CN116426393A - 一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用 - Google Patents

一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用。针对目前关于竹针孢座囊菌研究在基因分子层面的空缺，提供了一种带有适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子(PtrpC)及增强绿色荧光(EGFP)能够高效表达绿色荧光基因的敲除载体质粒在竹针孢座囊菌基因敲除中的应用。

Description

一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种竹针孢座囊菌及其制备方法与应用。
背景技术
丛枝病(Witche’s broom disease，WBD)作为对竹林危害最严重的病害之一，在发病严重的竹林中，常造成整个竹林衰败，对生态环境影响严重，造成巨大经济损失，并严重威胁大熊猫等食竹动物生存。引起竹丛枝病的病原大多为真菌，而我国普遍发生的竹丛枝病是由竹针孢座囊菌(Aciculosporium take)引起，竹针孢座囊菌目前研究仅限于病原鉴定、菌种生长条件初探、外部形态观测和少量生理生化指标检测上，远远不能解析竹丛枝病的发病机理，通过基因分子层面改造对竹针孢座囊菌的代谢进行调控以探究竹丛枝病发病机理还未见有报道。
发明内容
本发明提供了一种竹针孢座囊菌(Aciculosporium take)，所述竹针孢座囊菌在2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2023413。
本发明还提供了上述菌种的构建方法，包括以下步骤：
(1)候选基因左右同源臂克隆
提取Aciculosporium take真菌基因组DNA，扩增候选基因左右同源臂A、B臂片段；
(2)敲除载体的构建
a带有适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子PtrpC及增强绿色荧光EGFP能够高效表达绿色荧光基因的重组载体
pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR的构建：利用pCAMBIA1300ura-GFP-BAR起始载体质粒为模板克隆启动子pTrpc基因序列，pEGFP-N1载体质粒为模板扩增并克隆绿色强荧光蛋白EGFP基因序列；将起始载体质粒pCAMBIA1300ura-GFP-BAR通过限制性内切酶AvrⅡ和BamHⅠ进行双酶切线性化，将启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP与pCAMBIA1300ura-GFP-BAR连接与转化；
b敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B的构建：根据A、B、HYG序列及pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR序列，设计A、B、HYG含融合PCR接头且能使片段与线性化克隆载体相互同源重组的序列；以A、HYG、B克隆质粒DNA为模板，使用ApexHF HS DNA聚合酶-FS高保真酶扩增长度2832bp的融合片段；将pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR重组载体线性化形成粘性末端，将A-HYG-B融合片段与
pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR质粒连接与转化，构建敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B；
(3)农杆菌介导敲除载体转化Aciculosporium take野生型菌株
a将pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体质粒转化至农杆菌AGL1感受态细胞；
b Aciculosporium take野生菌株对潮霉素抗生素的敏感性实验：制备含不同浓度潮霉素的培养基，观察Aciculosporium take野生菌株的生长状况，选择完全抑制浓度作为筛选转化子最佳条件；
c含载体的农杆菌与Aciculosporium take野生型菌株共培养转化：利用农杆菌介导技术将基因敲除片段pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B转化至Aciculosporium take野生型菌株；
d对筛选平板上转化子进行PCR验证及荧光观察验证。
进一步的，在步骤(1)中，所述扩增候选基因左右同源臂片段的引物包括扩增A臂的引物和扩增B臂的引物。
进一步的，所述扩增A臂的引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ IDNO.2所示的下游引物。
进一步的，所述扩增B臂的引物包括如SEQ ID NO.3所示的上游引物和如SEQ IDNO.4所示的下游引物。
本发明还提供了一种菌剂，包括上述竹针孢座囊菌。
