MX2015001976A - Cepa de bacillus sp. con actividad antifungica, antibacteriana y de promocion del crecimiento. - Google Patents

Abstract

Una cepa de Bacillus, aislado F727 de Bacillus sp., que produce metabolitos con actividad plaguicida. Composiciones y metabolitos bioactivos derivados de cultivos del aislado F727 de Bacillus sp. con capacidad de controlar plagas; así como métodos para usar la cepa y sus metabolitos para controlar plagas.

Description

CEPA DE BACILLÜS SP. CON ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA, ANTIBACTERIANA Y DE PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud invoca el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° 61/683.174 presentada el 14 de agosto de 2012 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos N° 13/835.677, presentada el 15 de marzo de 2013; cuyas divulgaciones se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad para todos los propósitos.

ANTECEDENTES Y CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente divulgación se relaciona con el campo de los bioplaguicidas y control de plagas; en particular plaguicidas microbianos y las cepas microbianas que los producen.

Los productos naturales son sustancias producidas por microbios, plantas y otros organismos. Los productos naturales microbianos ofrecen una fuente abundante de diversidad química, y existe una larga historia de utilización de productos naturales con propósitos farmacéuticos. A pesar del énfasis en los productos naturales para medicamentos humanos, en donde más del 50% derivan de productos naturales, solamente el 11% de los plaguicidas derivan de fuentes naturales. Sin embargo, los plaguicidas de productos naturales tienen un potencial de tener un rol importante en el control de plagas en granjas convencionales y orgánicas. Los metabolitos secundarios producidos por microbios (bacterias, actinomicetos y hongos) proveen compuestos químicos novedosos que pueden usarse solos o en combinación con compuestos conocidos para controlar eficazmente plagas de insectos y para reducir el riesgo de desarrollo de resistencia. Hay muchos ejemplos bien conocidos de productos naturales microbianos que tienen éxito como insecticidas agrícolas (Thompson y col·., 2000; Arena y col., 1995; Krieg y col.1983).

El desarrollo de un plaguicida microbiano comienza con el aislamiento de un microbio en un cultivo puro. Luego se procede con un tamizaje eficaz y de espectro usando ensayos in vitro, in vivo o a escala piloto en un vivero y en el campo. Al mismo tiempo, se aíslan y se identifican los compuestos activos producidos por el microbio. Para la comercialización de un plaguicida microbiano, el microbio tiene que ser producido económicamente por fermentación a escala industrial y ser formulado con aditivos biocompatibles aprobados para aumentar la eficacia y para maximizar la simplicidad de su aplicación.

Con el desarrollo de resistencia en aumento a los plaguicidas químicos, el espectro de plaguicidas disponibles se reduce. Adicionalmente, los plaguicidas de origen no natural pueden tener efectos perjudiciales para medioambiente. En consecuencia, existe una necesidad de nuevos plaguicidas de origen natural para los cuales los patógenos vegetales no hayan desarrollado resistencia, y que tengan mínimos efectos para el medioambiente.

Breve descripción de la invención En la presente se describe una cepa microbiana, aislado F727 de Bacillus sp. , que tiene actividad plaguicida. Esta 0 cepa produce metabolitos bioactivos activos para el control de plagas y para promover el crecimiento de las plantas. También se describen métodos para usar el aislado 727 de Bacillus sp. y sus metabolitos para el control de plagas y para promover el crecimiento de plantas. En una forma de 5 realización particular, el Bacillus sp. puede tener por lo menos una de las características identificadoras de NRRL B- 50768.

Adicionalmente, el Bacillus sp. puede tener una secuencia del gen del ARNm de 16S con por lo menos 99% de 0 identidad y particularmente 99,5% de identidad con la secuencia consenso detallada en SEQ ID NO: 3 y que comprende una secuencia directa que tiene por lo menos 99% de identidad y particularmente 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:l, y una secuencia revertida que tiene 5 por lo menos 99% de identidad y particularmente 99,5% de identidad con la secuencia detallada en SEQ ID NO:2.

Además se provee un cultivo sustancialmente puro o caldo de células enteras que comprende dicha cepa, o fracción celular, extracto, sobrenadante y/o sustancias o compuestos derivados de dicha cepa o extracto o de la misma.

Además se provee un método para modular la infestación por plaga en una planta que comprende aplicar a la planta y/o semillas de la misma y/o sustrato usado para hacer crecer a dicha planta una cantidad de dicho aislado F727 de Bacillus sp. (y/o un cultivo, fracción celular, extracto, sobrenadante y/o sustancias o compuestos derivados de dicha cepa o extracto o) que es eficaz para modular dicha infestación por plaga. En ciertas formas de realización, la plaga es un hongo vegetal tal como, por ejemplo, Bremia, Botrytis , Sclerotinia , Sphaerotheca , Rhizoctonia , Colletotrichum, Fusarium, Verticillium, Phytophthora o Bipolar is. En formas de realización adicionales, la plaga es una bacteria tal como, por ejemplo, Erwinia , Pseudomonas , Xanthomonas , Acidovorax o Clavibacter .

También se proveen métodos para promover el crecimiento vegetal y/o germinación de semillas, en donde los métodos comprenden aplicar a la planta y/o semillas de la misma y/o sustrato usado para el crecimiento de dicha planta una cantidad de dicho aislado F727 de Bacillus sp. (y/o un cultivo, fracción celular, extracto, sobrenadante y/o sustancias o compuestos derivados de dicha cepa o extracto o) que es eficaz para promover el crecimiento vegetal y/o germinación de semillas.

En formas de realización particulares, dicho Bacillus produce un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: (a) compuesto "A" que (i) que puede obtenerse de un Bacillus sp. , particularmente, Bacillus sp. aislado 727; (ii) tiene actividad plaguicida; (iii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1020 y 1060 y más particularmente, 1044 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (iv) tiene valores de 1H RMN de d 7,15, 6,72, 4,81, 4,70, 4,65, 4,40, 4,35, 4,25, 4,15, 3,85, 3,65, 3,50, 3,22, 2,85, 2,80, 2,65, 2,45, 2,35, 2,30, 2,20, 1,95, 1,55, 1,31, 1,20 y 0,85; (v) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 12 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 8,31 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa (Pheno enex, Luna 5m C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 mi/min y detección en UV a 210 nm; (vi) opcionalmente contiene 47 carbonos, 72 hidrógenos, 12 nitrógenos, y 15 oxígenos; y (vii) opcionalmente es un péptido y puede comprender glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades); (b) Compuesto "B" que (i) tiene actividad plaguicida; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1030 y 1080 y más particularmente, 1058 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (iii) tiene un tiempo de retención por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 14 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 8,67 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm; (iv) opcionalmente comprende 48 carbonos, 74 hidrógenos, 12 nitrógenos, y 15 oxígenos; y (v) opcionalmente es un péptido y puede comprender glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades); y (c) Compuesto "C" que (i) tiene actividad plaguicida; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1050 y 1120 y más particularmente, 1072 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (iii) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 14 minutos, más específicamente aproximadamente 9 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 9,19 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm; (iv) opcionalmente contiene 49 carbonos, 76 hidrógenos, 12 nitrógenos, y 15 oxígenos; y (v) opcionalmente es un péptido y puede comprender glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades).

En la presente también se provee una cepa de Bacillus que tiene las siguientes características: (a) por lo menos uno de: (1) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 99,5% de identidad con una secuencia de ARNm de 16S detallada en SEQ ID N0:3; (2) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 95% de identidad con una secuencia de recA detallada en SEQ ID NO:10 y (3) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90% de identidad con una secuencia de phoR revertida detallada en SEQ ID NO:13; (b) produce uno o más de los compuestos que (i) tiene actividad plaguicida; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1020 y 1120 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS), y (iii) tiene un tiempo de retención por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 15 minutos en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm, y (iv) opcionalmente son péptidos; (c) es resistente a Kanamicina, Cloramfenicol, Ampicilina, Penicilina, Cefuroxima, Piperacilina, Tetracielina; y (d) posee actividad de fosfatasa alcalina, esterasa, fosfatasa ácida, y naftol-AS-BI-fosfohidrolasa.

También se provee una combinación que comprende dicho aislado F727 de Bacillus sp. , un cultivo sustancialmente puro, fracción celular, extracto, sobrenadante y sustancias, metabolitos o compuestos derivados de dicha cepa o extracto o de la misma y por lo menos uno de (a) una segunda sustancia que puede ser un plaguicida químico o biológico y (b) por lo menos uno de a transportador, diluyente, tensioactivo, adyuvante. La combinación puede ser una composición y puede ser aplicado como recubrimiento sobre una semilla.

Además se provee un método para modular la infestación por plaga en una planta que comprende aplicar a la planta y/o semillas de la misma y/o sustrato usado para el crecimiento de dicha planta una cantidad de dicha combinación eficaz para modular dicha infestación por plaga. En ciertas formas de realización, la plaga es un hongo vegetal tal como, por ejemplo, Bremia, Botrytis, Sclerotinia , Sphaerotheca , Rhizoctonia, Colletotrichum, Fusarium , Verticillium, Phytophthora o Bipolaris. En formas de realización adicionales, la plaga es una bacteria tal como, por ejemplo, Erwinia , Pseudomonas , Xanthomonas , Acidovorax o Clavibacter.

Además se provee el uso de una composición, opcionalmente en combinación con una o más segundas sustancias, para formular una composición plaguicida, en donde la composición se selecciona del grupo que consiste en uno o más de: (a) un cultivo sustancialmente puro de aislado F727 de Bacillus sp. , (b) una fracción celular de un cultivo de aislado F727 de Bacillus sp. , (c) un sobrenadante obtenido de un cultivo de aislado F727 de Bacillus sp. , (d) un filtrado obtenido de un cultivo de aislado F727 de Bacillus sp. , (e) un extracto o de cualquiera de (a), (b), (c) o (d), (f) un metabolito producido por un cultivo de aislado F727 de Bacillus sp. , (g) compuesto A, (h) compuesto B, y (i) compuesto C; y la segunda sustancia se selecciona del grupo que consiste en: (a) un plaguicida, (b) un agente promotor del crecimiento vegetal, (c) un transportador, (d) un adyuvante, (e) un tensioactivo, (f) un fertilizante, y (g) un agente antifitopatogénico.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una representación esquemática del esquema de purificación para obtener los compuestos de la invención del caldo de cultivo.

La Figura 2 describe el cromatograma de ESI-LCMS para el compuesto "A".

La Figura 3 describe el (+) ESIMS para el compuesto "A".

La Figura 4 describe el cromatograma de ESI-LCMS para el compuesto "B".

La Figura 5 describe el (+) ESIMS para el compuesto "B".

La Figura 6 describe el cromatograma de ESI-LCMS para el compuesto "C".

La Figura 7 describe el (+) ESIMS para el compuesto "C".

La Figura 8 describe la bioactividad de la fracción VLC 3 (F727F3 en la Figura), y el Compuesto A purificado por HPLC (F727F3H11 en la Figura), Compuesto B (F727F3H14 en la Figura) y Compuesto C (F727F3H17 en la Figura) contra cuatro patógenos fúngicos: Botrytis cin rea (Botrytis en la Figura), Sclerotinia homeocarpa (Sclerotina en la Figura), Rhizoctonia solani (Rhizoctonia en la Figura) y Bipolaris maydis (Bipolaris en la Figura).

La Figura 9 muestra el efecto del sobrenadante de F727 sobre Botrytis cinerea en tomate. Las plantas se inocularon con esporas de B. cin rea a las concentraciones indicadas en la Figura y se trataron con el sobrenadante de una fermentación de F727 de Bacillus sp. (segunda barra desde la izquierda) o Switch® (tercera barra desde la izquierda). Los controles incluyen plantas no inoculadas (barra de la izquierda) y plantas tratadas sin plaguicida inoculadas con dos concentraciones diferentes de los hongos (cuarta y quinta barras de la izquierda).

La Figura 10 muestra el efecto del sobrenadante F727 sobre ildiu polvoroso en lechuga. Las plantas se trataron con el sobrenadante del aislado F727 de Bacillus sp. (F727); Ridomil,.o no se trataron (UTC).

La Figura 11 compara el efecto del sobrenadante de F727 con Fenhexamida sobre Botrytis en tomate. Las plantas que habían sido infectadas experimentalmente con B. cin rea se prerociaron una vez (sobrenadante de F727) o dos veces (sobrenadante de F727 x 2) con sobrenadante de F727, con agua o con Fenhexamida (Elévate®), y se evaluó la severidad de la enfermedad.

La Figura 12 compara el efecto del sobrenadante de F727 con Fenhexamida sobre Botrytis en pimientos. Las plantas se rociaron con el sobrenadante de una fermentación de aislado F727 (F727) de Bacillus sp. , agua, (UTC) o Fenhexamida (Elévate®). Las plantas rociadas se infectaron luego con B. cinerea, se hicieron crecer, y se evaluaron después de 13 dias la severidad de la enfermedad.

La Figura 13 muestra medidas del control de la enfermedad sobre pepinos infectados con oidio de la vid y se trataron con diferentes preparaciones de F727. Las células F727 se hicieron crecer en tres medios diferentes: SPY, SMP y TSB, como se indica en la figura. Se obtuvo caldo de células enteras, células (suspendidas en MgSO410 mM), y sobrenadante para cada una de estas condiciones de crecimiento. Se usó agua ("Agua DI" en la figura) como control negativo. También se incluyeron los blancos para medio SMP, medio SPY, medio TSB y MgS0410 mM.

La Figura 14 muestra medidas del control de la enfermedad sobre plantas de tomate infectadas con Botrytis cin rea y tratadas con diferentes preparaciones de F727. Las células F727 se hicieron crecer en tres medios diferentes: SPY, SMP y TSB, como se indica en la figura. Se obtuvo caldo de células enteras, células (suspendidas en MgS0410 mM), y sobrenadante para cada una de estas condiciones de crecimiento. Se usó agua ("Agua DI" en la figura) como control negativo. También se incluyeron los blancos para medio SMP, medio SPY, medio TSB y MgS0410 mM.

La Figura 15 muestra medidas del control de enfermedad en plantas de pepino infectadas con oidio de la vid. Antes de la inoculación con esporas fúngicas, las plantas de rociaron con agua ("Agua DI" en la figura, control negativo), caldo de células enteras de fermentación del aislado F727 (MBI-110 WCB) o uno de un número de plaguicidas comerciales (Double Nickel® (Certis, Bacillus amyloliquefaciens cepa D747) Sonata® ( Bacillus subtilus) , Vacciplant®, Companion®, Serenade® ( Bacillus pumilus) o Regalía® ( Reynoutria sachalinensis) , o una combinación de Regalía® ( Reynoutria sachalinensis) y WCB F727.

La Figura 16 muestra medidas del control de enfermedad en plantas de tomate infectadas con Phytophthora infestans . Antes de la inoculación con P. infestans , las plantas se rociaron con agua ("Agua DI" en la figura, control negativo), Regalía®, Double Nickel® (Certis, Bacillus amyloliquefaciens cepa D747) o caldo de células enteras de la fermentación del aislado F727 (MBI-110 WCB).

