CN114292802A - 一种抑制镰孢菌生长的分子生物学方法 - Google Patents
一种抑制镰孢菌生长的分子生物学方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于食品防腐技术领域，公开了一种氨基酸添加通过Tap42基因调控抑制镰孢菌生长的方法，本发明通过分子生物学的方法，构建基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42‑C，经向野生株、以及构建的基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42‑C中添加不同种类的氨基酸，发现一些特定的氨基酸可以显著抑制尖孢镰孢菌的生长，从而为未来食品的防腐保鲜提供新的方法奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及食品防腐技术领域，更具体地，涉及一种抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法。
背景技术
真菌细胞中，TORC1可感知环境中的营养物质、生长因子、压力等信号，来参与调节蛋白质翻译、核糖体合成、基因转录等信号通路，进而调节真菌的生长及代谢。上游响应元件Gtr1与Gtr2结合为异源二聚体，可介导上游多个信号通路，进而通过下游效应器调控细胞的生理过程，而下游支路中，Sch9与Tap42作为代谢效应元件，可响应上级通路传导的信号因子并通过下游调控镰孢菌的生长代谢。但Gtr1、Gtr2、Sch9与Tap42单一元件由TORC1通路介导对菌丝生长及次生代谢物生成的调控作用，目前还未有报道。
氨基酸作为TORC1信号通路的激活因子，具有显著调控细胞功能的作用。氨基酸根据性质的不同，可分为酸性氨基酸、碱性氨基酸、支链氨基酸、含硫氨基酸等。在不同种类的氨基酸激活下，可通过真菌TORC1元件传达不同的响应信号，对特定氨基酸进行响应，并通过下游支路的协同作用吸收利用于生长代谢。但目前对不同种类的氨基酸如何调控镰孢菌的生长与代谢，目前还没有深入研究。
发明内容
本发明为了克服现有技术中存在的上述缺陷，首先提供了一种抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法。
本发明的第二个目的是提供上述方法在食品防腐的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法，包括以下步骤：
S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株△FoTap42和尖孢镰孢菌基因回补株△FoTap42-C；
S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42-C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L-Arg、L-Asp、L-Glu、L-Cys、L-Met、L-Tyr、L-Ser、L-Leu中的至少一种。
优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因敲除株△FoTap42的构建方法包括以下步骤：
(1)、设计扩增Tap42基因左右同源臂的引物，以尖孢镰孢菌野生型菌DNA为模板，分别PCR扩增Tap42基因的左右同源臂；
(2)、纯化的左右同源臂PCR产物经过酶切后，分别连接到基因敲除载体pBluescript KS(+-)(pBS)-HPH1的潮霉素抗性基因的前、后的多克隆位点上，得到重组的基因敲除载体得到重组的基因敲除载体pPBS-HPH-Tap42-5’3’；
(3)、以重组载体pPBS-HPH-Tap42-5’3’为模板，用引物扩增得到长度约为3,000bp的敲除大片段HPH-Tap42-5’3’；
(4)、通过原生质体转化，将Tap42的敲除结构转化尖孢镰孢菌的原生质体细胞。转化后原生质体通过潮霉素HYG平板筛选，25℃条件下培养至转化子长出。
优选的，S1所述尖孢镰孢菌基因回补株△FoTap42-C的构建方法包括以下步骤：
(1)、以连接Tap42基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增Tap42基因。PCR产物经过纯化后，利用
HD Cloning Kit连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上，并测序进行验证；