竹针孢座囊菌在研究竹丛枝病菌与寄主互作机理中的应用。
本发明还提供了上述竹针孢座囊菌或上述菌剂在制备防治丛枝病药剂中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明针对目前关于竹针孢座囊菌研究在基因分子层面的空缺，提供了一种带有适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子(PtrpC)及增强绿色荧光(EGFP)能够高效表达绿色荧光基因的敲除载体质粒在竹针孢座囊菌基因敲除中的应用。
2.本发明提供了一种根癌农杆菌介导的竹针孢座囊菌遗传转化方法，利用潮霉素筛选标记，通过该方法可得到目的基因插入菌株，有利于对病原菌基因功能研究分析、挖掘致病相关基因、病原菌与宿主互作机制等，可为病害精准防控提供新靶标。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A、B臂琼脂糖凝胶电泳图；其中M:DNA Marker DL2000：1、2:A臂；3、4:B臂；5：空白对照；
图2启动子pTrpc克隆琼脂糖凝胶电泳图；其中M：DNA Marker DL2000；1、2：启动子pTrpc(387bp)；
图3绿色强荧光蛋白EGFP克隆琼脂糖凝胶电泳图；其中M：DNA Marker DL2000；1、2：EGFP(720bp)
图4pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR质粒图谱；
图5A-HYG-B融合PCR的琼脂糖凝胶电泳检测；其中M：DNA Marker DL5000；1、2：A-HYG-B目的片段(2832bp)；
图6pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体双酶切验证电泳检测；其中M：DNAMarker DL15000；1：未酶切
pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B(14312bp)；2、3、4：双酶切pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B(11147bp，2835bp)
图7pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B质粒图谱；
图8pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体转化农杆菌菌液PCR验证；其中M：DNAMarker DL2000；1-18：
pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体转化农杆菌菌液PCR验证(1416bp)
图9潮霉素B工作浓度的选择；
图10一筛平板转化子；
图11含HYG抗性SDA平板(左：转化子；右：野生株)；
图12SDA平板(左：转化子；右：野生株)；
图13ΔattRNA-ipt的琼脂糖凝胶电泳PCR检测；其中M：DNA Marker DL2000；1、2：野生型中目的基因；3、4:ΔattRNA-ipt中目的基因；5、6：潮霉素基因验证
图14ΔattRNA-ipt的琼脂糖凝胶电泳PCR检测；M：DNA Marker DL2000；1、2：ΔattRNA-ipt上游重叠验证(1522bp)；3、4：ΔattRNA-ipt下游重叠验证(1507bp)
图15菌株显微观察；其中DIC：明场；GFP：绿色激发光
具体实施方式
实施例一候选基因左右同源臂克隆
1、A.take基因组DNA的提取
将菌接种到SDA培养基平板上，倒置于25℃培养箱中暗培养7d，于菌落边缘使用0.5cm打孔器打孔，挑取5块菌饼至100ml SDA液体培养基中，25℃，180r/min暗培养5-8d。将培养后的孢子悬液5000rpm，离心5-10min，弃去上清，使用无菌的滤纸把菌丝和孢子的水吸干。按照Sangon Biotech公司真菌基因组DNA快速抽提试剂盒说明书中步骤，提取真菌基因组DNA。
(1)取20mg干燥的菌丝用液氮研磨成粉末，加入到1.5ml离心管中。加入400lBuffer Digestion和4l β－巯基乙醇，震荡混匀。65℃水浴1h至细胞完全裂解。
①水浴过程中，每10min颠倒混匀一次，可促进样品裂解。
②在水浴后加入20l的RNase A(10mg/ml)，室温放置2～5min，去除RNA。
(2)加入200l Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。
(3)室温10,000rpm离心5min，将上清液(500～550l)转移到新的1.5ml离心管中。
(4)加入等体积的异丙醇，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min。室温10,000rpm离心5min，弃上清。
(5)加入1ml 75％乙醇，颠倒漂洗1～3min，10,000rpm离心2min，弃上清。(漂洗时一定要使沉淀悬浮起来)
(6)重复步骤(5)一次。
(7)开盖室温倒置5～10min至残留的乙醇完全挥发。(此步绝不可省略，否则残余的乙醇会严重影响得率和后续实验，如果残留的乙醇有挂壁现象，倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。然后开盖室温放置5～10min至残留的乙醇完全挥发)
