CN104039755A - 由昆虫病原真菌分离的脂类杀虫剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了杀虫剂脂类以及包含该脂类或脂类级份的组合物，以及它们的制备方法。此外，还提供了使用所述的脂类或包含该脂类的组合物、以及可任选地一种或多种杀虫剂或昆虫病原试剂(包括昆虫病原真菌)用于对昆虫(例如植物病原昆虫)进行生物控制的方法。

Description

由昆虫病原真菌分离的脂类杀虫剂及其用途

技术领域

本发明总体而言涉及生物领域，更具体而言，本发明涉及某些实施方案，这些实施方案与脂类(包括由丝状真菌制备的脂类)、包含该脂类的组合物、以及该脂类和组合物作为生物控制剂的用途有关。此外，本发明还提供了使用所述的脂类和包含该脂类的组合物来控制昆虫(包括植物病原昆虫)的方法。

背景技术

控制昆虫和昆虫种群的能力对于人类和动物的健康、农业以及广泛的经济活力而言是非常重要的。例如，昆虫是多种重要的人类疾病的携带者：蚊子是疟疾、西尼罗病毒病和登革热的携带者；蜱为立克次氏体病的携带者，例如斑疹伤寒、非洲蜱咬热和莱姆病；而跳蚤为瘟疫的携带者。同样，由虫害和病原体(统称为“植物病原体”)引起的植物疾病或损失会给植物基农业和工业带来显著的经济成本。通过收获前和收获后产品的破坏、植物本身的损失或生长及生产能力的降低可以产生损失。

传统上，通过使用化学杀虫剂对昆虫(例如植物害虫和病原体)持续进行大规模的控制，此外，还可以使用物理方法(例如诱捕、挑拣、阻隔)。使用化学品具有很多缺点。诸如植物害虫和病原体之类的昆虫在经过一段时间后可以并发展成对化学品耐受，从而产生抗性种群。事实上，对杀虫剂具有抗性对于植物基农业和工业(例如园艺工业)的生存能力而言都是最大的挑战。

参照多种经济重要性的植物病原昆虫具体说明所述的问题。广泛地报道西花蓟马种群对大部分种类的杀虫剂具有抗性，包括以下实例：高灭磷、阿巴美丁、毒死蜱、硫丹、灭多虫、灭多威、氧乐果、定菌磷和氟胺氰菊酯。在新西兰，洋葱蓟马种群发展出对溴氰菊酯的抗性，并报道当地的种群对二嗪农和敌敌畏的抗性。已经报道在美国，洋葱蓟马对许多杀虫剂具有抗性(Grossman,1994)。温室粉虱被报道发展出对有机氯、有机磷、氨基甲酸盐和拟除虫菊酯杀虫剂的抗性(例如Georghiou1981,Anis&Brennan1982,Elhag&Horn1983,Wardlow1985,and Hommes1986)。此外，还报道了对新近的杀虫剂(稻虱净和氟苯脲)的抗性(Gorman et al.2000)。

此外，化学品残余物还产生了环境危害，并引发健康关注。过去的20年，生物控制(例如微生物杀虫剂)的重要复兴直接源自于关注化学品毒性的公众压力。生物控制提出了控制植物病原体的备选手段，与当前的方法相比，其可能是更有效且特异性的，并减轻了对化学品的依赖。这种生物控制方法被理解为是化学品杀虫剂的“天然”备选方法，其优点是公众接受更高、环境污染降低并且持续性增加。

生物控制的机制是多样的。已经证明有效的一种机制为使用拮抗微生物有机体，例如控制植物病原昆虫的细菌。例如，在新西兰的奥克兰，大规模生产苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)可以使用这种细菌杀虫剂来控制澳古毒蛾(Paintedapplemoth)。

然而，成功应用生物控制剂(BCA)的实例较少，并且BCA时代还没有得到多数种植者的接受，而且被认为可能是不经济的。

因此，需要有效地控制昆虫(包括植物病原昆虫)的试剂和方法，特别是这样的试剂，与当前使用的杀虫剂相比，其起效快、控制昆虫的效力增加、使用频率或强度较低、低成本或者得到较低的毒性。

因此，本发明的目的为想办法来满足这种需要，从而提供用于控制昆虫和昆虫种群(包括植物病原昆虫)、或者至少为公众提供使用选择的一种或多种试剂。

发明概述

本发明提供了杀虫脂类及其制备方法。这些脂类与已知的杀虫剂的不同之处表明它们包含一类新的杀虫剂。

因此，在第一个方面中，本发明涉及用于控制一种或多种昆虫的、式I所示的经分离、纯化或基本纯的脂类：

其中R₁和R₂可以相同或不同，且均为脂肪酸的脂肪族部分，并且其中R₃、R₄和R₅均独立地选自这样的组，该组包含或由H、羟基、羧基、酰胺基、未取代的或取代的烷基、未取代的或取代的烯基、未取代的或取代的炔基、以及未取代的或取代的芳基部分组成。

在一个实施方案中，R₁和R₂独立地选自这样的组，该组包含C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C18单不饱和脂肪酸以及C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁和/或R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁和/或R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁和/或R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁和/或R₂为为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁和/或R₂为为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。在另一个实施方案中，R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分，并且R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

在一个实施方案中，R₃、R₄、R₅均为H或甲基。在另一个实施方案中，R₃、R₄、R₅均为甲基。

在一个实施方案中，脂类为甜菜碱脂类。

在一个实施方案中，脂类为l,2-二酰基甘油基-3-O-4'-(N,N,N-三甲基)-高丝氨酸(二酰基甘油基-N,N,N-三甲基高丝氨酸,DGTS)。在另一个实施方案中，脂类为1,2-二酰基甘油基-3-O-2'-(羟甲基)-(N,N,N-三甲基)-β-丙氨酸、或1,2-二酰基甘油基-3-O-羧基-(羟甲基)-胆碱。

本发明提供了包含本文所公开的一种或多种脂类、以及至少一种药物或农业可接受的载体的组合物和配制物，包括包含一种或多种本发明的脂类以及一种或多种真菌的组合物和配制物。此类组合物可以为细胞提取物、细胞悬浮物、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或者生产此类脂类的细胞的细胞团。在某些示例性的实施方案中，例如通过纯化或添加而使所述的组合物富集有一种或多种本发明的脂类。在另一个示例性的实施方案中，所述的组合物包含一种或多种本发明的添加的脂类。例如，在一个实施方案中，所述的组合物为上文所述的其中添加有一种或多种本发明的脂类的细胞提取物、细胞悬浮物、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或者细胞团。

因此，在第二个方面中，本发明涉及包含本发明的一种或多种脂类、以及一种或多种载体的组合物。

在另一个方面中，本发明提供了植被具有对抗昆虫(例如吸啜昆虫或甲虫类昆虫、双翅昆虫、或鳞翅类昆虫)的杀虫活性的脂类的方法。该方法总体涉及由合适的细胞培养物(例如一种或多种子囊菌门真菌的培养物)分离本文所述的一种或多种脂类。在某些实施方案中，所述的细胞在或者已经在能够支持菌丝生长的条件下生长。此类脂类可以由细胞培养物或上清液、或者由细胞培养物衍生的孢子悬浮物分离，并以天然形式使用，或者可以以其他方式纯化或浓缩成适用于特定的应用。

此外，本发明还提供了控制昆虫种群的方法。该方法总体涉及将所述的种群与本文所述的有效杀虫量的脂类接触。该方法可以用于杀死或减少给定地区的目标昆虫的数量，或者可以预防性地用于诸如环境地区之类的场所，从而防止被易感昆虫入侵。

在另一个方面中，本发明提供了用于生产生物控制组合物的方法，该方法包括：

提供一种或多种子囊菌门真菌的培养物；

将该培养物保持在适用于生产至少一种本发明的脂类的条件下；以及

i)将本发明的至少一种脂类与载体结合；或者

ii)将本发明的至少一种脂类与本文所述的一种或多种昆虫病原真菌结合；或者

iii)由一种或多种真菌的培养物分离本发明的至少一种脂类；或者

iv)至少部分纯化或分离本发明的至少一种脂类；或者

v)(i)至(iv)的两项或多项的任意组合。

在一个实施方案中，所述的组合物包含多种真菌、真菌的培养物或者如上文所述的其中添加有本发明的脂类的、真菌培养物的上清液。

本发明进一步涉及本发明的脂类或本发明的组合物用于控制一种或多种昆虫(例如一种或多种植物病原昆虫)的用途。本发明的脂类在制造用于控制一种或多种昆虫的组合物中的用途同样被考虑在内。

在另一个方面中，本发明提供了控制一种或多种昆虫的方法，该方法包括将一种或多种昆虫与本发明的脂类或其功能变体接触。

本发明进一步涉及控制一种或多种昆虫(例如一种或多种植物病原昆虫)的方法，该方法包括将本发明的脂类或其功能变体以及可任选的本文所述的至少一种昆虫病原真菌一起施加到诸如植物或其周围之类的场所中。

在另一个方面中，本发明提供了完全或部分逆转昆虫对一种或多种杀虫剂或一种或多种昆虫病原试剂的抗性的方法，该方法包括将昆虫与本发明的脂类接触。

可任选地，所述的方法包括将昆虫与本发明的脂类以及一种或多种杀虫剂、或一种或多种昆虫病原试剂、或它们的任意的组合一起接触。

在不同的实施方案中，所给予的一种或多种杀虫剂或一种或多种昆虫病原试剂与昆虫对其具有或预计具有或成为具有抗性的那些是相同的。

在另一个方面中，本发明提供了使用一定量的有效的控制一种或多种昆虫的杀虫剂或昆虫病原试剂来控制所述的一种或多种昆虫的方法，其中所述的昆虫已经与一种或多种本发明的脂类接触。

一种或多种杀虫剂或者一种或多种昆虫病原试剂可以在本发明的脂类之前、同时或之后给予。因此，本发明的一种或多种脂类与一种或多种杀虫剂或昆虫病原试剂的给予可以是同时、依次或分开的。

在另一个方面中，本发明提供了完全或部分逆转昆虫对一种或多种杀虫剂或者一种或多种昆虫病原试剂的抗性的方法，该方法包括将一种或多种昆虫与本发明的昆虫病原真菌、以及可任选的杀虫剂或昆虫病原试剂一起接触。

在一个实施方案中，所述的方法包括将一种或多种昆虫与昆虫病原真菌、以及本发明的一种或多种脂类一起接触。

以下实施方案可以涉及本文所述的这些方面的任一方面。

在一个实施方案中，至少一种真菌为粪壳菌纲，包括以下一种或多种真菌的亚纲：肉座菌亚纲，例如冠囊菌目、肉座菌目、黑孢壳目或小子囊菌目的一种或多种真菌；粪壳菌亚纲，包括团壳菌目、美球菌目、剌球菌目、间座壳菌目、间座壳菌目、长喙壳菌目、蛇口菌目、粪壳菌目的一种或多种真菌；炭角菌亚纲，包括炭角菌目的真菌以及Koralionastetales、路霉目、小煤炭菌目、黑痣菌目和假毛球壳目的真菌。

在一个实施方案中，所述的一种或多种真菌为肉座菌目，例如生赤壳科、麦角菌科、肉座菌科、丛赤壳科、Niessliaceae或蛇形虫草科的一种或多种真菌。

在一个实施方案中，所述的一种或多种真菌为麦角菌科，包括得自以下属的一种或多种真菌：Aciculosporium、Ascopolyporus、Atkinsonella、Atricordycep、瘤座菌属、Berkelella、Cavimalum、Cepsiclava、麦角菌属、Cordycepioideus、虫草属、Dussiella、香柱菌属、Epicrea、Helminthascus、Heteroepichloe、Hyperdermium、亚肉座菌属、Konradia、Loculistroma、泛虫草菌属、Moelleriella、Mycomalmus、Myriogenospora、Neobarya、Neoclaviceps、新虫草亚属、Parepichloe、Phytocordyceps、Podocrella、Regiocrella、Romanoa、Shimizuomyces、Sphaerocordyceps、Stereocrea、Torrubiella、Wakefieldiomyces、刺束梗孢属、座壳孢属、白僵菌属、Chaunopycnis、珊座孢新属、蚊霉属、掘氏梅里属、青茅斑穗病菌属、球束梗孢属、Haptocillium、钩丝孢属、被毛孢属、层束梗孢属、棒束孢属、蜡蚧属、Mariannaea、绿僵菌属、小脐霉属、Neomunkia、Neotyphodium、蛾霉菌属、拟青霉属、Pochonia、Polycephalomyces、拟球束梗孢属、拟青霉属、小团孢属、Tolypocladium或绿核菌属。

例如，一种或多种真菌为白僵菌属，例如包括球孢白僵菌(球孢白僵菌)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、Beauveria felina、或球孢白僵菌(Beauveria globulifera)的一种或多种菌株。

在另一个实施方案中，所述的一种或多种真菌为肉座菌科，包括得自以下属的一种或多种真菌：Aphysiostroma、Cladobotryum、Gliocladium、肉座菌属、类肉座菌属、Hypomyces、Mycogone、肉棒菌属、Protocrea、Rogersonia、Sarawakus、瘤孢菌属、Sphaerostilbella、Sporophagomyces、冠孢属或木霉属。

在一个实施方案中，所述的一种或多种真菌为木霉属，包括以下真菌的一种或多种：侵占木霉(Trichoderma aggressivum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、黄绿木霉(Trichoderma aureoviride)、Trichoderma austrokoningii、脐孢木霉菌(Trichoderma brevicompactum)、Trichoderma candidum、Trichodermacaribbaeum var.aequatoriale、Trichoderma caribbaeum var.caribbaeum、Trichoderma catoptron、奶油木霉(Trichoderma cremeum)、Trichodermaceramicum、Trichoderma cerinum、Trichoderma chlorosporum、Trichodermachromospermum、Trichoderma cinnamomeum、桔绿木霉(Trichodermacitrinoviride)、Trichoderma crassum、奶油木霉、Trichoderma dingleyeae、Trichoderma dorotheae、Trichoderma effusum、Trichoderma erinaceum、Trichoderma estonicum、Trichoderma fertile、Trichoderma gelatinosus、加纳木霉(Trichoderma ghanense)、钩状木霉(Trichoderma hamatum)、Trichoderma harzianum、哈茨木霉(Trichoderma helicum)、Trichodermaintricatum、康长木霉(Trichoderma konilangbra)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、拟康氏木霉(Trichoderma koningiopsis)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、Trichoderma longipile、微孢木霉(Trichodermaminutisporum)、Trichoderma oblongisporum、Trichoderma ovalisporum、Trichoderma petersenii、Trichoderma phyllostahydis、Trichoderma piluliferum、Trichoderma pleuroticola、平菇木霉(Trichoderma pleurotum)、多孢木霉(Trichoderma polysporum)、拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)、Trichoderma pubescens、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Trichodermarogersonii、俄罗斯木霉(Trichoderma rossicum)、土星孢木霉(Trichodermasaturnisporum)、Trichoderma sinensis、Trichoderma sinuosum、木霉属菌种MA3642、木霉属菌种PPRI3559、螺旋木霉(Trichoderma spirale)、Trichoderma stramineum、Trichoderma strigosum、哈茨木霉(Trichodermastromaticum)、Trichoderma surrotundum、Trichoderma taiwanense、Trichoderma thailandicum、Trichoderma thelephoricolum、Trichodermatheobromicola、Trichoderma tomentosum、Trichoderma velutinum、绿木霉(Trichoderma virens)、绿色木霉(Trichoderma viride)、Trichodermaviridescens；或一种或多种肉座菌菌种，包括Hypocrea phyllostachydis。

在不同的实施方案中，所述的一种或多种真菌为选自以下的一种或多种菌株：球孢白僵菌K4B3 NMIA No.V08/025855的，或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉(Lecanicillium muscarium)菌株K4V1(NMIA No.NM05/44593)，或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA编号No.NM05/44594)，或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA编号No.NM06/00007)，或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA编号No.NM05/44595)，或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA编号No.NM06/00010)，或具有其鉴别特征的菌株；长孢蚧霉(Lecanicillium longisporum)菌株KT4L1(NMIA编号No.NM06/00009)，或具有其鉴别特征的菌株；以及玫烟色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)菌株K4P1(NMIA编号No.NM06/00008)，或具有其鉴别特征的菌株。

在不同的实施方案中，由子囊菌门的真菌获得的或可由子囊菌门的真菌获得的组合物或分离物包含至少大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99重量％的脂类，并且可用的范围可以在这些值的任一者之间选择(例如大约1至大约99、大约5至大约99、大约15至大约99、大约20至大约99、大约25至大约99、大约30至大约99、大约35至大约99、大约40至大约99、大约45至大约99、大约50至大约99、大约55至大约99、大约60至大约99、大约65至大约99、大约70至大约99、大约75至大约99、大约80至大约99、大约85至大约99、大约90至大约99重量％)。