(2)、基因回补载体向农杆菌的转化：通过向农杆菌中加入1μg质粒DNA，进行涂布平板培养后挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定；
(3)、将农杆菌溶液与真菌孢子按比例混匀；涂布于IM平板上的硝酸纤维素膜上，放置在25℃条件下培养3d；
(4)、将农杆菌和真菌孢子共培养物转移到真菌筛选培养基上，黑暗条件下30℃培养3d，直至菌落出现，再转接并进行单孢培养；
(5)、培养的菌落用AxyPrep基因组DNA小量提取试剂盒提取待验证菌株的基因组DNA。以引物NEO-F和NEO-R进行PCR扩增，并进行测序验证。
优选的，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指抑制菌落生长、产孢能力和产毒能力中的至少一种。
优选的，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指同时抑制菌落生长、产孢能力和产毒能力；所述氨基酸为L-Asp。
本发明还提供上述方法在食品防腐中的应用。本领域技术人员知道，尖孢镰孢菌在鱼干、虾干等水产干制品中广泛存在，对水产干制品造成了一定程度的危害，因此，可以使用上述方法用于防控水产干制品中尖孢镰孢菌的爆发。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过分子生物学的方法，构建基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42-C，经向野生株、以及构建的基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42-C中添加不同种类的氨基酸，发现一些特定的氨基酸可以显著抑制尖孢镰孢菌的生长，从而为未来食品的防腐保鲜提供新的方法奠定基础。
附图说明
图1为Tap42敲除转化子中PCR扩增HYG基因(a)和Tap42敲除转化子(b)和Tap42敲除转化子(c)的PCR验证；(a)M：DNA分子标记；1-16.分别以1-16号Tap42敲除转化子的菌丝基因组DNA为模板扩增HYG基因；(b)扩增左同源臂与HYG之间的区域；M：DNA Markers；1-2：(b)以Tap42敲除转化子10、12号的菌丝DNA为模板，用引物A5和HY进行PCR扩增同源臂与HYG间的区域；(c)M：DNA Markers 1-2：分别以Tap42敲除转化子10、12号的菌丝DNA为模板，用引物A6和YG进行PCR扩增同右源臂与YG间的区域；
图2为尖孢镰孢菌Tap42基因扩增的PCR验证M：DNA分子标记；4：Tap42基因的PCR验证；所有基因包括5’端的启动子区域和3’端的终止子区域；
图3为尖孢镰孢菌Tap42基因敲除菌回补的PCR验证；M:DNA分子标记；以尖孢镰孢菌菌丝DNA为模板的PCR扩增NEO基因(1-8)和HYG基因(9-16)的PCR扩增[1：△FoGtr1的回补验证；2：△FoSch9基因的回补验证；3：△FoTap42的回补验证；(IM-AS，农杆菌和尖孢镰孢菌共培养过程中不加AS)][4：△FoGtr1的回补验证；5：△FoSch9的回补验证；6：△FoTap42的回补验证；7:转化pCAMBIA1300-NEO的尖孢镰孢菌；(IM+AS，农杆菌和尖孢镰孢菌共培养过程中添加AS)]8：NEO基因PCR阳性对照[9：△FoGtr1的回补验证；10：△FoSch9的回补验证；(IM-AS，农杆菌和尖孢镰孢菌共培养过程中不加AS)][11：△FoTap42的回补验证；12.△FoGtr1的回补验证；13：△FoSch9的回补验证；14：△FoTap42的回补验证；15：转化pCAMBIA1300-NEO的尖孢镰孢菌；(IM+AS，农杆菌和尖孢镰孢菌共培养过程中添加AS)]；16：HYG PCR阳性对照；
图4为尖孢镰孢菌野生株Fo17、△FoTap42和△FoTap42-C在添加18种氨基酸的PDA培养基上的菌落形态；
图5为Fo17野生株和Tap42基因缺失株及回补株在CDA液体培养基中的产孢量(注：以Fo17在CDA培养基的产孢量为基准，进行单因素方差分析，结果以p<0.05标为#，p<0.01标为##)；
图6为Fo17野生株、Tap42基因敲除及回补株在分别添加特定氨基酸的CDA液体培养基中的产孢规律热图；
图7为野生株Fo17在分别添加18种氨基酸的GYM培养基中培养14d后T-2毒素产生量；
