

具体原生质体制备方法如下：

构巢曲霉菌丝培养：构巢曲霉重组菌株的活化及孢子的获取与实施例1中步骤1相同，获得孢子后，在24孔板每格孔中加入1mL的CM液体培养基，然后将各重组菌株的孢子分别添加至24孔板中，每孔一种菌株的孢子，每孔1×10⁸个孢子，每个菌株3个平行。最后于100rpm，37℃黑暗培养16小时。

原生质体制备：使用移液枪吸取去24孔板中的培养基，再分别向每孔培养的菌丝球中加入0.5mL溶菌酶酶解液(溶菌酶酶解液由溶质和溶剂组成，溶质为溶菌酶，溶剂为KCl-柠檬酸溶液，溶菌酶在酶解液中的浓度为0.5g/100mL)和0.5mL YG溶液，于100rpm，30℃摇床培养4小时进行细胞壁裂解，得到酶解产物。将所得酶解产物加至塞有脱脂棉的96孔过滤柱中(经高温灭菌，无菌)，使用冷冻离心机于1800rcf、4℃下离心，发现并未得到原生质体。其中，溶菌酶为SIGMA产品，货号L1412。

按照上述原生质体制备方法，将溶菌酶酶解液替换为Yatalase酶解液(Yatalase酶解液由溶质和溶剂组成，溶质为Yatalase，溶剂为KCl-柠檬酸溶液，Yatalase在酶解液中的浓度为0.3g/100mL)，结果显示并未得到原生质体。其中，Yatalase为Takara产品，货号：T017。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 高通量筛选构巢曲霉启动子与启动子库的构建方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 527

