JP2008504014A - 菌類における菌糸の育成 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
本発明は、菌類の形態、特に菌糸の分枝に関係した、アスペルギルス(Aspergillus)遺伝子の発見に一部基づいている。(菌糸成長の長さ単位として測定された)菌糸の分岐の程度と(流動系の羽車の上に及ぼされる粘度により測定される)発酵器中の培養物の粘度の間には直線関係が観察されてきた。過度に分岐している菌類変異体の単離及び菌類の過度な分岐に関係する遺伝子の同定は、菌類の形態を修飾するための手段を提供し、それにより粘度を制御するため及び発酵器の性能を改良するための手段も提供する。
定義
本明細書において使用する、「菌糸成長に関係するタンパク質」の語は菌類において菌糸成長を修飾することが可能なタンパク質を意味する。そのようなタンパク質の例示は、本明細書中の実施例に開示されたタンパク質HbrA 1−9である。「HbrA」の語は配列番号2に示されたアミノ酸配列を意味する。「hbrB」、「HbrA3」及び「hbr3」は本明細書において互換的に使用する。本発明は配列番号2又は8に開示されたアミノ酸配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%の相同性を有する菌類の菌糸成長に関係したタンパク質を包含する。核酸レベルのパーセント相同性はFastAプログラムを使用して計算し、そしてアミノ酸レベルのパーセント相同性はTFastAを使用して計算し、両者はPearson and Lipmanの方法(PNAS USA,1988,85:2444−2448)を使用する。本発明は、HbrA又はHbrBの変異体(mutants)、変更物(variants)及び誘導体(derivatives)が菌類の菌糸成長を修飾出来る限り、前記の変異体、変更物及び誘導体も包含する。
本発明は、アスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)におけるHbrA及びHbrBの同定に関係する。本明細書においてHbrA2と呼ぶHbrAの変異体は、擬似有性分析により染色体VIIに位置することが明らかである(Aspergillus:50 Years On(1994)vol 20,ed S.D.Martinelli & J.R.Kinghorn pp.41−43)。37℃において、変異体hbrA2は、野生型アスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)とは違い、組換え発現されたムコールミエヘイ(M.meihei)のプロテアーゼを分泌することができない。HbrA2遺伝子の翻訳された配列は、酵母のSLP/VPS33のSec1遺伝子産物に顕著な相同性を示す。SLP/VPS33のSec1が液胞タンパク質の選別(sorting)に必須のタンパク質をコードすることが証拠である。SLP1変異体はタンパク質を液胞に向けさせることができず、そしてそれらは既存の経路に沿って細胞質膜に送られる。SLP1/VPS33のSec1の厳密な性質及び機能は未知であるが、それはSEC1ファミリーのメンバーであり、そして小胞を液胞に向けさせることに関与する膜結合タンパク質であると考えられる。酵母におけるVPS33の欠失は致死的ではないが、光学及び電子顕微鏡観察により明らかにされたところによれば、成長が遅くなり、温度感受性及び液胞の損失を導く。蛍光顕微鏡の観察によると、酵母のSLP1/VSP33のように、HbrA2は非許容温度においては液胞が構築されなかった。
本発明は、HbrAに関してのアミノ酸(配列番号2)HbrA及び核酸(配列番号1)配列を提供する。本発明は、変異体が適切な菌糸成長をする限り、配列番号2に示す配列を有するアミノ酸に対して少なくとも70%の相同性を有するアミノ酸変異体も包含する。核酸レベルのパーセント相同性はFastAプログラムを使用して計算し、そしてアミノ酸レベルのパーセント相同性はTFastAを使用して計算し、両者はPearson and Lipmanの方法(PNAS USA,1988,85:2444−2448)を使用する。別法として、相同性は、Jotun Hein法(1990,Method in Enzymology,183:626−645)によるDNAstar(DNASTAR,Inc.Maidson,WI53715)からのMegAlignプログラムにより、ギャップペナルティ=11、ギャップ長ペナルティ=3及びPairwise Alignment Parameters Ktuple=2を用いて決定した。様々なポリヌクレオチドがHbrAをコードし得ることは当業者が容易に理解する。本発明は、そのようなポリヌクレオチドの全てを包含する。HbrA、及び菌糸成長に関係するタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドは、例えばクローン化されたDNA(例えば、DNA「ライブラリー」)、ゲノミックDNAライブラリーから当業界で公知の標準手法により、確立された化学合成により、cDNAクローニングにより、あるいは所望の細胞から精製したゲノミックDNAまたはその断片のクローニングにより、得ることができる。(例えば、Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York;Glover,D.M.(ed.),1985,DNA Cloning:A practical Approach,MRL Press,Ltd.,Oxford,U.S.