应该理解的是本文使用的任何组合物或分离物都包括由包含子囊菌门的一种或多种真菌或者可由包含子囊菌门的一种或多种真菌得到的组合物和分离物，并且可以由其中存在子囊菌门的一种或多种真菌、或开始存在但其后被除去的培养物获得。

在一个实施方案中，本文使用的组合物包含至少大约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mg/mL的脂类，并且可用的范围可以在这些值的任一者之间选择(例如大约0.01至大约1.0、大约0.01至大约10、大约0.01至大约20、大约0.01至大约30、大约0.01至大约40、大约0.01至大约50、大约0.01至大约60、大约0.01至大约70、大约0.01至大约80、大约0.01至大约90、大约0.01至大约100、大约0.1至大约1.0、大约0.1至大约10、大约0.1至大约20、大约0.1至大约30、大约0.1至大约40、大约0.1至大约50、大约0.1至大约60、大约0.1至大约70、大约0.1至大约80、大约0.1至大约90、大约0.1至大约100、大约0.7至大约1.0、大约0.7至大约10、大约0.7至大约20、大约0.7至大约30、大约0.7至大约40、大约0.7至大约50、大约0.7至大约60、大约0.7至大约70、大约0.7至大约80、大约0.7至大约90、或者大约0.7至大约100mg/mL)。

生产本发明的一种或多种脂类的示例性真菌细胞包括于2008年10月14日在澳洲国家计量研究院(National Measurement Institute of Australia(NMIA))以编号No.V08/025855保藏的球孢白僵菌菌株K4B3，或具有其鉴别特征的培养物；球孢白僵菌菌株AM2、球孢白僵菌菌株F480、木霉属分离物1328、绿僵菌菌种、或具有它们任意一者的鉴别特征的菌株。

在一个实施方案中，本发明涉及制备杀虫剂脂类的方法，该方法包括：提供子囊菌门的一种或多种真菌培养物的有机溶剂提取物；

由一种或多种其他化合物至少部分分离一种或多种脂类；以及

回收一种或多种脂类。

在一个实施方案中，本发明涉及制备杀虫剂脂类的方法，该方法包括：

提供子囊菌门的一种或多种真菌培养物的有机溶剂提取物；

由一种或多种其他化合物至少部分分离一种或多种脂类；以及

回收一种或多种脂类。

在某些实施方案中，由子囊菌门的真菌制备具有杀虫剂活性的脂类的方法基本如本文所述。

在一个示例性的实施方案中，有机溶剂为或包含氯仿。例如，有机溶剂包含甲醇和氯仿。在另一个实施方案中，有机溶剂为二氯甲烷。

在不同的实施方案中，有机溶剂为包含短链烷基醇的烷醇，例如但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丁醇；或者为氯仿。

在不同的实施方案中，有机溶剂为农业可接受的载体，包括本文所述的载体。

在不同的实施方案中，所述的分离为色谱法，包括阴离子交换色谱和薄层色谱。在一个示例性的实施方案中，阴离子交换色谱为DEAE-Sephadex。

本发明的组合物可以配制成粉末、粉剂、丸、颗粒、喷雾、乳化剂、胶体、溶液等，并且可以通过传统手段分离，例如包含脂类的细胞培养物的干燥、冻干、均化、提取、过滤、离心、沉淀或离心。在包含至少一种所述的杀虫剂脂类的示例性组合物的实施方案中，脂类以大约1重量％至99重量％的浓度存在。

优选的是，所述的组合物可以由本文所述的球孢白僵菌的一种或多种培养物获得。示例性杀虫剂脂类的配制物可以通过包含以下步骤的工艺来制备：在有效生产菌丝的条件下培养合适的球孢白僵菌菌株K4B3细胞；提供至少部分纯化的菌丝；以及由该菌丝获得一种或多种脂类。

在另一个实施方案中，本发明提供了制备杀虫剂脂类组合物的方法。在示例性的实施方案中，所述的脂类可以配制用作杀虫剂，并且可以用于控制环境中的昆虫种群，包括农业环境等。在一些实施方案中，配制物可以通过局部应用或者通过使昆虫摄取脂类组合物而用于杀死一种或多种昆虫或昆虫的种群。在其他实施方案中，配制物可以通过局部应用或者通过使昆虫摄取肽组合物而用于拮抗一种或多种昆虫或昆虫的种群。在某些实例中，理想的是配制本发明的脂类以用于土壤，植物、树、灌木等上或其附近，活的植物附近，家畜、住所、农用设备、建筑物等。

在包含本发明的一种或多种脂类、以及一种或多种真菌的组合物的不同实施方案中，一种或多种真菌为具有可再生能力的形式和量。

在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其包含本文所述的一种或多种脂类、由至少一种真菌得到的孢子、以及至少一种载体。

优选的是，所述的组合物为生物控制组合物，更优选的是，所述的生物控制组合物为杀虫剂组合物。

优选的是，所述的生物控制组合物包含至少一种农业可接受的载体。

优选的是，所述的至少一种载体为农业可接受的载体，更优选的是选自填料刺激剂、抗结块剂、润湿剂、乳化剂、抗氧化剂，更优选的是，所述的组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、润湿剂、乳化剂和抗氧化剂的各底物的至少一种。

优选的是，所述的填料刺激剂为碳水化合物源，例如二糖，例如包括蔗糖、果糖、葡萄糖或右旋葡萄糖；所述的抗结块剂选自滑石、二氧化硅、硅酸钙或高岭土；所述的润湿剂为脱脂奶粉；所述的乳化剂为豆基乳化剂，例如卵磷脂，或植物基乳化剂，例如单甘油二酸酯；以及所述的抗氧化剂为谷氨酸钠或柠檬酸。

在不同的实施方案中，所述的组合物为稳定的组合物，其能够支持真菌的可再生能力、或者能够保持杀虫效力达到超过大约2周、优选超过大约1个月、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大约5个月、更优选的是超过大约6个月的时间。

在某些实施方案中，所述的组合物包含真菌的单一菌株。在一个示例性的实施方案中，真菌为球孢白僵菌菌株K4B3(于2008年10月14日保藏的NMIA No.V08/025855)。

备选地，所述的组合物包含所述的真菌的多个菌株。在一个实施方案中，所述的组合物为生物控制组合物，其包含本发明的一种或多种脂类；具有可再生形式和量的一种或多种菌株，该菌株选自球孢白僵菌K4B3NMIA No.V08/025855，或具有其鉴别特征的培养物；K4V1(于2005年3月16日保藏的NMIA No.NM05/44593)，或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(于2005年3月16日保藏的NMIA编号No.NM05/44594)，或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(于2006年3月3日保藏的NMIA编号No.NM06/00007)，或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(于2005年3月16日保藏的NMIA编号No.NM05/44595)，或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(于2006年3月3日保藏的NMIA编号No.NM06/00010)，或具有其鉴别特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(于2006年3月3日保藏的NMIA编号No.NM06/00009)，或具有其鉴别特征的菌株；以及玫烟色拟青霉菌株K4P1(于2006年3月3日保藏的NMIA编号No.NM06/00008)，或具有其鉴别特征的菌株；以及至少一种农业可接受的载体。

在一个实施方案中，用于生产生物控制组合物的方法包括：

提供球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培养物；

将培养物保持在适于生产本发明的至少一种脂类的条件下；以及

i)将本发明的至少一种脂类与载体结合；或者

ii)将本发明的至少一种脂类与本文所述的一种或多种昆虫病原真菌结合；或者

iii)由球孢白僵菌K4B3 V08/025855分离本发明的至少一种脂类；或者

iv)(i)至(iii)的两项或多项的任意组合。

在某些实施方案中，所述的方法可以额外包括在保持步骤后的一步或多步细胞溶解的步骤。

在不同的实施方案中，分离是通过离心或过滤进行的。

在不同的实施方案中，分离有效地除去了大约50％的真菌(例如球孢白僵菌K4B3 V08/025855)，大于大约55％、大于大约60％、大于大约65％、大于大约70％、大于大约75％、大于大约80％、大于大约85％、大于大约90％、大于大约95％、大于大约99％、大于大约100％的真菌，例如大约100％的球孢白僵菌K4B3 V08/025855。因此，在一个具体考虑的实施方案中，所述的方法包括：提供球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培养物；将培养物保持在适用生产本发明的至少一种脂类的条件下；以及由球孢白僵菌K4B3 V08/025855分离本发明的至少一种脂类。

优选的是，所述的载体为农业可接受的载体，优选的是，至少一种载体选自填料刺激剂、抗结块剂、润湿剂、乳化剂和抗氧化剂，更优选的是，所述的组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、润湿剂、乳化剂和抗氧化剂的各底物的至少一种。

在不同的实施方案中，植物病原昆虫为半翅目。

优选的是，所述的一种或多种植物病原昆虫选自蚊子、娥(包括菜娥)、蓟马属(缨尾目)、蚜虫、木虱、蚧壳虫或粉虱(半翅目)。

在一个实例中，本发明的脂类或其功能变体可以存在于本文所述的组合物中。

在一个实施方案中，所述的组合物包含本发明的两种或多种脂类在不同的实施方案中，所述的组合物包含本发明的至少一种脂类、以及：

(i)至少一种白僵菌素；

(ii)至少一种类白僵菌素；

(iii)至少一种昆虫病原真菌；

(iv)上述(i)至(iii)的任意两项或多项。

在一个实施方案中，本发明提供了控制一种或多种昆虫(例如一种或多种植物病原昆虫)的方法，该方法包括将本发明的脂类或组合物施加到诸如植物或其周围之类的场所。

在一个实施方案中，用于控制一种或多种昆虫的方法包括将式I所示的脂类施加到所述的场所：

其中R₁和R₂可以相同或不同，且均为脂肪酸的脂肪族部分，并且其中R₃、R₄和R₅均独立地选自这样的组，该组包含或由H、羟基、羧基、酰胺基、未取代的或取代的烷基、未取代的或取代的烯基、未取代的或取代的炔基、以及未取代的或取代的芳基部分组成。

在不同的实施方案中，例如，可以在诸如植物脂类的场所被一种或多种昆虫种群感染、或者暴露于一种或多种昆虫种群之前，预防性地施加本发明的脂类或组合物。在其他实施方案中，在感染形成或在病原体存在(例如在植物被昆虫感染或者暴露于昆虫时，或者在昆虫存在于所述的场所上或场所中时)时，施加所述的组合物。

在一个实施方案中，本发明的脂类或组合物直接施加到所述的场所中，例如直接施加给植物或其周围。例如，本发明的组合物与溶剂预混或乳化(例如与水乳化)，并以本文所述的方式施加。在其他实施方案中，本发明的脂类或组合物例如通过施加到底物上、随后该底物被施加到所述的场所中而间接施加到场所中。

优选的是，所述的组合物在应用前与水预混至脂类的最终浓度为大约0.5gm/L至大约10gm/L，并且更优选的是脂类的最终浓度为大约1gm/L。

优选的是，诸如Deep Fried^TM、Fortune^TM或Fortune Plus^TM之类的干燥保护剂在应用前预混至最终浓度为大约1ml/L。

对于包含一种或多种昆虫病原真菌的组合物而言，示例性的浓度范围为大约1x10²至大约1x10¹²孢子/ml、大约1x10²至大约1x10¹¹孢子/ml、大约1x10²至大约1x10¹⁰孢子/ml、大约1x10²至大约1x10⁹孢子/ml、大约1x10³至大约1x10⁹孢子/ml、大约1x10⁴至大约1x10⁹孢子/ml、大约1x10⁵至大约5x10⁸孢子/ml，并且更优选的是，大约1x10⁶至大约2x10⁸孢子/ml。在某些实施方案中，所述的组合物在应用时包含至少10⁷孢子/毫升、在应用时包含至少5x10⁷孢子/毫升、或者在应用时包含至少10⁸孢子/毫升。

在当一种或多种真菌存在于组合物中时的不同实施方案中，可以以大约1x10⁸至大约1x10¹⁵感染单位(IU)/公顷、大约1x10⁹至大约1x10¹⁵IU/公顷、大约1x10¹⁰至大约1x10¹⁵IU/公顷、大约1x10¹¹至大约1x10¹⁵IU/公顷、优选的是大约1x10¹⁰至大约1x10¹⁴IU/公顷、更优选的是大约5x10¹⁰至大约1x10¹⁴IU/公顷、更优选的是大约1x10¹¹至大约5x10¹¹IU/公顷的比率施加本发明的组合物。

在一个实施方案中，感染单位为孢子，例如内生孢子，并且以大约1x10⁸至大约1x10¹⁵孢子/公顷、大约1x10⁹至大约1x10¹⁵孢子/公顷、大约1x10¹⁰至大约1x10¹⁵孢子/公顷、大约1x10¹¹至大约1x10¹⁵孢子/公顷、优选的是大约1x10¹⁰至大约1x10¹⁴孢子/公顷、更优选的是大约5x10¹⁰至大约1x10¹⁴孢子/公顷、更优选的是大约1x10¹¹至大约5x10¹¹孢子/公顷的比率施加所述的组合物。

方便的是，这种应用比率可以通过以大约10⁸孢子/毫升或更高来配制所述的组合物、并以大约1L/公顷的比率施加所述的组合物来取得。如本文所讨论，这种应用比率可以通过将所述的组合物溶解于大量的农业可接受的溶剂(例如水)中而方便地取得。

优选的是，所述的组合物在应用前与水预混。在一个实施方案中，所述的组合物与水预混，并以至少大约100L水/Ha、至少大约150L水/Ha、至少大约200L水/Ha、至少大约250L水/Ha、至少大约300L水/Ha、至少大约350L水/Ha、至少大约400L水/Ha、至少大约450L水/Ha、或者至少大约500L水/Ha来施加。在优选的实施方案中，所述的组合物在应用前与水预混至最终浓度为大约1x10¹¹至大约5x10¹¹孢子/500L水，并以500L/公顷的比率施加。

优选的是，所述的应用是通过喷雾进行的。

优选的是，包含球孢白僵菌菌株K4B3(NMIA编号No.V08/025855)或具有其鉴别特征的培养物的组合物以大约1x10¹⁰至大约1x10¹⁵孢子/公顷、优选为大约1x10¹²至大约1x10¹⁴孢子/公顷、更优选为大约5x10¹²至大约1x10¹⁴孢子/公顷、更优选为大约1-3x10¹³孢子/公顷的比率施加。

方便地，这种使用比率可以通过以大约10⁷孢子/毫克或更多来配制所述的组合物、并以大约1kg/公顷的比率施加所述的组合物来取得。如本文所讨论，此类使用比率可以通过将所述的组合物溶解于大量的农业可接受的溶剂(例如水)中来取得。

本发明可应用于任何植物或其周围。在某些实施方案中，示例性的植物为单子叶植物或双子叶植物，例如苜蓿、大麦、加拿大油菜、谷物、棉、亚麻、红棉、花生、马铃薯、燕麦、水稻、黑麦、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、烟草、番茄、小麦、草皮草、牧草、浆果、水果、豆类蔬菜、蔬菜、园林植物、灌木、仙人掌、肉质植物、和树。

在另一个说明性的实施方案中，所述的植物可以为任何植物，包括选自茄目的植物，包括得自以下科的植物：旋花科、田基麻科、山醋李科、茄科、和桔梗科；以及得自天门冬目的植物，包括得自以下科的植物：石蒜科、天门冬科、芳香草科、香水花科、山茱萸科、石冬青科、仙茅科、鸢尾科、鸢尾蒜科、毛石蒜科、兰科、蓝星科、刺叶树科、和血剑草科。

本发明所涉及的领域的技术人员在不脱离所附权利要求书所定义的本发明的范围的条件下，通过结构、不同的实施方案以及本发明的应用的多种改变来表明它们。本文的公开内容和说明纯粹是说明性的，并非是任何意义上的限定。

在其中参照了专利说明书、其他外部文件或其他信息来源的本说明书中，这通常是为了提供用于讨论本发明的特征的内容。除非另作说明，参照这些外部文件并非解释为承认这些文件或信息来源在任何权限内是现有技术，或者形成了本领域普遍公知的部分。

有意的是参照本文所公开的数的范围(例如1至10)还掺入了参照该范围内的所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)、以及该范围内有理数的任何范围(例如2至8、1.5至5.5、以及3.1至4.7)，因此，在本文所清楚公开的所有范围的所有亚范围在此均明确公开。这些仅是具体意图的实例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合均被认为在本申请中以相似的方式清楚地陈述。