(8)得到的DNA用50-100l TE Buffer溶解。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
2、左右臂引物设计
关于A.take全基因组已在本实验室完成测序，利用KEGG细胞分裂素信号通路明确CK合成关键基因，通过GO富集分析结果将差异基因提取出，并在gff3基因位置信息注释文件提取相关位置基因(目的基因，左右臂同源基因)序列信息如表1所示：
表1相关位置基因序列信息
Figure BDA0004222532750000071
根据候选基因位置在其左右各取700bp左右片段作为目的基因两个上下游同源臂A、B片段分别记为(A、B)，利用全基因组测序结果Aciculosporium_take.fasta核酸序列文件提取A、B序列信息，使用软件Primer Premier 5设计引物，送至生工生物公司合成。A、B臂引物序列如表2所示。
表2A、B臂引物序列
Figure BDA0004222532750000072
3、构建目的基因同源臂片段PCR优化实验
由于构建敲除载体目的基因的引物克隆所需PCR条件不能确定，需要优化PCR条件，提高扩增产物的准确性，根据引物Tm值筛选最佳退火温度及时间，因此做了一个梯度PCR，其中退火温度为：50.0℃、50.7℃、51.9℃、53.8℃、56.1℃、58.0℃、59.2℃、60.0℃，退火时间为15sec，根据琼脂糖凝胶电泳条带显示确认最佳反应条件。
4、A、B臂片段扩增
构建扩增片段的酶应用高保真酶，使用艾科瑞生物ApexHF HS DNA聚合酶-FS，以前得到的DNA为模板，利用以上相应基因引物进行PCR扩增反应，如表3所示配制体系，轻轻混匀之后，于PCR扩增仪上按表4所示条件进行扩增，此条件依据2.5.2PCR优化实验所得到的程序，完成之后，扩增产物应保存于4℃条件。
表3高保真酶PCR扩增体系
Figure BDA0004222532750000081
表4PCR扩增条件
Figure BDA0004222532750000082
5、琼脂糖核酸凝胶电泳
(1)凝胶的制备：称取琼脂糖0.8g，置于三角瓶中，加入对应量的1×TAE缓冲液80mL，放入微波炉中加热至琼脂糖全部溶解，取出摇匀，待琼脂糖胶液冷至50℃～60℃后，加入4mL GoldView核酸染料，混匀后倒入插好梳子的电泳板中。室温静置，使之完全凝固。
(2)加样：取25mL PCR产物上样，加样时移液器应与加样孔垂直对准，缓缓地将混合液加入孔中，以GL DNA Marker 2000为对照。
(3)电泳：加样完成后，接通电源，电压设为150V，待溴酚蓝条带移动至距凝胶前沿约5cm左右时，即可切断电源。
(4)观察与拍照：电泳后将凝胶置于BIO-RAD Gel Doc 1000成像系统中成像，所得图片如图1所示，A(703bp)，B(710bp)，各目的条带与预期相符合。
6、DNA凝胶回收
琼脂糖凝胶回收实验使用擎科生物DNA Gel Ectraction Kit试剂盒。
(1)将吸附柱置于收集管中，加入250μL BufferBL,12000×g离心1min，活化硅胶膜；
(2)在365nm长波紫外灯下，用干净刀片将目的条带切下，尽量切除不含目的DNA条带，得到凝胶体积越小越好；
(3)将含有目的DNA条带的凝胶放入2mL离心管中，加入500μL的Buffer GL；
(4)65℃水浴4—6min，每2—3min上下颠倒混匀一次至凝胶完全融化，溶液呈淡黄色；
(5)将溶液转入吸附柱中，12000×g离心1min，弃废液，将吸附柱放回空收集管；
(6)在吸附柱中加入700μL Buffer W2(已加入指定体积的无水乙醇)，12000×g离心1min，弃废液；
(7)重复操作(6)一次；
(8)将吸附柱放回空收集管中，12000×g离心2min；
(9)取出吸附柱，置于干净的1.5mL离心管中，在吸附膜的中间部位加35-50μLEluent(60～65℃预热效果更好)，20-25℃放置2min，12000×g离心2min。
(10)将洗脱下的DNA溶液-20℃保存备用。
7、连接转化感受态，鉴定阳性克隆
(1)连接T载体
将上述胶回收A、B片段连接至T载体pclone007(擎科生物T载体试剂盒)中，反应体系如表5所示：
表5连接载体体系
Figure BDA0004222532750000101
上述连接体系放置于PCR仪中25℃5min，反应完成后立即转化。
(2)转化
使用擎科Trelief 5αChemically Competent Cel进行转化。转化步骤如下：
取100μL冰浴上融化的DH5α大肠杆菌感受态细胞，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min；42℃水浴热激45s，迅速转移至冰浴中，静置2min；向离心管中加入500μL无抗性LB培养液，混匀后37℃，200rmp复苏1h；吸取一定量的复苏液均匀涂布到含有Amp抗生素的LB培养基上，将平板倒置于37℃培养箱过夜培养。
(3)阳性克隆检测