Patent No..K.Vol.I,IIを参照)。ゲミックDNAに由来する核酸配列はコーディング領域に加えて制御領域を含んでよい。源が何であれ、菌糸成長に関係するタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子の増幅のために適切なベクターで、分子的にクローンすることができる。
本発明は、宿主菌類中で所望のタンパク質を生産するための宿主細胞、発現方法及び発現システムを提供する。菌糸成長に関係するタンパク質をコードする核酸を得たなら、前記核酸を含む組換え宿主細胞を本技術分野で公知の技術を使用して構築してよい。分子生物学の技術は、Sambrook et al.,Molecular Biology Cloning,A Laboratory Manual,Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)に開示される。菌糸成長に関係するタンパク質をコードし且つhbrAに対して少なくとも60%の相同性を有する核酸を得て、適切なベクターを使用して宿主細胞を形質転換する。菌類におけるクローニング、形質転換及び発現に適した様々なベクター及び形質転換及び発現カセットは当業者に知られている。
and Products(Finkelstein & Bill)113−156)。プロトプラストのエレクトロポレーションはFinkelstein,DB 1992 Transformation.In Biotechnology of Filamentous Fungi.Technology
and Products(Finkelstein & Billにより編纂)113−156に開示される。カンジダへのマイクロインジェクション砲撃はFungaro et al.(1985)Transformation of Aspergillus nidulans by microprojection bombardment on intact conidia FEMS Microbiology Letters 125 293−298に記載されている。アグロバクテリウムが媒介する形質転換は、Groot et al.(1998)Agrobacterium tumefaciens−mediated transformation of filamentous fungi.Nature Biotechnology 16 839−842に開示されている。
菌類の細胞においてhprAを発現するかまたは菌類の細胞において所望のタンパク質を発現するのに使用される発現ベクターは、前記タンパク質に関連する少なくとも一つのプロモーターを含む。前記プロモーターは宿主細胞において機能する。本発明の一つの態様において、前記プロモーターは前記タンパク質の野生型プロモーターである。本発明の別の態様において、前記プロモーターは前記タンパク質に対しては異種のプロモーターであるが、菌類の宿主細胞において依然として機能する。本発明の一の好ましい態様において、前記タンパク質をコードする核酸は微生物のゲノムに安定に組み込まれる。
実施例1及び2に示す結果は、菌類の分岐に作用する変異体を同定するためのスクリーニングおける使用温度を例示する。そのような温度に基づく選抜を使用することによる予測されない利点は、天然または内因性の遺伝子の輸送とは相対する、組換えにより導入された異種タンパク質の輸送において異なる作用を有する、HbrA変異体又は菌糸成長に関係するタンパク質の変異体を同定することができる点である。この種の選抜法により、異種タンパク質の分泌を増加することができる株の単離を促進することができる。従って、本発明は、複数の菌類変異体を得て、前記変異体を所望の条件下での選択に供し、そして所望の変異体を同定する工程を含む、タンパク質の分泌を増強する過剰に分枝する菌類変異体を同定する方法も提供する。一の態様において、同定は菌糸成長に対する選択を含む。一つの態様において、上記選択は、限定された温度における異種タンパク質の成長及び/または分泌を含む。
プロモーター交換は、条件付で発現された遺伝子であるalcAを用いて行った。hbrBの5’末端の1050bpをpAL3発現ベクターの中のalcAプロモーターの後ろに結合した(Waring, et al. Gene 79:119−130)。これを、アスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)野生型株、G191の中で形質転換させた。25の軽質転換体が得られ、そのうちの5つが異なる媒体上で、制御下可能な形態を示した。hbrBダウン制御の表現型の影響を研究するためにカルコフローラ(Calcoflour)染色を用いた。このダウン制御された発現型は本来の温度感受性変異体の発現形態とは異なっていた。胞子及び第一挿入成分は大きく膨張し、対立表現型のロスのようであった。組込みを確認するためにサザンブロットを行い、1の形質転換体であるT12が正しい組込みパターンを示した。
hbrB3に相補であるDNA配列がhbrB遺伝子自身であるか、又は2の遺伝子の間の遺伝子外抑圧組換えであるかどうかを確かめる試験を行った。この試験のために、オリジナル温度感受性変異体2−169をT2プロモーター置換株と交差させた。もし、2つの遺伝子が同じ位置であるならこれらの間で組換えは起こらないであろうし、全子孫は完全に温度感受性であるか、あるいはグルコース抑制されるであろう。代わりに、もし、相補遺伝子が遺伝子外抑制であるなら、するために、自由にhbrBと組換えが起こり、5の表現型程度の子孫を生産すると考えられる。野性型クラス及び温度感受性であり且つalcAであるクラスの2の親クラスが得られるであろう。120の子孫をテストし、hbrB及びhbrB3を同じ位置に含む2の親クラスが、約1:1の割合で得られた。
アスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)の中のSodV1C1変異体は、細胞表面及び表面外分泌されるタンパクのプロセシングに影響を与える(Lee, HEUBACH. et al (2002) FEMS Microbiol. Lett. 208: 253−257)。SodV1C遺伝子は、分泌経路の膜結合成分の間の細胞内タンパク質輸送に必須であり、極大化に必須である、α−関連遺伝子である。1%スキムミルクアガープレートにおいて、SodV1C1変異体株は細胞外にハロの生産を欠失するプロテアーゼを分泌する能力を欠いている。PS1−Blastの結果により示唆される同様の役割をHbrBが有するかどうかを評価するために、野性型及びhbrB3株を同じスキムミルクプレートに接種し、そして所定の温度(42℃)でインキュベートした。両株はハロを生産し、hbrB3変異体がプロテアーゼ分泌において明らかな影響を示さないことが示唆された。
Claims (31)
- 配列番号8で開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも95%の相同性を有する、菌類において菌糸成長に関係する単離されたタンパク質。
- 配列番号8で開示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項1に記載のタンパク質。