La Figura 17 muestra los efectos de sobrenadantes de la fermentación de F727, y controles, en el crecimiento micelial de S. rolfsii en un ensayo in vitro. Se muestran los efectos del agua (Agua DI), sobrenadante de F727 no filtrado (F727 no filtrado), sobrenadante de F727 filtrado (F727 filtrado) y Pristine®. Para cada material de ensayo y control, se evaluaron dos volúmenes: en cada par de barras, la barra del extremo izquierdo muestra los resultados del uso de 25 ml, y la barra del extremo derecho muestra los resultados del uso de 50 ml.

La Figura 18 muestra el efecto de empapado de suelo con WCB de F727 sobre la infección con mildiu polvoroso de lechuga. UTC: plantas de lechuga control no tratadas infectadas con aproximadamente 5xl04 esporas de mildiu polvoroso; empapado de F727: plantas de lechuga que se sometieron a empapado del suelo con WCB de F727 una hora antes de la inoculación con aproximadamente 5xl04 esporas de mildiu polvoroso. Se midió la severidad de la enfermedad como cobertura porcentual de hojas/cotiledones con tejido enfermo.

La Figura 19 muestra resultados de ESIMS/MS para el Compuesto A.

La Figura 20 muestra un diagrama esquemático de la estructura del Compuesto A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Si bien las composiciones y métodos descritos en la presente son susceptibles a diferentes modificaciones y formas alternativas, en la presente se describirán formas de realización ejamplificativas en detalle. Se debe entender, sin embargo, que no se tiene como intención limitar la invención a las formas particulares descritas, sino lo contrario, la intención es cubrir todas las modificaciones, equivalentes, y alternativas que caen dentro del espíritu y alcance de la invención como se definen en las reivindicaciones anexas.

Cuando se provee un rango de valores, se entiende que cada valor interviniente, a la décima de la unidad del limite inferior a menos que el contexto claramente lo indique de otra forma, entre el limite superior e inferior de ese rango y cualquier otro valor indicado o interviniente en el rango detallado, se incluye dentro del mismo. También se incluyen rangos menores. El limite superior e inferior de estos rangos menores también se incluyen dentro del mismo, sujeto a cualquier limite específicamente excluido en el rango indicado.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos téenicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por una persona con experiencia ordinaria en el arte a la cual pertenece esta invención. A pesar de que en la práctica o prueba de la presente invención también puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la presente, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.

Se debe hacer notar que como se usa en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/una", «y" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otra forma.

Como se define en la presente, "derivado de" se refiere a directamente aislado u obtenido de una fuente particular o como alternativa que tiene características identificadoras de una sustancia u organismo aislado u obtenido de una fuente particular. En el evento en que la "fuente" es un organismo, "derivado de" se refiere a que puede ser aislado u obtenido del organismo mismo o medio usado para cultivar o hacer crecer dicho organismo.

Como se define en la presente, los términos "cultivo de caldo completo" y "caldo de células enteras" se refieren a un cultivo líquido que contiene células y media. Si las bacterias se hacen crecer en una placa las células pueden recolectarse en agua u otro líquido, para proveer un cultivo de caldo completo.

El término "sobrenadante" se refiere al líquido remanente cuando las células que se hacen crecer en caldo o recolectadas de otro líquido de una placa con agar son eliminadas por centrifugación, filtración, sedimentación, u otros medios bien conocidos en el arte.

Como se define en la presente, "filtrado" se refiere un líquido de un cultivo de caldo completo que se ha pasado a través de una membrana.

Como se define en la presente, "extracto o" se refiere una sustancia líquida extraída de células por un solvente (agua, detergente, solución amortiguadora) y separada de las células por centrifugación, filtración u otro método.

Como se define en la presente, "metabolito" se refiere a un compuesto, sustancia o subproducto de una fermentación de un microorganismo, o sobrenadante, filtrado, o extracto obtenido de un microorganismo que tiene actividad plaguicida y particularmente, bactericida o fungicida. Como se define en la presente, un ''compuesto aislado" está esencialmente libre de otros compuestos o sustancias, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20% puro, preferentemente por lo menos aproximadamente 40% puro, más preferentemente aproximadamente 60% puro, incluso más preferentemente aproximadamente 80% puro, más preferentemente aproximadamente 90% puro, e incluso más preferentemente aproximadamente 95% puro, según lo determinado por métodos analíticos, que incluyen a título enunciativo no taxativo métodos cromatográficos y electroforéticos. Los términos "metabolito" y "compuesto" pueden usarse como sinónimos.

Un "transportador" como se define en la presente es un material inerte, orgánico o inorgánico, con el cual se mezcla o formula el ingrediente activo para facilitar su aplicación a una planta u otro objeto a tratar, o para facilitar su almacenamiento, transporte y/o manejo.

El término "modular" como se define en la presente se usa para referirse a alterar la cantidad de infestación por plaga o tasa de esparcimiento déla infestación por plaga.

El término "infestación por plaga" como se define en la presente, es la presencia de una plaga en una cantidad que produce un efecto dañino que incluye una enfermedad o infección en una población huésped o emergencia de una maleza no deseada en un sistema de crecimiento.

Un "plaguicida" como se define en la presente, es una sustancia derivada de un producto biológico, o una sustancia química, que aumenta la mortalidad o que inhibe el la tasa de crecimiento de plagas de plantas e incluye a título enunciativo no taxativo nematicidas, insecticidas, fungicidas vegetales, bactericidas vegetales, y viricidas vegetales.

Identificación y caracterización de F727de Bacillus sp.

El aislado F727 de Bacillus sp. se identificó como una cepa novedosa de Bacillus usando una estrategia polifásica que combina la determinación de la secuencia del ARNr de 16S, análisis de ácidos grasos, análisis de proteínas por MALDI-TOF y caracterización usando diferentes ensayos bioquímicos. Véanse los Ejemplos 1-4, más adelante.

Se aislaron y caracterizaron los metabolitos producidos por fermentación de F727 de Bacillus sp. . Véanse los Ejemplos 5, 25 y 26 más adelante. Algunos de estos metabolitos demostraron actividad contra patógenos fúngicos y bacterianos in vitro e in vivo. Véanse los Ejemplos 6-17, 20, 22, 23 y 27-29 más adelante. Los efectos en la promoción del crecimiento vegetal, de Bacillus sp. F727 y sus metabolitos, también han sido observados en un número de plantas. Véanse los Ejemplos 18 y 19, y 21, 24 más adelante.

Por lo tanto Bacillus sp. F727, y/o sus metabolitos, también pueden usarse como productos naturales para el control de enfermedades fúngicas y bacterianas en agricultura; y para la promoción del crecimiento vegetal.

Métodos de producción Como se indicó precedentemente, los compuestos o metabolitos pueden obtenerse, son obtenibles o pueden derivar de un organismo que tiene una o más características identificadoras de una cepa F727 de Bacillus. Los métodos comprenden cultivar estos organismos y obtener los compuestos y/o composiciones de la presente invención por aislamiento de estos compuestos del cultivo de estos organismos.

En particular, los organismos son cultivados en medio de nutrientes usando métodos conocidos en el arte. Los organismos pueden cultivarse por cultivo en frasco para agitación, fermentación en escala pequeña o escala grande (incluyendo a título enunciativo no taxativo fermentación continua, en lote, lote alimentado, o estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en medio adecuado y bajo condiciones que permiten el crecimiento celular. El cultivo puede tener lugar en medio con nutrientes adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en el arte. Los medios adecuados se encuentran disponibles de fuentes comerciales o pueden prepararse de acuerdo a composiciones publicadas.

Después del cultivo, puede usarse un sobrenadante, filtrado y/o extracto de o derivado de dicha cepa de Bacillus (por ejemplo, F727 de Bacillus sp. ) para la formulación de una composición plaguicida.

Como alternativa, después del cultivo, los compuestos y/o metabolitos pueden ser un extracto de, enriquecido y/o purificado del caldo de cultivo.

El extracto puede fraccionarse por cromatografía. Las fracciones cromatográficas pueden ensayarse para el estudio de la actividad tóxica, por ejemplo, hongos (por ejemplo, Botrytis , Sclerotinia , Rhizoctonia & Bipolaris) usando métodos conocidos en el arte. El fraccionamiento puede repetirse una o más veces usando el mismo método cromatográfico o diferentes.

En una forma de realización, una composición producida por la cepa F727 comprende uno o más compuestos que (i) tienen actividad plaguicida; (ii) tienen pesos moleculares entre 1020 y 1120 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (iii) tienen tiempos de retención por Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) entre 6 y 15 minutos en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm; y (iv) opcionalmente pueden obtenerse a partir de la especie Bacillus . Los compuestos en una forma de realización son péptidos.

En una forma de realización especifica, el compuesto "A" (i) puede obtenerse a partir de una especie de Bacillus; (ii) es tóxico para una plaga; (iii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1020 y 1060 y más particularmente, 1044 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (iv) tiene valores de XH RMN de d 7,15, 6,72, 4,81, 4,70, 4,65, 4,40, 4,35, 4,25, 4,15, 3,85, 3,65, 3,50, 3,22, 2,85, 2,80, 2,65, 2,45, 2,35, 2,30, 2,20, 1,95, 1,55, 1,31, 1,20, 0,85; y (v) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 12 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 8,31 min en una columna de C-18 HPLC en fase reversa (Phenomenex, Luna 5m C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solventes en gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm. Adicionalmente, el Compuesto "A" revela señales para 47 carbonos, 72 hidrógenos, 12 nitrógenos, y 15 oxígenos determinado por análisis por 1H RMN, 13C RMN & MS. El espectro de 1H RMN muestra características de un péptido típico. El análisis detallado del Compuesto "A" por análisis por 1H RMN, 13C RMN, MS/MS y aminoácidos reveló la presencia de glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades).

En otra forma de realización particular, un compuesto producido por la cepa F727 es un compuesto "B" que (i) tiene actividad plaguicida; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1030 y 1080 y más particularmente, 1058 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); y (iii) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 14 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 8,67 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm. Los datos de los espectros 1H y 13C RMN, junto con los datos de MS, revelan señales de 48 carbonos, 74 hidrógenos, 12 nitrógenos, y 15 oxígenos. El espectro de 1H RMN muestra características de un péptido típico. El análisis detallado del Compuesto "B" por análisis por 1H RMN, 13C RMN, MS/MS y de aminoácidos reveló la presencia de glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades).

En aún otra forma de realización particular, un compuesto producido por la cepa F727 es un compuesto "C" que (i) tiene actividad plaguicida; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1050 y 1120 y más particularmente, 1072 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); y (iii) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 14 minutos, más específicamente aproximadamente 9 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 9,19 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm. Los datos de los espectros de 1H y 13C RMN, junto con los datos de MS, revelan señales de 49 carbonos, 76 hidrógenos, 12 nitrógenos, y 15 oxígenos. El espectro de 1H RMN muestra características de un péptido típico. El análisis detallado del Compuesto "C" por análisis por 1H RMN, 13C RMN, MS/MS y de aminoácidos reveló la presencia de glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades).

Composiciones Las composiciones pueden comprender cultivos de caldo completo, caldos celulares completos, cultivos líquidos, o suspensiones de o derivados de una cepa de Bacillus, específicamente una cepa de Bacillus que tiene por lo menos una de las características identificadoras del aislado F727 de Bacillus sp. , así como sobrenadantes, filtrados o extractos obtenidos de dicho Bacillus sp. Las composiciones también pueden comprender uno o más metabolitos o compuestos aislados derivados del aislado F727 de Bacillus sp. , que en particular tienen actividad bactericida, fungicida y/o promotora del crecimiento vegetal.

Las composiciones indicadas precedentemente pueden formularse de cualquier manera. Las formulaciones ejemplificativas incluyen a título enunciativo no taxativo concentrados emulsificables (EC), polvos humectables (WP), líquidos solubles (SL), aerosoles, soluciones concentradas de volumen ultra bajo (ULV), polvos solubles (SP), microencapsulados, gránulos dispersados en agua, fluidos (FL), microemulsiones (ME), nanoemulsiones (NE), etc. En cualquier formulación descrita en la presente, el porcentaje del ingrediente activo está dentro del rango entre 0,01% y 99,99%.

Las composiciones pueden estar en la forma de un liquido, gel o sólido. Una composición sólida puede prepararse por suspensión de un transportador sólido en una solución de ingrediente(s) activo(s) y secar la suspensión bajo condiciones suaves, tal como evaporación a temperatura ambiente o evaporación en vacio a 65°C o menor.

Una composición puede comprender ingrediente(s) activo(s) encapsulado (s) en gel. Dichos materiales encapsulados en pueden prepararse por mezclado de un agente formador de gel (por ejemplo, gelatina, celulosa, o lignina) con un cultivo o suspensión de células vivas o inactivadas de la cepa F727 de Bacillus sp. , o con un filtrado libre de células o fracción celular de un cultivo o suspensión de la cepa F727 de Bacillus sp. , o con un cultivo secado por aspersión o congelamiento, célula, o fracción celular de la cepa F727 de Bacillus sp. ; o con una solución de compuestos plaguicidas usados en el método de la invención; e inducir la formación de gel del agente.

La composición puede comprender adicionalmente un tensioactivo a ser usado con el propósito de emulsificación, dispersión, humectación, esparcimiento, integración, control de la desintegración, estabilización de ingredientes activos, y mejoramiento de la fluidez o inhibición de enmohecimiento. En una forma de realización particular, el tensioactivo es un tensioactivo no fitotóxico no iónico que preferentemente pertenece a la lista de EPA 4B. En otra forma de realización particular, el tensioactivo no iónico es polioxietileno (20) monolaurato. La concentración de tensioactivo(s) puede variar en un rango entre 0,1 y 35% de la formulación total, un rango preferido es entre 5 y 25%. La selección de agentes dispersantes y emulsificantes, tales como agentes dispersantes y emulsificantes no iónicos, aniónicos, anfotéricos y catiónicos, y la cantidad empleada, se determina por la naturaleza de la composición y la capacidad del agente para facilitar la dispersión de las composiciones.

Las composiciones indicadas precedentemente pueden combinarse con otro agente, microorganismo y/o plaguicida (por ejemplo, nematicida, bactericida, fungicida, acaricida, insecticida). Los microorganismos incluyen a titulo enunciativo no taxativo Bacillus sp. (por ejemplo, Bacillus firmus, Bacillus thuringiensis , Bacillus pumilus , Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis) , Paecilomyces sp. (P. lilacinus) , Pasteuria sp. (P. penetrans) , Chromobacterium sp., Pseudomonas sp., BrevaBacillus sp. , Lecanicillium sp., Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp (S. bikiniensis, S. costaricanus, S. avermitilis), Burkholdería sp., Trichoderma sp., Gliocladium sp., avermectina, Myrothecium sp., Paecilomyces spp., Sphingobacterium sp. , Arthrobotrys sp. , Clorosplrnium, Neobulgaria, Daldinia, Aspergillus , Chaetomium, Lysobacter spp, Lachnum papiraceum, Verticillium suchlasporium, Arthrobotrys oligospora , Verticillium chlamydosporium, Hirsutella rhossiliensis , Pochonia chlamydosporia , Pleurotus ostreatus , Omphalotus olearius , Lampteromyces japónicas , Brevudimonas sp. , Muscodor sp.