PCR检测：用枪头挑取白色单菌落到10L的无菌水中，吹打混匀后取1L到20L SuperPCR Mix(green)中，使用载体通用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)及M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)，进行菌落PCR验证，PCR程序如下表6所示。
表6pcr程序
Figure BDA0004222532750000111
测序验证：使用载体通用引物M13F(TGTAAAACGACGGCCAGT)及M13R(CAGGAAACAGCTATGACC)送擎科生物公司测序比对，并返回阳性克隆A、B质粒。
二、本发明敲除载体的构建
(一)启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP、潮霉素B磷酸转移酶HYG全长克隆
1、引物设计
(1)启动子pTrpc基因序列，利用pCAMBIA1300ura-GFP-BAR起始载体质粒为模板，设计扩增启动子特异性引物：
PTrpc-F：GTCGACAGAAGATGATATTGAAGG
PTrpc-R：CGAAGCGTTGCTTGGGTAGAATA
(2)绿色强荧光蛋白EGFP基因序列，利用pEGFP-N1载体质粒为模板，设计扩增EGFP特异性引物：
EGFP-F：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA
EGFP-R：TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC
(3)潮霉素B磷酸转移酶HYG基因序列，由生工生物公司合成，长度1416bp，以返回质粒为模板，设计扩增HYG特异性引物：
HYG-F：GTCGACAGAAGATGATATTGAAGG
HYG-R：TTACTATTCCTTTGCCCTCGGAC
2、启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP基因序列PCR扩增
构建启动子pTrpc扩增片段的酶应用高保真酶，使用艾科瑞生物ApexHF HS DNA聚合酶-FS，如表3所示配制体系，轻轻混匀之后，于PCR扩增仪上反应程序如表7所示。
表7反应程序
Figure BDA0004222532750000121
Figure BDA0004222532750000131
构建绿色荧光蛋白EGFP扩增片段的酶应用高保真酶，使用艾科瑞生物ApexHF HSDNA聚合酶-FS，如表3所示配制体系，轻轻混匀之后，于PCR扩增仪上反应程序如表8所示。
表8反应程序
Figure BDA0004222532750000132
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，电泳图如图2、3所示，将上述胶回收片段连接至T载体pclone007(擎科生物T载体试剂盒)中，并使用擎科Trelief 5αChemically Competent Cel DH5α感受态进行转化，37℃培养、挑单菌落并通过菌液PCR鉴定阳性克隆，对菌液进行质粒提取与保存。
3、根据启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP基因序列及重组到起始载体pCAMBIA1300ura-GFP-BAR上的相应位置及其方向设计含有载体部分序列的接头引物(下列横线标记)，使扩增产物之间以及扩增产物及线性化克隆载体之间能够相互同源重组的完全一致的序列，PCR反应程序同上。
PTrpc-F’:GAACCCAATCTTCAAACCTAGGGTCGACAGAAGATGATATTGAAG G
PTrpc-R’:GCCCTTGCTCACCATCGAAGCGTTGCTTGGGTAGAATA
EGFP-R’:TTCAGTAACGTTAAGTGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC
(二)载体启动子及绿色强荧光蛋白改造
1、起始载体质粒pCAMBIA1300ura-GFP-BAR线性化
将该质粒通过限制性内切酶AvrⅡ和BamHⅠ进行双酶切后形成粘性末端，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物保存于-20℃冰箱；
2、利用ClonExpress Cltra One Step Cloning Kit多片段重组克隆试剂盒将启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP与pCAMBIA1300ura-GFP-BAR质粒连接与转化
(1)线性化载体与插入片段的使用量
使用Onedrop等基于吸光值的仪器进行浓度测定，但只有当A260/A280在1.8-2.0之间时浓度值可信。
pCAMBIA1300ura-GFP-BAR线性化载体使用量：0.02×12063(bp)＝241.26ng(最大使用量200ng)；
绿色强荧光蛋白EGFP插入片段最适使用量：0.02×720(bp)＝14.4ng
启动子pTrpc插入片段最适使用量：0.02×387(bp)＝7.74ng
(2)连接反应
于冰上按表9配制反应体系：
表9反应体系配方
Figure BDA0004222532750000141
