CN102341493A - 昆虫病原真菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了昆虫病原性球孢白僵菌菌株，包含该昆虫病原真菌菌株或所述菌株的代谢物的组合物，和所述昆虫病原真菌菌株和组合物作为生物控制剂的用途。也提供了使用昆虫病原球孢白僵菌真菌菌株或其一种或多种代谢物和任选地联合其他昆虫病原真菌，包括选自蚧霉属物种、玫烟色拟青霉的菌株的真菌，以及包含所述真菌或其代谢物的组合物用于生物控制植物病原昆虫的方法。

Description

昆虫病原真菌及其用途
发明领域
本发明涉及昆虫病原真菌及其代谢物，包含所述昆虫病原真菌或一种或多种其代谢物的组合物和这些昆虫病原真菌和组合物作为生物控制剂的用途。也提供了使用昆虫病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和包含所述真菌或一种或多种其代谢物的组合物用于植物病原昆虫包括蚜虫、蓟马、粉虱、粉蚧等等的生物控制的方法。 
发明背景 
由病原体例如昆虫导致的植物疾病是基于植物的农业和工业的重要经济成本。损失可由收获前后产品的损坏、植物自身的损失或由生长和生产能力的降低而引起。 
传统上，通过应用化学农药寻求对植物病原体的控制。化学试剂的使用存在多个缺点。随着时间的过去，病原体可以并已经对化学试剂产生耐受性，由此导致抗性种群。实际上，农药抗性是对园艺工业生产力的最大挑战。 
通过许多在生态学上重要的植物病原昆虫具体说明这一问题。据报导，世界范围的西花蓟马种群对大多数类型的农药具有抗性，包括以下示例：高灭磷(acephate)、阿巴美丁(abamectin)、毒死蜱(chlorpyrifos)、硫丹(endosulfan)、灭多虫(methomyl)、灭虫威(methiocarb)、氧化乐果(omethoate)、定菌磷(pyrazophos)和氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)。新西兰的洋葱蓟马种群已经对溴氰菊酯(Deltamethrin)产生抗性，据报导地方种群对二嗪农(diazinon)和敌敌畏(dichlorvos)具有抗性。据报导，美国的洋葱蓟马对许多农药具有抗性(Grossman，1994)。据报导温室粉虱已对有机氯、有 机磷酸酯、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性(例如Georghiou 1981，Anis&Brennan 1982，Elhag&Horn 1983，Wardlow 1985和Hommes1986)。在较新的农药噻嗪酮(buprofezin)和伏虫隆(teflubenzuron)中也报导了抗性(Gorman等人2000)。 
化学残留物也会造成环境危害和引起健康问题。在近20年中对生物控制例如微生物农药的兴趣的复苏直接来自由关注化学毒性引起的公众压力。生物控制提供了控制植物病原体的替代方式，其比现有方法潜在地更有效和具特异性，并且降低对化学品的依赖性。这些生物控制方法被视为农药的“天然”替代物，并具有更高的公众接受度、降低的环境污染和增强的可持续性的优点。 
生物控制的机制有多种。一种被证明有效的机制是使用拮抗性微生物例如细菌控制植物病原昆虫。例如，苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)的大规模生产使此细菌杀虫剂能够用于控制新西兰奥克兰的基黄毒蛾(painted apple moth)。 
有关成功应用昆虫病原真菌的信息很少，它们的工业生产仍相对不成熟。在美国、欧洲、非洲和俄罗斯已经开发了使用蜡蚧霉(Lecanicillium muscarium)(以前被称为蜡蚧轮枝孢(Verticillium lecanii))，球孢白僵菌和绿僵菌(Metarhizium anisopliae)作为生物控制剂(BCA)的昆虫病原真菌应用。然而，至今没有一种候选菌被证明是理想的，这可能是由于无法在田间的环境变异性中迅速定植和/或存活。事实上，现有的候选菌似乎不能得到大量种植者的认可，并可能被视为是不经济的。 
在一个国家中开发的昆虫病原真菌对另一个国家的园艺学家例如由于管理限制常常是不可得的或者是延迟获得的，从而使上述情况恶化。此外，许多非本土真菌可能不适于或不能够在当地条件下存活或繁盛。 