El agente puede ser un aceite natural o producto oleoso que tiene actividad nematicida, fungicida, bactericida y/o insecticida (por ejemplo, aceite parafinico, aceite de árbol de té, aceite de limoncillo, aceite de clavo de olor, aceite de canela, aceite de cítrico, aceite de romero, piretrum, aceite de cítrico (que incluye a título enunciativo no taxativo aceite de naranja amarga, naranja, y limón); aceite de romero, pimienta de Jamaica, bergamota, goma azul, manzanilla, citronela, jazmín común, enebro común, lavanda común, mirra común, menta silvestre, fresia, santolina gris, hierba de hisopo, albahaca santa, árbol de incienso, jazmín, lavanda, caléndula, menta, menta acuática, caléndula de maceta, menta verde, árbol ylang-ylang, saponinas).

Adicionalmente, el plaguicida puede ser un agente antifúngico de sitio único que puede incluir a título enunciativo no taxativo bencimidazol, un inhibidor de desmetilación (DMI) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol) , morfolino, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inhibidor externo de quinona, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarbono aromático, ácido cinámico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, bencenoide (xililalanina); un inhibidor de desmetilación seleccionado del grupo que consiste en imidazol, piperazina, pirimidina y triazol (por ejemplo, bitertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol), miclobutanilo, y un inhibidor externo de quinona (por ejemplo, estrobilurina). La estrobilurina puede incluir a titulo enunciativo no taxativo azoxistrobina, kresoxim-metilo o trifloxistrobina . En aún otra forma de realización particular, el agente antifúngico es una quinona, por ejemplo, quinoxifeno (5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofenil éter). El agente antifúngico también puede derivar de un extracto de Reynoutria .

El fungicida también puede ser un fungicida químico multisitio no inorgánico, seleccionado del grupo que consiste en cloronitrilo, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquitios, fenilpiridin-amina y ciano-acetamida oxima.

Como se indica precedentemente, la composición además puede comprender un nematicida. El nematicida puede incluir a título enunciativo no taxativo químicos tales como organofosfatos, carbamatos, yy ffuummiiggaanntteess,, y productos microbianos tales como avermectina, Myrothecium sp. Biome ( Bacillus firmus) , Pasteuria spp. , Paecilomyces , y productos orgánicos tales como saponinas y aceites vegetales.

Las composiciones pueden aplicarse usando métodos conocidos en el arte. Específicamente, estas composiciones se aplican a y alrededor de las plantas o partes de la planta. Las plantas deben entenderse que se refieren en el contexto presente todas las plantas y poblaciones de plantas tal como plantas deseadas y no deseadas salvajes o plantas de cultivos (que incluyen plantas de cultivos de origen natural). Las plantas de cultivos pueden ser plantas que pueden obtenerse por cruza de plantas convencional y métodos de optimización o por bioteenología e ingeniería genética o por combinaciones de estos métodos, que incluyen plantas transgénicas y cultivares de plantas protegidos o no protegidos por los derechos de los cultivadores de plantas. Las partes de plantas se deben entender como que se refieren a todas las partes y órganos de plantas por encima y por debajo de la tierra, tales como brote, hoja, flor y raíz, los ejemplos que pueden mencionarse son hojas, espinas, pedúnculos, tallos, flores, cuerpos de frutas, frutas, semillas, raíces, tubérculos y rizomas. Las partes de las plantas también incluyen material cosechado, y material de propagación vegetativa y generativa, por ejemplo recortes, tubérculos, rizomas, retoños y semillas.

El tratamiento de plantas y partes de plantas con las composiciones indicadas precedentemente puede realizarse directamente o permitiendo que las composiciones actúen alrededor de la planta, hábitat o espacio de almacenamiento por, por ejemplo, inmersión, aspersión, evaporación, niebla, dispersión, pintado, o inyección.

Las composiciones descritas en la presente también pueden aplicarse al suelo usando métodos conocidos en el arte. Estos incluyen a titulo enunciativo no taxativo (a) irrigación por goteo o quimiogación; (b) incorporación en suelo; (c) empapado de suelo; (d) tratamiento y desinfección de semillas; y (e) empapado de raíz desnuda.

Tratamiento de semillas Los tratamientos de semillas incluyen la aplicación de una composición descrita en la presente, opcionalmente en combinación con otros agentes bioactivos, antagonistas o simbióticos a la superficie de una semilla antes de siembra. Pueden aplicarse toxinas, proteínas, y/o compuestos plaguicidas descritos en la presente a semillas como polvos secos, polvos en lechada o rociados sobre la semilla antes de plantarlas.

Las composiciones descritas en la presente pueden formularse para los tratamientos de semillas en cualquiera de los siguientes modos: polvo seco, polvo en lechada con agua, solución líquida, concentrado fluido o emulsión, emulsión, microcápsulas, gel, o gránulos que pueden dispersarse en agua.

En el caso de un polvo seco, el ingrediente activo se formula similarmente a un polvo humectable, pero con el agregado de un agente adhesivo, tal como aceite mineral, en lugar de un agente humectante. Por ejemplo, un kg de polvo de talco purificado (esterilizado durante 12 h), 15 g de carbonato de calcio, y 10 g de carboximetilcelulosa se mezclan bajo condiciones asépticas siguiendo el método descrito por Nandakumar y col (2001). El o los ingredientes activos se mezclan en una relación 1:2,5 (suspensión a mezcla seca) y el producto se seca a la sombra para reducir el contenido de humedad a entre 20 y 35%.

En formas de realización en las cuales las composiciones descritas en la presente se aplican a una semilla, puede aplicarse una composición como uno o más recubrimientos antes de plantar la semilla usando uno o más de los agentes de recubrimiento de semilla que incluyen, a título enunciativo no taxativo, etilenglicol, polietilenglicol, quitosano, carboximetilquitosano, musgo de pantano, resinas y ceras. Las composiciones también pueden aplicarse a semillas en combinación con, por ejemplo, fungicidas químicos o bactericidas con un modo de acción de sitio único, multisitio o desconocido, usando métodos conocidos en el arte.

En formas de realización adicionales, las composiciones descritas pueden aplicarse a semillas por imbibición de semillas o como un inoculo en polvo.

Las semillas pueden ser semillas convencionales o pueden ser semillas modificadas genéticamente tal como Liberty Link (Bayer CropScience), semillas Roundup Ready (Monsanto), u otra semilla resistente a herbicida, y/o semillas diseñadas para ser resistentes a insectos, o semillas que tienen genes apilados de resistencia a herbicida e insectos.

Promoción del crecimiento vegetal Las interacciones planta-bacteria en la rizoesfera son determinantes importantes de la fertilidad del suelo y salud de la planta. Las bacterias de vida libre que son beneficiosas para el crecimiento vegetal son conocidas como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR). Generalmente los promotores del crecimiento vegetal funcionan en una de tres maneras: sintetizando reguladores del crecimiento vegetal, facilitando la incorporación de nutrientes del suelo y/o por prevenir enfermedades vegetales. Por lo tanto, los efectos de las PGPR pueden ser directos e indirectos. La promoción indirecta del crecimiento vegetal puede involucrar efectos antagonistas contra fitopatógenos. Esto puede lograrse, por ejemplo, por producción de sideróforos, síntesis de antibióticos, y la producción de HCN y/o enzimas degradantes de la pared celular. Los efectos directos de la promoción del crecimiento vegetal se logran por medio de la regulación de fitohormonas (que ayudan al desarrollo de la planta y raíz y la protección contra el estrés), y solubilización de fosfatos minerales y otros nutrientes.

Las composiciones descritas en la presente, en particular, aislado F727 de Bacillus sp. y/o un sobrenadante, filtrado, extracto, compuesto, metabolito o fracción celular obtenido de un cultivo de Bacillus sp. F727, puede usarse para modular o más particularmente promover el crecimiento de plantas, por ejemplo cultivos tales como frutas (por ejemplo, frutillas), vegetales (por ejemplo, tomate, zapallo, pimienta, palta), legumbres o cultivos de grano (por ejemplo, soja, trigo, arroz, maíz), árbol, flores, plantas ornamentales, arbustos (por ejemplo, algodón, rosas), césped (por ejemplo, vallico italiano, grama común, césped buffalo, agróstide común, agróstide rastrera, dichondra, cañuela dura, poa de los prados, césped kikuyu, vallico inglés, cañuela roja, poa común, paspalo costero, césped de St. Augustine, cañuela alta, zoisía, etc.), plantas de bulbo (por ejemplo, cebolla, ajo) o vid (por ejemplo, vid de uva). Las composiciones también pueden usarse para modular la germinación de una o más semillas en una o más plantas.

Las composiciones descritas en la presente, o producto formulado, pueden usarse solas o en combinación con uno o más de otros componentes como se describe más adelante, tal como agentes promotores del crecimiento y/o agentes antifitopatógenos en una mezcla en tanque o en un programa (aplicación en secuencia llamada rotación) con orden predeterminado e intervalo de aplicación durante la temporada de crecimiento. Cuando se usa en combinación con los productos mencionados anteriormente, a una concentración menor que la recomendada en la etiqueta del producto, la eficacia combinada de los dos o más productos (uno de los cuales es la mencionada composición descrita en la presente) es, en ciertas formas de realización, mayor que la suma del efecto de cada componente individual. Por lo tanto, el efecto es potenciado por el sinergismo entre estos dos (o más) productos, y se reduce el riesgo del desarrollo de resistencia a plaguicida entre las cepas patogénicas de plantas.

La composición puede aplicarse sumergiendo la raíz en el trasplante, específicamente por tratamiento de una fruta o vegetal vegetable con la composición hundiendo las raíces de la fruta o vegetal en una suspensión de dicha composición (aproximadamente 0,25 y aproximadamente 1,5 % y más particularmente aproximadamente 0,5% y aproximadamente 1,0% en volumen) antes del trasplante de la fruta o vegetal al suelo .

Como alternativa, la composición puede aplicarse por goteo u otro sistema de irrigación. Específicamente, la composición puede inyectarse en un sistema de irrigación por goteo. En una forma de realización particular, la composición se aplica a una concentración of lxlO8 unidades formadoras de colonia (UFC)/mi en un volumen de entre aproximadamente 11 y aproximadamente 4 cuartos por acre.

En aún otra forma de realización, la composición puede agregarse como una aplicación en surcos. Específicamente, la composición puede agregarse como una aspersión en surcos durante el plantado usando boquillas calibradas para administrar una salida total de entre 2 y 6 galones/acre. Las boquillas se colocan en el abridor de surcos sobre la surcadora de forma que la aplicación de plaguicida y caída de la semilla en el surco sean simultáneas.

Las mezclas de las composiciones descritas con, por ejemplo, un adyuvante sólido o líquido se preparan de una forma conocida. Por ejemplo, las mezclas pueden prepararse por mezclado homogéneo y/o molienda de los ingredientes activos con extendedores tales como solventes, transportadores sólidos y, cuando resulta apropiado, compuestos con acción en superficie (tensioactivos). Las composiciones también pueden contener ingredientes adicionales tales como estabilizantes, reguladores de la viscosidad, aglutinantes, adyuvantes asi como fertilizantes u otros ingredientes activos con el objetivo de obtener efectos especiales.

Combinaciones con agentes promotores del crecimiento vegetal Las composiciones descritas en la presente pueden usarse en combinación con otros agentes promotores del crecimiento tales como fertilizantes sintéticos u orgánicos (por ejemplo, fosfato de diamonio, en forma granular o liquida), tés de cómpost, extractos de alga marina, hormonas de crecimiento vegetal tal como IAA (ácido indolacético) usadas en un tratamiento con hormonas para enraizamiento para trasplantes solas o en combinación con reguladores del crecimiento vegetal tal como IBA (ácido indolbutirico) y NAA (ácido naftalenacético), y microbios promotores del crecimiento, tal como, por ejemplo, PPFM (metilotrofos facultativos pigmentados de rosa), Bacillus spp . , Pseudomonads, Rhizobia, y Trichoderma .

Agentes antifitopatógenos Las composiciones descritas en la presente también pueden usarse en combinación con otros agentes antifitopatógenos, tal como extractos vegetales, bioplaguicidas, protectores de cultivo inorgánicos (tal como cobre), tensioactivos (tal como ramnolípidos; Gandhi y col., 2007) o aceites naturales tales como aceite parafinico y aceite de árbol de té que poseen propiedades plaguicida o fungicidas químicas o bactericidas con un modo de acción de sitio simple, multisitio o desconocido. Como se define en la presente, un "agente antifitopatógeno" es un agente que modula el crecimiento de un patógeno vegetal, particularmente un patógeno que produce enfermedad transmitida por el suelo en una planta, o como alternativa previene la infección de una planta por un patógeno vegetal. Un patógeno vegetal incluye a título enunciativo no taxativo un hongo, bacteria, actinomiceto o virus.

Como se indica precedentemente, el agente antifitopatógeno puede ser un agente antifúngico de sitio simple que puede incluir a título enunciativo no taxativo bencimidazol, un inhibidor de desmetilación (DMI) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolino, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inhibidor externo de quinona, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarbono aromático, ácido cinámico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, bencenoide (xililalanina). En una forma de realización más particular, el agente antifúngico es un inhibidor de desmetilación seleccionado del grupo que consiste en imidazol, piperazina, pirimidina y triazol (por ejemplo bitertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol). En una forma de realización más particular, el agente antifúngico es miclobutanilo. En aún otra forma de realización particular, el agente antifúngico es un inhibidor externo de quinona (por ejemplo, estrobilurina). La estrobilurina puede incluir a titulo enunciativo no taxativo azoxistrobina, kresoxim-metilo o trif loxistrobina. En aún otra forma de realización particular, el agente antifúngico es una quinona, por ejemplo, quinoxifeno (5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofenil éter).

En aún otra forma de realización, el fungicida es un fungicida químico multisitio no inorgánico seleccionado del grupo que consiste en cloronitrilo, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquitios, fenilpiridina-amina, y ciano-acetamida oxima.

En aún otra forma de realización adicional, el agente antifitopatógeno puede ser estreptomicina, tetraciclina, oxitetraciclina, cobre, o kasugamicina.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Aislamiento del aislado F727 de Bacillus sp. y caracterización sobre la base de la secuencia de su ARNr 16S y de sus genes rec A y phoR La cepa F727 de Bacillus sp. fue aislada a partir de una muestra de tierra que había sido recolectada en Jonesville, CA, con métodos de dilución en placa tradicionales. El aislado fue identificado como Bacillus sp. a través de la amplificación del gen que codifica el ARNr 16S y de los genes recA y phoR por medio de una PCR, mediante el uso de cebadores universales para bacterias, y por medio de su secuenciación. Cerritos et al. (2008), Int. J. Sys. Evol. Microbiol., 58: 919-923; Guo et al. (2012), Can. J. Microbiol., 58: 1295-1305.

El producto cultivado en una placa con dextrosa de papa durante 24 horas se raspó con un asa estéril y se suspendió nuevamente en un amortiguador apropiado para extraer el ADN. El ADN se extrajo usando el conjunto de elementos para extraer el ADN MoBio Ultra Clean. La calidad del ADN extraído y su cantidad se comprobaron por medio de una electroforesis sobre un gel de agarosa al 1%, con una alícuota de 5 ml.