<212> DNA

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 1

tgatttaata gctccatgtc aacaagaata aaacgcgttt cgggtttacc tcttccagat 60

acagctcatc tgcaatgcat taatgcattg gacctcgcaa ccctagtacg cccttcaggc 120

tccggcgaag cagaagaata gcttagcaga gtctattttc attttcggga gacgagatca 180

agcagatcaa cggtcgtcaa gagacctacg agactgagga atccgctctt ggctccacgc 240

gactatatat ttgtctctaa ttgtactttg acatgctcct cttctttact ctgatagctt 300

gactatgaaa attccgtcac cagcccctgg gttcgcaaag ataattgcac tgtttcttcc 360

ttgaactctc aagcctacag gacacacatt catcgtaggt ataaacctcg aaaatcattc 420

ctactaagat gggtatacaa tagtaaccat ggttgcctag tgaatgctcc gtaacaccca 480

atacgccggc cgaaactttt ttacaactct cctatgagtc gtttacc 527

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

atgcgcaagg gcgaggagct gttcaccggt gtcgtgccta tcctggtcga gctcgatggt 60

gacgtgaacg gtcacaagtt cagcgtccga ggcgagggcg agggtgatgc caccaacggc 120

aagctgaccc tcaagttcat ctgcaccacc ggcaagctcc ctgtcccttg gcctaccctg 180

gtgaccaccc tcacctacgg tgtccagtgc ttcgctcgat accctgatca catgaagcag 240

catgacttct tcaagagcgc tatgcccgag ggttacgtgc aggagcgcac catctccttc 300

aaggatgacg gcacctacaa gacccgcgcc gaggtcaagt tcgagggtga taccctggtg 360

aaccgcatcg agctcaaggg catcgatttc aaggaggacg gtaacatcct gggccacaag 420

ctcgagtaca acttcaacag ccataacgtg tacatcaccg ccgacaagca gaagaacggt 480

atcaaggcta acttcaagat ccgccacaac gtcgaggatg gctccgtgca gctggctgac 540

cattaccagc agaacacccc tatcggtgat ggccccgtcc tgctccctga caaccattac 600

ctgtccaccc agagcgtgct ctccaaggat ccgaacgaga agcgcgacca catggtcctg 660

ctcgagttcg tgaccgccgc tggtatcacc catggcatgg acgagctcta caagtga 717

<210> 3

<211> 1516

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

aattccatcc ggatgtcgaa ggcttggggc acctgcgttg gttgaattta gaacgtggca 60

ctattgatca tccgatagct ctgcaaaggg cgttgcacaa tgcaagtcaa acgttgctag 120

cagttccagg tggaatgtta tgatgagcat tgtattaaat caggagatat agcatgatct 180

ctagttagct caccacaaaa gtcagacggc gtaaccaaaa gtcacacaac acaagctgta 240

aggatttcgg cacggctacg gaagacggag aagccacctt cagtggactc gagtaccatt 300

taattctatt tgtgtttgat cgagacctaa tacagcccct acaacgacca tcaaagtcgt 360

atagctacca gtgaggaagt ggactcaaat cgacttcagc aacatctcct ggataaactt 420

taagcctaaa ctatacagaa taagataggt ggagagctta taccgagctc ccaaatctgt 480

ccagatcatg gttgaccggt gcctggatct tcctatagaa tcatccttat tcgttgacct 540

agctgattct ggagtgaccc agagggtcat gacttgagcc taaaatccgc cgcctccacc 600

atttgtagaa aaatgtgacg aactcgtgag ctctgtacag tgaccggtga ctctttctgg 660

catgcggaga gacggacgga cgcagagaga agggctgagt aataagccac tggccagaca 720

gctctggcgg ctctgaggtg cagtggatga ttattaatcc gggaccggcc gcccctccgc 780

cccgaagtgg aaaggctggt gtgcccctcg ttgaccaaga atctattgca tcatcggaga 840

atatggagct tcatcgaatc accggcagta agcgaaggag aatgtgaagc caggggtgta 900

tagccgtcgg cgaaatagca tgccattaac ctaggtacag aagtccaatt gcttccgatc 960

tggtaaaaga ttcacgagat agtaccttct ccgaagtagg tagagcgagt acccggcgcg 1020

taagctccct aattggccca tccggcatct gtagggcgtc caaatatcgt gcctctcctg 1080

ctttgcccgg tgtatgaaac cggaaaggcc gctcaggagc tggccagcgg cgcagaccgg 1140

gaacacaagc tggcagtcga cccatccggt gctctgcact cgacctgctg aggtccctca 1200

gtccctggta ggcagctttg ccccgtctgt ccgcccggtg tgtcggcggg gttgacaagg 1260

tcgttgcgtc agtccaacat ttgttgccat attttcctgc tctccccacc agctgctctt 1320

ttcttttctc tttcttttcc catcttcagt atattcatct tcccatccaa gaacctttat 1380

ttcccctaag taagtacttt gctacatcca tactccatcc ttcccatccc ttattccttt 1440

gaacctttca gttcgagctt tcccacttca tcgcagcttg actaacagct accccgcttg 1500

agcagacatc accatg 1516

<210> 4

<211> 1150

<212> DNA

<213> 皮肤真菌(Trichophyton tonsurans)

<400> 4

atggagaaac gaggcccaaa acgacggcag caagctgctc atctcagctg tgaactatgc 60

cgcgagcgta aggtcaagtg tgataaactt gatccatgca cgaactgttc gtcggcgggt 120

gtgatttgtg ttcccgtacg gcggccacgt ttgcctcgag gtgcccatgc tcagcgattg 180

cggaggaatt cccctgaaga ccctgaagca ccgatacaaa tagatattgc ttctcctgcc 240

gatgctggca ccatagctga cgacgacctc aagaagcgca ttcgcagact agaggccctg 300

gtggacagta tgcgttcttc cagccacatc tcgaagcagg taagtcaggg ataacaacat 360

cacaactagt caagaaaatt agaagagtag ctcatcaaga attttcaaac aaacaaggat 420

caggaagctg aagataccat tgaatcaact ctgaacagaa ttgacgatga tagcctactg 480

ataaaaaccc caagagttca cccgagtgat ggtggcttga gaatcctggg attaagtgga 540

tcatccagtc ctgaaactgg atgggcctct attctcgagg atagagagat atcgatgcaa 600

ttgtgccagg tatatctctt aaatgtagac ccggtgatca aaattttaca tcggccgtcc 660

gtcgaaaagt ggatgttgca gggacaacga tatctaggat ttcctgaacg ccattctgcg 720

gtcgagtctc tgggtgcggc catctgctat gttgcggcta ccagtttaac agagacacag 780

agctgggctc gtttccatgc caccaagtcc agcattgttg cccgcgcaag aagggcatgt 840

gagacgacac tagagaagag tagcccgcta ctttctccag tgatcaccac ccttcaagcg 900

tttttattat accttgtgag ttttctaacg catatttatc agcacgagtc tttcattgaa 960

caaaatgttc taatcccatt aaaaacacac caggttgcta ggaggtcaga ggatccaagt 1020

cgtgctgttt ggacattgat ggcattcgcg gtacgaatcg cgaaagctct cgacctcccc 1080

aggggcgcag gagacaattt ttttggccaa cagatgcgaa agcgactttg gctagccatc 1140

tgcttgctgg 1150

<210> 5

<211> 1000

<212> DNA

<213> 构巢曲霉(Aspergillus nidulans)