令人惊讶的，本申请人现在鉴定并分离了在任何以前的报导中均没有提过作为有效BCA的白僵菌属菌株。本申请人已确定此物种对控制植物病原昆虫(包括但不限于蓟马、蚜虫和粉虱)高度有效并在田间成功存活和定植。 
因此本发明的目的是提供对植物病原昆虫的生物控制有用的白僵菌属菌株，或至少提供给公众一种有用的选择。 
发明概述 
由此，本发明的一个方面提供2008年9月23日在澳大利亚国家计量院(National Measurement Institute of Australia)(NMIA)以保藏号V08/025855保藏的球孢白僵菌真菌菌株K4B3的生物纯培养物，或具有其鉴定特征的培养物。 
在另一个方面，本发明提供了可从本发明的真菌获得的孢子。 
在另一个方面，本发明提供了如上面定义的至少一种真菌和至少一种载体在制备组合物中的用途。 
在另一个方面，本发明提供了来自如上面定义的至少一种真菌的孢子和至少一种载体在制备组合物中的用途。 
在一个实施方案中，所述至少一种真菌为具繁殖活力的形式和量。 
在另一个方面，本发明提供了包含如上面定义的至少一种真菌和至少一种载体的组合物。 
优选地，所述至少一种真菌为具繁殖活力的形式和量。 
在另一个方面，本发明提供了包含可从本发明的至少一种真菌获得的孢子和至少一种载体的组合物。 
优选地，所述组合物为生物控制组合物，更优选地所述生物控制组合物为昆虫病原组合物。 
优选地，所述生物控制组合物包含至少一种农业上可接受的载体。 
在另一个方面本发明提供了包含保藏号V08/025855的球孢白僵菌菌株K4B3的至少一种代谢物和至少一种载体的组合物。 
在另一个实施方案中，至少一种代谢物为昆虫病原剂，例如至少一种代谢物为分泌的代谢物，例如分泌的毒素。 
优选地，所述至少一种载体为农业上可接受的载体，更优选地，其选自填料刺激剂(filler stimulant)、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂， 更优选地所述组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂各至少一种。 
优选地，所述填料刺激剂为碳水化合物来源，例如二糖，包括例如蔗糖、果糖、葡萄糖或右旋糖(dextrose)，所述抗结块剂选自滑石、二氧化硅、硅酸钙或高岭土(kaelin clay)，所述湿润剂为脱脂奶粉，所述乳化剂为基于大豆的乳化剂例如卵磷脂或基于植物的乳化剂例如甘油单/二酯(monodiglyceride)，和所述抗氧化剂为谷氨酸钠或柠檬酸。 
优选地，所述组合物为生物控制组合物，更优选的为昆虫病原组合物。 
更优选地，所述生物控制组合物为在长于约2周，优选地长于约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月，更优选地长于约6个月的时期内能够支持真菌的繁殖活力或能够保持昆虫致病效力的稳定组合物。 
在某些实施方案中，组合物包含真菌单菌株，球孢白僵菌菌株K4B3(NMIA No.V08/025855，在2008年10月14日保藏)。 
可选地，组合物包含所述真菌的多个菌株，但优选地包含3种菌株或更少。合适地，组合物包含NMIA No.V08/025855和任何一种或多种选自下述的菌株：菌株NMIA No.NM05/44593，菌株NMIA No.NM05/44594，菌株NMIA No.NM05/44595，菌株NM06/00007，菌株NM06/00008，菌株NM06/00009，菌株NM06/00010，和具有所述菌株中任一种的鉴定特征的菌株。 
优选地，所述组合物为下述生物控制组合物，其包含具繁殖活力的形式和量的NMIA No.V08/025855和选自下述的至少一种菌株：蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA No.NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉(Lecanicillium longisporum)菌株KT4L1(NMIA保藏号 NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)菌株K4P1(NMIA保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株，和至少一种农业上可接受的载体。 