Figure BDA0004222532750000151
使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底，50℃反应15min，降至4℃或立即置于冰上冷却。
(3)重组产物转化：同前DH5α大肠杆菌感受态转化步骤。
(4)重组产物菌落PCR并送菌液至擎科生物公司进行测序比对，提取质粒后续使用，命名为pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR重组载体(EGFP启动子为pTrpc)，载体图谱如图4，红线部分为插入序列。
(三)敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B的构建
1、引物设计
根据A、B、HYG序列及pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR序列，设计A、B、HYG含融合PCR接头且能使片段与线性化克隆载体相互同源重组的序列(下划线为接头序列其中加粗为酶切位点，A臂上游为AscⅠ、B臂下游为XhoⅠ)。
A-F’：ACTCCACATCTCCACGGCGCGCCCGTTAGCACCCAGGTTTCTTG
A-R：TTGCAGATGGAGGTTCTAGGAG
HYG-F’：TAGAACCTCCATCTGCAAGTCGACAGAAGATGATATTGAAGG
HYG-R：TTACTATTCCTTTGCCCTCGGAC
B-F’：AGGGCAAAGGAATAGTAATGTCTGTTCGAGCTGATACT
B-R’：CAATTTTCTAGATGCATGCTCGAGGAGAAGATGGCAGAAGTG
2、A-HYG-B融合片段PCR扩增
以A、HYG、B克隆质粒DNA为模板，使用ApexHF HS DNA聚合酶-FS高保真酶扩增长度2832bp的融合片段，反应体系如表10所示。
表10反应体系配方
Figure BDA0004222532750000161
反应程序如表11所示。
表11反应程序
Figure BDA0004222532750000162
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，电泳图如图5所示，条带2832bp与目的A-HYG-B融合片段长度相符合。
3、利用ClonExpress II单片段重组克隆试剂盒将A-HYG-B融合片段与pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR质粒连接与转化
(1)pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR重组载体线性化
将该质粒通过限制性内切酶AscⅠ、XhoⅠ进行双酶切后形成粘性末端，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，并用胶回收试剂盒回收酶切产物，回收产物保存于-20℃冰箱待使用；
(2)线性化载体与插入片段的使用量
pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR线性化载体使用量：0.02×13947(bp)≈200ng(最大使用量)；
A-HYG-B融合片段最适使用量：0.04×2832(bp)＝113.28ng
(3)连接反应
于冰上按表12配制反应体系：
表12反应体系配方
Figure BDA0004222532750000171
使用移液器轻轻吸打混匀(请勿振荡混匀)，短暂离心将反应液收集至管底，37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
(4)重组产物转化：同前DH5α大肠杆菌感受态转化步骤。
(5)重组产物菌液PCR及利用限制性内切酶AscⅠ、XhoⅠ进行双酶切分析鉴定电泳图如图6所示，双酶切得到两个条带分别是11147bp及2835bp，该结果与双酶切所得两个片段长度相符，证明敲除载体构建成功。并送菌液至擎科生物公司进行测序比对均正确，提取质粒后续使用，命名为pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体，载体图谱如图7所示，红线部分为插入序列。
三、农杆菌介导敲除载体转化A.take野生型菌株
(一)敲除载体转化农杆菌
取-80℃保存的农杆菌AGL1感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中；每100μL感受态加入1μgpCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体质粒，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5分min、冰浴5min；加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2-3h；6000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含50μg/ml kan，20μg/ml rif的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3d，挑取单菌落进行PCR验证，获得含敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B的农杆菌，并置于-80℃超低温冰箱保存，农杆菌菌液PCR验证电泳图如图8所示，所用引物为HYG-F、HYG-R该条带大小与目的条带相符(1416bp)，可以证明敲除载体已经转入农杆菌，可用于后续实验。