图8为△FoTap42和△FoTap42-C在分别添加18种氨基酸的GYM培养基中培养14d后T-2毒素的产生量(注：以△FoTap42和△FoTap42-C在GYM培养基中的产T-2毒素量为基准，进行显著性差异分析，p<0.05标为#)；
图9为Fo17野生株、Tap42基因敲除及回补株在添加特定氨基酸的CDA液体培养基中的产T-2毒素规律热图；
图10为氨基酸对TORC1-Tap42基因缺失尖孢镰孢菌的生长、产孢和产T-2毒素的调控。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
供试菌株：尖孢镰孢菌野生株Fo17(GDMCC 60824)、基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42-C，上述基因敲除株和基因回补株的构建均属于常规基因工程和分子生物学技术。
实验数据采用平均值±标准差(Mean±SD)表示，通过SPSS 19.0对菌落生长直径、孢子产量和T-2产生量进行单因素方差分析，以p<0.05定义为具有显著性差异水平。
实施例1基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42-C的构建
一、尖孢镰孢菌Tap42基因敲除株的构建
1、钢珠法小量提取基因组DNA：在平板上挑取新鲜菌丝约0.1g，置于2mL离心管中，在装有菌丝的离心管中加入600μL细胞裂解液，加研磨钢珠2颗，将2mL的离心管放入样品研磨器中，以60Hz的频率振荡1min。研磨好的样品静置10min后，4℃，13,200rpm离心10min。吸取上清到新的离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，缓慢颠倒混匀，4℃，12,000rpm离心15min。弃去上清，用70％的乙醇洗涤沉淀。沉淀干燥后用100μL ddH2O溶解。
2、CTAB法提取尖孢镰孢菌DNA
将新鲜培养的尖孢镰孢菌菌块接种于200mL PDB培养液中，25℃，180rpm/min培养24h。培养结束后用纱布过滤菌丝，用灭菌蒸馏水洗涤菌丝3次，用吸水纸擦干菌丝水分后加入液氮研磨成细粉状。随后加入65℃预热后的10mL CTAB抽提液，轻微振荡摇匀，并在65℃水浴锅中加热1h，结束后在4℃条件下9,000rpm离心10min，取上清液于离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(v:v:v＝25:24:1)，振荡混匀后12,000rpm离心10min，取上清液加入2倍体积的-20℃预冷无水乙醇，混匀后静置2h，再4℃、1,000rpm离心10min，去掉上清液，同时使用10mL 70％乙醇洗涤5次，洗涤后在1,000rpm下离心5min，保留沉淀并干燥。干燥后加入400μL双蒸水溶液DNA并于37℃培养下中加入1μL的10mg/mL RNase温育2h。
3、PCR扩增
PCR反应体系：
PCR反应条件：98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸5s/kb，35个循环；72℃延伸5min，产物于4℃保存。
4、DNA电泳、PCR产物纯化、DNA酶切：采用常规手段。
5、DNA片段与载体连接
采用T4 DNA Ligase连接DNA片段与载体。
连接体系如下：
连接条件：16℃，2h。
6、质粒DNA转化大肠杆菌(E.coil DH 5α)感受态细胞、质粒DNA的提取均采用常规手段；分生孢子的制备、原生质体的制备均采用常规手段；
7、尖孢镰孢菌转化：在放置于冰上预冷的1.5mL离心管中加入200μL待转化的原生质体细胞，加入100μL DNA样品，10μL 5mg/mL肝素钠以及250μL SPTC溶液后充分吸打混匀，冰上避光放置30min。然后向混合液中逐滴加入400μL SPTC溶液并充分混匀，避光室温放置20min。将混合液加入装有25mL TB3液体培养基的三角瓶中，缓慢混匀，并置于暗处30min。然后将三角瓶置于25℃摇床，100rpm过夜培养。次日将菌丝加入到PDA培养基中，再加入100μg/mL潮霉素，25°培养至转化子长出。
8、Tap42基因编码区核苷酸序列的测定：首先从网站https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi下载Tap42(Q04372)基因的核苷酸序列，并进行比对，根据比对结果设计扩增基因的引物Tap42_5F和Tap42_3R。以尖孢镰孢菌提取基因组DNA为模板，PCR扩增基因的编码框区域。PCR产物经过电泳后切胶纯化，并连接T载体测序。将测序结果与相关序列进行比对并作为设计后续用于基因敲除引物时的参照序列。