附图说明

图1示出了如本文中实施例4所述的示例性甜菜碱脂类的色谱图。

图2示出了如本文中实施例4所述的示例性甜菜碱脂类的MS/MS谱。

图3示出了如本文中实施例4所述的、m/z为762.5的示例性脂类的子代谱。

图4示出了如本文中实施例6所述的、在10天时间内生产的示例性甜菜碱脂类的相对量。

发明详述

本发明部分涉及一种或多种脂类，包括由子囊菌门真菌的不同菌株分离得到的一种或多种脂类，例如白僵菌菌种和木霉菌种，其中所述的一种或多种脂类具有对抗昆虫(例如织物病原昆虫)的效力；并且本发明部分涉及此类脂类在控制昆虫和昆虫种群中的用途。

定义

如本文所用，术语“甜菜碱脂类”是指包含甜菜碱部分的醚键键合的甘油脂类，其中甜菜碱部分在甘油部分的sn-3位置处通过醚键键合，并且在甘油部分的sn-1和sn-2位置处具有酯化的脂肪酸。已经报道甜菜碱脂类在藻类、苔藓类植物、真菌、一些原生动物、光合细菌、和一些产孢子的植物(例如蕨类植物和属于木贼门的物种)中形成。

如本文所用，术语“生物控制剂”(BCA)是指这样的生物试剂，其起到一种或多种有机体(通常为一种或多种害虫或病原体，例如一种或多种植物病原体，例如植物病原昆虫)的拮抗剂的作用，或者能够控制一种或多种病原体，例如一种或多种植物病原体。拮抗作用可以采用多种形式。在一种形式中，生物控制剂可以简单地起到排斥剂的作用。在另一种优选的形式中，生物控制剂可以寄生于害虫或病原体中、使害虫或病原体失去能力、使害虫或病原体不育、阻止害虫或病原体生长、阻止害虫或病原体分布或蔓延、和/或杀死害虫或病原体抗菌作用。因此，拮抗机制包括但不限于抗菌作用、寄生、阻止移动、不育和毒性作用。因此，起到一种或多种病原体昆虫的拮抗剂作用的试剂均可以被认为具有杀虫效力。此外，作为昆虫(包括植物病原昆虫)的拮抗剂的试剂均可以被认为是杀虫剂。

如本文所用，“生物控制组合物”为这样的组合物，其包含或包括至少一种生物控制剂，该生物控制剂为一种或多种害虫或病原体(例如一种或多种植物害虫或植物病原体)的拮抗剂。此类控制剂包括但不限于起排斥剂作用的试剂、提供不利于害虫或病原体的环境的试剂、以及使害虫或病原体失去能力、使害虫或病原体不育、和/或杀死害虫或病原体。

因此，如本文所用，“抗植物病原组合物”为这样的组合物，其包含或包括至少一种试剂，该试剂为一种或多种植物病原体的拮抗剂。此类组合物在本文中被理解为具有抗植物效力。

如本说明书所用，术语“包含”是指“至少部分由……构成”。当对本说明书中包括术语“包含”的各个陈述进行解释时，除了以所述的术语开始的那些以为，还可以存在其他的特征。诸如复数形式的“包含”和单数形式的“包含”之类的相关术语均以相同的方式解释。

如本文所用，术语动词形式的“控制”或动名词形式的“控制”通常理解为防止、减少或根除由一种或多种病原体引起的感染，例如由一种或多种植物病原体引起的感染；或者抑制此类感染的比率和程度，例如减少植物或其周围中或植物或其周围上的植物病原体种群，其中相对于未处理的感染或种群而言，对感染或种群的防止或减少是相当有意义的。治疗处理也被考虑在内。优选的是，通过增加病原体种群的死亡率来取得这种控制。

短语“昆虫病原活力”和“昆虫病原效力”在本文中交换使用，是指某些试剂(例如某些微生物有机体或由某些微生物有机体衍生的试剂)拮抗一种或多种病原体昆虫(例如一种或多种植物病原昆虫)的能力。

在不同的实施方案中，所述的昆虫病原效力为优选地与昆虫接触14天后、更优选地与昆虫接触7天后具有寄生于一种或多种昆虫(例如植物病原昆虫)中并使其失去能力、使一种或多种昆虫不育、阻止一种或多种昆虫生长或者杀死一种或多种昆虫，更优选的是，在与昆虫接触7天后仍具有杀死一种或多种植物病原昆虫的能力。备选地，所述的昆虫病原效力能够支持或促进一种或多种昆虫病原微生物有机体(例如一种或多种昆虫病原真菌)的生长。

因此，如本文所用，“昆虫病原组合物”是指这样的组合物，其包含或包括至少一种试剂，该试剂为一种或多种病原体昆虫的拮抗剂。此类组合物在本文中被认为具有昆虫病原效力。

因此，如本文所用，“杀虫剂组合物”是指这样的组合物，其包含或包括至少一种试剂，该试剂为一种或多种病原体昆虫的拮抗剂。此类组合物在本文中被认为具有杀虫剂效力。

在某些实施方案中，昆虫病原活力是杀虫剂活力。例如，本发明的脂类的某些实施方案是杀虫的。

如本文所用，就一种或多种脂类(例如关于本文的实施例中示例的一种或多种脂类)而言，术语“功能变体”是指不同于明确鉴别的实体的脂类，例如其中一个或多个(例如一个或多个脂肪酸基团)被删除、取代或加入，但是其至少部分具有具体鉴别的实体的一种或多种生物学活性，例如激发由具体鉴别的脂类所激发出的一种或多种生物作用的能力。功能变体可以与其他物种相同或不同，并且可以涵盖同系物、旁系同源物和直系同源物。

在目前的情况下，功能变体优选地保留了明确鉴别脂类的至少一部分杀虫活性。

测定由本发明的脂类所激发的一种或多种生物作用(例如杀虫作用)的方法和测试是本领域公知的，并且该方法和测试可以用于鉴别或证实本发明的一种或多种脂类的一种或多种功能变体。例如，本发明的脂类杀死或以其他方式拮抗目标昆虫(例如本文实施例中所述的那些)的生长的能力测试容易鉴别脂类的一种或多种功能变体。

如本文所用，术语“脂类”涵盖了高度还原的富含碳的底物，其不溶于水，并且包括烃链长度通常为4至36个碳原子的一种或多种脂肪酸、羧酸。脂类包括三酰甘油、磷脂(包括甘油磷脂)、鞘脂、甘油酯和固醇。

如本文所用，术语“脂类级份”涵盖了这样的组合物，其包含一种或多种脂类和/或游离的脂肪酸，其中所述的脂类级份包含或由在未分级来源的材料中存在的总脂肪的子集组成。通常，脂类级份具有可确定且可鉴别的组成，例如特征色谱概况或质谱图概况。脂类级份的实例示于本文中。

如本文所用，术语“植物”不仅涵盖了全体植物，而且延伸至植物的部分、插枝以及植物产物，包括根、叶、花、种子、茎、愈合组织、坚果、块茎、结节、球茎、谷粒、插枝、根茎、或接穗，并且包括在种植前、生长过程中以及收获时或收获后的任何植物材料。受益于本发明的应用的植物覆盖了广泛的农业和园艺农作物。此外，本发明的组合物还特别适于有机生产系统的应用。

当与昆虫病原试剂(例如昆虫病原脂类或昆虫病原真菌菌株)相关而使用时，短语“保持昆虫病原效力”及其语法等价物和衍生物是指所述的试剂仍具有有用的昆虫病原活力。优选的是，保持的活力为原始活力的至少大约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％，并且有用的范围可以在这些值的任一者之间选择(例如大约35至大约100％、大约50至大约100％、大约60至大约100％、大约70至大约100％、大约80至大约100％、以及大约90至大约100％)。例如，本发明的优选的脂类功能变体应该保持昆虫病原活力，即，保持指定的亲代脂类的昆虫病原活力的至少大约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％。相似地，本发明的优选的组合物能够支持它们所包含的昆虫病原试剂的有用昆虫病原活力的保持，并且可以被认为理想地保持昆虫病原活力直到使用本文所考虑的方法来进行应用。

相似地，当与杀虫剂(例如杀虫脂类或昆虫病原真菌菌株)相关而使用时，短语“保持杀虫效力”及其语法等价物和衍生物是指所述的试剂仍具有有用的昆虫病原活力。优选的是，保持的活力为原始活力的至少大约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％，并且有用的范围可以在这些值的任一者之间选择(例如大约35至大约100％、大约50至大约100％、大约60至大约100％、大约70至大约100％、大约80至大约100％、以及大约90至大约100％)。例如，本发明的优选的脂类功能变体应该保持杀虫活力，即，保持指定的亲代脂类的杀虫活力的至少大约35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100％。相似地，本发明的优选的组合物能够支持它们所包含的杀虫剂的有用杀虫活力的保持，并且可以被认为理想地保持杀虫活力直到使用本文所考虑的方法来进行应用。

如本文所用，当与本发明的组合物相关而使用时，术语“稳定的”是指能够支持杀虫效力达几周，优选为大约1周、大约2周、大约3周、大约4周，优选为大约5周、更优选为大约6个月或更长的组合物。例如，当与额外包含一种或多种昆虫病原真菌的组合物相关而使用时，术语“稳定的”是指能够支持昆虫病原真菌生殖活力达几周、优选为大约1周、大约2周、大约3周、大约4周，优选为大约5周，更优选为大约6个月或更长的组合物。

具有“[特定菌株]的鉴别特征的菌株”或“[特定培养物]的鉴别特征的培养物”(包括特定菌株的同系物或突变体)与特定的菌株密切相关(即，与特定的菌株具有共同的祖先)或由其衍生，但是通常具有不同于特定的菌株的一种或多种基因型或表现型特征。通过评估遗传学差异，突变体通常是可鉴别的。通过评估遗传、生物化学和形态学差异程度以及分类学方法的使用(例如包括诸如遗传分类学之类的分析)，同系物是可鉴别的。但是，具有[特定菌株]的鉴别特征的菌株(包括特定菌株的同系物或突变体)将保持杀虫效力，可区别于其他细菌菌株，并且使用本文所述的技术科鉴别为亲代菌株的同系物或突变体。

当与经历本发明的真菌、方法和组合物的植物相关而使用时，术语“周围”包括土壤、水、落叶层、和/或与植物或根相邻或在其周围的生长介质、结节等、相邻的植物、所述植物的插枝、支持物、给与植物的水、以及包衣(包括种子包衣)。其进一步包括储存、包装或加工材料，例如保护性包衣，盒和包装纸，以及种植、保持或收获设备。

植物病原体的控制

本发明意识到许多国家(例如包括美国、新西兰以及欧洲的许多国家)的园艺领域都面对着植物病原昆虫害虫的杀虫抗性有所增加的问题。这种情况在一些管理制度(由于管理屏障而减少新型化学杀虫剂的利用)下是复杂的。

使用由真菌衍生的杀虫剂脂类作为生物控制剂显示出对这一问题的解决方法。可以根据生物控制剂使目标植物病原昆虫或昆虫种群失去能力或杀死它们的能力来选择有效的生物控制剂。在有利的条件下，诸如蚜虫、牧草虫和粉虱之类的植物病原昆虫可以感染植物和它们的周围，包括土壤、落叶层、相邻的植物、支持物等。可以使用由真菌衍生的杀虫剂脂类以及由该脂类衍生的试剂使得植物病原昆虫失去能力和/或杀死它们，由此阻止或限制病原体引起疾病的能力。在一定领域中由真菌衍生的这些杀虫剂脂类的效力部分由于它们能够在变化的气候条件(例如阻湿期和失水条件)下保持杀虫效力。由昆虫病原真菌衍生的试剂(例如本文所述的脂类)的效力通常无需生存能力，但是需要保持杀虫效力。而且，可以理解的是，组合物的稳定性(例如通过污染微生物有机体而对定殖具有抗性、能够抑制或不支持微生物有机体的生长、或者抑制细菌或抑制真菌的特征)均可以有助于组合物的效用和/或杀螺效力(molluscicidal efficacy)的保持。

有效对抗昆虫(例如植物病原昆虫)并由此适于根据本发明使用的本发明的脂类被鉴别为这样的脂类，就与本发明的脂类或其功能变体相比较的底物的对照处理而言，本发明的脂类通过大量地减少目标昆虫物种的种群而是有效的。这种脂类可以被认为具有杀虫效力。如本文所述，目标昆虫种群的减少可以通过不同的拮抗机制。例如，所述的脂类可以使植物病原昆虫失去能力、使其不育、抑制其生长或发育、和/或优选地杀死植物病原昆虫，或者可以支持或促进一种或多种通常存在的昆虫病原(例如与本发明的脂类一起(分开的、同时的或依次的)存在于组合物中的昆虫病原真菌)的生长和杀虫效力。由此，本发明的脂类能够或者可以支持诸如昆虫病原真菌脂类的昆虫病原寄生于植物病原昆虫中、使其失去能力、使其不育、和/或优选地杀死植物病原昆虫的能力。此外，本发明的脂类还可以通过提供环境(例如对植物或其周围施加一种或多种不利于植物病原昆虫的真菌)而减少目标昆虫的种群。在这种实施方案中，所述的脂类可以被认为起到排斥剂的作用，并减少植物附近或其周围中目标昆虫的有效种群。

在一个实施方案中，所述的脂类为本文所述的功能变体。

优选的是，本发明的合适的脂类或其功能变体展示出大约5％的杀虫效力、至少大约10％、至少大约15％、至少大约20％、至少大约25％、至少大约30％、至少大约35％、至少大约40％、至少大约45％、更优选的是至少大约50％的杀虫效力，其表示为与对照处理相比，相关昆虫物种种群的减少的百分率。例如，使用本文所述的方法学来鉴别对抗多种目标昆虫的白僵菌属脂类级份的分离物，而且可以使用与其他真菌和昆虫物种相关的与本文所述的那些类似的方法。

虽然杀虫效力是被认为适于用作生物控制剂的脂类的主要要素，但是所述的脂类可以具有适于用作生物控制剂的额外的特征。

例如，所述的脂类应该能够以有效的形式储存合理的时间，最终允许其以作为生物控制剂的有效形式和浓度而被施加给目标植物或其周围。

本发明的技术人员意识到本发明的脂类和组合物可以包含、或者本发明的方法可以使用本发明的一种或多种脂类的一种或多种功能变体，包括本文举例的那些。此外，脂类和功能变体的组合在本发明中也是可用的。

用于分离脂类的方法

用于生产和分离本发明的一种或多种脂类的示例性方法在本文中有所描述。这些方法包括由子囊菌门的一种或多种真菌的培养物中分离一种或多种脂类，例如白僵菌物种(例如包括球孢白僵菌K4B3)或木霉物种。

备选地，可以使用本领域公知的脂类合成方法来制备本发明的脂类，包括其功能变体。

包含昆虫病原真菌的组合物

如果在某些管理制度下是可行的，则昆虫病原真菌的进口往往是成问题的、高昂的且不实际的。例如，由于给定国家的管理和法律的阻止，则在给定国家以外可以利用的昆虫病原真菌在该国家内是不能被园艺种植者所利用。因此，本发明意识到由此类真菌鉴别和制备这样的试剂是非常有利的，所述的试剂具有杀虫效力，和/或能够支持或促进昆虫病原真菌(或其他昆虫病原体)的生长并由此可以帮助该昆虫病原体在多种环境条件下繁荣生长。

所述的真菌的分离物可以方便地由环境获得，例如包括由植物、它们的周围以及由植物的病原体获得。在某些实施方案中，所述的真菌的分离物可以由目标昆虫获得，或者由植物物种(或周围)获得，其中所述的植物物种随后被施加包含所述的真菌的生物控制剂或者包含所述的真菌的组合物。

测定所述的真菌在不同条件(包括不同的温度和在不同的介质或其他底物上)下的生长的方法是本领域公知的。同样地，测定本发明的脂类对真菌生长的积极影响(例如与在所述的脂类缺如的情况下所观察到的情况相比，在所述的脂类存在下，所述的真菌的毒力或杀虫效力的增加)的方法也是本领域公知的。测定本发明的脂类的能力的方法的实例如本文所述，其中所述的能力为本发明的脂类在不同温度或者不同植物、环境、或目标有机体下影响真菌生长的情况。

虽然昆虫病原效力是分离物被认为适于用作生物控制剂的主要要素，但是真菌分离物应该具有适于用作生物控制剂的其他特征。

例如，所述的真菌应该能够以可行的形式储存合理的时间，最终允许其以作为生物控制剂的有效形式和浓度而被施加给目标植物或其周围。

此外，所以该真菌还应该能够在施加到植物或其周围时取得该真菌适于用作生物控制剂的感染阈值。如本文所用，感染阈值是指所述的真菌在目标植物或其周围确立、以便随后具有昆虫病原效力所需的真菌的浓度。可以理解的是，为了取得感染阈值，真菌的一些分离物必须高速使用，而变得不实际的或不可行的。此外，不管一些真菌分离物所施加的浓度或比率如何，它们可能不会取得感染阈值。合适的昆虫病原真菌能够在以低于10¹⁰孢子/公顷的比率施加时，或者以低于10⁷孢子/毫克组合物的浓度施加时(此时所述的组合物以大约1kg/1000L/公顷的比率施加)取得感染阈值。