Secuencias de ARNr Las reacciones de PCR con las que se amplificó el gen del ARNr 16S se llevaron a cabo combinando 2 mi del extracto de ADN depurado con 25 ml de la mezcla maestra GoTaq, 1,5 m? del cebador directo (el cebador FDl, 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3' (SEQ ID N° 4) y 1,5 ml del cebador inverso (el cebador RD1, 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3' (SEQ ID N° 5)). El volumen de la reacción se completó hasta 50 mi con agua estéril libre de nucleasas. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termocielador, bajo las condiciones que se detallan a continuación: 10 minutos a 95°C (la desnaturalización inicial) y 30 ciclos de 45 segundos a 94°C, 45 segundos a 55°C y 2 minutos a 72°C, seguidos por 5 minutos a 72°C (la extensión final), con una temperatura de mantenimiento final de 10°C.

El tamaño del producto de la PCR, su calidad y su cantidad se evaluaron por medio de una electroforesis sobre un gel de agarosa al 1%, con una alícuota de 5 ml, que fue seguida por la comparación de la banda correspondiente con una escala de la masa.

El exceso de los cebadores, de los nucleótidos, de las enzimas y del molde se eliminó del producto de la PCR mediante el uso del conjunto de elementos de depuración para PCR MoBio. El producto de la PCR depurado se sometió a una secuenciación directa con los cebadores que se describieron con anterioridad.

Se alinearon las secuencias directas y las secuencias inversas mediante el uso del software BioEdit y se creó una secuencia de consenso de 1459 pb.

Secuencia de FD116S F727 TATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA CCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACA GATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGT AGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGT GATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAATAG GGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTT CTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACT TGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG GAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGG GGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAG GGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGT CGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCNAGAACCTTACCANGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAG GACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACNNNGGNGCATGGNNGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAG ATGTTGGGTAAGTCCCGCACNAGCGCAACCCNTTGATCTTANTTGCCAGCATTCANTTGGN NNNNNNNNNNNNACTGCCNNNACNANCCGNNNAAGGNNNGGGNATNACGTNNANNNATNCN NGCCCNNNNTGACNNNNNNCACNCCNNNNNNNNNNANNGNNNNNNAANNANNGGGNCNNNN NGNNNNNNAAANNNCNNNCNCNNNNGNGNN (SEQ ID N° 1) Secuencia de FR116S F727 TCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTA CAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCAT GCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGA ACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCC ATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCT TCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGAT CAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACC ATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGAT GTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGT GCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGC TTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTT TTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCCACGCTTTCGCTCCCTCA GCGTCAGTTACAGACCCAGAGAGTCGCCTTCGCCCCACTGGTGTTCCTCCACATCCTCTAC GCATTTCACCCGGCTACAACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCCAG TTTCCAATGACCCCTCCCCGGTTGAGCCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAAGAAACCCG CCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACACGCTTGGCCACCTACGTATTACCGCGC TTGCTTGGCACGTTAGTAGCCGTGGCTTTTCTGGTTAGTTAACCGTCAGTGCCGCCTATTC GGAACGGTACTTGTTCTTCCCTACACAGAGCTTTACGATCGAAACTCATCACCTCCACGCG CGTGCTCGTCAGAACTTTCGTCATGCGAAGATCCTACTGCTGCCTCCGTAGGGTTGGCGTT TCTCTCAGTCCAGTGGCCATACGTCAGTAGCTACCCATCGTGCCTAGTGAGCGTTACCTCA CCCACCTAGGC (SEQ ID N° 2) Secuencia de consenso para 16S F727 TATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGT GAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA CCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACA GATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGT AGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGT GATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAATAG GGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGGT TTCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGGCTCAACCGGGGAGGGGTCATTGGAAACTGGG GAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTTGTAGCCGGGTGAAATGCGTAGA GGATGTGGAGGAACACCAGTGGGGCGAAGGCGACTCTCTGGGTCTGTAACTGACGCTGAGG GAGCGAAAGCGTGGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAACGA TGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAAGCACT CCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAG CGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCT CTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTG TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTT AGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACA GAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGA TCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCC GCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACA CCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA (SEQ ID N° 3 ) La secuencia de consenso para el ARNr 16S de la cepa F727 se comparó con secuencias de dominios bacterianos representativos disponibles a través de un procedimiento BLAST. La especie con la que hubo la coincidencia más cercana fue Bacillus sp. (número de acceso GU250449.1), con una similitud de 99%. Ninguna de las secuencias del ARNr 16S en las bases de datos de acceso público presentó una similitud de 100% con la de la cepa F727.

Adicionalmente, la secuencia de consenso fue analizada usando el servidor EzTaxon-e (eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim et al., 2012), sobre la base de la información relacionada con la secuencia del ARNr 16S. Las coincidencias más cercanas (que se detallan en la tabla 1) incluyeron cepas de diversas especies del género Bacillus que no pudieron diferenciarse exclusivamente en función de la secuencia del ARNr 16S.

Tabla 1 Secuencias de recA Las reacciones de PCR para la amplificación del gen recA se llevaron a cabo combinando 2 ml del extracto de ADN depurado con 25 ml de la mezcla maestra GoTaq, 1,5 m? del cebador directo (recAf, 5'-GATCGTCARGCAGSCYTWGAT-3', SEQ ID N° 12) y 1,5 m? del cebador inverso (recAr, 5'- TTWCCRACCATAACSCCRAC-3', SEQ ID N° 13). El volumen de la reacción se llevó hasta 50 m? con agua estéril libre de nucleasas. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termocielador, bajo las condiciones que se detallan a continuación: 5 minutos a 95°C (la desnaturalización inicial) y 30 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 45°C y 1 minuto a 72°C, seguidos por 5 minutos a 72°C (la extensión final), con una temperatura de mantenimiento final de 4°C.

El tamaño del producto de la PCR, su calidad y su cantidad se evaluaron por medio de un procedimiento en un gel de agarosa al 1%, con una alícuota de 5 m?, que fue seguida por la comparación de la banda correspondiente con una escala de la masa.

El exceso de los cebadores, de los nucleótidos, de las enzimas y del molde se eliminó del producto de la PCR mediante el uso del conjunto de elementos de depuración para PCR MoBio. El producto de la PCR depurado se sometió a una secuenciación directa con los cebadores que se describieron con anterioridad.

Se alinearon las secuencias directas y las secuencias inversas mediante el uso del software BioEdit y se creó una secuencia de consenso de 505 pb.

Secuencia del cebador directo para recA de F727 AACATTCGGCAAGGTTCCATCATGAAACTCGGGGAAAAGACGGATACAAGAATTTCAACAG TTCCGAGCGGTTCCCTTGCACTTGATACCGCTCTCGGAATAGGCGGATACCCGCGCGGACG GATTATTGAAGTATACGGACCTGAAAGCTCAGGTAAAACGACTGTAGCGCTTCATGCGATT GCTGAAGTTCAGGAGAAAGGCGGACAAGCCGCATTTATTGATGCTGAGCATGCCCTTGACC CTGTTTACGCGCAAAAGCTCGGTGTAAATATTGAGGAGCTGCTGCTTTCTCAGCCTGATAC GGGAGAGCAGGCGCTTGAGATTGCCGAAGCGCTGGTACGAAGCGGAGCCGTCGATATCGTA GTTGTCGACTCTGTTGCGGCGCTTGTCCCGAAAGCTGAAATCGAAGGAGACATGGGGGATT CCCACGTCGGTTTGCAGGCCCGTTTGATGTCTCAAGCGCTCCGTAAGCTTTCCGGTGCCAT CAATAAATCTAAAACAATCGCAATCTTTATTAACCAAATTCGTGAAAAAGTCGGCGTTAGG GTCGGAAAAAA (SEQ ID N° 8) Secuencia del cebador inverso para recA de F727 GTATAAGATTGCGATTGTTTTAGATTTATTGATGGCACCGGAAAGCTTACGGAGCGCTTGA GACATCAAACGGGCCTGCAAACCGACGTGGGAATCCCCCATGTCTCCTTCGATTTCAGCTT TCGGGACAAGCGCCGCAACAGAGTCGACAACTACGATATCGACGGCTCCGCTTCGTACCAG CGCTTCGGCAATCTCAAGCGCCTGCTCTCCCGTATCAGGCTGAGAAAGCAGCAGCTCCTCA ATATTTACACCGAGCTTTTGCGCGTAAACAGGGTCAAGGGCATGCTCAGCATCAATAAATG CGGCTTGTCCGCCTTTCTCCTGAACTTCAGCAATCGCATGAAGCGCTACAGTCGTTTTACC TGAGCTTTCAGGTCCGTATACTTCAATAATCCGTCCGCGCGGGTATCCGCCTATTCCGAGA GCGGTATCAAGTGCAAGGGAACCGCTCGGAACTGTTGAAATTCTTGTATCCGTCTTTTCCC CGAGTTTCATGATGGAACCTTTGCCGAATTGTTTTTCTATTTGCTTAAGAGCCATATCWAA GRCTGWAWTRAMRATCAA (SEQ ID N° 9) Secuencia de consenso para recA de F727 AAGGTTCCATCATGAAACTCGGGGAAAAGACGGATACAAGAATTTCAACAGTTCCGAGCGG TTCCCTTGCACTTGATACCGCTCTCGGAATAGGCGGATACCCGCGCGGACGGATTATTGAA GTATACGGACCTGAAAGCTCAGGTAAAACGACTGTAGCGCTTCATGCGATTGCTGAAGTTC AGGAGAAAGGCGGACAAGCCGCATTTATTGATGCTGAGCATGCCCTTGACCCTGTTTACGC GCAAAAGCTCGGTGTAAATATTGAGGAGCTGCTGCTTTCTCAGCCTGATACGGGAGAGCAG GCGCTTGAGATTGCCGAAGCGCTGGTACGAAGCGGAGCCGTCGATATCGTAGTTGTCGACT CTGTTGCGGCGCTTGTCCCGAAAGCTGAAATCGAAGGAGACATGGGGGATTCCCACGTCGG TTTGCAGGCCCGTTTGATGTCTCAAGCGCTCCGTAAGCTTTCCGGTGCCATCAATAAATCT AAAACAATCGCAATCTT (SEQ ID N° 10) La secuencia de consenso para el gen recA de la cepa F727 (SEQ ID N° 10) se comparó con secuencias bacterianas representativas a través de un procedimiento BLAST. La especie con la que hubo la coincidencia más cercana fue el genoma completo de Bacillus amyloliquefaciens (número de acceso CP002927.1), con una similitud de 92%.

Secuencias de phoR Las reacciones de PCR para la amplificación del gen phoR se llevaron a cabo combinando 2 ml del extracto de ADN depurado con 25 ml de la mezcla maestra GoTaq, 1,5 m? del cebador directo {phoR-f, 5'-TTYARYTCATGRGAVACATT-3', SEQ ID N° 11) y 1,5 m? del cebador inverso (phoR-r, 5'-GGNTAYAAANARGAGGAGCC-3', SEQ ID N° 12). El volumen de la reacción se llevó hasta 50 m? con agua estéril libre de nucleasas. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termocielador, bajo las condiciones que se detallan a continuación: 5 minutos a 95°C (la desnaturalización inicial) y 35 ciclos de 45 segundos a 95°C, 45 segundos a 48°C y 1 minuto a 72°C, seguidos por 10 minutos a 72°C (la extensión final), con una temperatura de mantenimiento final de 4°C.

El tamaño del producto de la PCR, su calidad y su cantidad se evaluaron por medio de un procedimiento en un gel de agarosa al 1%, con una alícuota de 5 m?, que fue seguida por la comparación de la banda correspondiente con una escala de la masa.

El exceso de los cebadores, de los nucleótidos, de las enzimas y del molde se eliminó del producto de la PCR mediante el uso del conjunto de elementos de depuración para PCR MoBio. El producto de la PCR depurado se sometió a una secuenciación directa con los cebadores que se describieron con anterioridad.

Mediante el uso del cebador inverso que se describió con anterioridad, se obtuvo una secuencia de phoR de 998 nucleótidos.

Secuencia inversa de phoR de F727 TCGTTGTCTGTATCATATTGGTTTTCAGTGTTCTCGGCCTTTTCTTGCAGCAGCTCATTTC TTCATCCGCCAAGGAAAGAACGGAGGGACAGCTTGAAAAGGAAGCCGCATACATAGCCGGA CTCCTTGACGCCGGCCAAGTAAACAATAAAAGAAACGAAACGGTCATTAAAGATGCCAGCC GTACATTAGATATCGACGTGTCCGTATTAAATGAAAAAGGCCGCGGTTTATATCACTCAGG CAGACGCGCTGATGACTCGGCTATAAAGGAATTCGTCTCCCGTAATAAAAATGCGGCGGCG ATTCAGAACGGAGAGAAAGTATGGCATGGAACGGCCCTTAAAAACGCCGCCGGCCAAACGG CGGGATATGTGCTCGTTTCCTCGCGGATCGATAAAGGTTCGAATATAACAGGGGAAATGTG GGGCATGCTGGCTGCAAGCCTTTGTACTGCTTTTATTATTATCGTTTTCTTCTATACGAAT ATGACCTCCCGTTACAAAAGGTCAATCGACTCCGCGACAAAAGTGGCCACTGAGCTGTCTA AGGGGAACTATGACGCCCGCTCCTACGGCGGGTACGCAAGACGCTCAGACCGTCTCGGGCG CGCTATGAACAGCCTCGCTGTGGATTTGATGGAAATGACGAGAACGCAGGATATGCAGCGC GACCGCCTGCTGACCGTCATCGAAAATATCGGATCAGGTTTGATTTTAATAGACGGGAGAG GCTTTATTAATCTCGTGAACAGGTCGTATACGAAGCAGTTCCATACAAATCCTGAACGTCT GCTTCGGCGTCTCTACCATGACGCATTTGAGCATGAGGAAATCATTCGGCTGGTCGAAGAC ATCTTTATGACAGAAACGAAGAAACGCCAGCTGCTCACGCTTCCCATCAAAATCGAACGGC GCTATTTTGAGGTTGACGGCGTCCCGATTATGGGCCCTGACGATGAATGGAAAAGGCATTG TTCTCGTGTTTCATGATATGAC (SEQ ID NO:13) La secuencia inversa de phoR se comparó con secuencias bacterianas representativas a través de un procedimiento BLAST. La especie con la que hubo la coincidencia más cercana fue el genoma completo de Bacillus amyloliquefaciens, con una similitud de apenas 83%.

Ejemplo 2. Composición de los ácidos grasos del aislado F727 El análisis del perfil de los ácidos grasos del aislado F727 fue realizado por MIDI Labs, Inc (Newark, DE), de acuerdo con referencias comerciales. Los resultados se proveen en la tabla 2. Mediante una comparación entre el perfil de ácidos grasos obtenido y los perfiles en la base de datos RTSBA66.10, fue posible comprobar que el aislado F727 presenta un indice de similitud de 0,885 con Bacillus subtilis.

Tabla 2 Ejemplo 3. Caracterización del aislado F727 sobre la base del perfil de sus proteínas por medio de un procedimiento de MALDI-TOF El perfil de las proteínas de F727 se caracterizó por medio de un procedimiento espectrométrico de MALDI-TOF en MIDI Labs, Inc. (Newark, DE). El aislado F727 presentó un perfil de proteínas, determinado en el procedimiento de MALDI-TOF, que fue diferente del de cualquier otro microorganismo presente en la base de datos de espectros de masa. Se observaron algunas similitudes con el perfil de las proteínas de Bacillus vallismortís, de Bacillus mojaviensis y de Bacillus subtilis, pero ninguna de las calificaciones de la similitud fue suficientemente elevada para ser indicativa siquiera de una coincidencia genérica.