9、Tap42基因敲除结构的构建方法
分别设计扩增Tap42基因左右同源臂的引物Tap42-A1(5’端加SpeI酶切位点)和Tap42-A2(5’端加BamHI酶切位点)、Tap42-A3(5’端加SalI酶切位点)和Tap42-A4(5’端加KpnI酶切位点)，以尖孢镰孢菌野生型菌DNA为模板，分别PCR扩增Tap42基因的左右同源臂，纯化的左右同源臂PCR产物经过酶切后，分别连接到基因敲除载体pBluescript KS(+-)(pBS)-HPH1的潮霉素抗性基因的前、后的多克隆位点上，得到重组的基因敲除载体pPBS-HPH-Tap42-5’3’。
10、Tap42基因敲除结构的尖孢镰孢菌转化
参考尖孢镰孢菌原生质体的转化方法，将Tap42基因的敲除大片段HPH-Tap42-5’3’转化入尖孢镰孢菌的原生质体细胞。将转化后的原生质体铺含有潮霉素HYG的平板进行筛选，25℃条件下培养至转化子长出。
11、Tap42基因敲除转化子的验证
从Tap42基因敲除转化子筛选平板上长出的菌落上挑取菌丝，提取菌丝基因组DNA，首先以此菌丝DNA为模板，PCR扩增HYG基因。共挑取了16个菌落上的菌丝，从第10、11、12、13、15和16号菌落中扩增出了预期大小的条带。PCR结果见下图。以第10和12号菌落菌丝基因组DNA为模板，进一步用引物对Tap42-A5和HY、YG和Tap42-A6进行PCR验证，PCR产物切胶纯化后送测序，Tap42-A5HY、Tap42-A6YG测序结果见附录5。结果表明，10和12号菌株中的Tap42基因被成功敲除(图1)。
二、尖孢镰孢菌Tap42基因敲除株的回补
1、回补基因序列的扩增
扩增待回补基因的全长序列(包括基因5’端的启动子区域和3’端的终止子区域)，基因扩增的参考序列通过同源查找尖孢镰孢菌Fusarium oxysporium的基因(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/MultiHome.htmL)获得。基因扩增所需要的引物序列见表1。以野生型尖孢镰孢菌基因组DNA为模板，使用相应的引物扩增Tap42基因的全长序列。PCR产物经过纯化后连接到T载体上进行测序。
表1
PCR扩增结果如图2所示，可以看出Tap42基因的全长序列在5000bp左右。
2、基因回补载体的构建：
分别以连接有上述全长基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增基因。PCR产物经过纯化后，利用
HD Cloning Kit连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上，得到回补载体pCA-FoTap42-C。
构建回补载体的引物利用在线软件(http://www.takarabio.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Selection_Guides/Online_In-Fusion_Tools)完成。连接的正确性经过测序进行验证。
3、基因回补载体向农杆菌的转化，包括以下步骤：
(1)取一管农杆菌感受态细胞(200μL)，放置于冰上融化后，加入1μg质粒DNA，轻轻混匀后冰上放置30min。
(2)然后于液氮中速冻l min，37℃水浴5min。
(3)加入400μL LB液体培养基(不含抗生素)，28℃振荡培养2d直至长出单菌落。挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定。
4、农杆菌介导的尖孢镰孢菌的转化
(1)真菌孢子的制备：挑取新鲜培养的禾谷镰孢菌边缘菌块，加入到150mLCMC孢子培养液中，25℃摇床中180rpm培养6d，培养后菌液通过2层纱布过滤，并用少量无菌水冲洗纱布，收集滤液，4℃，2,500×g离心10min，收集孢子。用IM液体培养基悬浮孢子，使孢子浓度达到1×107CFU/mL。
(2)农杆菌的准备：
a、将带有双元载体的农杆菌在LB平板(含Kan 50μg/mL，rif 50μg/mL)上划线，28℃培养3天，以得到农杆菌单克隆；b、挑取一个农杆菌单克隆接种到液体10mL LB培养基(含Kan 50μg/mL，rif 50μg/mL)，28℃，250rpm培养24h；c、取1.5mL农杆菌菌液，室温下2，400g离心10min。弃去上清，用250μL液体IM培养基缓慢悬浮沉淀，室温下2,400g离心10min，弃去上清；d、将沉淀悬浮于5mL液体IM培养基(含200μM AS)，再将菌液转入100mL锥形瓶，28℃，100rpm培养5h，将菌液的OD 600nm调节为0.8。