测定感染阈值的方法是本领域公知的，并且这些方法的实例示于本文中。在某些实施方案中，例如可以通过分析由目标植物、其周围和/或所述植物的病原体得到的一个或多个样本、并测定所述样本中真菌的存在情况或量来直接测定感染阈值。在其他实施方案中，例如可以通过观察在一个场所内一种或多种昆虫的种群的减少情况(例如在植物上或其周围植物病原昆虫的种群的减少情况)来直接测定感染阈值。这些方法的组合也可以设想。

球饱白僵菌为攻击幼稚和成熟昆虫(例如蝗虫、蚜虫、蛾子和多种其他物种)的土传真菌。通常，可以由昆虫(例如蚜虫、粘蛀虫和牧草虫)尸体上分离球饱白僵菌，并且还可以由土壤中分离。在本发明的某些实施方案中，可以使用示例性的杀虫球饱白僵菌菌株K4B3，并且根据用于专利程序的布达佩斯条约于2008年10月14日保藏在澳大利亚国家计量院(National Measurement Institute of Australia，NMIA、原来的the AustralianGovernment Analytical Laboratories(AGAL))、1Suakin Street、Pymble、NewSouth Wales、Australia on14 October2008。分离物已经给予保藏号V08/025855。

因此，在本发明的一个方面中，提供了多种方法和组合物，其依赖于本发明的一种或多种脂类，编码它们的一种或多种多核苷酸，以及生殖活力形式和量的球孢白僵菌菌株K4B3、NMIA No.V08/025855，或具有菌株K4B3、NMIA No.V08/025855的鉴别特征的白僵菌属。

球饱白僵菌菌株K4B3是特别有效的生物控制剂，其能够存活过阻湿期、失水、及定植，使植物病原昆虫失去能力并杀死植物病原昆虫，所述的植物病原昆虫例如但不限于场地中的蚜虫、毛虫、粉虱、蛾子、蜂虱、蝉和牧草虫。

在本发明的其他实施方案中，球饱白僵菌K4B3可以用于制备包含本文所鉴别的一种或多种脂类的组合物。

在一个实施方案中，所述的方法包括使球饱白僵菌K4B3 V08/025855保持在适于生产至少一种脂类的条件下；以及由球饱白僵菌K4B3V08/025855分离至少一种脂类。

在一个实施方案中，所述的组合物包含两种或多种本文所述的脂类。注意，这些脂类均不具有明显的特性，或者均不与白僵菌属的已知的杀虫剂(白僵菌素和类白僵菌素)是同系的。在一个实施方案中，所述的组合物为包含本文所述的两种或多种脂类的协同组合物。

在另一个实施方案中，所述的组合物额外包含少于大约1mgL^-1的白僵菌素、少于大约1mgL^-1的白僵菌素、少于大约0.5mgL^-1的白僵菌素、少于大约0.1mgL^-1的白僵菌素、少于大约0.05mgL^-1的白僵菌素、少于大约0.01mgL^-1的白僵菌素、少于大约0.005gL^-1的白僵菌素、少于大约0.001mgL^-1的白僵菌素、或者少于大约0.0001mgL^-1的白僵菌素。

例如，所述的组合物额外包含少于大约1mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约1mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约1mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约0.5mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约0.1mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约0.05mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约0.01mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约0.005mgL^-1的白僵菌素-F、或者少于大约0.001mgL^-1的白僵菌素-F、少于大约0.0005mgL^-1的白僵菌素-F、或者少于大约0.0001mgL^-1的白僵菌素-F。

在另一个实施方案中，所述的组合物额外包含少于大约1mgL^-1的类白僵菌素、少于大约0.5mgL^-1的类白僵菌素、少于大约0.1mgL^-1的类白僵菌素、少于大约0.05mgL^-1的类白僵菌素、少于大约0.01mgL^-1的类白僵菌素、少于大约0.005mgL^-1的类白僵菌素、少于大约0.001mgL^-1的类白僵菌素、少于大约0.0005mgL^-1的类白僵菌素、或者少于大约0.0001mgL^-1的类白僵菌素。

在不同的实施方案中，所述的组合物为包含本文所述的一种或多种脂类、以及一种或多种白僵菌素的协同组合物，其中所述的白僵菌素例如为白僵菌素-A、白僵菌素-D、白僵菌素-E、白僵菌素-F、一种或多种类白僵菌素、或它们的组合。

例如，所述的组合物额外包含多于大约0.1mgL^-1的白僵菌素、多于大约0.5mgL^-1的白僵菌素、多于大约1mgL^-1的白僵菌素、多于大约10mgL^-1的白僵菌素、多于大约50mgL^-1的白僵菌素、或者多于大约100mgL^-1的白僵菌素。

在另一个实例中，所述的组合物额外包含多于大约0.1mgL^-1的类白僵菌素、多于大约0.5mgL^-1的类白僵菌素、多于大约1mgL^-1的类白僵菌素、多于大约5mgL^-1的类白僵菌素、多于大约10mgL^-1的类白僵菌素、多于大约50mgL^-1的类白僵菌素、或者多于大约100mgL^-1的类白僵菌素。

在另一个实施方案中，所述的组合物为包含本文所述的一种或多种脂类、本文所述的一种或多种昆虫病原真菌、以及一种或多种白僵菌素的协同组合物，其中所述的白僵菌素例如为白僵菌素-A、白僵菌素-D、白僵菌素-E、白僵菌素-F、一种或多种类白僵菌素、或它们的组合。

在另一个实施方案中，所述的组合物为包含本文所述的一种或多种脂类以及本文所述的一种或多种昆虫病原真菌的协同组合物。

本发明的球饱白僵菌菌株K4B3可以单独使用，或者与本文所述的其他昆虫病原真菌组合使用。其他昆虫病原真菌的实例在下文中更详细地描述。

球饱白僵菌菌株K4B1在Bombay、New Zealand的松林中由钻蛀虫的幼虫分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，这种球饱白僵菌分离物已经于2005年3月16日保藏在National Measurement Institute of Australia、1Suakin Street、Pymble、New South Wales、Australia。分离物已经给予保藏号NM05/44595。

球饱白僵菌分离物K4B1显示对牧草虫成虫具有偏爱，并且还是蓟马幼虫和蛹、蚜虫和粉虱的病原体。K4B1的无性孢子形成了乳状聚集。

在the Aka Aka flats、New Zealand，球饱白僵菌分离物K4B2由向日葵上的鳞翅目毛虫分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，这种球饱白僵菌分离物已经于2006年3月3日保藏在澳大利亚国家计量院。分离物已经给予保藏号NM06/00010。

球饱白僵菌分离物K4B2显示对毛虫具有偏爱，包括大豆尺夜娥毛虫、粉蝶和粘虫毛虫。该分离物也是蓟马幼虫、成虫和蛹，蚜虫和粉虱的病原体。K4B1的无性孢子形成了黄色粉末状聚集。

NMIA No.V08/025855、NMIA No.NM05/44595、NMIA No.NM06/00010和球饱白僵菌的其他合适的分离物可以与本发明的一种或多种脂类、或其功能变体或片段组合使用，并且为特别有效的生物控制剂，其能够存活与阻湿期、失水、及定植，使植物病原昆虫失去能力并杀死植物病原昆虫，所述的植物病原昆虫例如但不限于场地中的蚜虫、毛虫、粉虱、蛾子、蜂虱、和牧草虫。球饱白僵菌的这些分离物杀死粉虱、牧草虫和蚜虫的程度通常与上文所述的常用的杀虫剂一样良好。对这些杀虫剂的抗性已经形成；在这些和其他情况下，包含球饱白僵菌分离物的组合物或者使用球饱白僵菌分离物的方法提供了对昆虫进行控制的有效备选方法。植物疾病控制中的这种有效的活性加上任何未能观察到的由球饱白僵菌诱导的植物病原性，证明这些物种的分离物具有用作生物控制剂的所需的特征。

之前，木霉属物种尚未被认为具有任何杀虫活性或作用。木霉属培养物通常在25-30℃下快速生长，但是在35℃下不生长。最初，集落在培养基(例如玉米粉葡萄糖琼脂(CMD))上是透明的，或者在富集培养基(例如马铃薯葡萄糖琼脂(PDA))上是白色的。菌丝在CMD上通常是不明显的，一周内，无性孢子形成绿色或黄色色彩的(较少为白色)、紧实或疏松的丛。黄色色素被分泌到琼脂中，特别是在PDA上。一些物种产生特征性的甜或“椰子”气味。

分生孢子是高度枝化的，由此难以定义或测量，分生孢子为疏松的或紧实的丛状，通常在明显的同心环中形成或者沿着稀少的气生菌丝生长。分生孢子的主枝产生成对的或非成对的侧枝，最长的分枝远离菌端，并且通常由菌端附近的主轴上直接形成瓶梗。所述的分枝可以二次分枝，并且二级分枝通常是成对的，且最长的二级分枝与主轴最近。所有的一级和二级分枝相对于主轴成90°或大致90°的角。具有成对分枝的典型的木霉属分生孢子呈现出金字塔形的面貌。通常，分生孢子在一个或几个瓶梗中结束。在一些物种(例如多饱木霉)中，主枝通过长的、单一的或分枝的、钩状的、直的或弯曲的、具有隔膜的、薄壁的、不育的或末端繁殖的延长方式结束。主轴与瓶梗的基底可以具有相同的宽度，或者其可以更宽。

通常，瓶梗在中部扩大，但是可以是圆柱形的或者是近球形的。瓶梗可以保持为螺纹状，且相对于螺纹的其他部件成90°角，或者它们可以是各种流苏状的(粘帚霉型)。瓶梗在宽阔的主轴上可以是致密成簇的(例如多饱木霉、钩状木霉)，或者它们可以是单独的(例如长枝木霉)。

无性孢子通常表现为干燥的，但是在一些物种中，它们可以保持为澄清的绿色或黄色液滴(例如绿木霉、棕孢木霉)。多数物种的无性孢子是椭圆体的，3-5x2-4μm(L/W＝>1.3)；球形无性孢子(L/W<1.3)是稀少的。无性孢子通常是光滑的，但是具有突起至细微疣状的无性孢子在一些物种中是已知的。

共无性型由一些物种形成，这些物种也具有典型的木霉属脓疱。共无性型通过它们独立的分生孢子鉴别，这些独立的分生孢子是轮生枝化的，并且在各个瓶梗的菌端具有澄清的绿色液滴中具有无性孢子。

厚垣孢子可以由所有的物种产生，但是并非所有的物种在20℃下在CMD上在10天内都能产生厚垣孢子。厚垣孢子通常为单细胞近球形，并且以短的菌丝结束；它们还可以在菌丝细胞内形成。一些物种的厚垣孢子是多细胞的(例如T.stromaticum)。

蜡蚧霉是一种宿主范围广泛的昆虫病原真菌，包括同翅类昆虫和其他节肢动物组。蜡蚧霉被认为是物种复合物，其包含形态学特征和生物化学特征可变的分离物。通常，蜡蚧霉可以由昆虫尸体(例如蚜虫、蓟马、粉虱和粉虫)分离得到，并且还可以由土壤分离得到。

在Pukekohe、New Zealand，蜡蚧霉菌株K4V1由温室番茄农作物分离得到。根据用于专利程序的布达佩斯条约，这种蜡蚧霉分离物已经于2005年3月16日保藏在澳大利亚国家计量院。分离物已经给予保藏号NM05/44593。

K4V1具有额外的鉴别特征，其在粉虱若虫(whitefly scale)时，60％的无性孢子为1.0x1.0微米，其在蓟马幼虫(nymphs)时，30％的无性孢子为2.0x1.0微米，其在蓟马蛹时，10％的无性孢子为2.5x1.3微米。在菌丝菌体的下方形成稀疏的折痕，菌丝菌体可以很容易地由琼脂上移除。

在Pukekohe、New Zealand，蜡蚧霉菌株K4V2由温室黄瓜分离得到。根据用于专利程序的布达佩斯条约，这种蜡蚧霉分离物已经于2005年3月16日保藏在澳大利亚国家计量院。分离物已经给予保藏号NM05/44594。

K4V2具有额外的鉴别特征，50％的无性孢子为2.0x1.0μm，30％的无性孢子为2.0x1.0μm，20％的无性孢子为1.0x1.0μm，其对粉虱成虫致病，而粘芽生孢子对蚜虫致病。在菌丝菌体的下方频繁地形成折痕，菌丝菌体难以由琼脂表面上移除。

蜡蚧霉菌株K4V4由户外有机树番茄农作物分离得到。根据用于专利程序的布达佩斯条约，这种蜡蚧霉分离物已经于2006年3月3日保藏在澳大利亚国家计量院。分离物已经给予保藏号NM06/00007。

K4V4具有额外的鉴别特征，50％的无性孢子为1.0x0.5μm，对粉虱级别和成虫致病，在低湿度65-75％、高温28-32℃下具有极强的入侵性。通常，v.l>75％。50％的无性孢子为0.5x0.5μm。在菌丝菌体的下方形成稀疏的折痕，菌丝菌体以奶糊状由黄色至浅橘色在培养基上四下散开。

NMIA No.NM05/44593、NMIA No.NM05/44594、NMIA No.NM06/00007以及蜡蚧霉的其他合适的分离物可以与本发明的一种或多种脂类或其功能变体结合使用，并且是特别有效的生物控制剂，其能够存活过阻湿期、失水、及定植，使植物病原昆虫失去能力并杀死植物病原昆虫，所述的植物病原昆虫例如但不限于场地中的蚜虫、粉虱、粉蚧虫、蜂虱、以及蓟马。

长孢蚧霉为一种特别对蚜虫致病的昆虫病原真菌。在Franklin、Auckland、New Zealand，长孢蚧霉菌株KT4L1由Barley grass Banker植物中的蚜虫分离得到。根据用于专利程序的布达佩斯条约，这种长孢蚧霉分离物已经于2006年3月3日保藏在澳大利亚国家计量院。分离物已经给予保藏号NM06/00009。

分离物KT4L1具有以下鉴别特征：100％的无性孢子为6.0x2.1μm，菌丝具体呈灰白色至黄色极粗糙地生长，这在一致性上可以描述为结块的。菌丝具体以浅红褐色分散到琼脂中。

NMIA No.NM06/00009以及长孢蚧霉的其他合适的分离物可以与本发明的一种或多种脂类或其功能变体组合使用，并且是特别有效的生物控制剂，其能够存活过阻湿期、失水、及定植，使植物病原昆虫失去能力并杀死植物病原昆虫，所述的植物病原昆虫例如为场地中的蚜虫。

玫烟色拟青霉为在感染和死亡的昆虫中、以及在一些土壤中发现的昆虫病原真菌。玫烟色拟青霉通常感染粉虱、蓟马、蚜虫、以及毛虫。

在Runciman、New Zealand，玫烟色拟青霉的K4P1菌株由在甘蓝上存在的菜娥毛虫上分离得到。根据用于专利程序的布达佩斯条约，这种玫烟色拟青霉分离物已经于2006年3月3日保藏在澳大利亚国家计量院。分离物已经给予保藏号NM06/00008。

NMIA No.NM06/00008以及玫烟色拟青霉的其他合适的分离物可以与本发明的一种或多种脂类或其功能变体组合使用，并且是特别有效的生物控制剂，其能够存活过阻湿期、失水、及定植，使植物病原昆虫失去能力并杀死植物病原昆虫，所述的植物病原昆虫例如但不限于场地中的粉虱、蜂虱、以及鳞翅目毛虫。

如上文所述，很多昆虫发展出对多种杀虫剂的抗性；在这些和其他实例中，本发明的组合物提供了用于昆虫控制的有效的备选方法，其中所述的组合物可任选地包含或者与一种或多种真菌分离物(例如上文所述的那些)一起给予。昆虫疾病控制中的这种有效的活力加上任何未能观察到的由这些试剂诱导的哺乳动物或植物病原性，证明本发明的脂类以及在这些物种的真菌分离物存在时，具有用作生物控制剂的所需的特征。

本发明提供了一种组合物，其包含本发明的一种或多种脂类或其功能变体、以及一种或多种昆虫病原真菌和至少一种载体。

所述的组合物可以包括昆虫病原真菌的多种菌株，并且在某些实施方案中，多种菌株可以用于靶向多种植物病原物种，或者单一植物病原体的不同发育阶段，或者实际上是这些相同情况的组合。例如，可以使用一种真菌菌株靶向植物病原昆虫的蛹的形式，而植物病原昆虫的成虫形式可以使用另一种真菌菌株靶向，其中两种菌株均包含在本发明的组合物中。在其他实施方案中，3种菌株或更少是优选的，并且通常情况下，单一的菌株是优选的。

合适地，所述的组合物包含选自以下的真菌：蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA编号No.NM05/44593)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA编号No.NM05/44594)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA编号No.NM06/00007)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA编号No.NM05/44595)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA编号No.NM06/00010)或具有其鉴别特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA编号No.NM06/00009)或具有其鉴别特征的菌株；以及玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA编号No.NM06/00008)或具有其鉴别特征的菌株。

特别考虑了包含本发明的一种或多种脂类、以及蜡蚧霉菌株K4V1(NM05/44593)或具有其鉴别特征的菌株的组合物；包含本发明的一种或多种脂类或其功能变体、以及蜡蚧霉菌株K4V2(NM05/44594)或具有其鉴别特征的菌株的组合物；包含本发明的一种或多种脂类或其功能变体、以及蜡蚧霉菌株K4V1(NM05/44593)和具有其鉴别特征的菌株的组合物；包含本发明的一种或多种脂类或其功能变体、以及蜡蚧霉菌株K4V2(NM05/44594)和具有其鉴别特征的菌株的组合物.