Ejemplo 4. Caracterización bioquímica del aislado de Bacillus sp. F727 Coloración de Gra La coloración de Gram es un método para diferenciar las bacterias sobre la base de las propiedades físicas de la pared celular, principalmente la composición de los peptidoglucanos. Las cepas bacterianas Gram-positivas comprenden una capa de peptidoglucanos gruesa, que da como resultado una coloración violeta/azul, mientras que los aislados bacterianos Gram-negativos comprenden una capa de peptidoglucanos más delgada en la pared celular, lo que da como resultado una coloración rosa/roja. Cuando se realizó la inspección microscópica del aislado F727 después de aplicar la coloración de Gram, se observaron células púrpura, una indicación de que el aislado de Bacillus sp. F727 es una bacteria Gram-positiva.

Actividad de la ureasa El análisis de la ureasa se emplea para detectar la actividad de la enzima ureasa, que cataliza la conversión de la urea en amoniaco y bicarbonato. El caldo de urea contiene urea y el indicador del pH rojo fenol. El indicador se torna amarillo en un ambiente ácido y rosa en un ambiente alcalino. Si hay actividad de la enzima ureasa, la urea en el caldo se degrada para producir amoniaco y el medio se torna rosa, lo que es indicativo de un resultado positivo.

Después de la inoculación con el aislado F727, el color del caldo de urea pasó de rojo a amarillo, una indicación de un resultado negativo para la actividad de la ureasa. En otras palabras, el aislado de Bacillus sp. F727 generó un ambiente ácido, indicativo de la ausencia de actividad de la ureasa.

Actividad de la catalasa El análisis de la catalasa se emplea para detectar la actividad de la enzima catalasa. La catalasa descompone el peróxido de hidrógeno en oxigeno y agua. Los organismos que presentan actividad de catalasa producen burbujas de gas cuando se los trata con peróxido de hidrógeno. Las burbujas se formaron en cuestión de segundos cuando se aplicó el reactivo sobre un cultivo del aislado de Bacillus sp. F727, lo que es una indicación de que este organismo presenta actividad de catalasa.

Actividad de la oxidasa El análisis de la oxidasa se emplea para detectar la presencia de actividad de la oxidasa del citocromo c. Las bacterias que contienen el citocromo c como parte de su cadena respiratoria son positivas para la oxidasa y le confieren un color púrpura al reactivo. Por el contrario, las bacterias que son negativas para la oxidasa no oxidan el reactivo, que permanece incoloro. El aislado de Bacillus sp. F727 le confirió un color púrpura al reactivo, por lo que puede concluirse que presentaba actividad de oxidasa.

Agar TSI El agar con azúcares triples y hierro (TSI) se emplea para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa, la lactosa y/o la sacarosa, asi como la capacidad de las bacterias entéricas de producir sulfuro de hidrógeno. El medio contiene el indicador del pH rojo fenol y sulfato ferroso, el cual reacciona con el sulfuro de hidrógeno para producir un precipitado negro. Cuando se analizó el aislado F727, el sobrenadante permaneció rojo, mientras que el precipitado adquirió un color amarillo, y no se observó el color negro. Estos resultados reflejan que el aislado F727 no produce sulfuro de hidrógeno y que solamente puede fermentar la glucosa, no la lactosa ni la sacarosa. Sensibilidad a los antibióticos La sensibilidad a los antibióticos del aislado de Bacillus sp. F727 fue analizada con discos con antibióticos en un medio de Muller-Hinton. Se suspendió un asa de siembra de F727 en 1 mi de agua desionizada estéril y se sembraron 100 ml de esta suspensión en una placa con agar de Mueller- Hinton. Una vez que la siembra se absorbió en el agar, se aplicaron discos que hablan sido cargados con antelación con diversos antibióticos sobre la placa y se realizó una incubación a 25°C durante 48 horas. Los resultados se detallan en la tabla 3.

Tabla 3. Susceptibilidad de Bacillus sp. F727 a diversos antibióticos *+++ representa una bacteria altamente susceptible (ausencia de crecimiento), ++ representa una bacteria moderadamente susceptible (reducción del crecimiento), representa una bacteria no susceptible Cinta API ZYM La cinta API ZYM (de BioMerrieux) es un método útil para analizar la actividad de diversas enzimas en un microbio. El análisis se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se provee un resumen de los resultados en la tabla 4.

Tabla 4 0 5 0 Cinta API 20 NE La cinta API® 20 NE consiste en 20 microtubos que contienen sustratos deshidratados. Los sustratos convencionales fueron inoculados con una suspensión del 5 aislado de Bacillus sp. F727, lo que dio como resultado la reconstitución del medio. El metabolismo produjo cambios en el color de los microtubos. Los sustratos para analizar la asimilación fueron inoculados con un medio mínimo, lo que habría posibilitado el crecimiento del aislado de Bacillus sp. F727 si la bacteria hubiera sido capaz de emplear el sustrato. Las reacciones se analizaron de acuerdo con la tabla de lectura del fabricante, y los resultados se resumen en la tabla 5.

Tabla 5 0 5 Ejemplo 5. Aislamiento y caracterización de los compuestos A, B y C 0 Procedimiento de purificación El procedimiento que se describirá a continuación (que se ilustra en la figura 1) se empleó para purificar los compuestos que fueron extraídos a partir de un cultivo de células del aislado de Bacillus sp. F727. 5 Se extrajo un caldo de cultivo proveniente de una fermentación de 11 del aislado de Bacillus sp. F727 en un medio de cultivo con una resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006), para lo cual la suspensión que contenía las células se centrifugó con la resina a 225 rpm, a temperatura ambiente durante dos horas. La masa que contenía la resina y las células se recolectó por medio de una filtración a través de un tejido perforado y se lavó con agua desionizada para eliminar las sales. Posteriormente, la resina, la masa que contenía las células y el tejido perforado se sumergieron durante 2 horas en acetona, después de lo cual se eliminó la acetona por medio de una filtración y se realizó un secado al vacío, mediante el uso de un evaporador rotatorio, de modo tal de obtener un extracto en bruto.

El extracto en bruto se fraccionó por medio de una cromatografía líquida con una fase inversa C18 al vacío (VLC, con una mezcla de H2O y CH3OH, en un gradiente de entre 80%:20% y 0%:100%), con lo que fue posible obtener 6 fracciones. Se concentraron las fracciones obtenidas hasta secarlas mediante el uso de un evaporador rotatorio y se determinó la actividad biológica de los residuos secos resultantes mediante el uso de un análisis con discos con agar. Véase el ejemplo 16 más adelante. Con este análisis, fue posible determinar que la fracción 3 que se obtuvo en la VLC C18 presentó actividad fungicida.

La fracción activa 3 se sometió a una HPLC con una fase inversa (en un sistema Spectra P4000, Thermo Scientific), de manera tal de obtener los compuestos puros, que luego fueron sometidos a un bioensayo como el que se describió con anterioridad para identificar los que presentaban actividad.

La fracción activa 3 fue sometida a una purificación adicional en una columna de HPLC C18 (una columna Luna C18 (2), de Phenomenex, de 10 mm, 100 A y 250 mm x 30 mm), mediante el uso de un gradiente de un sistema de solventes que comprendió agua y acetonitrilo (con 0,01% de TFA; entre los minutos 0 y 10, se empleó CH3CN acuoso al 70%, entre los minutos 10 y 20, se empleó CH3CN acuoso al 70%-45%, entre los minutos 20 y 40, se empleó CH3CN acuoso al 45%-30%, entre los minutos 40 y 60, se empleó CH3CN acuoso al 30%-0%, entre los minutos 60 y 65, se empleó CH3CN acuoso al 100%, entre los minutos 65 y 70, se empleó CH3CN acuoso al 0%—30%), con un flujo a una velocidad de 8 ml/minuto y una detección UV a 210 nm. Se obtuvieron tres compuestos purificados: el compuesto A (F727F3H11), que presentó un tiempo de retención de 35,95 minutos, el compuesto B (F727F3H14), que presentó un tiempo de retención de 37,26 minutos, y el compuesto C (F727F3H17), que presentó un tiempo de retención de 38,11 minutos.

Espectrometría de masa Se llevó a cabo un análisis de espectrometría de masa con los compuestos A, B y C y un instrumento de electronebulización (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus, usando los modos de ionización positiva y de ionización negativa, con una modalidad de barrido completo (m/z entre 100 y 1500 Da), en un espectrómetro de masa LCQ DECA XPplus (de Thermo Electron Corp., San José, CA). La cromatografía líguida de alto desempeño (HPLC) se llevó a cabo en un instrumento de Thermo, que estuvo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA Plus, un analizador automático de muestras, una bomba MS y una columna Luna C18, de 5 mm, 100 A y 4,6 mm x 100 mm (de Phenomenex). El sistema de solventes consistió en agua (el solvente A) y acetonitrilo (el solvente B). La fase móvil comenzó con 10% del solvente B, que se incrementó de manera lineal hasta 100% en un período de 20 minutos, luego se mantuvo durante 4 minutos y finalmente se redujo nuevamente hasta 10% en un periodo de 3 minutos, una proporción que se mantuvo durante 3 minutos. El flujo fue de 0,5 ml/minuto. El volumen inyectado fue de 10 ml, y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un analizador automático de muestras.

Los compuestos fueron sometidos a un análisis de LC-MS, a un análisis de LC y a una cromatografía con una fase inversa. El análisis de espectrometría de masa de los compuestos que se han descripto se llevó a cabo bajo las condiciones que se detallan a continuación. La velocidad del flujo del nitrógeno gaseoso se fijó en 30 y 15 arb para el barrido circundante y para el barrido auxiliar, respectivamente. La ionización por electronebulización se aplicó con un voltaje de atomización de 5000 V y una tensión capilar de 35,0 V. La temperatura del capilar se fijó en 400°C. Los resultados se analizaron con el software Xcalibur.

Se determinó que el peso molecular del compuesto A (F727F3H11) fue de 1044, sobre la base de la presencia de un pico correspondiente a un ión molecular en 1043,84 (M-H) en el modo de ionización negativa (figura 2). Este descubrimiento concordó con el patrón de ionización en el modo positivo ESIMS, en el cual se observó un pico en 1045,48 (M+H) y un pico correspondiente a un ión pseudomolecular en 1067,55 (M+Na) (figura 3).

Se determinó que el peso molecular del compuesto B (F727F3H14) fue de 1058, sobre la base de la presencia de un pico correspondiente a un ión molecular en 1057,83 (M-H) en el modo de ionización negativa (figura 4). Este descubrimiento concordó con el patrón de ionización en el modo positivo ESIMS, en el cual se observó un pico en 1059,56 (M+H) y un pico correspondiente a un ión pseudomolecular en 1081,63 (M+Na) (figura 5).

Se determinó que el peso molecular del compuesto C (F727F3H17) fue de 1072, sobre la base de la presencia de un pico correspondiente a un ión molecular en 1071,85 (M-H) en el modo de ionización negativa (figura 6). Este descubrimiento concordó con el patrón de ionización en el modo positivo ESI S, en el cual se observó un pico en 1073,57 (M+H) y un pico correspondiente a un ión pseudomolecular en 1095,62 (M+Na) (figura 7).

Análisis de la actividad antifúngica de las fracciones y de los compuestos puros por medio de un procedimiento con tapones La actividad antifúngica de las fracciones y de los compuestos purificados se analizó como se detalla a continuación. Se colocó un disco de filtro en cada cuadrante de una placa de Petri con un tamaño mediano (cuatro discos en total). Cada disco se colocó a una distancia de 2 cm del centro de la placa. Se aplicaron 15 ml de cada fracción de la columna o de cada compuesto purificado (20 mg/ml) en la superficie de cada uno de los discos, que se distribuyeron como pares opuestos. Como control, se aplicó etanol sobre otros dos discos. Una vez cargados los discos de filtro, se aplicaron tapones pequeños (de aproximadamente 1 cm x 1 cm) que contenían los hongos en el centro de la placa de Petri. Los hongos patogénicos que se emplearon fueron Bipolaris maydis, Botrytis cin rea, Sclerotinia homeocarpa y Rhizoctonia solani . Las placas se incubaron a 25°C, y después de 48 horas, se analizó la presencia de una zona de inhibición alrededor de cada disco de filtro. Los resultados que se obtuvieron con la fracción 3 proveniente de la VLC 3 y con los compuestos A, B y C se representan en la figura 8, y reflejan que los tres compuestos presentaron una actividad fungicida significativa.

Análisis de los aminoácidos de los compuestos A, B y C El compuesto A (F727F3H11, 0,05 g) fue sometido a una hidrólisis en una fase liquida (con HCl 6 N y 1% de fenol, a 110°C durante 24 horas y al vacio). Después de enfriar, se secó la mezcla de reacción y se disolvió el producto hidrolizado en un amortiguador de dilución Norleu, en un volumen de 1,0 mi. Se aplicó una alícuota de 50 ml de esta muestra sobre una columna de intercambio iónico para llevar a cabo el análisis.

Como referencia y para la calibración del dispositivo basado en Na Hitachi 8800 (de Sigma, ?-9906), se usó una solución que comprendió aminoácidos, que estuvo compuesta por un hidrolizado de proteínas: de esta manera, se determinó el factor de la respuesta y fue posible calibrar el dispositivo Hitachi 8800 para todos los aminoácidos. Cada una de las inyecciones comprendió norleucina como referencia interna, de manera tal de posibilitar la corrección de los errores en los resultados que pudieran deberse a las variaciones en el volumen de las muestras y a las diversas variables propias de la cromatografía. En el sistema, se usaron amortiguadores a base de Na de Pickering, HCl de grado de Pierce Sequanal (para la hidrólisis), una columna de intercambio iónico Transgenomic y un método optimizado desarrollado por Molecular Structure Facility (MSF), UC Davis. Se analizaron los aminoácidos individuales presentes en cada una de las muestras. Se determinó que los aminoácidos presentes en el compuesto A eran la glutamina (1 unidad), la prolina (1 unidad), la serina (1 unidad), la tirosina (1 unidad) y la asparragina (3 unidades).

La composición de los aminoácidos de los compuestos B y C se analizó de manera similar. Se determinó que los compuestos B y C comprendían los mismos aminoácidos que el compuesto A, en una proporción idéntica.

Ejemplo 6. Efecto del aislado de Bacillus sp. F727 sobre Botrytis en plantas de tomate Se trataron plantas de tomate ( Solanum lycopersicum) var. Roma con un sobrenadante proveniente de una fermentación de F727. Cada planta fue atomizada con aproximadamente 3 mi de un sobrenadante libre de células proveniente de una fermentación. Se permitió que las plantas se secaran y se las inoculó con 2 mi de una suspensión de esporas de Botrytis cinerea, en una concentración de 6,67 x 107 esporas/ml. Una planta de control se roció con agua desionizada, dos plantas de control negativo se rociaron solamente con esporas (en una concentración de entre 1 x 107 esporas/ml y 6,67 x 107 esporas/ml) y una planta de control positivo se atomizó con SWITCH® 65.2 WG (que comprende cipronidil y fludioxonil y es comercializado por Bayer Crop Sciences, Inc.), en una tasa de 14 onzas/100 galones/acre. Los tratamientos se realizaron por triplicado. Las plantas se colocaron en un recipiente de plástico transparente, en una recámara de cultivo con una iluminación y una temperatura controladas de manera constante. La calificación de la enfermedad se realizó 8 dias después del tratamiento. La severidad de la enfermedad en las plantas se determinó sobre la base de la evaluación visual del área de las hojas en las que se observaron los síntomas propios de la enfermedad, en función de la cual se obtuvo una calificación. Véase, por ejemplo, W. C. James (1971), "A Manual of Assessment Keys in Plant Diseases", Sociedad Americana de Fitopatología, ISBN 978-0-89054-081-7. En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 9, puede concluirse que la severidad de la enfermedad se redujo desde 65% (en el control infectado sin tratar) hasta 40% en las plantas infectadas que fueron tratadas con el sobrenadante de F727.