5、农杆菌-真菌共培养
取100μL 上述农杆菌溶液与100μL真菌孢子(浓度约为1×107CFU/mL)以1:1的比例混匀。用灭菌镊子将0.45μM硝酸纤维素膜放入15cm直径的IM平板(含有200μM的AS)上，吸取200μL农杆菌与真菌孢子的混合液，加到平板上的硝酸纤维素膜上，用玻璃涂布器涂匀。将平板放置在25℃条件下培养3d。
6、转化体的筛选
将带有农杆菌和真菌孢子共培养物的硝酸纤维素膜用灭菌的镊子转移到真菌筛选培养基上(PDA培养基，含有Kan 50μM，cef 200μM，Geneticin 100μM)。黑暗条件下30℃培养3d，直至菌落出现。将转化体再转接到筛选培养基上，进行单孢培养。
7、回补菌株的验证
用AxyPrep基因组DNA小量提取试剂盒提取待验证菌株的基因组DNA。以引物NEO-F和NEO-R进行PCR扩增。
PCR验证体系如下：
利用引物Tap42-C1/Tap42-C2以野生型的尖孢镰孢菌基因组DNA为模板扩增Tap42基因的全长序列(包括5’端启动子区域和3’端终止子区域)，PCR产物经过纯化后连接到T载体上进行测序，以验证序列的正确性。以测序正确的重组质粒为模板，用基因回补引物Tap42-infu-5F/Tap42-infu-3R扩增Tap42的全长序列，并将Tap42基因分别连接到经过BamHI和HindIII双酶切的双元载体pCAMBIA1300-NEO上，得到回补载体pCA-FoTap42-C。将回补载体转入农杆菌Agrobacterium tumefaciens C58C1感受态细胞中，再通过农杆菌介导的转化法将其转入Tap42基因敲除的尖孢镰孢菌中。回补菌株经过基因霉素抗性培养基筛选和PCR验证6号条带PCR验证成功，最终得到Tap42基因回补株(图3)。
实施例2氨基酸添加对镰孢菌菌落生长的影响
配制含5mg/mL特定氨基酸(sAA)的PDA培养基，回补株培养基中添加10μg/mL潮霉素。以PDA培养基作为对照组，PDA培养基中添加0.5mmol/L雷帕霉素设置为阳性对照组。培养基121℃灭菌冷却后，使用Fo17野生株Tap42基因敲除株及回补株平板各打5mm菌饼，接种于sAA-PDA培养基，28℃培养7d，菌落拍照观察。
一、不同氨基酸对△FoTap42和△FoTap42-C菌落生长的影响
由图4可得，与野生株相比，△FoTap42在添加L-Lys、L-Pro、L-Ser、L-Thr添加下生长速率减慢，菌落形态较小，但边缘较完整，无产生明显菌落缺陷。基因回补后菌丝形态和生长恢复正常。在L-Tyr添加下△FoTap42菌落生长抑制比较明显，基因回补后生长有恢复但仍存在生长抑制现象。L-Val添加后，△FoTap42生长菌落边缘发育不完整，且生长速率减慢，基因回补后恢复正常。在L-Asp和L-Glu添加下，△FoTap42除生长速率变慢外，边缘呈菌丝凸起状，基因回补后恢复正常。与野生株一致的是，在L-Cys、L-Met、L-Asp和L-Glu添加后，△FoTap42和△FoTap42-C生长显著受到抑制，菌丝体较小。
二、氨基酸对镰孢菌菌落生长率分析
以Fo17野生株及TORC1基因缺失株及回补株在PDA培养基为基准(100％)，计算在添加不同氨基酸PDA培养基的菌落生长率，结果表明：Fo17在L-Arg、L-Cys、L-Glu及L-Iso添加的培养基中的生长率分别为80.0％、44.3％、49.3％、72.8％，表明其生长显著受到抑制。△FoTap42在L-His培养基中生长率为77.7％，而△FoTap42-C的生长率达101.5％，表明Tap42基因可调控镰孢菌对L-His的吸收。
实施例3 TORC1关键基因介导氨基酸对镰孢菌孢子产生的影响
一、对CDA液体培养基中孢子产生量及孢子形态的影响
配制sAA-CDA培养基，每个培养基含10mg/mL特定氨基酸，将基因缺失株及回补株分别接种于特定的10mL sAA-CDA培养基内，28℃摇床培养7d。培养结束后用磁力搅拌器500rpm/min转速将孢子混匀打碎，三层纱布过滤。取50μL滤液在显微镜下用血细胞计数板测定孢子数量。
由图5可得，Fo17野生株在CDA液体培养基中的产孢量为12.3×105CFU/mL，△FoTap42产孢量与野生株相比显著下降(p<0.05)，基因回补后产孢量增加，但仍低于野生株对照组。