包含杀虫剂或抗植物病原真菌的组合物的实例是本领域公知的，并且包括例如在Mycotech Corporation的PCT/US94/1 1542(在WO95/10597中公开)、由美国农业部代表的PCT/US2002/037218(在WO2003/043417中公开)、McCabe et al.的美国专利No.4,530,834、Wright et al.的美国专利申请No.10/657,982(在US2004/0047841中公开)、以及PCT/NZ2009/000217(在WO2010/044680中公开)中所述的那些，这些文件均以引用方式全部掺入本文。

为了适用于例如植物或其周围，所述的至少一种载体为农业可接受的载体，更优选的是为选自料刺激剂、抗结块剂、润湿剂、乳化剂、抗氧化剂，更优选的是，所述的组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、润湿剂、乳化剂和抗氧化剂的各物质的至少一种。优选的是，所述的填料刺激剂为碳水化合物源，例如二糖，例如包括蔗糖、果糖、葡萄糖或右旋葡萄糖；所述的抗结块剂选自滑石、二氧化硅、硅酸钙或高岭土；所述的润湿剂为脱脂奶粉；所述的乳化剂为豆基乳化剂，例如卵磷脂，或植物基乳化剂，例如单甘油二酸酯；以及所述的抗氧化剂为谷氨酸钠或柠檬酸。但是，本领域公知的其他实例可以替代，条件是组合物支持杀虫效力的能力以及在需要条件下真菌的繁殖活力得到保持即可。

优选的是，所述的组合物为生物控制组合物。在该组合物中存在的、有效作为生物控制剂所需的、本发明的杀虫剂脂类的浓度可以根据最终用途、植物的生理条件；病原体感染的类型(包括昆虫物种)、浓度和程度；温度、季节、湿度、在生长季中的阶段和植物的年龄；正在应用的常规杀虫剂或其他处理(包括杀真菌剂)的数量和类型；和植物处理(例如叶的采摘和修剪)而变化，并且在配制所述的组合物时都可以考虑在内。

杀虫剂组合物

脂类组合式以及使用方法

本发明人考虑，本文所公开的脂类组合物作为BCA组合物将具有特定的用途，以便对例如农作物、草、水果和蔬菜、草坪、树和/或观赏植物进行局部和/或系统的应用。备选地，本文所公开的脂类可以配制为喷雾、粉剂、粉末或其他水性试剂、汽化试剂或气溶胶以用于杀死昆虫或控制昆虫种群。本文所公开的脂类组合物可以预防使用，或者备选地，在待处理的特定环境中一旦鉴别目标昆虫，则可以将所述的组合物施加到环境中。所述的脂类组合物可以包含单一的脂类，或者可以包含本文所公开的脂类的各种组合。

不论使用方法如何，活性脂类成分的量以有效杀虫的量施加，其将根据以下因素而改变，所述的因素例如为待控制的特定目标昆虫、特定的环境、位置、植物、农作物、待处理的农业位点、环境条件，以及杀虫活性脂类组合物的施加的方法、比率、浓度、稳定性和数量。此外，所述的配制物还可以随着气候条件、环境考虑、和/或应用的频率和/或昆虫感染的严重性而改变。

所述的组合物可以通过将一种或多种脂类、其功能变体或功能片段可任选地与真菌细胞和/或包子悬浮物、以及所需的农业可接受的载体配制而成。所述的组合物可以在以合适的手段给与之前配制，其中所述的手段例如为冻干的，冷冻干燥的，脱水的，或在水性载体、培养基或合适的稀释剂(例如盐水或其他缓冲剂)中。配制的组合物可以为灰分或颗粒材料，或者悬浮于油中(植物油或矿物油)、或者水或油/水乳化剂、或者作为可润湿的粉末、或者与适合于农业用途的任何其他载体材料组合的形式。合适的农业载体可以为固体或液体，并且是本领域公知的。术语“农业可接受的载体”涵盖在杀虫剂配制技术中常用的所有的佐剂、惰性成分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂；这些是杀虫剂配制领域中的技术人员所公知的。配制物可以与一种或多种固体或液体佐剂混合，并且通过多种手段制备，例如通过使用常规的配制技术与合适的佐剂均匀混合、共混和/或研磨杀虫剂组合物。

所述的组合物可以包括一种或多种真菌菌株，可以包括一种或多种细菌物种，或者包括这二者。示例性的细菌物种包括诸如苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡样芽胞杆菌(B.cereus)、E.coli、沙门氏菌属菌种、土壤杆菌属菌种、或假单胞菌属之类的那些。

油悬浮剂

在一个示例性的实施方案中，生物杀虫剂组合物包含本发明的一种或多种脂类、其功能变体或功能片段，可任选地与一种或多种真菌细胞形成的油悬浮剂，其中所述的真菌细胞包括表达本文所述的一种或多种新型蛋白质的一种或多种真菌细胞。

水分散颗粒

在另一个重要的示例性实施方案中，生物杀虫剂组合物包含水分散颗粒。这种颗粒包含本发明的一种或多种脂类、其功能变体或功能片段，以及可任选地一种或多种真菌细胞，其中所述的真菌细胞包括生产本发明所公开的本发明的脂类的一种或多种真菌细胞。

粉末、灰分和孢子配制物

在第三个重要的示例性实施方案中，生物杀虫剂组合物包含可润湿的粉末、灰分、孢子配制物、细胞团、或胶状浓缩物。这种粉末包含本发明的一种或多种脂类、其功能变体或功能片段，以及可任选地一种或多种真菌细胞，该真菌细胞包括生产本文所公开的本发明的脂类的一种或多种真菌细胞。这种干燥形式的杀虫剂组合物可以配制成在润湿时立刻溶解，或者备选地以控释、缓释或其他时间依赖的方式溶解。这种组合物可以被施加给目标昆虫或被目标昆虫消化，并由此，可以用于控制昆虫的数量，或者这种昆虫在给定环境中的传播。

水性悬浮物、以及真菌细胞滤液或溶解产物

在第四个重要的示例性实施方案中，生物杀虫剂组合物包含本发明的一种或多种脂类、其功能变体或功能片段，可任选地与一种或多种真菌细胞形成的水性悬浮物，其中所述的真菌细胞包括能生产本文所公开的脂类的一种或多种真菌细胞。这种水性悬浮物可以以浓缩原液形式(使用前稀释)提供，或者备选地以即用的稀释溶液形式提供。

当杀虫剂组合物包含生产所关注的脂类的完整细胞时，可以以多种方式配制这种细胞。它们可以通过与多种惰性材料混合而已可润湿的粉末、颗粒或灰分形式使用，其中所述的惰性材料例如为无机矿物(页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物材料(玉米芯粉、稻壳、胡桃壳等)。配制物可以包括粘展剂佐剂、稳定剂、其他杀虫添加剂或表面活性剂。液体配制物可以为水基或非水性的，并且以泡沫、悬浮物、可乳化的浓缩物等形式使用。所述的组分可以包括流变学试剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。

备选地，新型杀虫剂脂类可以通过体外的天然或重组表达系统来制备，并分离用于随后的场地应用。这种脂类可以为天然的细胞溶解产物、悬浮物、胶体等，或者备选地，可以在活性杀虫剂配制物中配制之前纯化、精制、缓冲和/或进一步的加工。同样，在某些环境下，理想的是由生产脂类的培养物分离脂类或孢子，并使用这种脂类或孢子的溶液、悬浮物或胶体制备物作为活性生物杀虫剂组合物。

多功能配制物

在某些实施方案中，例如在需要控制多种昆虫物种时的那些实施方案，本文所述的杀虫剂配制物还可以进一步包含一种或多种化学杀虫剂(例如化学杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、杀病毒剂、杀微生物剂、杀变形虫剂、杀虫剂等)和/或于本文所鉴别的杀虫剂脂类具有相同或不同杀虫剂活性或杀虫剂特异性的一种或多种脂类。此外，杀虫剂脂类还可以与其他处理结合使用，例如化肥、除草剂、冷冻保护基、表面活性剂、洗涤剂、杀虫剂肥皂、休眠油、聚合物和/或延时释放或可生物降解的载体配制物(其允许在单次应用配制物后对目标区域进行长期定量给与)。通常，所述的配制物可以制备成允许被杀虫剂配制物的目标昆虫食用或消化的、可食用的“饵”或者塑造成昆虫“陷阱”。

此外，本发明的杀虫剂组合物还可以连续或同时用于单个的环境位点，或者与一种或多种额外的杀虫剂、农药、化学品、化肥或其他化合物结合使用。

包含真菌的组合物

对于生物控制剂用途而言，当本发明的昆虫病原真菌存在于组合物中时，其应该为生殖活力形式。如本文所用，术语生殖上可存活的包括菌丝和孢子形式的真菌。例如，对于多数目的而言，理想的是将真菌菌株以孢子形式(无性孢子或粘芽生孢子)掺入所述的组合物中。孢子可以由本文所述的真菌菌株获得，并且可以使用本领域已知的技术生产。本发明的另一个方面为本发明的组合物，其包含本发明的一种或多种脂类、其功能变体或功能片段，以及可任选地一种或多种真菌细胞，其包含由真菌细胞获得的一个或多个孢子。组合物中真菌孢子的浓度取决于该组合物待投入的用途。示例性的浓度范围为大约1x10⁶至1x10¹²孢子/ml，优选地为大约1x10⁷至2x10¹⁰，并且更优选地为1x10⁷至1x10⁸孢子/ml。

理论上，一个感染单位应该足以感染宿主，但是在实际情况下，需要少量的感染单位来引起感染。在化学品农药中常用的致死剂量(LD)的概念不适用于这些微生物农药，其中昆虫病原活力的某些要素依赖于昆虫病原真菌在植物或其周围定植。感染剂量(ID)或感染浓度(IC)的概念是更精确的或适用的。ID或IC是指引起感染所需的感染单位的实际数量，或者为暴露于病原体而导致死亡的感染单位的数量。因此，在场地或温室中对抗病原体所适用的感染单位的数量将影响控制的程度。重要的是在适当放置及恰好的时间使用合适浓度的抗植物病原真菌，从而良好地控制害虫：这称为“感染阈值”。

显而易见的是配制用于使用的组合物中，真菌孢子的浓度低于例如用于储存所配制的组合物的中的浓度。申请人确定使用本文所述的昆虫病原真菌，当以大约1L/公顷的比率施加时，感染阈值为大约10⁷孢子/ml可喷射溶液。因此，在一个实例中，配制用于使用的组合物优选地具有至少大约10⁷孢子/ml的浓度。在另一个实例中，配制用于储存的组合物(例如这样的组合物，如能够配制成适用于应用的组合物的可润湿的粉末)优选地具有至少大约10¹⁰孢子/克的浓度。显而易见的是配制用于储存并随后配制成适用于使用的组合物的、组合物的浓度必须足以使所述的用于使用的组合物还可以被充分的浓缩，从而能够使用达到感染阈值。

在某些实施方案中，所述的组合物为能够支持(例如一种或多种脂类的)杀虫效力达到大于大约2周、优选地大于大约1个月、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大约5个月、更优选地大于大约6个月的时间。为了适用于实施方案(使用了一种或多种昆虫病原体，例如本文所述的昆虫病原真菌)中的用途，所述的组合物优选地能够支持昆虫病原体在生殖上的生活力或昆虫病原效力达到大于大约6个月的时间。

使用本领域公知的传统的固体底物和液体发酵技术，可以生产足量的本发明的杀虫剂脂类，以允许用作生物控制剂。例如，可以使用这些生长技术生产足量的本发明的脂类或脂类级份，并且示例性的技术示于本文的实施例中。通常，在满足有机体生长的任何温度下，在有氧条件下，会影响生长。例如，对于球饱白僵菌而言，10至32℃的温度范围是优选的，优选为25至30℃，并且最优选的是23℃。生长培养基的pH为微酸至中性，即，大约5.0至7.0，最优选为5.5。温育时间足以使分离物达到稳定的生长期，当在23℃下为大约21天，并且在正常的光周期下形成。

使用营养膜、深层培养和稻基质培养技术(rice substrate growingteniques)，可大量产生选定菌株的孢子用于田间应用。可以通过本领域公知的方法(例如通过传统过滤或沉淀方法(例如离心))收获孢子，或使用气旋系统收获干燥。孢子可以立即使用或储存，在0℃至6℃冷冻(优选在2℃冷冻)，只要它们保持繁殖活力即可。但是，通常优选的是，当不掺入本发明的组合物时，在收获2周内使用。

类似的，当需要时，可通过本领域熟知的方法(例如通过分馏法、过滤或沉淀方法(例如离心))，从球孢白僵菌K4B3中分离由球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物，其中所述的方法组合(例如对于细胞内脂类)或不组合(例如对于分泌至生长培养基的脂类)一个或多个细胞裂解步骤。

此外，本发明的组合物还可以包括一种或多种载体，优选一种或多种农业上可接受的载体。在一个实施方案中，诸如农业上可接受的载体之类的载体可为固体或液体。本文中所用的载体包括通常用于配制农用组合物的任何物质。

在一个实施方案中，农业上可接受的载体可以选自填料、溶剂、赋形剂、表面活性剂、悬浮剂、展开剂/粘着剂(粘合剂)、消泡剂、分散剂、湿润剂、减少漂移剂(drift reducing agent)、辅助剂、佐剂或它们的混合物。

可以通过已充分建立的方法，将本发明的组合物配制为例如浓缩物、溶液、喷雾剂、气雾剂、浸浴剂(immersion bath)、浸蘸剂(dip)、乳化剂、可湿润的粉末、可溶粉末、悬浮浓缩物、灰分(dust)、颗粒、水可分散的颗粒、微囊、糊剂、凝胶和其他制剂类型。

这些方法包括混合和/或研磨活性组分和农业上可接受的载体物质，例如填料、溶剂、赋形剂、表面活性剂、悬浮剂、展开剂/粘着剂(粘合剂)、消泡剂、分散剂、湿润剂、减少漂移剂、辅助剂、佐剂。

在一个实施方案中，固体载体包括但不限于矿物土，例如硅酸、硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、无水硅酸铝白土、石灰岩、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、氧化铝硫酸钙、硫酸镁、氧化酶、磨碎的塑料；化肥，例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵和尿素；以及植物产物例如谷物粗粉、树皮粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉；纤维质粉末等等。以下为适用于颗粒的固体载体：压碎或分级的天然岩石，例如方解石、大理石、浮石、海泡石和白云石；无机或有机粗粉的合成颗粒；有机材料的颗粒，例如锯末、椰壳、玉米芯、玉米壳或烟草杆；硅藻土、磷酸三钙、粉状软木或活性炭黑；水溶性聚合物、树脂、蜡；或固体化肥。如果需要，此类固体组合物可包含一种或多种相容的湿润剂、分散剂、乳化剂或着色剂，当其为固体时，还可以用作稀释剂。

在一个实施方案中，载体还可以为液体，例如水；醇，特别是丁醇或乙二醇，以及它们的醚或酯，特别是醋酸甲基乙二醇酯；酮，特别是丙酮、环己酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或异佛尔酮；石油馏分，例如石蜡或芳香烃，特别是二甲苯或烷基萘；矿物或植物油；脂肪族氯化烃，特别是三氯乙烷或二氯甲烷；芳香族氯化烃，特别是氯苯；水溶性或强极性溶剂，例如二甲基甲酰胺、二甲亚砜或N-甲基吡咯烷酮；液化的气体等；或它们的混合物。

在一个实施方案中，表面活性剂包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，并促进聚集物在喷洒时保留在溶液中的能力。