(二)A.take孢子的获取
取生长状况良好的于SDA固体培养基生长8d的A.take，在超净工作台内用无菌水冲洗培养基表面，三层滤纸过滤得到孢子悬液，血球计数板计数。调整孢子数约为1×106CFC/mL。
(三)A.take菌株对潮霉素抗生素的敏感性
根癌农杆菌介导的A.take菌株遗传转化，选用合适的潮霉素浓度，对选择敲除突变体至关重要，A.take野生菌株孢子悬浮液(1×106CFC/mL)滴5μL于含不同浓度潮霉素(0，100，200，300，400，500，600，700，800μg/mL)的SDA平板中央，25℃培养7d，观察菌落生长情况，每个浓度梯度重复三次，确定潮霉素最低抑制浓度，结果如图9，可见潮霉素浓度增长的同时，菌落数逐渐减少，而在400μg/mL浓度的平板上无菌落生长。因此，为了实验效果更理想，选择潮霉素的筛选抑制浓度为500μg/mL。
(四)含载体的农杆菌与A.take野生型菌株共培养转化
(1)将含有重组质粒pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B的农杆菌菌液在含50μg/mLKan和20μg/mL Rif的LB固体培养基上划线，28℃黑暗培养2—3d。挑取单菌落于1mL含50μg/mL Kan和20μg/mL Rif的LB液体培养基中，28℃条件下200r/min振荡培养过夜。
(2)离心收集浑浊农杆菌菌体，用IM液体培养基重悬菌体(含50μg/mL Kan和20μg/mL Rif)，稀释菌液浓度至OD600＝0.15左右，继续200r/min避光振荡培养5—6h，至OD600＝0.5左右；用IM液体培养基冲洗PDA培养基上培养7d左右的A.take野生型菌株的孢子，使用microcloth滤布过滤收集孢悬液，600rpm离心1min收集孢子，离心后用IM培养基(含乙酰丁香酮AS 400μmol/L)重悬孢子至所需浓度为107CFC/mL，继续利用IM液体培养基(含AS 400μmol/L)180r/min振荡萌发6h。
(3)取200μL农杆菌菌液和200μL孢子菌悬液加入1.5mlIM液体培养基(含AS 400μmol/L)，25℃，180r/min培养过夜预诱导。将混合溶液离心弃上清，取100μL培养液涂布于含有玻璃纸的IM共培养固体培养基(含400μmol/L AS和1mg/mL MES)，在无菌操作台中吹干后，置于25℃正置避光培养3d。
(4)3d后将玻璃纸揭起正面朝上放于新的SDA一筛培养皿中，含有200μg/mL Cef和500μg/mL HYG，25℃倒置培养5-7d，直至有转化子长出，如图10所示。
(6)将一筛平板得到的转化子，挑出转入含200μg/mL Cef和600μg/mL HYG的SDA平板中(二筛平板)继续培养3—5d，仍能正常生长的可以初步认定是阳性转化子，随之将筛选转化子转至普通SDA培养一代，再转回二筛平板，野生株和转化子在带有600μg/mL HYG的SDA平板及不含抗生素SDA平板上对照如图11、图12所示，野生株在含有HYG抗性的平板上不生长而转化子正常生长，不含抗生素SDA平板上野生株和转化子都能正常生长。
(五)验证
随之对筛选平板上敲除突变子进行PCR验证及荧光观察。
(1)活化由潮霉素筛选的初筛转化子，用利用生工生物真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提转化子的基因组DNA。以转化子基因组DNA为模板，利用特异性引物HYG-F和HYG-R扩增HYG抗性基因，确认潮霉素抗性基因转入后，利用引物IPT-F和IPT-R扩增敲除片段基因attRNA-ipt，初步确认敲除转化子，所用引物及验证结果如图13所示。
IPT-F:ATGCTCGACTTTCTACGAC
IPT-R:CTGCCTCTGGAGTGGAAG
结果说明：获得attRNA-ipt敲除转化子，以该转化子DNA为模板，利用特异性引物HYG-F和HYG-R扩增HYG抗性基因(1416bp)，利用特异性引物IPT-F和IPT-R扩增敲除片段基因(1520bp)，WT可以扩增出敲除片段基因，敲除转化子可以扩增出HYG抗性基因，不能扩增敲除片段基因，各目的条带大小正确，说明attRNA-ipt基因被HYG抗性基因替换，初步确认转化子为敲除转化子。
(2)以上述敲除转化子基因组DNA为模板，以构建敲除载体的左臂在A.take基因组中的上游和敲除载体的HYG抗性基因中间序列分别设计正反引物，PCR扩增，确认敲除载体的左臂是否进行正确替换。同理，以敲除载体右臂在A.take基因组中的下游序列和敲除载体的HYG抗性基因中间序列设计引物，PCR扩增，确认敲除载体的右臂是否进行正确替换。如果pCAMBIA1300ura-eGFP-A-HYG-B敲除载体上的同源基因与A.take基因组中的基因发生正确交换，也就是以上PCR反应均能扩增成功，则说明转化子为敲除突变体，所用引物及验证结果如图14所示。