Fo17野生株在CDA液体培养基上的产孢量为12.3×105CFU/mL，在培养基添加L-Asp、L-Cys、Gly、L-His和L-Leu后，Fo17产孢量明显减少至2.3-7.6×105CFU/mL，表现为氨基酸负向抑制产孢效应。对△FoTap42的产孢量有抑制作用的有L-Arg、L-Cys和L-Leu。而L-Ala对野生株、基因敲除和回补株均有显著抑制产孢效果。△FoTap42在L-Pro添加的条件下，产孢量显著升高(p<0.05)，达37.3×105CFU/mL，而在L-Ser添加条件下，产孢量显著抑制，仅为2.6×105CFU/mL。
二、镰孢菌在CDA液体培养基中的产孢规律
根据图6聚类分析热图可得，Fo17野生株和Tap42基因敲除及回补株在L-Cys、L-Leu、L-Val、L-Try、L-Ala和Gly添加的CDA培养基中，产孢量显著较低，表明这6种氨基酸对镰孢菌的产孢能力具有抑制效应。△FoTap42在L-Iso和L-Pro添加下，产孢量极显著升高，表明Tap42基因对L-Iso和L-Pro的激活产孢具有抑制作用，基因缺失后，抑制作用消失，产孢量增加。
实施例4 TORC1关键基因介导氨基酸对镰孢菌产T-2毒素的影响
配制含5mg/mL特定氨基酸的GYM培养基，取1mL sAA-GYM培养基溶液加入2mL离心管中，将不同种类的镰孢菌分别打2个5mm菌饼，接种于液体培养基中，28℃120r/min摇床培养15d，培养结束后将培养液5,000rpm离心15min，取上清液加入等量乙酸乙酯，涡旋震荡3min后收集上清液，重复操作3次，合并上清液，60℃氮气吹干后加入1mL的30％甲醇溶液复溶，涡旋震荡至底层沉淀溶解，0.22μm滤膜过滤，LC-MS/MS法测定T-2含量。
一、氨基酸添加对野生株Fo17产T-2产量的影响
由图7可得，野生株Fo17在GYM培养基中的产T-2为22.8ng/mL，添加L-Asp、L-Glu后产毒量显著降低，仅为14.8ng/mL和12.6ng/mL(p<0.05)。添加L-Cys、L-Phe和L-Pro后产T-2量显著升高，分别达33.6、30.5和31.0ng/mL。在其他氨基酸添加下的GYM培养基中镰孢菌产T-2量与对照组无明显差异(p>0.05)。
二、氨基酸添加对△FoTap42和△FoTap42-C产T-2毒素产量的影响
由图8可得，△FoTap42在GYM培养基中产T-2为30.8ng/mL，Tap42基因回补后产毒量下降。△FoTap42在L-Asp组的产毒能力显著下降(p<0.01)，仅为6.2ng/mL，△FoTap42-C显著升高(p<0.05)。△FoTap42在L-His、L-Val添加的培养基中，T-2产量显著升高(p<0.05)，Tap42基因回补后产毒量显著下降至对照组水平，表明Tap42基因缺失后激活镰孢菌产毒能力，回补后产毒能力下降。△FoTap42-C在L-Met、L-Ser添加的GYM培养基中，产T-2量均显著低于对照组。
三、氨基酸添加调控镰孢菌产毒规律
由图9可得，Fo17野生株、Tap42基因敲除及回补株在L-Asp、L-Glu添加的GYM培养基中产毒量显著降低，表明这两种氨基酸可显著抑制镰孢菌的产毒能力。
实施例5 TORC1关键基因介导氨基酸对镰孢菌生长及代谢规律
由图10可得，除L-Asp、L-Glu、L-Met和L-Cys的负向调控能力外，在L-Tyr和L-Try添加下，镰孢菌Tap42基因的缺失对菌丝生长能力产生负调控效应，同时大部分氨基端对孢子产生呈正向激活调控，L-Leu对镰孢菌的产毒产孢能力具有显著负向调控。而L-Glu对镰孢菌生长和产毒能力有负面抑制，对产孢有正向激活作用。
在本研究中，Tap42基因缺失后，镰孢菌菌丝生长显著降低，尤其对促进野生株生长的Gly、L-His、L-Pro和L-Thr响应降低，这可能是Tap42基因缺失后无法通过磷酸酶途径激活TORC1，导致细胞吸收无法吸收胞外氮源。Tap42基因缺失后，在未添加氨基酸的条件下，镰孢菌的产孢和产毒能力均显著下降，表明Tap42基因同时调控产孢和产毒途径，基因缺失后，这两种代谢能力均下降，Tap42基因缺失后，L-Asp和L-Glu激活产孢能力，但抑制产毒能力。这可能是一种由氨基酸介导的潜在的基因逆向协调机制，即镰孢菌在合成代谢通路关键基因缺失条件下，氨基酸会通过激活其他途径如MAPK和HOG途径，进行生长代谢和次生产物合成。
Claims (6)
1.一种抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别构建尖孢镰孢菌基因敲除株△FoTap42和尖孢镰孢菌基因回补株△FoTap42-C；