En experimentos adicionales, se analizaron diluciones al medio, al cuarto y al décimo de un WCB de F727. El uso de WCB provenientes de dos fermentaciones separadas en las tres diluciones dio como resultado una disminución en la severidad de la enfermedad.

Ejemplo 7. Efecto de Bacillus sp. F727 sobre el moho polvoriento en la lechuga Se sembraron plantas de lechuga ( Lactuca sativa) var. Celtuce en una densidad de cuatro plantas por maceta. Cada maceta se atomizó con 2 mi del sobrenadante de una fermentación de F727. Se permitió que las plantas se secaran y luego se las inoculó con 2 mi de una suspensión de esporas de Bremia lactuca (un moho polvoriento, a razón de 1 x 105 esporas/ml). Los tratamientos se realizaron en 5 réplicas. Las plantas tratadas se incubaron en bandejas selladas con un recubrimiento de plástico, en una recámara de cultivo a 15°C, con un fotoperiodo de 12 horas. 10 dias después del tratamiento, se evaluó la severidad de la enfermedad como se describió en el ejemplo 6.

Los resultados se representan en la figura 10. La severidad media de la enfermedad en el control no tratado fue de 54,47%, mientras que en las plantas tratadas con F727 fue de apenas 14,64%. La severidad de la enfermedad en las plantas que fueron tratadas con F727 fue comparable a la que se observó después de tratar las plantas con el control químico Ridomil® GOLD CE (de Syngenta, que comprende 4% p/p de metalaxil-M y 64% p/p de mancozeb, con 150 ppm del ingrediente activo), con el cual se obtuvo una severidad de 11,67%.

En experimentos adicionales, se analizaron diluciones al medio, al cuarto y al décimo de un WCB de F727. El uso de WCB provenientes de dos fermentaciones separadas en las tres diluciones dio como resultado una disminución en la severidad de la enfermedad.

Ejemplo 8. Comparación del efecto de Bacillus sp. F727 con el de ELEVATE Se trataron plantas de tomate ( Solanum lycopersicum) var. Roma con 3 mi del sobrenadante de una fermentación de F727 y se las dejó secar. Las plantas se inocularon con aproximadamente 2 mi de una suspensión de esporas de Botrytis cin rea (con 2,8 x 107 esporas/ml). Un subconjunto de las plantas infectadas fueron sometidas a una segunda inoculación con F727 después de 2 horas, o bien una vez completo el secado del primer tratamiento. Las plantas inoculadas también fueron tratadas con agua (control negativo) o con ELEVATE® 50 WDG (de Bayer Crop Science, Inc., que comprende fenhexamida) como control positivo.

Los tratamientos se llevaron a cabo en réplicas de 4.

Nueve dias después del tratamiento, se evaluó la severidad de la enfermedad como se describió en el ejemplo 6. Los resultados relacionados con la severidad de la enfermedad se representan la figura 11. En el control tratado con agua, la severidad de la enfermedad fue de 38,3%, mientras que en el control positivo (tratado con ELEVATE® 50 WDG, de Bayer Crop Science, Inc., que comprende fenhexamida), la severidad de la enfermedad se redujo hasta 13,33%. En las plantas que fueron tratadas con el sobrenadante de F727 lx o 2x, la severidad de la enfermedad fue de 8,3% o 5%, respectivamente.

Ejemplo 9. Efecto del sobrenadante de F727 sobre las infecciones de B. cin rea en el pimiento Se atomizaron plantas de pimiento ( Capscicum annuum) var. Serrano con aproximadamente 2 mi de un sobrenadante de F727 y se las dejó secar. Las plantas se inocularon con 2 mi de una suspensión de esporas de Botrytis cinérea (con 2,7 x 107 esporas/ml). Las plantas se trataron por triplicado. Trece dias después del tratamiento, se evaluó la severidad de la enfermedad y se la comparó con la que se observó en un control sin tratar (atomizado con agua) y en un control positivo (atomizado con ELEVATE® 50 WDG, de Bayer Crop Science, Inc., que comprende fenhexamida y que fue aplicado en la tasa indicada).

En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 12, puede concluirse que el control de la enfermedad en las plantas infectadas por Botrytis cinerea que se obtuvo como resultado del tratamiento con F727 fue comparable al que se obtuvo cuando las plantas se trataron con ELEVATE®.

Ejemplo 10. Evaluación de un caldo de células completas, un sobrenadante y células de F727 obtenidos por medio fermentaciones en tres medios sobre el moho polvoriento en el pepino Se hicieron fermentar células de F727 en tres medios de cultivo diferentes (SPY, SMP y TSB). Se rociaron plantas de pepino ( Cucumis sativus) var. S R58 que tenían una edad de dos semanas con aproximadamente 3 mi de un caldo de células completas de F727, un sobrenadante de F727 y células de F727, que habían sido obtenidos por medio de las tres fermentaciones que se han descripto. Las células se hicieron sedimentar y se suspendieron nuevamente en sulfato de magnesio 10 mM para atomizarlas. Se analizaron cuatro réplicas por tratamiento. Las plantas se dejaron secar durante dos horas y se rociaron con aproximadamente 2 mi de una suspensión de esporas de un moho polvoriento, en una concentración de 3,0 x 105 esporas/ml, que había sido preparada a partir de una planta infectada. Posteriormente, las plantas se incubaron en una recámara de cultivo hasta que se desarrolló la enfermedad, y la severidad de la enfermedad se evaluó como se describió en el ejemplo 6.

Los resultados, expresados como el porcentaje de control de la enfermedad, se representan en la figura 13. Los caldos de células completas, los sobrenadantes y las células completas que se obtuvieron a partir de los tres medios presentaron actividad antifúngica sobre el pepino.

Ejemplo 11. Evaluación de un caldo de células completas, un sobrenadante y células de F727 obtenidos por medio de fermentaciones en tres medios sobre Botrytis cin rea en el tomate.

Se rociaron plantas de tomate ( Solanum lycopersicum) var. Stupice que tenían una edad de dos semanas con aproximadamente 2 mi de un caldo de células completas de F727, un sobrenadante de F727 y células de F727, que habían sido obtenidos a través de tres fermentaciones en sendos medios de cultivo (SPY, SMP y TSB). Las células se hicieron sedimentar y se suspendieron nuevamente en sulfato de magnesio 10 mM para atomizarlas. Se analizaron cuatro réplicas por tratamiento. Las plantas se dejaron secar durante dos horas y se expusieron a condiciones de humedad para que se abrieran los estomas. Sobre cada una de las plantas, se aplicó aproximadamente 1 mi de una suspensión de esporas de Botrytis cinérea, que había sido preparada a partir de un cultivo con una edad de diez dias en una placa de agar y que comprendía 1,0 x 107 esporas/ml en caldo de maltosa de Sabouraud al 2%. Las plantas se incubaron en una recámara de cultivo, con un fotoperíodo de 12 horas, hasta que se desarrolló la enfermedad, y la severidad de la enfermedad se evaluó como se describió en el ejemplo 6.

Los resultados, expresados como el porcentaje de control de la enfermedad, se representan en la figura 14. Los caldos de células completas, los sobrenadantes y las células completas que se obtuvieron a partir de los tres medios presentaron actividad antifúngica sobre el tomate.

Ejemplo 12. Evaluación de la eficacia de un caldo de células completas de F727, de diversos productos comerciales basados en Bacillus y de un caldo de células completas de F727 mezclado con Regalía® sobre el moho polvoriento en el pepino Se atomizaron plantas de pepino ( Cucumis satívus) var. SMR58, que tenían una edad de dos semanas y que se encontraban en la etapa de la primera hoja verdadera, con aproximadamente 3 mi de Regalía® al 5% (de, Marrone Bio Innovation, Inc., Davis, CA, que comprende Renoutria sachalinensis) en una dilución de 1:2000, de Regalía® al 5% en una dilución de 1:200, de un caldo de células completas de F727, de un caldo de células completas de F727 más Regalía® al 5% en una dilución de 1:2000, de Serenade® (de Bayer Crop Science, Inc.) en una dilución de 1:200, de Sonata® (de Bayer Crop Science, Inc.) en una dilución de 1:200, de Vacciplant® (de Laboratoires Goémar SA) en una dilución de 40 m1/50 mi, de Companion® (de Growth Products, Ltd.) en una dilución de 1:200 o de Double Nickel 55® (de Certis USA, LLC) en una concentración de 0,06 g/50 i. Se analizaron cuatro réplicas por tratamiento. Las plantas se dejaron secar durante dos horas, y luego se trató cada una de ellas con aproximadamente 2 mi de una suspensión de esporas de un moho polvoriento, con una concentración de 3,0 x 105 esporas/ml. Las plantas se incubaron en una recámara de cultivo hasta que se desarrolló la enfermedad.

En función de los resultados, que se representan en la figura 15, puede concluirse que el caldo de células completas proveniente de una fermentación con el aislado de Bacillus sp. F727 (que se identifica como WCB MBI-110 en la figura) fue más eficaz sobre el moho polvoriento que numerosos fungicidas existentes. Los resultados que se obtuvieron con Regalía®, con el sobrenadante de F727 o sin él, se representan en la tabla 6. El coeficiente de sinergia de Colby es una indicación de la presencia de sinergia entre el caldo de células completas de F727 y Regalía® al 5% en una dilución de 1:2000.

Tabla 6 Ejemplo 13. Evaluación de la eficacia de un caldo de celulas completas de F727, de Regalía® y de Double Nickel 55® sobre Phytophthora infestans en el tomate Se atomizaron plantas de tomate ( Solanum lycopersicum) var. Stupice que se encontraban en la etapa de las dos hojas verdaderas, con 2 mi de un caldo de células completas de F727, de Regalía® de (Marrone Bio Innovations, Inc.) en una dilución de 1:200 o de Double Nickel 55® en una concentración de 0,06 g/50 mi (Certis USA, LLC). Las plantas se dejaron secar y luego se atomizaron con una solución que comprendía esporas de Phytophthora infestans en una concentración de 104 esporas/ml, que había sido preparada a partir de hojas de tomate infectadas. Las plantas se incubaron en una recámara de cultivo a 20°C, bajo iluminación artificial. Tres días después del tratamiento, la severidad de la enfermedad en las plantas se evaluó como se describió en el ejemplo 6.

En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 16, puede concluirse que el caldo de células completas proveniente de una fermentación con el aislado de Bacillus sp. F727 (que se identifica como WCB MBI-110 en la figura) dio como resultado una protección sólida contra las infecciones de P. infestans en el tomate.

Ejemplo 14. Evaluación del control de Sclerotívun rolfsii con F727 in vitro Se hizo fermentar el aislado F727 en un medio liquido y se eliminó el sobrenadante por medio de una centrifugación. La mitad del sobrenadante se tamizó a través de un filtro de 0,2 pm. Se colocaron esclerocios individuales de Sclerotium rolfsii en el centro de placas de Petri de 10 cm y se colocaron cuatro discos con un diámetro de 0,5 cm en cada placa, a una distancia de 2 cm de los hongos y a una distancia idéntica unos de otros. Se aplicó un sobrenadante de F727, un sobrenadante de F727 filtrado o Pristine® (de BASF) en una concentración de 0,5 ml/1 sobre los discos, en alícuotas de 12,5 mi, hasta que uno de los pares de discos opuestos comprendiera un volumen total de 25 ml y el otro comprendiera 50 ml. Se prepararon dos placas por tratamiento. Las placas se incubaron a 25°C durante tres días.

El porcentaje de inhibición correspondiente a cada una de las sustancias que se deseaba analizar se determinó en función del crecimiento del micelio, desde el esclerocio hasta el borde más alejado de la colonia en el disco. En función de los resultados que se obtuvieron, que se representan en la figura 17, puede concluirse que el sobrenadante filtrado y el sobrenadante sin filtrar de F727 fueron eficaces para inhibir el crecimiento de S. rolfsii en este análisis en discos. El sobrenadante sin filtrar fue consistentemente más eficaz que el filtrado, y su eficacia fue comparable a la del estándar comercial.

Ejemplo 15. Evaluación del control de Bhizoctonia. solani con F727 en la soja Se inocularon granos de cebada estériles con Rhizoctonia solani y se los incubó durante 1-2 semanas. Los granos se secaron, se combinaron y se mezclaron con arena en una proporción de uno a uno, de manera tal de generar un inoculo con R. solani . La tierra se mezcló a fondo con este inoculo hasta alcanzar un volumen de 500 mi de tierra por maceta, se realizó un riego con 100 mi de agua y se llevó a cabo una incubación en una recámara de cultivo durante 24 horas. El caldo de células completas del aislado F727 se preparó con una fuerza de 100%, de 50% o de 25%. A continuación, se trató la tierra con 40 mi de cada dilución del caldo y se sembraron nueve semillas de soja en cada maceta. Se analizaron tres macetas en cada réplica, y hubo tres réplicas para cada tratamiento. Las plantas se incubaron en una recámara de cultivo durante 14 dias. Se analizó la frecuencia de la germinación, la altura de las plantas, el peso fresco de los brotes y el peso fresco de las raíces.

Se determinó la cantidad de brotes (tabla 7), la emergencia (tabla 8), el promedio del peso de brotes (tabla 9) y la media de la altura de los brotes (tabla 10). En función de los resultados que se obtuvieron, puede concluirse que el caldo de células completas de F727 dio como resultado un incremento a nivel de la emergencia, del peso de los brotes y de la altura de los brotes entre las plantas de soja infectadas por R. solani .

Tabla 7 0 Tabla 8 5 0 5 Tabla 9 Tabla 10 0 5 16. Evaluación del control de diversas bacterias patogénicas de las plantas con F727 in vitro 0 Se inoculó un mi de agua estéril con un asa de cada una de las siguientes bacterias patogénicas de las plantas: Erwinia amylovora , Pseudomonas syringae , Bacillus cereus, Erwinia carotovora , Xanthomonas campestris , Xanthomonas arboricola o Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, 5 que provinieron de cultivos en placas con agar de dextrosa de papa (PDA). Se suspendieron las bacterias nuevamente, se sembraron 100 ml de las suspensiones que contenían los patógenos resultantes en una placa con agar PDA y se permitió que tuviera lugar la absorción en las placas durante 10-15 minutos. Se aplicaron discos de filtro estériles sobre el agar y se los cargó con 20 ml de las fracciones de F727 que se habían obtenido en la VLC (a razón de 10 mg/ml en metanol) o de combinaciones de las fracciones provenientes de la VLC. Las fracciones se obtuvieron a partir de una fermentación del aislado de Bacillus sp. F727 en un medio V8, que se llevó a cabo como se describió con anterioridad en el ejemplo 5.