- 配列番号8で示される配列を有するアミノ酸をコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号7で示される配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも60%の相同性を有する、あるいは中から高ストリンジェンシー条件下において配列番号7で示される配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、あるいは配列番号7で示される配列を有するポリヌクレオチドに相補的であることを特徴とする請求項3に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号7で開示される核酸配列を有することを特徴とする請求項4に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項3に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 糸状菌であることを特徴とする請求項7に記載の宿主細胞。
- 前記糸状菌がアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ムコール(Mucor)及びフサリウム(Fusarium)を含むことを特徴とする請求項8に記載の宿主細胞。
- 所望のタンパク質を製造するために適した条件下において前記所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を培養する工程を含む、菌類中で所望のタンパク質を製造する方法であって、ここで、組換え菌類が前記菌類において菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含み、前記タンパク質が配列番号8で開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%の相同性を有することを特徴とする方法。
- 前記所望のタンパク質を回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが前記菌類に相同であり、前記ポリペプチドが、天然発生の菌類において見られるよりも多数のコピー数で存在し、菌糸成長に関係するタンパク質をコードする特徴とする請求項10に記載の方法。
- 菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが前記菌類に対して異種であり、前記菌類中へ組換え的に導入されていることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記菌類の中において菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが複製プラスミドを含むことを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記菌類の中において菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが菌類ゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記菌糸成長に関係するタンパク質が配列番号8で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 菌糸成長に関係するタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが配列番号7で示される配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも60%の相同性を有するか、又は中から高ストリンジェンシー条件において配列番号7で示される配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるか、又は配列番号7で示される配列を有するポリヌクレオチドに相補的であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが配列番号7で示される核酸配列を有することを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 前記菌類が糸状菌であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記糸状菌がアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ムコール(Mucor)及びフサリウム(Fusarium)種を含むことを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 前記アスペルギルス(Aspergillus)種がアスペルギルス・ニガー(A.niger)、アスペルギルス・ニディユランス(A.nidulans)、アスペルギルス・オリザエ(A.oryzai)及びアスペルギルス・フミガタス(A.fumigataus)を含むことを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 菌糸成長に関係するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を生産する方法であって、
(a)関係する前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得る工程と、
(b)前記ポリヌクレオチドを前記宿主細胞に導入する工程と、及び
(c)菌糸成長に関係する前記タンパク質の生産に適した条件下で前記宿主細胞を生育する工程とを含む方法。 - 前記宿主細胞が糸状菌を含むことを特徴とする請求項22に記載の方法。
- 前記糸状菌がアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、ムコール(Mucor)及びフサリウム(Fusarium)を含むことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記アスペルギルス(Aspergillus)がアルペルギルス・ニガー(A.niger)、アスペルギルス・ニディユランス(A.nidulans)、アスペルギルス・オリザエ(A.oryzai)及びアスペルギルス・フミガタス(A.fumigataus)を含むことを特徴とする請求項24に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号7で示される配列を有する核酸に少なくとも60%の相同性を有することを特徴とする請求項22に記載の方法。
- 菌類変異体を得る工程と、前記変異体を所望の条件下で選択する工程と、及び所望の変異体を同定する工程とを含む、高度に枝分かれした菌類変異体を同定する方法。
- 前記同定する工程が菌糸成長についての選択を含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記選択する工程が限定された温度における異種タンパク質の育成及び分泌を含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- 前記所望のタンパク質の生産に対して適した条件下で、前記所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え菌類を培養する工程を含む菌類の中で所望のタンパク質を生産するための方法であって、前記組換え菌類が菌糸成長に関係するタンパク質をコードする内因性核酸における変異を含み、前記変異が菌糸成長に関係するタンパク質の前記菌類による生成阻害を生じることを特徴とする方法。
- 前記菌糸成長に関係するタンパク質が配列番号8で開示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%の相同性を有することを特徴とする請求項30の方法。
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