S2、分别向尖孢镰孢菌野生株、基因敲除株△FoTap42和基因回补株△FoTap42-C中添加氨基酸，所述氨基酸选自L-Arg、L-Asp、L-Glu、L-Cys、L-Met、L-Tyr、L-Ser、L-Leu中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法，其特征在于，S1所述尖孢镰孢菌基因敲除株△FoTap42的构建方法包括以下步骤：
(1)、设计扩增Tap42基因左右同源臂的引物，以尖孢镰孢菌野生型菌DNA为模板，分别PCR扩增Tap42基因的左右同源臂；
(2)、纯化的左右同源臂PCR产物经过酶切后，分别连接到基因敲除载体pBluescriptKS(+-)(pBS)-HPH1的潮霉素抗性基因的前、后的多克隆位点上，得到重组的基因敲除载体得到重组的基因敲除载体pPBS-HPH-Tap42-5’3’；
(3)、以重组载体pPBS-HPH-Tap42-5’3’为模板，用引物扩增得到敲除大片段HPH-Tap42-5’3’；
(4)、通过原生质体转化，将Tap42的敲除结构转化尖孢镰孢菌的原生质体细胞，转化后原生质体通过潮霉素HYG平板筛选，25℃条件下培养至转化子长出。
3.根据权利要求2所述的抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法，其特征在于，S1所述尖孢镰孢菌基因回补株△FoTap42-C的构建方法包括以下步骤：
(1)、以连接Tap42基因的重组T载体为模板，利用构建回补载体的引物扩增Tap42基因。PCR产物经过纯化后，利用In-
HD Cloning Kit连接到相应的经过双酶切的双元载体pCAMBIA1300-neo上，并测序进行验证；
(2)、基因回补载体向农杆菌的转化：通过向农杆菌中加入1μg质粒DNA，进行涂布平板培养后挑取单克隆菌落，提取质粒，并通过PCR扩增鉴定；
(3)、将农杆菌溶液与真菌孢子按比例混匀，涂布于IM平板上的硝酸纤维素膜上，放置在25℃条件下培养3d；
(4)、将农杆菌和真菌孢子共培养物转移到真菌筛选培养基上，黑暗条件下30℃培养3d，直至菌落出现，再转接并进行单孢培养；
(5)、培养的菌落提取待验证菌株的基因组DNA，以引物NEO-F和NEO-R进行PCR扩增，并进行测序验证。
4.根据权利要求2所述的抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法，其特征在于，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指抑制菌落生长、产孢能力和产毒能力中的至少一种。
5.根据权利要求5所述的抑制尖孢镰孢菌生长的分子生物学方法，其特征在于，所述抑制尖孢镰孢菌生长是指同时抑制菌落生长、产孢能力和产毒能力；所述氨基酸为L-Asp。
6.权利要求2至6任一项所述的方法在食品防腐中的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116426393A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-07-14 | 四川农业大学 | 一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010071973A1 (en) * | 2008-12-24 | 2010-07-01 | National Research Council Of Canada | Modification of plant phenotypes through tor gene expression |
| WO2016100893A1 (en) * | 2014-12-18 | 2016-06-23 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Methods and compositions for treating eukaryotic infections via altering aggregation dynamics of raptor/kog1 |
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2022
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