Las placas se incubaron durante 24-48 horas, y luego se las inspeccionó para determinar si había una zona de inhibición alrededor de los disco de filtro, una indicación de la susceptibilidad del patógeno a la fracción de F727. Los resultados se detallan en la tabla 11.

Tabla 11. Susceptibilidad de diversas bacterias fitopatogénicas a las fracciones de F727 Referencia: +++ muy susceptible, ++ susceptible, - resistente La inhibición de la mayor cantidad de especies de bacterias se observó con la fracción 3. Como consecuencia, esta fracción fue sometida a un fraccionamiento adicional, según se describió con anterioridad en el ejemplo 5. Por otro lado, la fracción 5 presentó actividad antibacteriana contra Bacillus cereus, contra Erwinia carotovora y contra Clavibacter .

Ejemplo 17. Evaluación de un sobrenadante y un extracto en bruto de F727 preparados en diversos medios en el control de la germinación de diversos hongos patogenicos in vitro El aislado F727 se hizo fermentar en 12 medios líquidos diferentes. Se tomaron muestras del sobrenadante y del extracto en bruto y se las sometió a un análisis de la respuesta a la dosis, que estuvo basado en germinación de diversas esporas. En una placa de 48 cavidades, se combinó una muestra de 100 ml de un sobrenadante o de un extracto en bruto con 200 ml de agar de dextrosa de papa (PDA) 1,5x y se permitió que se completara la solidificación. Se prepararon suspensiones de esporas de diversos hongos patogénicos de las plantas en las concentraciones que se detallan en la tabla 12 y se aplicaron 50 ml de las suspensiones que contenían las esporas sobre la parte superior de la mezcla que comprendía el PDA y los tratamientos. Se incubaron las placas a 25°C durante 3-5 días y se llevó a cabo la evaluación visual de la germinación de las esporas de los hongos.

Los resultados se detallan en la tabla 13. Todos los sobrenadantes que se analizaron dieron como resultado la inhibición de la germinación de los patógenos en la concentración más baja (3,13%). La actividad de los extractos en bruto varió en función del medio que se empleó para cultivar las células de F727 (una dilución 0,4% del extracto en bruto fue la concentración más baja que se evaluó). En función de esto, puede concluirse que la actividad de los extractos de F727 puede depender del medio en el cual se cultivan las células, y por tanto, la actividad óptima sobre un patógeno un particular puede ajustarse sobre la base del medio que se emplea para cultivar las células. A modo de ejemplo, el medio M24 puede usarse para cultivar células cuyos extractos pueden usarse para combatir a Fusarium.

Tabla 12 Tabla 13. Concentración mínima del extracto en bruto de F727 en diversos medios que es necesaria para inhibir la germinación de diversas esporas fúngicas Ejemplo 18. Evaluación del efecto de F727 sobre las características de crecimiento de las plantas in vitro Se analizó el efecto del aislado F727 sobre las características de crecimiento de las plantas in vitro, incluyendo su capacidad de solubilizar el fosfato, la producción de la ACC-desaminasa, la producción del ácido 0 indol-3-acético (IAA), la producción de los sideróforos (agar CAS) y la capacidad de desarrollarse con metanol como única fuente de carbono (agar AMS). El análisis de la capacidad de solubilizar el fosfato se llevó a cabo en agar de bromofenol con azul-fosfato, el análisis de la actividad de la ACC-5 desaminasa se realizó en placas con agar ACC como única fuente de carbono y de nitrógeno, el análisis de la producción de los sideróforos se puso en práctica sobre agar CAS, y el análisis de la metilotrofía se efectuó en agar con sales minerales, modificado con metanol como única fuente de 0 carbono. Según puede observarse en la tabla 14, el aislado F727 fue positivo en todos los aspectos relacionados con la promoción del crecimiento de las plantas que se han descripto.

Tabla 14 5 Referencia: +++ respuesta positiva muy fuerte, ++ respuesta positiva, + respuesta positiva débil Ejemplo 19. Análisis del vigor de las semillas tratadas con F727 Se sometieron semillas de maíz, de soja, de trigo, de arroz, de sorgo y de tomate a una esterilización superficial con lejía al 1% durante seis minutos y se las enjuagó cinco veces con agua esterilizada. Las semillas se sumergieron 0 durante 24 horas en una suspensión de F727 que había sido preparada en sulfato de magnesio 10 mM. Las semillas se secaron durante 30 minutos para el experimento N° 1 y durante la noche para el experimento N° 2. Se permitió que las semillas germinaran en toallas de papel húmedas durante 5 varios días y se determinó su peso fresco total.

Los resultados se representan en la tabla 15: a partir de ellos, puede concluirse que las células del aislado de Bacillus sp. F727 promovieron el crecimiento del maíz, de la soja, del sorgo y del tomate. 0 Tabla 15 5 #Var. Kandy Korn *Var. Trucker's Favorite Yellow, Boone County White y Silver King.

Ejemplo 20. Actividad antifúngica sobre Aspergillus niger Se evaluó el efecto de inhibición de un caldo de células completo (WCB) proveniente de una fermentación con el aislado de Bacillus sp. F727 sobre el patógeno posterior a la cosecha Aspergillus niger, por medio de un análisis basado en la inmersión de los frutos. El WCB se empleó no diluido o diluido en agua estéril, en una concentración de 5%, 20% o 50%.

Se sumergieron uvas verdes esterilizadas durante cinco segundos en cada una de las concentraciones del WCB y se las colocó sobre una rejilla, dentro en una caja para frutas y verduras. Una vez que se secaron los frutos, sobre cada caja se aplicaron 24 atomizaciones con el inoculo de A. niger, a razón de 3 x 103 esporas/ml. Se colocaron 100 mi de agua desionizada en cada caja, debajo de la rejilla, con el fin de incrementar la humedad, se sellaron las cajas y se llevó a cabo una incubación a temperatura ambiente. En el experimento, se emplearon dos cajas para frutas y verduras por tratamiento, cada una de las cuales contenía 5 uvas. Se usó un tratamiento con agua como control negativo y el producto comercial Switch como control positivo.

El porcentaje de la enfermedad en cada uva se determinó mediante la observación de la cobertura del micelio. Los resultados se detallan en la tabla 16, y a partir de ellos puede concluirse que el WCB de F727 presentó una actividad significativa sobre Aspergillus .

Tabla 16. Porcentaje de la enfermedad provocada por A. ni er en las uvas después de 12 dias de crecimiento y de un tratamiento basado en una inmersión con un WCB F727 Ejemplo 21. Promoción del crecimiento del maíz Se sembraron semillas de maíz en una mezcla de tierra, en macetas con un diámetro de 4 pulgadas, en una densidad de 10 semillas por maceta. En el momento de la siembra y una semana más tarde, las macetas sembradas se trataron con un caldo de células completas de F727. Las macetas se incubaron en un invernadero. En total, se evaluaron 10 plantas por maceta y 9 macetas por tratamiento.

Se registró el peso fresco total después de 2 semanas de crecimiento. Las plantas de control (tratadas con agua) se caracterizaron por un promedio del peso fresco de 21,48 ± 4,02 g, mientras que las plantas que fueron tratadas con el WCB de F727 presentaron un promedio del peso fresco de 26,5 ± 3,55 g. Estas diferencias son significativas desde el punto de vista estadístico, lo cual se determinó con un ANOVA de Tukey Minitab. Estos resultados constituyen una evidencia adicional de la actividad de promoción del crecimiento que presenta el WCB de F727.

Ejemplo 22. Control del moho polvoriento Bremia lactucae en la lechuga mediante el tratamiento de la tierra con un caldo de células completas de F727 Se obtuvieron esporas de un moho polvoriento ( Bremia lactucae) cortando las hojas de plantas infectadas donde se encontraban, que habían sido cultivadas en cajas de cultivo, y sacudiendo las hojas en 50 mi de agua desionizada. El líquido se tamizó a través de un filtro de nylon de 100 pm. Se determinó la cantidad de esporas en el líquido filtrado con un hemocitómetro y se ajustó su concentración con agua desionizada, de modo tal de obtener 5 x 104 esporas/ml.

Para preparar el caldo de células completas (WCB), se cultivó la cepa de Bacillus F727 en un medio SPY a 25°C durante 24-72 horas.

Se sembró lechuga (cv. Celtuce) en macetas de 2,5 pulgadas, en una densidad de seis plantas por maceta. Las plantas fueron cultivadas en una recámara de cultivo a 16°C, con un fotoperiodo de 12 horas. Después de 10 dias de cultivo, se trató la tierra con 20 mi del WCB de F727.

Una hora después de aplicar el tratamiento, se atomizó aproximadamente 1 mi de la suspensión de esporas del moho polvoriento que se describió con anterioridad sobre cada maceta con plantas de lechuga. Durante las primeras 48 horas posteriores a la inoculación, las macetas se incubaron en bandejas de plástico cubiertas. Posteriormente, se las incubó a 16°C durante 8 días, con un fotoperiodo de 12 horas.

En cada cotiledón, se calificó la severidad de la enfermedad en función del porcentaje de la superficie enferma de la hoja, y luego se calculó el promedio de la severidad para cada maceta con plantas. Se compararon los resultados que se obtuvieron con el tratamiento (que se aplicó como un riego sobre la tierra) con los que se obtuvieron en las plantas de control sin tratar (UTC) por medio de una prueba t: se los detalla en la tabla 17 y en la figura 18. Puede observarse una diferencia de significación estadística (p = 0,0036) en la disminución de la severidad de la enfermedad provocada por el moho polvoriento en las plantas de lechuga como resultado del tratamiento con el caldo de células completas de F727.

Tabla 17. Efecto del tratamiento de la tierra con el WCB de F727 sobre las infecciones del moho polvoriento en la lechuga (prueba de t con dos muestras, con la presunción de varianzas idénticas) Ejemplo 23. Sinergia entre el caldo de células completas de F727 y Bacillus amyloliquefaciens en el control del moho polvoriento Sphaerotheca fuliginea en el pepino Se preparó un inoculo de Sphaerotheca fuliginea enjuagando hojas de pepino infectadas con agua desionizada y filtrando el producto a través de dos capas de tejido perforado.

Se atomizaron plantas de pepino que se encontraban en la etapa de las dos hojas verdaderas con 2 mi del tratamiento (que se describirá más adelante) y se las dejó secar durante tres horas, después de lo cual se las inoculó cepillando las hojas con 2 mi de un inoculo de S. fuliginea con una concentración de 2,5 x 105 conidios/ml.

A continuación se describen los tratamientos que se aplicaron (que se analizaron en tres réplicas). 1. Agua (el control negativo) 2. Un caldo de células completas de F727 (con una fuerza completa) 3. Un caldo de células completas de F727 (con 50% de fuerza) 4. Un caldo de células completas de F727 (con una fuerza completa) más Double Nickel 55 (3 libras/acre) 5. Un caldo de células completas de F727 (con 50% de fuerza) más Double Nickel 55 (3 libras/acre) 6. Double Nickel 55 (3 libras/acre) Para preparar el caldo de células completas, se cultivó F727 en un medio SPY durante 5 dias. Double Nickel 55 es una preparación comercial a base de B. amyloliquefaciens (de Certis USA, Columbra, MD) que presenta una actividad fungicida con un espectro amplio, incluso sobre el moho polvoriento.

Después de la inoculación, las plantas se incubaron en una recámara de cultivo, a una temperatura de aproximadamente 25°C durante diez dias, momento en el cual se realizó una evaluación visual de la severidad de la enfermedad, que se determinó como el porcentaje enfermo de la superficie de las hojas. Los resultados, que se detallan en la tabla 18, se analizaron con el programa informático estadístico Minitab 16 (de Minitab, State College, PA), y la sinergia potencial se evaluó mediante el cálculo del coeficiente de sinergia de Colby. Colby (1967), "Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide combinations", Weeds, 15: 20-22.

Tabla 18. Efecto del caldo de células completas de F727 y de mezclas de éste con Double Nickel 55 en el control del moho polvoriento en el pepino *Los resultados relacionados con la severidad de la enfermedad se expresan como las medias y las desviaciones estándar. Las medias que no presentan letras idénticas difirieron de manera significativa (p < 0,05) en el análisis LSD de Fisher.

#Ee es la eficacia esperada en la fórmula de Colby (Colby, 1967): Ee = A + B - AB/100, donde A y B son las eficacias de los productos individuales; hay sinergia si la eficacia de la 0 combinación (% del control, E) es mayor que Ee (E/Ee > 1,0).

En función de los resultados que se proveen en la tabla 18, puede concluirse que el caldo de células completas de F727 presentó una sinergia fuerte con Double Nickel en el control de moho polvoriento, con coeficientes de sinergia de 5 Colby de 5,6 y 1,8 para el caldo de células completas con una fuerza completa y para el caldo de células completas con una fuerza media, respectivamente.

Ejemplo 24. Promoción del crecimiento de las plantas con 0 formulaciones en forma de talco con un caldo de células completas de F727 Se preparó una formulación en forma de talco mezclando un vehículo seco a base de talco (1 kg), carboximetil celulosa (10 g), carbonato de calcio (15 g) y un caldo de 5 células completas de F727, con una proporción entre el vehículo seco y el WCB de 1:1 (p/v). La mezcla se secó durante la noche, y luego se la sometió a una molienda fina. Esta formulación se aplicó de dos maneras. En el primer método, se la aplicó sobre la tierra durante la siembra, debajo de las semillas (de maíz del campo), directamente en los surcos. En el segundo método, la formulación en forma de talco se disolvió en agua y se aplicó con antelación sobre las semillas, durante la noche previa a la siembra. Se usó agua como control. Las plantas se cultivaron durante dos semanas en un invernadero y se pesaron.

Los resultados de estos análisis se detallan en las tablas 19 y 20. La aplicación en el surco dio como resultado un incremento de 16% en la media del peso fresco (tabla 19), mientras que la aplicación preliminar dio lugar a un incremento de 15% en promedio del peso fresco (tabla 20). En función de lo anterior, puede concluirse que el WCB de F727 presenta actividad de promoción del crecimiento.

Tabla 19. Aplicación de la formulación en forma de talco con el WCB de F727 sobre los surcos Tabla 20. Aplicación preliminar de la formulación en forma de talco con el WCB de F727 sobre las semillas Ejemplo 25. Fraccionamiento de un caldo de celulas completas de F727 Se cultivó la cepa F727 en un litro de un medio de fermentación apropiado (por ejemplo, SPM, SPY, TSB o V8), a 25°C durante 48-72 horas. Se extrajo un litro del caldo de células completas con una resina Amberlite XAD-7 agitando la suspensión de células con la resina a 155 rp , a temperatura ambiente durante dos horas. La masa que contenía la resina y las células se recolectó por medio de una filtración a través de un tejido perforado y se lavó con agua desionizada para eliminar las sales. Posteriormente, la resina, la masa que contenía las células y el tejido perforado se sumergieron durante 2 horas en acetona, después de lo cual se eliminó la acetona por medio de una filtración y se realizó un secado al vacío, mediante el uso de un evaporador rotatorio, de modo tal de obtener un extracto en bruto.