在另一个实施方案中，组合物可另外包含球孢白僵菌菌株K4B3保藏号V08/025855的至少一种代谢物。例如，组合物为下述生物控制组合物，其包含球孢白僵菌菌株K4B3保藏号V08/025855的至少一种代谢物和选自下述的至少一种菌株：蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA No.NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株，和至少一种农业上可接受的载体。 
在另一个方面，本发明提供了制备组合物的方法，所述组合物包含球孢白僵菌V08/025855，任选地和一种或多种如本文描述的其他昆虫病原真菌，所述方法包括将本发明的所述昆虫病原真菌的具繁殖活力的形式与至少一种农业上可接受的稀释剂、载体或赋形剂组合。 
优选地，所述其他真菌选自蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA保藏号NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。 
在另一个方面，本发明提供了制备生物控制组合物的方法，所述方法 包括： 
提供球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培养物， 
在适于产生至少一种代谢物的条件下维持所述培养物；和 
i)将该至少一种代谢物和载体组合，或 
ii)将该至少一种代谢物和本文描述的一种或多种昆虫病原真菌组合，或 
iii)从球孢白僵菌K4B3 V08/025855中分离该至少一种代谢物，或 
iv)(i)至(iii)中的2项或更多项的任意组合。 
在一个实施方案中，代谢物为分泌的代谢物。 
在另一个实施方案中，代谢物为细胞内代谢物。特别地在这些实施方案中，所述方法可另外包括在维持步骤之后的一个或多个细胞裂解步骤。 
在多个实施方案中通过离心或过滤进行分离。 
在多个实施方案中，分离有效地去除多于约50％的球孢白僵菌K4B3V08/025855，多于约55％，多于约60％，多于约65％，多于约70％，多于约75％，多于约80％，多于约85％，多于约90％，多于约95％，多于约99％或约100％的球孢白僵菌K4B3 V08/025855。 
由此，在一个特别考虑的实施方案中，所述方法包括提供球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培养物，在适于产生至少一种分泌的代谢物的条件下维持所述培养物和从球孢白僵菌K4B3 V08/025855中分离该至少一种分泌的代谢物。 
优选地，载体为农业上可接受的载体，优选地所述至少一种载体选自填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂，更优选地所述组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂之各至少一种。 
本发明还提供了本发明的组合物在控制一种或多种植物病原昆虫中的用途。 
优选地，所述一种或多种植物病原昆虫选自蓟马(缨翅目(Thysanoptera))，蚜虫，木虱，介壳虫或粉虱(半翅目(Hemiptera))，蛾和蝴蝶(鳞翅目(Lepidoptera))的幼虫和螨(包括瓦螨(varroa mite))。 
在另一个方面本发明提供了控制一种或多种植物病原昆虫的方法，所述方法包括对植物或其周围应用具繁殖活力的形式和量的球孢白僵菌V08/025855，任选地和如本文描述的至少一种其他昆虫病原真菌。 
在一个实施方案中，可对植物或其周围直接应用昆虫病原真菌的孢子。优选地，所述孢子与水混合并如本文描述的应用。 
优选地，所述至少一种其他真菌选自蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA保藏号NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。 
在另一个方面本发明提供了控制一种或多种植物病原昆虫的方法，所述方法包括对植物或其周围应用本发明的组合物。 
优选地，所述组合物在应用前与水混合至约0.5gm/L至约3gm/L的终浓度，更优选地至约1gm/L的终浓度。 
优选地，在应用前混合干燥保护剂，更优选Fortune PlusTM，至约1gm/L的终浓度。 
示例性浓度范围为从约1x102至1x108孢子每ml，从约1x102至1x107孢子每ml，优选地从约1x103至2x106，和更优选1x104至2x106孢子每ml。 