展开剂/粘着剂促进本发明的组合物粘附在植物表面的能力。表面活性剂、展开剂/粘着剂的实例包括但不限于Tween和Triton(Rhom and HassCompany)、Pulse、C.CodacideD_C.Supamet Oil、Penetrant、和Freeway、FortunePlus^TM、Fortune Plus Lite、Fruimec、Fruimec lite，芳香族磺酸(例如木质素磺酸、酚磺酸、萘磺酸和二丁基萘磺酸)和脂肪酸的碱金属、碱土金属和铵盐，烷基和烷基芳基磺酸盐，烷基、月桂基醚和脂肪醇硫酸盐，硫酸化的十六醇、十七醇和十八醇的盐，脂肪醇乙二醇醚的盐，磺酸化的萘和萘衍生物与甲醛的缩合产物，萘或萘磺酸与酚和甲醛的缩合产物，聚氧乙烯辛基酚醚，乙氧基化异辛基酚，乙氧基化辛基酚和乙氧基化壬基酚，烷基酚聚乙二醇醚，三丁基苯基聚乙二醇醚，烷基芳基聚醚醇，异十三烷基醇，脂肪醇环氧乙烷缩合物，乙氧基化蓖麻油，聚氧乙烯烷基醚，乙氧基化聚氧丙烯，月桂醇聚乙二醇醚缩醛，山梨糖醇酯，木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。根据已知的方案，在选择包含表面活性剂的情况下，一种或多种农用表面活性剂(例如Tween)理想地包含在组合物中。

湿润剂降低组合物中水的表面张力，因此增加给定量的组合物可以施加于其上的表面积。湿润剂的实例包括但不限于聚丙烯酸的盐，木质素磺酸盐，酚磺酸或萘磺酸的盐，环氧乙烷和脂肪醇或脂肪酸或脂肪酯或脂肪胺的缩聚物，取代的酚(特别是烷基酚或芳基酚)，磺基琥珀酸酯的盐，牛磺酸衍生物(特别是烷基牛磺酸盐)，醇或环氧乙烷和酚的缩聚物的磷酸酯，脂肪酸和酚的酯，或上述化合物的硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐功能衍生物。

在一个实施方案中，使用本发明的化合物或组合物的优选方法是通过手喷枪或商用鼓风机喷射稀释的或浓缩的溶液。

如上文所述，本发明的组合物可单独使用，或与一种或多种其他农业试剂组合使用，所述的农业试剂包括农药、杀虫剂、杀螨剂、杀真菌剂或杀细菌剂(前提条件是这些杀真菌剂或杀细菌剂对组合物中存在的真菌无害或无毒)、除草剂、抗生素、抗微生物剂、杀线虫剂、灭鼠剂、昆虫病原体、信息素、引诱剂、植物生长调节剂、植物激素、昆虫生长调节剂、化学不育剂、微生物害虫控制剂、驱避剂、病毒、诱食剂、植物营养素、植物化肥和生物控制剂。当与其他农业试剂组合使用时，两种试剂的给与可以是分开的、同时的或依次的。这些农业试剂的具体实例是本领域技术人员已知的，并且许多可以容易的购买到。

植物营养素的实例包括但不限于氮、镁、钙、硼、钾、铜、铁、磷、锰、钼、钴、硼、铜、硅、硒、镍、铝、铬和锌。

抗生素的实例包括但不限于土霉素和链霉素。

杀真菌剂的实例包括但不限于以下种类的杀真菌剂：羧酰胺类、苯并咪唑类、三唑类、羟基吡啶类、二甲酰胺类、苯基酰胺类、噻二唑类、氨基甲酸酯类、氰基肟类、肉桂酸衍生物、吗啉类、咪唑类、β-甲氧基丙烯酸酯类和吡啶类/嘧啶类。

杀真菌剂的其他实例包括但不限于天然杀真菌剂、有机杀真菌剂、硫基杀真菌剂、铜/钙杀真菌剂和植物宿主防御的诱导物。

天然杀真菌剂的实例包括但不限于全乳、乳清、脂肪酸或酯化的脂肪酸。

有机杀真菌剂的实例包括但不限于通过有机认证标准的任何杀真菌剂，例如生物控制剂、天然产物、诱导物(其中一些也可被归为天然产物)、以及硫和铜杀真菌剂(限于有限的用途)。

硫基杀真菌剂的实例为Kumulus^TMDF(BASF,Germany)。

铜杀真菌剂的实例为2000DF(Griffin Corporation、USA)。

诱导物的实例包括但不限于壳聚糖、Bion^TM、BABA(DL-3-氨基-正丁酸，β-氨基丁酸)以及Milsana^TM(Western Farm Service、Inc.、USA)。

在某些实施方案中，可以使用非有机杀真菌剂。非有机杀真菌剂的实例包括但不限于Bravo^TM(用于葫芦上的PM控制)；Supershield(Yates，NZ)(用于玫瑰上的葡萄孢和PM控制)；200EW(用于葡萄和葫芦上的PM控制)；Flint^TM(用于苹果和葫芦上的PM控制)；WG(用于谷类的锈菌和PM控制)；以及Captan^TM，Dithane^TM、Euparen^TM、Rovral^TM、Scala^TM、Shirlan^TM、Switch^TM和Teldor^TM(用于葡萄上的葡萄孢控制)。

农药的实例包括但不限于腈嘧菌酯、双苯三唑醇、萎锈灵、Cu₂O、清菌脲(cymoxanil)、环唑醇、环丙嘧啶、dichlofluamid、苯醚甲环唑、烯唑醇、依普座、拌种咯、咯菌腈、fluquiconazole、氟硅唑、粉唑醇、呋霜灵、双胍盐(guazatin)、己唑醇、恶霉灵、烯菌灵、酰胺唑、环戊唑醇(ipconazole)、醚菌酯、代森猛锌、甲霜灵、R-甲霜灵、叶菌唑、恶霜灵、稻瘟酯(pefurazoate)、戊菌唑(penconazole)、戊菌隆、咪酰胺、丙环唑、咯喹酮(pyroquilone)、SSF-109、螺环菌胺、戊唑醇、涕必灵、tolifluamid、咪唑嗪、三唑酮、三唑醇、氟菌唑、灭菌唑和烯效唑。

不同于本文所述的真菌菌株的生物控制剂的实例是包含奥德曼细基格孢(Ulocladium oudemansii)的BotryZen^TM生物控制剂。

此外，所述的组合物还可以包含广泛的用于增强活性组分的添加剂(例如稳定剂和渗透剂)和用于改善孢子活力、萌芽和生存性的所谓“应激”(stressing)添加剂(例如氯化钾、甘油、氯化钠和葡萄糖)。此外，添加剂还可以包括帮助维持微生物有机体在长期储存中的存活力的组合物，例如未精炼的玉米油和所谓的反相乳液(在外面包含油和蜡的混合物，在里面包含水、海藻酸钠和分生孢子)。

如本领域的技术人员所理解的那样，重要的是使用的任何添加剂以不影响生物控制剂的有效性的量存在。

US5780023提供了包含载体、防腐剂、表面活性剂、湿润剂、展开剂和营养素的合适组合物的实例，该文献以引用方式全文并入本文。

本申请人也已经确定许多常用杀真菌剂不会不利地影响本文所述的昆虫病原真菌(当其存在时)。包含所述真菌的本发明的组合物因此也可包含这些杀真菌剂。备选地，在控制程序中本发明组合物可以联合此类杀真菌剂、但是分开地使用。

此外，本发明还提供了生产包含本发明的一种或多种脂类或其一种或多种功能变体、以及本文所述的一种或多种昆虫病原真菌的组合物的方法，所述方法包括提供具有繁殖活力形式的所述的昆虫病原真菌，以及将具有繁殖活力形式的所述的昆虫病原真菌与至少一种农业上可接受的载体结合。

可以制备多种形式的所述的组合物。一种制备物包含可撒在植物或其周围上的粉末形式的本发明组合物。在另一种形式中，所述的组合物与稀释剂(例如水)混合以形成喷雾剂、泡沫、凝胶或浸蘸剂，并使用已知的方案合适地应用。在目前优选的实施方案中，使用加压喷雾器以大约lgm/L或大约1至3kg/ha在每公顷不低于1000L的水中将如上述配制的组合物与水混合。优选地，以大约lml/L将Deep Fried^TM或Fortune Plus^TM加入到组合物中作为UV和干燥防护剂。可以以类似的方式应用包含蜡蚧霉、长孢蚧霉或玫烟色拟青霉的组合物。

此外，还可以按需要使用为其他应用方法(例如注射、擦或刷)来配制的组合物，其可为任何已知的本领域方法。对植物周围或环境(例如土壤、水或种子包衣)间接应用组合物是潜在可能的。

如上文讨论的，包含本文所述的昆虫病原真菌的本发明的组合物作为有效生物控制剂的使用浓度将取决于最终用途、植物的生理条件；病原体感染的类型(包括昆虫物种)、浓度和程度；温度、季节、湿度、在生长季中的阶段和植物的年龄；正在应用的常规杀虫剂或其他处理(包括杀真菌剂)的数量和类型；和植物处理(例如叶的采摘和修剪)而变化。

此外，其他应用技术(包括撒粉、喷淋、土壤浸泡、土壤注射、种子包被、幼苗包被、叶喷雾、曝气、液体喷雾、雾化、熏蒸、使雾散开等)也是可行的，并且在某些环境(例如感染根或茎的昆虫，或者对易损草木或观赏植物的应用而言)下是需要的。这些应用方法对于本领域的技术人员而言是公知的。

此外，本发明的杀虫剂组合物还可以配制用于地区的防止或预防用途，并且在某些环境下所述的组合物可以用于宠物、家畜、动物垫草窝，或者用于农场设备中及周围，谷仓、住处，或者农业或工业设施等。

用于环境、系统、局部或叶敷的杀虫剂组合物的浓度将广泛地随着特定配方的本性、应用的手段、环境条件以及杀虫剂活力的程度而改变。通常，生物杀虫剂组合物以至少大约1重量％的浓度存在于应用的配制物中，并且可以至多并包括大约99重量％。脂类组合物的干燥配制物可以占脂类组合物的大约0.01重量％至大约99重量％或更多，而液体配制物通常可以包含大约1重量％至大约99重量％的活性组分。因此，多种配制物是可制备的，包括这些配制物，其包含大约5重量％至大约95重量％或更高的杀虫剂脂类；包括这些配制物，其包含大约10重量％至大约90重量％或更高的杀虫剂脂类。自然地，包含大约15重量％至大约85重量％或更高的杀虫剂脂类的组合物、以及包含大约20重量％至大约80重量％或更高的杀虫剂脂类的配制物也落入本公开考虑的范围内。

在其中包含完整的真菌细胞(其包含杀虫剂脂类)的组合物的情况下，制备物通常包含大约10⁴至大约10⁸细胞/mg，但是在某些实施方案中，理想的是使用包含大约10²至大约10⁴细胞/mg的配制物，或者在需要较高浓度的配制物时，还可以配制包含大于10⁸至大约10¹⁰或10¹¹细胞/mg的组合物。备选地，可以制备包含大约10¹²至10¹³细胞/mg活性脂类的等价物的细胞浆、孢子浓缩物或脂类悬浮浓缩物，并且这种浓缩物可以在使用前稀释。

可以根据需要，在一个或多个应用中，将上文所述的杀虫剂配制物给与特定的植物或目标区域，并且可以使用每公顷典型的田间应用比率，该比率的数量级为大约50g/公顷至大约500g/公顷活性组分，或者备选地为大约500g/公顷至大约1000g/公顷。在某些情况下，可能更理想的是以大约1000g/公顷至大约5000g/公顷或更高的活性组分的应用比率将杀虫剂配制物应用于目标区域。实际上，使用这种杀虫剂配制物，考虑大约50g活性脂类/公顷至大约10000g/公顷的所有应用比率来用于管理、控制和杀死目标害虫。因此，大约100g/公顷、大约200g/公顷、大约300g/公顷、大约400g/公顷、大约500g/公顷、大约600g/公顷、大约700g/公顷、大约800g/公顷、大约900g/公顷、大约1kg/公顷、大约1.1kg/公顷、大约1.2kg/公顷、大约1.3kg/公顷、大约1.4kg/公顷、大约1.5kg/公顷、大约1.6kg/公顷、大约1.7kg/公顷、大约1.8kg/公顷、大约1.9kg/公顷、大约2.0kg/公顷、大约2.5kg/公顷、大约3.0kg/公顷、大约3.5kg/公顷、大约4.0kg/公顷、大约4.5kg/公顷、大约6.0kg/公顷、大约7.0kg/公顷、大约8.0kg/公顷、大约8.5kg/公顷、大约9.0kg/公顷、以及等于并包括大约10.0kg/公顷或更高比率的活性脂类用于上文所述的杀虫剂配制物的某些农业、工业和家庭应用中。

例如，在某些应用中，包含本文所述的真菌的组合物可以以大约1x10¹⁰至大约1x10¹⁵孢子/公顷、优选为大约1x10¹²至大约1x10¹⁴孢子/公顷、更优选地为大约5x10¹²至大约1x10¹⁴孢子/公顷、更优选地为大约1-3x10¹³孢子的比率施加。

液体组合物的代表性应用比例包括在使用此类杀虫剂配制物时，考虑范围在大约50mL活性脂类/公顷至大约20L/公顷的应用比率来用于管理、控制和杀死目标害虫。因此，可以使用比例为大约100mL/hectare、大约200mL/公顷、大约300mL/公顷、大约400mL/公顷、大约500mL/公顷、大约600mL/公顷、大约700mL/公顷、大约800mL/公顷、大约900mL/公顷、大约1L/公顷、大约1.1L/公顷、大约1.2L/公顷、大约1.3L/公顷、大约1.4L/公顷、大约1.5L/公顷、大约1.6L/公顷、大约1.7L/公顷、大约1.8L/公顷、大约1.9L/公顷、大约2.0L/公顷、大约2.5L/公顷、大约3.0L/公顷、大约3.5L/公顷、大约4.0L/公顷、大约4.5L/公顷、大约6.0L/公顷、大约7.0L/公顷、大约8.0L/公顷、大约8.5L/公顷、大约9.0L/公顷、以及等于并包括大约10.0L/公顷或更高的活性脂类。

在另一个方面中，本发明提供了用于控制一种或多种植物病原昆虫的方法，该方法包括向植物或其周围施加本文所述的脂类。

在一个实施方案中，所述的应用为本文示例的一种或多种脂类级份以及本文所述的一种或多种其他的昆虫病原真菌。

优选地，所述的一种或多种其他真菌选自球孢白僵菌菌株K4B3(NMIA编号No.No.V08/025855)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA编号No.NM05/44593)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA编号No.NM05/44594)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA编号No.NM06/00007)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA编号No.NM05/44595)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA编号No.NM06/00010)或具有其鉴别特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA编号No.NM06/00009)或具有其鉴别特征的菌株；以及玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA编号No.NM06/00008)或具有其鉴别特征的菌株。

而且，无论本发明的脂类是否与昆虫病原真菌(具有对抗一种或多种植物病原昆虫物种的活性)的多种菌株结合，在控制过程中可以使用多种本发明的脂类。

通常，幼苗最容易受到害虫的损害。因此，考虑对新移植的农作物使用本发明的组合物(在突出体之前)，该组合物应用于突出体。

此外，还考虑在一个农作物周期中的相同或不同时间的重复应用。可以在季节的早期或晚期应用本发明的杀虫剂脂类和包含本发明的杀虫剂脂类的组合物。这可以在在开花时间内(over flowering)或在结果期期间。此外，可以在临收获前或收获后立即应用本发明的杀虫剂脂类或包含本发明的杀虫剂脂类的组合物，以迅速定植坏死的或开始衰老的叶、果实、茎、机收秆等，从而防昆虫定植。此外，还可以对冬季的休眠植物应用本发明的杀虫剂脂类或本发明的组合物，以延缓昆虫在休眠组织上的生长。

可以在裂芽(bud burst)前或后、以及收获前和后的时间应用。然而，优选在开花和收获之间进行处理。为了增加效力，多次应用(例如在开花阶段到结果阶段应用2至6次)本发明的杀虫剂脂类或本发明的组合物是优选的。

此外，在预后考虑再应用本发明的杀虫剂脂类或组合物。使用昆虫感染性预测模型或感染性分析数据，还可以对BCA的应用进行定时，以说明昆虫感染的风险期。

在多种示例性实施方案中，本发明的脂类以及包含此类脂类的组合物在以能够取得杀虫效力的剂量比率对所施加的植物或植物周围是无害的。

在目前优选的实施方案中，例如上文所述，使用加压喷雾器，以溶液的形式应用本发明的杀虫剂脂类或包含该脂类的组合物。应当对植物部分轻轻地喷洒直至溶液直到恰好要流下之前，理想的是确保完全覆盖。可以对植物的任何部分和/或其周围进行应用，例如对全部植物冠层，对冠层中花和发育中的果实集中的区域，或对植物茎和/或对根、块茎等附近或周围的土壤、水或生长培养基等。