<400> 5

tggggtatga tatctaccga actcagtcac agacaagcgg tcgcaggtca gtatgtactt 60

aagagtagtt gtttctctat tgtttggtac tgcttgtaac tatatttaac caaccactag 120

gcgtggcgtt cgtaaagcca cgcacataat cccagtgtcc ggtctatatt tccgtaatgg 180

gcacccttca ctttacgagt aattcgccgg ttcaaacttc gaagctctca tattattctg 240

ctgcctgaag gagggtaaat atagcacaac acagcccagt ttcagctcca atatttgtgc 300

gcagtgtagt cttgagagga cagatatact accattgtag ttgccaactc ttcatcaaat 360

tgaggagtga gtatcttact ttgtagactg atgtagcact cccgagcagt caaccttgta 420

ttgtatcaga atacagaaac aaggatggga ggagctgcag cactagcacc ggtttcagga 480

gccctagtcc gagcttgtat agccaaccgg gaaactcacg ggcgctgaat cagcagagga 540

cacgcaagcc tcttttacct gtttctattc tctccgtaaa ttaccggtat cgccgttacc 600

cctggcgctc cccactacga cccaccgcct atcgttccct cgccctcttc agacctcacc 660

atcccagcgc ccggcttggt tgatcttcca tccacctgtc cctgtttgtt tctccatctc 720

ctgcaccatc catcttgtcc cttttatcac tctattcatc cgcttcttct ctcctcgccc 780

tcagttgatg ccggcctgtg tttgacccgt tgctctgcac ctccaaaact tcgctctcgc 840

ttttttcgac tctaacccct gttcgatcgc tcgctttatc cgtgtactcc atatagccga 900

atctcgaccc aactgttcca gtgtcttgtg tcttgactac gaggtcttga aatatcatcc 960

aatctatctt tcgcgatctt agcggcacac agatcataac 1000

Claims

1.丝状真菌启动子的筛选方法，包括：

A1）将n个表达盒通过PEG介导的原生质体转化法分别导入丝状真菌中，获得n个重组丝状真菌；n大于等于2；所述n个表达盒中，每个表达盒均含有一个丝状真菌的待测启动子以及与之相连的报告基因；所述原生质体的制备方法为：将适量萌发孢子加入10ml含50mgLysing Enzymes和30mg Yatalase的酶液中，培养2-4小时获得原生质体；和

A2）培养A1）步骤得到的重组菌株获得菌丝体，利用VinoTaste Pro处理，获得由n个重组丝状真菌的原生质体组成的启动子库，利用流式细胞仪检测各个原生质体中所述报告基因的表达情况，所述报告基因得到表达的重组丝状真菌中所含待测启动子即为具有启动子活性的启动子，即实现丝状真菌启动子的筛选；

所述VinoTaste Pro为由活性成分为多聚半乳糖醛酸酶和1,3-β-葡聚糖外切酶组成的复合酶制剂；

所述丝状真菌为构巢曲霉。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述VinoTaste Pro处理为利用VinoTastePro酶解液进行处理所述VinoTaste Pro酶解液中多聚半乳糖醛酸酶的含量为35500 PGNU/100mL，1,3-β-葡聚糖外切酶的含量为1065 BGXU/100mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述处理还包括向含有所述VinoTastePro与重组丝状真菌的体系中添加YG溶液，所述YG溶液由溶质和溶剂组成，所述溶质及其在所述YG溶液中的浓度分别为2 g/100mL 葡萄糖和0.5 g/100mL酵母抽取物，所述溶剂为微量元素母液，每100mL所述微量元素母液含有硫酸锌ZnSO₄·7H₂O 2.2g，硼酸H₃BO₃1.1g，氯化锰MnCl₂·4H₂O 0.5g，硫酸亚铁FeSO₄·7H₂O 0.16g，氯化钴CoCl₂·5H₂O 0.16g，硫酸铜CuSO₄·5H₂O 0.16g，钼酸铵（NH₄）₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.11g，EDTA钠Na₂EDTA 5.0g，余量为水。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述A2）步骤中VinoTaste Pro处理的温度为30℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述A2）步骤中VinoTaste Pro处理的时间为4小时。