El extracto en bruto se fraccionó por medio de una cromatografía líquida con una fase inversa C18 al vacío. En un esquema de fraccionamiento que se describió con anterioridad (véase el ejemplo 5 y la figura 1), había sido posible hallar actividad plaguicida en las fracciones 3 (obtenida con un corte con metanol al 40%-60%) y 4 (obtenida con un corte con metanol al 60%-80%). Para maximizar la actividad en una misma fracción, se modificó el procedimiento de VLC en una fase inversa C18 como se detalla en la tabla 21: se introdujo un corte con metanol al 50%-80% (en la fracción 4). Los compuestos A, B y C se purificaron a partir de la fracción 4, por medio de una HPLC C18 que se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 5.

Tabla 21. Fracciones del extracto de F727 con la resina Amberlite que se obtuvieron en la VLC Ejemplo 26. Determinación de la estructura del compuesto A por medio de un análisis de MS/MS El compuesto con un peso molecular 1044 de la fracción 4 (el compuesto A) fue sometido a un análisis de espectrometría de masa con ionización combinada con una espectrometría de masa (ESIMS/MS) para obtener la secuencia de sus aminoácidos constituyentes. Los resultados se ilustran en la figura 19.

Sobre la base de estos resultados, puede afirmarse que la estructura del compuesto A corresponde a la del péptido cíclico que se ilustra en la fiqura 20.

Ejemplo 27. Actividad bactericida de los compuestos y las fracciones provenientes de la VLC Se sembró Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Xanthomonas arboricola, Acidovorax avenae subsp. citrulli y Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis en agar de dextrosa de papa. Una vez que se acumuló una biomasa suficiente, se extrajo un asa de siembra de cada uno de los patógenos y se la suspendió en agua estéril. Se sembraron 100 ml de cada suspensión en una placa con agar de dextrosa de papa y se permitió que se absorbiera durante 10-15 minutos.

Se prepararon muestras de las fracciones 4 y 5 que habían sido obtenidas en la VLC, según se describió en el ejemplo 25, y de los compuestos A (con un peso molecular de 1044), B (con un peso molecular de 1058) y C (con un peso molecular de 1072), que habían sido obtenidos a partir de la fracción 4 de la VLC, según se describió en el ejemplo 25, en una concentración de 5 mg/ml en metanol, y luego se las sometió a 5 series de diluciones al medio en agua (es decir, se analizaron concentraciones de entre 0,15625 mg/ml y 5 mg mi, en incrementos del doble). Se aplicaron discos de filtro estériles sobre las placas con agar y se los cargó con 20 ml de cada una de las muestras. Se incubaron las placas a 25°C durante 3 días y se determinó la presencia de zonas de inhibición del crecimiento alrededor de los discos de filtro, una indicación de la susceptibilidad del patógeno a las muestras. Cuando se detectó la inhibición, se determinó la concentración mínima de la muestra que presentó actividad de inhibición. Los resultados se detallan en la tabla 21. Las fracciones 4 y 5 presentaron actividad de inhibición sobre Erwinia caratovora y sobre Clavibacter michagensis, mientras que los compuestos A y B inhibieron el crecimiento de Acidovorax avenae.

Tabla 21. Concentración mínima de las muestras que inhibió el crecimiento de los patógenos Ejemplo 28. Actividad fungicida de los compuestos y de las fracciones provenientes de la VLC Se prepararon muestras de las fracciones 4 y 5 que hablan sido obtenidas en la VLC, según se describió en el ejemplo 25, y de los compuestos A (con un peso molecular de 1044), B (con un peso molecular de 1058) y C (con un peso molecular de 1072), que hablan sido obtenidos a partir de la fracción 4 de la VLC, según se describió en el ejemplo 25, en una concentración de 5 mg/ml en metanol. Se prepararon series de diluciones de cada muestra en una placa con 48 cavidades. La mayor concentración que se analizó para cada muestra fue de 500 mg/ml (10% de la concentración original): las muestras fueron sometidas a una serie de diluciones al medio en agua a partir de ella, hasta alcanzar una concentración de 3,9062 g/ml. Se aplicaron 100 ml de cada una de las diluciones de las muestras sobre las cavidades, se agregaron 200 ml de agar de dextrosa de papa (PDA) 1,5x y se permitió que se completara la solidificación durante 10-15 minutos.

Se sembró Colletotrichum cereale, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea y Verticillium dahliae en PDA y se realizó una incubación a temperatura ambiente hasta que el micelio creció sobre la totalidad de las placas. Se agregó agua estéril a cada placa y se usó un esparcidor estéril para desalojar el micelio y las esporas. La suspensión se hizo pasar a través de un filtro para separar el micelio y las esporas. Se contaron las esporas con un hemocitómetro y se ajustó su concentración entre 103 y 104 esporas/ml por medio de una dilución con agua.

Phytophthora capsici fue sembrada en agar PARP y fue cultivada a temperatura ambiente hasta que se observó un crecimiento suficiente del micelio. Se agregó agua estéril a la placa y se usó un esparcidor estéril para desalojar el micelio y las esporas. La placa se incubó en una recámara Conviron, a 16°C durante 1-2 horas, hasta que las zoosporas se liberaron de los esporangios. Las esporas se recolectaron en un tubo, se las contó con un hemocitómetro y se ajustó la concentración de la suspensión resultante entre 103 y 104 esporas/ml mediante la adición de agua.

Se aplicaron 50 ml de la solución que contenia las esporas de cada patógeno sobre cada una de las cavidades donde se hallaban las muestras. Se incubaron las placas a 25°C durante 4-5 dias y se observó la inhibición de la germinación de las esporas en las cavidades, una indicación de la susceptibilidad de los patógenos a las muestras. Cuando se detectó la inhibición, se determinó la concentración mínima de la muestra que presentó actividad de inhibición. Los resultados se detallan en la tabla 22.

Tabla 22. Concentración mínima de las muestras que inhibió la germinación de las esporas Los compuestos A, B, y C y la fracción 4 inhibieron la germinación de las esporas de todos los hongos patogénicos que se analizaron, con la excepción de P. capsici . El compuesto C y la fracción 4 presentaron las actividades de inhibición más elevadas.

DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO El siguiente material biológico ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con la Colección de Cultivo para Investigación Agrícola (NRRL), 1815 N.

University Street, Peoría, Illinois 61604 EE.UU., y se le ha dado el siguiente número: Depósito Número de acceso Fecha de depósito Cepa F727 Bacillus sp. NRRL B-50768 Io de agosto de 2012 La cepa se ha depositado bajo las condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible mientras esta solicitud de patente esté pendiente a una determinada por el Comisionado de Patentes y marcas registradas para tener derecho bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible según se requiera por las lcyes de patentes extranjeras en países en donde se presentar contrapartes de la presente aplicación, o su progenie. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación de derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.

La invención descrita e invocada en la presente no se limita en alcance por los aspectos específicos descritos en la presente, ya que estos aspectos tienen como intención ilustrar varios aspectos de la invención. Se pretende que cualquier aspecto equivalente se encuentre dentro del alcance de esta invención. De hecho, diferentes modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente resultarán evidentes para aquellos con experiencia en el arte a partir de la descripción precedente. Dichas modificaciones tienen como intención caer dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En caso de conflicto, prevalecerá la presente divulgación que incluye las definiciones.

En la presente se vitan varias referencias, cuyas divulgaciones se incorporan a modo de referencia en su totalidad. 0 5 0 25

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un cultivo sustancialmente puro de una cepa de Bacillus que tiene las siguientes características: (A) por lo menos uno de: (1) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 99,5% de identidad con una secuencia de ARNm de 16S detallada en SEQ ID NO:3; (2) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 95% de identidad con una secuencia de recA detallada en SEQ ID NO:10 y (3) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos 90% de identidad con una secuencia de phoR revertida detallada en SEQ ID NO:13; (B) actividad plaguicida; (C) es resistente a Kanamicina, Cloramfenicol, Ampicilina, Penicilina, Cefuroxima, Piperacilina, Tetracielina; (D) posee actividad de fosfatasa alcalina, esterasa, fosfatasa ácida, naftol-AS-BI-fosfohidrolasa; y (E) es no patogénico para animales vertebrados.

2. El cultivo de la reivindicación 1, en donde dicha cepa tiene por lo menos una de las características identificadoras de la cepa F727 de Bacillus (No, de acceso a NRRL B-50768).

3. Un filtrado, sobrenadante, extracto, fracción celular o cultivo de célula completo obtenido del cultico de la reivindicación 1.

4. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: (a) un compuesto A que (i) puede obtenerse del aislado F727 de Bacillus sp. ; (ii) tiene actividad plaguicida; (iii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1020 y 1060 y más particularmente, 1044 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS); (iv) tiene valores de 1H RMN de d 7,15, 6,72, 4,81, 4,70, 4,65, 4,40, 4,35, 4,25, 4,15, 3,85, 3,65, 3,50, 3,22, 2,85, 2,80, 2,65, 2,45, 2,35, 2,30, 2,20, 1,95, 1,55, 1,31, 1,20 y 0,85; (v) tiene un tiempo de retención de cromatografía liquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 12 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 8,31 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa (Phenomenex, Luna 5m C18(2) 100 D, 100 x 4,60 mm) usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm; (vi) opcionalmente contiene 47 átomos de carbono, 72 átomos de hidrógeno, 12 átomos de nitrógeno, y 15 átomos de oxigeno; y (vii) opcionalmente es un péptido que comprende glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades); (b) un Compuesto B que (i) tiene actividad plaguicida; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1030 y 1080 y más particularmente, 1058 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometria de masas (LC/MS); (iíi) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 14 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 8,67 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm; (iv) opcionalmente comprende 48 átomos de carbono, 74 átomos de hidrógeno, 12 átomos de nitrógeno, y 15 átomos de oxígeno; y (v) opcionalmente es un péptido que comprende glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades); y (c) un Compuesto "C" que (i) tiene actividad plaguicida; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente entre 1050 y 1120 y más particularmente, 1072 de acuerdo a lo determinado por cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS (iii) tiene un tiempo de retención de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) de aproximadamente entre 6 y 14 minutos, más específicamente aproximadamente 9 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 9,19 min en una columna C-18 HPLC en fase reversa usando un sistema de solvente en gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0,5 ml/min y detección en UV a 210 nm; (iv) opcionalmente comprende 49 átomos de carbono, 76 átomos de hidrógeno, 12 átomos de nitrógeno, y 15 átomos de oxígeno; y (v) opcionalmente es un péptido que comprende glutamina (1 unidad), prolina (1 unidad), serina (1 unidad), tirosina (1 unidad) y asparagina (3 unidades).

5. Una composición que comprende: (a) una primera sustancia seleccionada del grupo que consiste en: (i) el cultivo de la reivindicación 1, (ii) una fracción celular del cultivo de la reivindicación 1, (iii) un sobrenadante obtenido del cultivo de la reivindicación 1, (iv) un filtrado obtenido del cultivo de la reivindicación 1, (v) un extracto o de cualquiera de (i), (ii), (iii) o (iv), (vi) un metabolito producido por el cultivo de la reivindicación 1, (vii) compuesto A, (viii) compuesto B, (ix) compuesto C; y (b) opcionalmente en combinación con por lo menos uno de (i) una segunda sustancia, en donde dicha segunda sustancia es uno o más de un plaguicida químico o biológico, un agente promotor del crecimiento vegetal, un agente antifitopatogénico y un fertilizante; y (ii) por lo menos uno de un transportador, diluyente, tensioactivo, o adyuvante.

6. La combinación de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha segunda sustancia es un plaguicida químico o biológico.

7. La combinación de acuerdo con la reivindicación 5 en donde la combinación es una composición.

8. Un método para modular la infestación por plaga en una planta que comprende aplicar a la planta y/o semillas de la misma y/o sustrato usado para el crecimiento de dicha planta una cantidad de una composición selecciona del grupo que consiste en: (a) el cultivo de la reivindicación 1; (b) una fracción celular del cultivo de la reivindicación 1; (c) un sobrenadante obtenido del cultivo de la reivindicación 1; (d) un filtrado obtenido del cultivo de la reivindicación 1; (e) un extracto o de cualquiera de (a), (b), (c) o (d); (f) un metabolito producido por el cultivo de la reivindicación 1; (g) compuesto A; (h) compuesto B; y (i) compuesto C eficaz para modular dicha infestación por plaga.

9. El método of reivindicación 8, en donde la plaga es un hongo o una bacteria.

10. El método de la reivindicación 9 en donde el hongo se selecciona del grupo que consiste en Aspergillus, Alternaría, Bremia, Sphaerotheca , Colletotrichum , , Fusarium, Verticillium, Botrytis, Sclerotinia, Sclerotium, Rhizoctonia y Bipolaris.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la composición inhibe la germinación de esporas.

12. El método de la reivindicación 9 en donde la bacteria se selecciona del grupo que consiste en Bacillus, Erwinia , Acidovorax y Clavibacter .

13. El método de la reivindicación 8, en donde la plaga es Phytophthora .

14. El método de la reivindicación 9, en donde la composición además comprende un plaguicida.

15. El método de la reivindicación 14, en donde la plaga es un hongo y el plaguicida se selecciona del grupo que consiste en extracto de Reynoutria sachalinensis (hierba nudosa) o, Regalía® y Double Nickel 55™.

16. Un método para modular el crecimiento de una planta y/o germinación de una semilla; en donde el método comprende poner en contacto dicha planta, su sustrato de crecimiento, y/o una semilla de dicha planta con una cantidad de una composición selecciona del grupo que consiste en: (a) el cultivo de la reivindicación 1; (b) una fracción celular del cultivo de la reivindicación 1; (c) un sobrenadante obtenido del cultivo de la reivindicación 1; (d) un filtrado obtenido del cultivo de la reivindicación 1; (e) un extracto o de cualquiera de (a), (b), (c), o (d); (f) un metabolito producido por el cultivo de la reivindicación 1; (g) compuesto A; (h) compuesto B; y (i) compuesto C; en donde dicha cantidad es eficaz para modular el crecimiento de dicha planta y/o germinación de dicha semilla.

17. El método de la reivindicación 16, en donde la composición además comprende un agente promotor del crecimiento, un tensioactivo, un transportador, un adyuvante, y/o un fertilizante.

18. El método de la reivindicación 16, en donde la composición es una formulación en talco.

19. Uso de una composición para formular un plaguicida y/o composición promotora del crecimiento vegetal, en donde la composición se selecciona de uno o más del grupo que consiste en: (a) el cultivo de la reivindicación 1, (b) una fracción celular del cultivo de la reivindicación 1, (c) un sobrenadante obtenido del cultivo de la reivindicación 1, (d) un filtrado obtenido del cultivo de la reivindicación 1, (e) un extracto o de cualquiera de (a), (b) (c) o (d), (f) un metabolito producido por el cultivo de la reivindicación 1, (g! compuesto A, (h) compuesto B, y (i) compuesto C.

20. El uso de la reivindicación 19, en donde el plaguicida o composición promotora del crecimiento vegetal además comprende una segunda sustancia seleccionada de una o más del grupo que consiste en: (a) un plaguicida, (b¡ un agente promotor del crecimiento vegetal, (c) un transportador, (d) un adyuvante, (e) un tensioactivo, (f) un fertilizante, y (g) un agente antifitopatogénico.

21. El uso de la reivindicación 20, en donde el plaguicida se selecciona del grupo que consiste en un bactericida, un fungicida y un nematicida.

22. El uso de la reivindicación 21, en donde el plaguicida se selecciona del grupo que consiste en extracto de hierba nudosa y Regalía®. 0 5 0 5