优选地，所述的组合物是稳定的。如本文所用，术语“稳定的”是指组合物能够在数周内，优选大约1、大约2、大约3、大约4、优选大约5、更优选大约6个月或更长时间内支持杀虫效力。优选地，所述的组合物是稳定的，不需要在特殊条件下储存，例如冷藏或冷冻。

所施加的组合物会控制植物病原昆虫。植物病原昆虫是造成许多收获前和收获后疾病的原因，这些疾病攻击植物部分并降低生长速率、开花、结果、产量，并且可以引起感染植物的死亡。如本文所用，植物病原昆虫包括其自身为植物病原体的昆虫和可作为其他植物病原体(例如植物病原真菌和细菌)的载体的携带者。应该理解的是，通过控制作为其他植物病原体携带者的宿主昆虫可以减少植物疾病的发病率和/或严重度。

下表1示出了主要植物病原昆虫的实例，其中所述的植物病原昆虫影响了在New Zealand生长的多种重要的园艺农作物。

表1.主要的昆虫害虫

特别考虑使用本发明的脂类、组合物和方法来控制上文所述的农作物中半翅目，例如粉虱、蓟马、蚜虫和毛虫。此外，还特别考虑使用本发明的脂类(单独使用，或者与一种或多种球孢白僵菌真菌菌株一起、或与蜡蚧霉或玫烟色拟青霉一起)和本发明的组合物来控制瓦螨属。

本发明的方法特别用于收获前或收获后的植物和植物产品。例如，可对上面列举类型的储存产品(包括水果、蔬菜、切花和种子)施加本发明的组合物。合适的应用技术涵盖上文确认的那些，特别是喷雾。

相对于直接应用于植物而言，所述的组合物可以潜在地用于处理或预处理土壤或种子。所述的组合物可以应用于植物加工材料，例如保护性包衣、盒子和包装物。

此外，本发明还涵盖使用本发明的脂类或本发明的组合物直接处理的植物、植物产品、土壤和种子。

本发明以之前所述为主要部分，并且还设想以下部分，下文仅给出实施例，并决不限定本发明的范围。

实施例1-昆虫控制的生物测试

本实施例描述了稳健性测试的研发，从而测定多种脂类的杀虫效力。

使用标准：1)有效性、2)易感性和3)使用的容易情况来研发和评估目标昆虫的测试。

所有试验均使用在常温室内、在甘蓝植物上饲养的目标昆虫桃蚜(Myzus persicae)(桃蚜(green peach aphid)，半翅目)。使用脂类级份样品接种蚜虫，将蚜虫转移至一块甘蓝叶上，该甘蓝叶位于1％水琼脂平板的表面上，其中所述的平板在叶和琼脂之间使用0.05％Tween80作为润湿剂。使用年龄混合的蚜虫，通常位于30-50皮氏培养皿之间。

对手持式Paasche喷枪进行改造，以采用微量的体积，并用于使300μl的测试或控制溶液雾化。随后，将具有经处理的蚜虫的平板保持在20℃、12h光照：12h黑暗下，并每天检查。移除死亡的。在喷洒后直接计数接种的蚜虫，以避免在死亡率％中包含了新生的蚜虫，但是不必在温育过程中尝试移除新生的幼虫。

实施例2-昆虫控制的生物测试

本实施例描述了大范围生物测试的研发，以测定杀虫效力。

使用标准：1)有效性、2)易感性和3)使用的容易情况来研发和评估多个目标昆虫的测试。测试4种昆虫系统：粉虱、菜娥、粉虫和蚊子。

1.粉虱幼虫(半翅目)

粉虱为主要的目标物种，通常缺乏合适的控制试剂。粉虱幼虫得自Bioforce Ltd(Auckland、New Zealand)。使用K4B3脂类级份的样品和对照肉汤通过喷雾塔来接种大约100只的几组幼虫。

2.粉虫(黄粉虫(Tenebrio molitor))幼虫(鞘翅目)

黄粉虫得自生物供应商。使用K4B3脂类样品或水对照来喷洒10只幼虫，并监测2周。

3.菜娥-DBM(小菜娥(Plutella xylostella))幼虫(鳞翅目)

菜娥是全世界范围内芸苔农作物的主要害虫，并且是对大部分控制化学品具有抗性的昆虫。培养物得自Lincoln University，用于测试K4B3脂类样品。

标准方法使用小型的喷雾塔。对手持式A320喷枪进行改造，以采用微量的体积，使脂类样品或控制溶液雾化。将幼虫保持在小的甘蓝叶上，该甘蓝叶位于水琼脂平板(水+1％琼脂)的表面上，其中所述的平板使用了0.05％Tween80。使用年龄混合的蚜虫，通常位于30-50皮氏培养皿之间。5-20个所有大小(1龄若虫至预蛹期)的幼虫均用于各试验中。在一个测试中，还将幼虫浸渍在溶液滴中。微滴喂食试图测定毒性是局部的还是被摄取。

将38只2龄-6龄若虫幼虫接种K4B3脂类级份，并将19只幼虫作为对照。接种后，将幼虫在20℃下保持在16hL:8hD中。

4.蚊子幼虫

实施生物测试，其中将改变量的K4B3脂类级份加入到大约12.5mL水的瓶(包含Culex perviligans的幼虫)中。该幼虫接近蛹化，并且一些幼虫可能在试验过程中蛹化。

实施例3-杀虫剂脂类的鉴别

引言

本实施例描述了由球饱白僵菌K4B3制备得到的杀虫剂脂类的鉴别。

方法

使球饱白僵菌K4B3的培养物在摇瓶和200L生物发酵罐中生长。使用甲醇提取冷冻干燥的样品并干燥。将残余物溶解于50％乙醇中，并使用二氯甲烷提取。用水洗涤二氯甲烷，以除去不需要的共提取物。将少部分剩余的二氯甲烷提取物感染，再溶解于甲醇中，并进行MS分析。

在Strata SI-1 Silica柱(Phenomenex)上进行分馏法。将粗糙样品溶解于少量的二氯甲烷中，加载到Silica柱上，并使用异丙醇和二氯甲烷的混合物(在多个步骤中，将100％二氯甲烷加入到100％异丙醇中)洗脱，然后使用甲醇和二氯甲烷的混合物(在多个步骤中，将100％甲醇加入到100％异丙醇中)洗脱。

Waters Acquity UPLC(Waters、Milford、MA)与Waters-MicromassQuattro Premier三重四极光谱仪(Waters-Micromass、Manchester、UK)偶联。在40℃下，使用Acquity C18 BEH1.7μm柱50x1mm进行分离。使用水(A)和乙腈(B)流动相以0.25mL/min洗脱柱，其中所述的流动相均包含0.1％甲酸。最初的组合物为：在1min内，由100％A洗脱；在1至7min之间，由100％A至100％B的线性梯度洗脱；然后在7至9min之间，由100％B洗脱；最后在9至11分钟之间，所述的柱使用100％A再平衡。

电喷雾离子化源在正极模式下，在100℃、毛细管3kV、锥孔60V、氮脱溶剂200l/h(250℃)、锥孔气50l/h下操作，并使用3豪巴氩气操作碰撞池。使用40eV的碰撞能量(CE)获得由质子化分子阳离子得到的子离子光谱。对于定量分析(非绝对的，而是相对于参照样品而言)而言，使用选择离子记录(SIR)和多反应监测(MRM)。将峰面积与由参照样品获得的峰面积比较。

结论

在甲醇/二氯甲烷第一分级步骤过程中，在20-40％甲醇和60-80％二氯甲烷的混合物下由二氧化硅柱上洗脱甜菜碱脂类。有机溶剂提取的级份的色谱图示于图1中，其中可以看见包含所关注的示例性脂类的峰。

使用质谱(MS)分析所关注的级份。选择所关注的峰用于MS/MS(碎片分析)。如图2中所示，观察到m/z为736、738、760、762、764和766的6种脂类。

进行进一步的分析以分解各脂类的结构。m/z为762.5的示例性脂类的代表性子光谱示于图3中。其中，在m/z500.3处可以看到C18:2脂肪酸的酰基部分的丢失，以及在m/z498.3处可以看到C18:1脂肪酸的酰基部分的丢失。随后丢失的水分子在m/z482.2和480.4处是明显的。在丢失2种脂肪酸后形成的共有的甘油基-N,N,N-三甲基高丝氨酸碎片在m/z236.1处示出。在m/z162.0处观察的峰是在随后丢失甘油从而得到Ν,Ν,Ν-三甲基高丝氨酸后而形成的。

此外，还对5种保留的示例性脂类进行等价分析，由此，通过该分析测定示例性的杀虫剂脂类具有以下所示的式II的一般结构：

其中R₁和R₂均为脂肪酸的脂肪族部分。

在本实施例中测定的特定的示例性甜菜碱脂类的脂肪酸组成示于下表2中。

表2：甜菜碱脂类中的脂肪酸

M+H	脂肪酸A	脂肪酸B
			736	C16:0	C18:2
738	C16:0	C18:l
			760	C18:2	C18:2
762	C18:2	C18:l
			764A	C18:2	C18:0
764B	C18:l	C18:l
			766	C18:l	C18:0

对于764A和764B存在的证据得自碎片数据。M+H764示出了由764亲代脂类最初丢失的C18:0、C18:1以及C18:2脂肪酸。

在生物发酵罐中生长的过程中，在不同时间点下生产的各种甜菜碱脂类的相对量示于图4中。如所示，48hr生长的脂类760为主要的甜菜碱脂类，并且48hr还表示在所测试的时间点下生产的甜菜碱脂类的峰值。

讨论

本实施例阐明了由球孢白僵菌K4B3得到的示例性杀虫剂脂类的结构，并提供一类新的生物控制化合物。

实施例4-杀虫剂脂类的鉴别

引言

本实施例描述了由球饱白僵菌K4B3制备得到的杀虫剂脂类的鉴别。

方法

使球饱白僵菌K4B3的培养物在摇瓶和200L生物发酵罐中生长。使用甲醇提取冷冻干燥的样品并干燥。

将干燥的甲醇提取物(81.936g)再溶解于水(450ml)和甲醇(1L)中，并借助于超声处理。将氯仿(500ml)加入到混合物中，从而得到单相溶液，将该溶液分成2个相等的970ml部分。各部分分别与额外的氯仿(250ml)和水(225ml)一起摇动，其后它们分离到有机相和水相中。将合并的水相(1820ml)分成2个相等的部分，然后将各部分与额外的氯仿(250ml)一起摇动。所得的有几层与大量的有几层(990ml)合并，而2部分水层合并，并在Buchi旋转蒸发仪上浓缩，然后冷冻干燥。将干燥的水层(74.764g，91.2％产率)储存在-20℃的冰箱中。

在真空下由合并的有机相除去溶剂，从而得到2.728g(3.3％产率)氯仿提取物，将该提取物再溶解于50ml氯仿中，并储存在-20℃的冰箱中。

首先，使用氯仿-甲醇-0.8M醋酸钠(30:60:8)对DEAE-Sephadex(22.5g)再平衡，然后使用氯仿-甲醇-水洗涤(30:60:8)。将Beaublast^TM氯仿提取物(2.706g)加载到DEAE-Sephadex柱的氯仿-甲醇-水洗涤(30:60:8)中，并且使用相同的溶剂洗脱非保留的物质(非酸性级份)。然后，使用氯仿-甲醇-0.8M醋酸钠(30:60:8)洗脱酸性级份。

各级份分别浓缩至小体积，并与氯仿和0.88％氯化钾溶液一起摇动。分离后，由各级份得到的下层有机相在无水硫酸镁上干燥，然后过滤并在真空下浓缩至干燥。非酸性级份的产率为1.308g(48.4％)，而酸性级份的产率为0.072g(2.7％)。将各级份再溶解于氯仿中，并储存于-20℃的冰箱中。

在自包装于氯仿中的硅胶60(BDH，120目，121.5g)柱上进行非酸性级份(1.29g)的正常相色谱。将样品加载于氯仿中，然后使用氯仿、氯仿-丙酮(9:1)、以及最终的甲醇洗脱(均为～7.8个床体积)。在真空下将各个亚级份蒸发至干燥后，3种亚级份的产率为：氯仿亚级份，0.609(47.2％)；氯仿-丙酮亚级份，0.142g(11.0％)；以及甲醇亚级份，0.508g(39.4％)。将各亚级份溶解于氯仿中，并储存在-20℃的冰箱中。

在QStar Pulsar i Q-TOF质谱仪上实施Nanospray质谱(MS)。使用包含10mM醋酸铵的1:1氯仿-甲醇以1:20稀释样品，然后进行分析。

结论

进行Nanospray MS/MS(碎片分析)以分解在甲醇亚级份中存在的化合物的结构。观察到m/z为736.6、738.6、758.6 760.6、762.6和764.6的7种甜菜碱脂类。这些甜菜碱脂类的脂肪酸组成示于下表3中。

表3：甜菜碱脂类中的脂肪酸

m/z	脂肪酸A	脂肪酸B
			736.6	C16:0	C18:2
738.6	C16:0	C18:l

758.6	C18:2	C18:3
			760.6	C18:0	C18:2
762.6	C18:0	C18:2
			764.6	C18:0	C18:2
764.6	C18:l	C18:l

讨论

本实施例阐明了由球孢白僵菌K4B3得到的示例性杀虫剂脂类的结构，并提供一类新的生物控制化合物。

实施例5-杀虫剂脂类的生物测试

引言

本实施例描述了对在不同时间点由球饱白僵菌K4B3制备的杀虫剂脂类的评估。

方法

按照上文所述，使球饱白僵菌K4B3的培养物在摇瓶和生物发酵罐中生长。在10天内，在每个24小时时间点处提取16g样品，并按照上文所述使用甲醇提取脂类。将所有的样品冷冻干燥，然后使全强度(FS)的样品处于1.28ml H₂O中、并通过将0.2ml FS在0.8ml H₂O中以1:5稀释(1:5)来进行再构造，随后按照上文实施例1和2所述在生物测试中进行评估。简言之，将300μl各样品喷洒到40只蚜虫上。在该测试中还包括4个阴性对照(仅使用H₂O)。

结论

下表4示出了显示在各处理组中蚜虫死亡率的数据。

表4.蚜虫死亡率的生物测试

结论

如表4可见，所有全强度样品(即，跨越10天中的每一天)都会杀死蚜虫。在第1至5天由样品杀死的蚜虫是高度失水的，而在第5至10天由样品杀死的蚜虫较少失水。

讨论

本实施例表明杀虫剂脂类在生长过程中快速产生，并且杀虫活力的产生持续很长的时间。此外，提取的脂类具有有效的杀虫活力，通常在全强度下通常会杀死100％的目标昆虫，而当更加稀释时，通常会杀死大约50％的目标昆虫。

实施例6-杀虫剂脂类的生物测试

引言

本实施例描述了对由球饱白僵菌K4B3制备的杀虫剂脂类的评估。

方法

按照上文所述，使用50％甲醇:50％CH₂Cl₂提取由球饱白僵菌K4B3得到的脂类级份。将所有的样品冷冻干燥，然后以全强度(FS)和以1:5稀释(1:5)再构造，随后在生物测试中进行评估。简言之，将20μl各样品给与蚊子(Culex pervigilans)幼虫。此外，测试中包含阴性对照(仅MeOH)和阳性对照(S11)。在暴露后的第23小时和第48小时评估死亡率。

结果

下表5呈现了显示各处理组中蚊子死亡率的数据。

表5.蚊子幼虫死亡率的生物测试

结果

如表5可见，级份S5和S8甚至在稀释时还特别表现出显著地杀死蚊子幼虫。

讨论

本实施例表明本发明的杀虫剂脂类具有有效的杀虫活力，从而杀死广泛的目标昆虫物种。

实施例7-球饱白僵菌K4B3脂类对哺乳动物模型的毒性

引言

本实施例描述了K4B3脂类对哺乳动物模型的毒性的评估。

方法

按照实施例1所述分离K4B3脂类。

根据OECD指导原则425(口服急毒-上下增减剂量法)对小鼠实施测试。由于预计所述的材料不具有高毒性，所以选择通过经口插管单次剂量为2000mg/kg的极限测试。除了在特别的环境下，该剂量为OECD所推荐的用于急毒评价的最高剂量。

按照下文，通过经口插管，对5只雌性Swiss小鼠给与单次剂量为2000mg/kg的K4B3脂类。

测试条件

在大约4pm，取消一只小鼠的食物并测量其体重。次日早晨，再次对该小鼠称重，并计算提供剂量为2000mg/kg的K4B3脂类的重量。称量该重量，并使用150μl水稀释。采用填喂法将全部的量给与小鼠。