A-F：CGTTAGCACCCAGGTTTCTTG；-H-R：GTATTGACCGATTCCTTGCG
-H-F：TTGACATTGGGGAATTCAGC；B-R：GAGAAGATGGCAGAAGTGTG
结果说明：接着利用在左臂上游序列与HYG基因内部分别设计的正义引物A-F及反义引物-H-R，在HYG基因内部和右臂下游序列分别设计的正义引物-H-F和反义引物B-R，进行PCR扩增，结果如图所示，两对引物均能扩出目的片段上游重叠序列(1522bp)和下游重叠序列(1507bp)，说明敲除载体pCAMBIA1300ura-eGFP-A-HYG-B上的A和B与attRNA-ipt基因的上下游进行了正确替换，获得attRNA-ipt敲除突变体菌株。
(3)将此敲除转化子挑取置于无菌水中，用枪头打散后取一滴于蔡司显微镜下观察GFP，得到了强烈绿色荧光且荧光特性稳定的菌株，说明带EGFP敲除载体导入野生菌株并能正常表达，结果如图15所示。

Claims (8)

1.一种竹针孢座囊菌(Aciculosporium take)，其特征在于，所述竹针孢座囊菌在2023年03月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2023413。
2.一种如权利要求1所述的竹针孢座囊菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)候选基因左右同源臂克隆
提取Aciculosporium take真菌基因组DNA，扩增候选基因左右同源臂A、B臂片段；
(2)敲除载体的构建
a带有适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子PtrpC及增强绿色荧光EGFP能够高效表达绿色荧光基因的重组载体pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR的构建：利用pCAMBIA1300ura-GFP-BAR起始载体质粒为模板克隆启动子pTrpc基因序列，pEGFP-N1载体质粒为模板扩增并克隆绿色强荧光蛋白EGFP基因序列；将起始载体质粒pCAMBIA1300ura-GFP-BAR通过限制性内切酶AvrⅡ和BamHⅠ进行双酶切线性化，将启动子pTrpc、绿色强荧光蛋白EGFP与pCAMBIA1300ura-GFP-BAR连接与转化；
b敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B的构建：根据A、B、HYG序列及pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR序列，设计A、B、HYG含融合PCR接头且能使片段与线性化克隆载体相互同源重组的序列；以A、HYG、B克隆质粒DNA为模板，使用ApexHF HSDNA聚合酶-FS高保真酶扩增长度2832bp的融合片段；将pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR重组载体线性化形成粘性末端，将A-HYG-B融合片段与pCAMBIA1300ura-EGFP-BAR质粒连接与转化，构建敲除载体pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B；
(3)农杆菌介导敲除载体转化Aciculosporium take野生型菌株
a将pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B敲除载体质粒转化至农杆菌AGL1感受态细胞；
b Aciculosporium take野生菌株对潮霉素抗生素的敏感性实验：制备含不同浓度潮霉素的培养基，观察Aciculosporium take野生菌株的生长状况，选择完全抑制浓度作为筛选转化子最佳条件；
c含载体的农杆菌与Aciculosporium take野生型菌株共培养转化：利用农杆菌介导技术将基因敲除片段pCAMBIA1300ura-EGFP-A-HYG-B转化至Aciculosporium take野生型菌株；
d对筛选平板上转化子进行PCR验证及荧光观察验证。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述扩增候选基因左右同源臂片段的引物包括扩增A臂的引物和扩增B臂的引物。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述扩增A臂的引物包括如SEQ IDNO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述扩增B臂的引物包括如SEQ IDNO.3所示的上游引物和如SEQ ID NO.4所示的下游引物。
6.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的竹针孢座囊菌。
7.如权利要求1所述竹针孢座囊菌在研究竹丛枝病菌与寄主互作机理中的应用。
8.如权利要求6所述菌剂在制备防治丛枝病药剂中的应用。
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