在定量给药后，允许小鼠立即获取食物。按照OECD指导原则对于theTesting of Chemicals、Revised Draft Guideline425、October2000所指定的那样，在定量给药后密切观察60分钟，然后在定量给药的当天和随后几天多次不时观察小鼠。在第一只小鼠给药后的48小时，对第二只小鼠再次以2000mg/kg体重的剂量给药K4B4多肽。第三、第四和第五只小鼠随后均以48小时的间隔给药，均为2000mg/kg的剂量。

使用不设限的水和食物单独饲养小鼠(除了在定量给药之前的隔夜禁食以外)。每日观察小鼠，并在给药后的2周内测量体重。在定量给药后的第1天、第1周和第2周记录体重，伺候，通过吸入二氧化碳杀死动物，并进行尸检。

结果

在给药K4B3复合物后，在整个观察期，小鼠均保持良好的健康，在定量给药后立即喂食，并且在定量给药当天以及整个试验过程中均保持行为正常，显示无毒性作用，结果表明是无毒性的。

体重。在整个试验过程中，在多个时间间隔下，小鼠的平均体重未变，结果表明是无毒性的。在隔夜禁食后，小鼠体重通常平均损失2.4克。在定量给药后恢复供食后的第二天，这种损失大部分会恢复，并且在定量给药后的整个2周观察期中小鼠都保持它们的体重，表明是无毒性的。

尸检结果。在验尸时未观察到小鼠的异常，并且小鼠的肝脏、肾、脾、心、肺和肠(幽门至肛门)的重量均在它们的正常范围内，结果表明是无毒性的。

讨论

使小鼠口服给药剂量为2000mg/kg的K4B3脂类未引起可辨的不利作用，其中未发生死亡，尸检时未记录异常，器官重量均在正常范围内，并且小鼠的行为完全正常，结果表明急性毒性低。

该结果表明K4B3脂类显示低的急性口服毒性，其LD50大于2000mg/kg体重。该结果表明根据the New Zealand Hazardous Substancesand New Organisms(HSNO)Act1996，K4B3脂类应该归类为最低危害类别。

工业应用

正如从以上描述中显而易见地，本发明提供了用于控制昆虫(例如植物病原昆虫)的由丝状真菌得到的杀虫剂脂类、以及包含该脂类的组合物。此外，还此类脂类以及脂类级份在控制昆虫(例如植物病原昆虫)的方法中的用途。本发明的脂类和组合物在广泛的农业和园艺应用中具有用途。

为了清楚地理解，通过说明和实例，现在已经完全详细地描述了本发明，对于本领域的普通技术人员而言，显而易见的是在不影响本发明的范围或其任何特定的实施方案的条件下，可以通过在广泛且等价的条件、配制和其他参数范围内对本发明进行修改或改变来实施本发明，并且这些修改和改变都将涵盖在所附的权利要求书的范围内。

本领域的任一技术人员都将理解的是在本发明的实施过程中，除了具体举例说明的那些以外，还可以使用其他的起始材料、试剂、纯化方法、材料、底物、装置部件、分析方法、测试方法、成分的混合物和组合，而无需借助于过度的试验。任何这种材料和方法的所有本领域已知的功能等价物均包含在本发明内。已经使用的术语和表达方法均用作说明性的术语，而非限定性的，并且使用此类术语和表达方法均无意于排除所示的及所描述的特征的任何等价物或其部分，但是应该承认在所要求的本发明的范围内，多种修改是可行的。因此，应该理解的是尽管本发明通过优选的实施方案以及可任选的特征进行了特定的公开，但是本领域的技术人员可以采取本文所公开的概念的修改和改变，并且认为这些修改和改变均在所附的权利要求书定义的本发明的范围内。

如本文所用，“包含”与“包括”、“含有”或“表征为”是同义的，并且是包含在内或开放式的，不排除额外的、未叙述的元素或方法步骤。如本文所用，“由……组成”排除了在权利要求元素中未具体说明的任何元素、步骤或组分。如本文所用，“基本上由……组成”并不排除不会大幅影响权利要求书中的基本的和新颖性特征的材料或步骤。在本文的各个实例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”可以被其他两个术语的任一个替代。

当本发明公开一组材料、组合物、成分或化合物时，应该理解的是这些组及其所有亚组的所有单个的成员均单独公开。当在本文中使用Makush组或其他分组时，该组的所有单个的成员以及该组的所有组合和亚组合均单独地包含在本公开中。本文所描述或示例的成分的各种配制物或组合均可以用于实施本发明，除非另作说明。说明书中无论何时给定一个范围，例如，温度范围、时间范围或组成范围，该给定范围内所包含的所有中间范围和亚范围、以及所有单个的值均包含在本公开中。在本公开和权利要求书中，“和/或”是指额外的或交替的。此外，任何使用的单数形式的术语还涵盖复数形式。

本文所引用的所有参考文献均以引用方式全文并入本文，其程度与本说明书的公开内容保持一致。以参考方式并入本文所提供的一些参考文献，从而提供了关于起始材料、额外的起始材料、额外的试剂、额外的合成方法、额外的分析方法、额外的生物材料、额外的核酸、化学修饰核酸、额外的细胞、以及本发明的额外的用途的来源的详细情况。本文使用的所有标题仅仅为了方便。本说明书中体积的所有专利和出版物均表明了本发明所属技术领域的技术人员的技术水平，并且以引用方式并入本文，如同每份单个的出版物、专利或专利申请均特意地且单独地以参考方式并入本文。本文所述的参考文献以引用方式全文并入本文，表明截至它们的公开或提交日期时的技术陈述，并且如果需要，本文可以使用这些信息，从而排除了现有技术的具体的实施方案。

出版物

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Georghiou、G.P.1981The occurrence of resistance to pesticides inarthropods、an index of cases reported through1980.FAO of UN、Rome1981.172p.

Gorman、K.；Devine、G.J.；Denholm、I.2000Status of pesticide resistancein UK populations of glasshouse whitefly、Trialeurodes vaporariorum、and thetwo-spotted spider mite、Tetranychus urticae.The BCPC Conference:Pests anddiseases:1:459-464.

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Claims (84)

1.一种式I所示的经分离、纯化或基本纯的脂类：

其中R₁和R₂可以相同或不同，且均为脂肪酸的脂肪族部分，并且其中R₃、R₄和R₅均独立地选自这样的组，该组包含或由H、羟基、羧基、酰胺基、未取代的或取代的烷基、未取代的或取代的烯基、未取代的或取代的炔基、以及未取代的或取代的芳基部分组成。

2.用于控制一种或多种昆虫的根据权利要求1的脂类。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的脂类，其中R₁和R₂独立地选自这样的组，该组包含C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C18单不饱和脂肪酸、C18双不饱和脂肪酸以及C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

4.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁和/或R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分。

5.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁和/或R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分。

6.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁和/或R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

7.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁和/或R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

8.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁和/或R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

9.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分。

10.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

11.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18双不不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

12.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分。

13.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

14.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

15.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C16饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

16.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分.

17.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

18.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

19.根据权利要求1所述的脂类，其中R₁为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

20.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分。

21.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

22.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

23.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

24.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

25.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

26.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

27.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

28.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

29.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R1为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

30.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R1为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

31.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18单不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R1为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

32.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

33.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

34.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

35.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

36.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₂为C18双不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

37.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

38.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₁为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分，而R₂为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

39.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R2为C18三不饱和脂肪酸的脂肪族部分。

40.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₃、R₄和R₅均为H或甲基。

41.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中R₃、R₄和R₅均为甲基。

42.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中所述的脂类为1，2-二酰基甘油基-3-O-4′-(N，N，N-三甲基)-高丝氨酸(二酰基甘油基-N，N，N-三甲基高丝氨酸，DGTS)。

43.根据权利要求1至3的任意一项所述的脂类，其中所述的脂类为1，2-二酰基甘油基-3-O-2′-(羟甲基)-(N，N，N-三甲基)-β-丙氨酸、或1，2-二酰基甘油基-3-O-羧基-(羟甲基)-胆碱。

44.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的、杀虫有效量的一种或多种脂类、以及一种或多种载体。

45.一种富含根据权利要求1所述的一种或多种脂类的组合物，其中所述的组合物为或包含细胞提取物、细胞悬浮物、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液、细胞团、子囊菌门的一种或多种真菌培养物的一种或多种细胞或者由该培养物得到的一种或多种细胞。

46.根据权利要求44或45所述的组合物，其中该组合物中加入了根据权利要求1所述的一种或多种脂类。

47.根据权利要求44至46的任意一项所述的组合物，其中该组合物中加入了由所述的子囊菌门的一种或多种真菌培养物得到的有机溶剂提取物，其中所述的有机溶剂提取物包含根据权利要求1所述的一种或多种脂类。

48.根据权利要求44至47的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物包含生殖活力形式和量的一种或多种真菌。

49.根据权利要求48所述的组合物，其中所述的一种或多种真菌显示为孢子。

50.根据权利要求44至49的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物配制成粉末、粉剂、丸、颗粒、喷雾、乳化剂、胶体或溶液。

51.根据权利要求44至50的任意一项所述的组合物，其中所述的一种或多种脂类以大约1重量％至大约99重量％的浓度存在。

52.根据权利要求44至52的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物为能够能够保持杀虫效力长达超过大约2个月的稳定的组合物。

53.根据权利要求44至52的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物包含或由单一的真菌菌株衍生得到。

54.根据权利要求45至53的任意一项所述的组合物，其中所述的子囊菌门的真菌为球孢白僵菌菌株K4B3(于2008年10月14日保藏的NMIANo.V08/025855)。

55.根据权利要求44至52、或54的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物包含生殖活力形式和量的一种或多种真菌，该真菌选自球孢白僵菌K4B3NMIA No.V08/025855或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA No.NM05/44593)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA编号No.NM05/44594)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA编号No.NM06/00007)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA编号No.NM05/44595)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA编号No.NM06/00010)或具有其鉴别特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA编号No.NM06/00009)或具有其鉴别特征的菌株；以及玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA编号No.NM06/00008)或具有其鉴别特征的菌株。

56.根据权利要求44至55的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物额外包含：

i)至少一种白僵菌素；或

ii)至少一种类白僵菌素；或

iii)至少一种昆虫病原真菌；或

iv)上述(i)至(iv)的任何两项或多项。

57.根据权利要求44至56的任意一项所述的组合物，其中所述的组合物额外包含一种或多种杀虫剂。

58.根据权利要求1至43的任意一项的一种或多种脂类在制造用于控制一种或多种昆虫的组合物中的用途。

59.由所述的子囊菌门的一种或多种真菌培养物得到的有机溶剂提取物在制造用于控制一种或多种昆虫的组合物中的用途，其中所述的有机溶剂提取物包含根据权利要求1至43的任意一项所述的一种或多种脂类。

60.根据权利要求59所述的用途，其中所述的一种或多种真菌为球孢白僵菌K4B3NMIANo.V08/025855或具有其鉴别特征的菌株。

61.一种控制一种或多种昆虫的方法，该方法包括将所述的一种或多种昆虫与根据权利要求1至43的任意一项所述的有效量的一种或多种脂类、或与权利要求44至57的任意一项所述的有效量的组合物接触。

62.一种用于控制一种或多种昆虫的方法，该方法包括向某一场所施加根据权利要求1所述的一种或多种脂类或其功能变体、或根据权利要求44至57的任意一项所述的组合物、以及可任选地至少一种昆虫病原真菌。

63.一种完全或部分逆转昆虫对一种或多种杀虫剂或一种或多种昆虫病原试剂的抗性的方法，该方法包括向某一场所施加根据权利要求1所述的一种或多种脂类或其功能变体、或根据权利要求44至57的任意一项所述的组合物，或者将所述的昆虫与根据权利要求1所述的一种或多种脂类或其功能变体、或根据权利要求44至57的任意一项所述的组合物接触。

64.根据权利要求63所述的方法，该方法包括向某一场所施加所述的一种或多种脂类、以及一种或多种杀虫剂或一种或多种昆虫病原试剂、或它们的任意组合，或者将所述的昆虫与所述的一种或多种脂类、以及一种或多种杀虫剂或一种或多种昆虫病原试剂、或它们的任意组合接触。

65.根据权利要求63或64所述的方法，其中给与的所述的一种或多种杀虫剂或者一种或多种昆虫病原试剂与所述的昆虫对其具有或预计具有或成为具有抗性的那些是相同的。

66.一种控制一种或多种昆虫的方法，其中所述的昆虫已经与根据权利要求1所述的一种或多种脂类接触，该方法包括向某一场所施加有效控制所述的一种或多种昆虫的量的杀虫剂或昆虫病原试剂，或者将所述的一种或多种昆虫与所述的一种或多种昆虫的量的杀虫剂或昆虫病原试剂接触。

67.权利要求66所述的方法，其中所述的本发明的一种或多种脂类、以及所述的一种或多种杀虫剂或昆虫病原试剂的施加或接触是同时的、依次的或分开的。

68.一种完全或部分逆转昆虫对一种或多种杀虫剂或一种或多种昆虫病原试剂的抗性的方法，该方法包括向某一场所施加昆虫病原真菌、以及可任选地杀虫剂或昆虫病原试剂，或者将所述的一种或多种昆虫与昆虫病原真菌、以及可任选地杀虫剂或昆虫病原试剂接触。

69.根据权利要求68所述的方法，其中该方法包括向某一场所施加昆虫病原真菌、以及根据权利要求1所述的一种或多种脂类或其功能变体、或者根据权利要求44至57的任意一项所述的组合物，或者将所述的一种或多种昆虫与昆虫病原真菌、以及根据权利要求1所述的一种或多种脂类或其功能变体、或者根据权利要求44至57的任意一项所述的组合物接触。

70.根据权利要求62至69的任意一项所述的方法，其中当所述的一种或多种真菌存在时，其为选自球孢白僵菌K4B3NMIA No.V08/025855或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V1(NMIANo.NM05/44593)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA编号No.NM05/44594)或具有其鉴别特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA编号No.NM06/00007)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA编号No.NM05/44595)或具有其鉴别特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA编号No.NM06/00010)或具有其鉴别特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA编号No.NM06/00009)或具有其鉴别特征的菌株；以及玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA编号No.NM06/00008)或具有其鉴别特征的菌株中的一种或多种菌株。

71.根据权利要求61至70的任意一项所述的方法，其中所述的一种或多种昆虫的一种或多种为植物病原昆虫。

72.根据权利要求61至71的任意一项所述的方法，其中所述的一种或多种昆虫的一种或多种为半翅目。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述的植物病原昆虫选自蚊子、蛾子(包括菜娥)、蓟马(缨尾目)、蚜虫、木虱、蚧壳虫或粉虱。

74.根据权利要求62至65、或69至73的任意一项所述的方法，其中预防性地施加所述的一种或多种脂类或所述的组合物。

75.根据权利要求62至65、或69至74的任意一项所述的方法，其中在所述的场所存在所述的一种或多种昆虫时，施加所述的一种或多种脂类或所述的组合物。

76.根据权利要求62至65、或69至75的任意一项所述的方法，其中将所述的一种或多种脂类或所述的组合物直接施加到所述的场所中。

77.一种制备具有对抗昆虫的杀虫剂活力的组合物的方法，该方法包括由能够合成所述的一种或多种脂类的细胞培养物分离根据权利要求1所述的一种或多种脂类；以及将所述的一种或多种脂类与载体结合形成所述的组合物。

78.权利要求77所述的方法，其中所述的培养物为所述的子囊菌门的一种或多种真菌的培养物。

79.一种用于生产生物控制组合物的方法，该方法包括：提供所述的子囊菌门的一种或多种真菌的培养物；将所述的培养物保持在适于生产根据权利要求1所述的至少一种脂类的条件下；以及

i)将所述的至少一种脂类与载体结合，或

ii)将所述的至少一种脂类与本文所述的一种或多种昆虫病原真菌结合，或

iii)由所述的一种或多种真菌的培养物分离所述的至少一种脂类，或

iv)至少部分纯化或分离所述的至少一种脂类，或

v)(i)至(iv)的两项或多项的任意组合物，

由此形成所述的组合物。

80.根据权利要求79所述的方法，其中该方法在所述的保持步骤之后额外地包括一步或多步细胞溶解步骤。

81.一种制备杀虫剂脂类的方法，该方法包括：对所述的子囊菌门的一种或多种真菌的培养物或培养物提取物进行有机溶剂提取；由一种或多种其他化合物至少部分分离根据权利要求1所述的一种或多种脂类；以及回收所述的一种或多种脂类。

82.根据权利要求81所述的方法，其中所述的有机溶剂为或包含氯仿、二氯甲烷、烷醇(包括短链烷基醇，例如但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、或它们的两种或多种的任意组合)。

83.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述的分离为色谱法，包括阴离子交换色谱和薄层色谱。

84.根据权利要求77至83的任意一项所述的方法，其中所述的培养物为球孢白僵菌K4B3NMIA No.V08/025855或具有其鉴别特征的菌株的培养物。