优选地，所述组合物在应用时每毫克包含至少107孢子，更优选地，所述应用通过喷雾进行。 
优选地，包含球孢白僵菌菌株K4B3(NMIA保藏号V08/025855)或具有其鉴定特征的培养物的组合物以约1x1010至约1x1015孢子每公顷的比例应用，优选约1x1012至约1x1014孢子每公顷，更优选约5x1012至约1x1014孢子每公顷，更优选约1-3x1013孢子每公顷。 
方便地，这样的应用比例可通过将所述组合物以约每毫克107孢子或更多配制，并以约每公顷的1kg的比例应用所述组合物而获得。如本文描述的，这样的应用比例可通过将组合物溶解在大体积的农业上可接受的溶剂(例如水)中方便地获得。 
对本发明所属领域的技术人员来说，在不背离如附加的权利要求中定义的本发明的范围下，在本发明的构建和不同实施方案和应用中的许多改变是显而易见的。本文的公开和说明书纯粹是举例说明性的且无意在任何意义上为限制性的。 
在此说明书中当对专利说明书、其他外部文件或其他信息来源进行参考时，这一般是为讨论本发明特征提供背景。除非另外特别说明，对这些外部文件的参考不应理解为承认这些文件或这些信息来源在任何辖区中是现有技术或构成本领域公知常识的一部分。 
附图描述 
图1显示了如本文中实施例4中描述的“白僵菌素-标准蛋氨酸”标准品的质谱扫描。显示了被鉴定为白僵菌素、白僵菌素-F和类白僵菌素的峰。 
图2显示了如本文中实施例4中描述的来自球孢白僵菌K4B3菌株的提取物的质谱扫描。 
发明详述 
本发明部分涉及具有对抗植物病原昆虫效力的球孢白僵菌菌株和这样的真菌在控制所述植物病原昆虫中的用途。 
定义 
词语“昆虫致病活性”和“昆虫致病效力”在本文中可互换使用，指某些活性剂例如某些微生物拮抗一种或多种植物病原昆虫的能力。 
优选地，所述昆虫致病效力是，优选地在与昆虫接触的14天内，更优选7天内，对一种或多种植物病原昆虫造成寄生并使其失去能力，使其不育，阻碍其生长或杀死其的能力，更优选地在7天内杀死一种或多种植物 病原昆虫的能力。 
如本文使用的术语“生物控制剂”(BCA)指下述生物剂，其作为一种或多种植物病原体例如植物病原昆虫的拮抗剂起作用，或能够控制一种或多种植物病原体。拮抗作用可采用多种形式。在一种形式中，生物控制剂可简单地起驱避剂的作用。在另一种形式中，生物控制剂可使环境不利于植物病原体。在另一种优选的形式中，生物控制剂可寄生于植物病原体，使其失去能力，使其不育，阻碍其生长和/或杀死植物病原体。由此，拮抗机制包括但不限于抗生作用、寄生、不育和毒性。因此，作为一种或多种植物病原昆虫的拮抗剂起作用的活性剂可被称为具有昆虫致病效力。此外，作为植物病原昆虫拮抗剂的活性剂可被称为昆虫病原剂。 
如本文使用的，“生物控制组合物”是包含或包括至少一种生物控制剂(其为一种或多种植物病原体的拮抗剂)的组合物。这些控制剂包括但不限于起驱避剂作用的活性剂，使环境不利于病原体的活性剂和使病原体失去能力、使其不育和/或杀死病原体的活性剂。 
由此，如本文使用的“昆虫病原组合物”为包含或包括至少一种作为一种或多种植物病原昆虫的拮抗剂的活性剂的组合物。这些组合物在本文中被认为具有昆虫致病效力。 
如本说明书中使用的术语“包含(comprising)”指“至少部分由...组成”。当在本说明书中解释各条包括术语“包含”的陈述时，以所述术语为开端的那些特征之外的特征也可能存在。以相同的方式解释相关术语例如“包含”和“包括”。 
如本文使用的术语“控制”(“control”或“controlling”)一般涵盖在植物或其周围之中或之上预防、降低或根除植物病原体感染或抑制这些感染的速度和程度，或减少植物病原体群体，其中对感染或群体的预防或降低相对未处理的感染或群体是统计上显著的。也考虑治愈性处理。优选地，通过在植物病原体群体中提高的死亡率实现这些控制。 
如本文使用的术语“代谢物”涵盖本发明真菌所产生的任何物质，或参与本发明真菌中发生的代谢反应的任何物质，包括本发明的昆虫病原真 菌分泌、排泄或产生的任何物质。 
如本文使用的术语“植物”不仅涵盖整株植物，还延及植物部分、插枝以及植物产物，包括根、叶、花、种子、茎、愈伤组织、坚果和果实、鳞茎、块茎、球茎、谷粒、插枝、根砧木或接穗，并包括任何植物材料，不管是种植前、生长中和收获时或收获后的。可能从本发明的应用中获利的植物覆盖广泛的农业和园艺作物范围。本发明的组合物还特别适用于在有机生产系统中应用。 
当在昆虫病原剂例如昆虫病原真菌菌株中使用时，词语“保持昆虫致病效力”和其语法上的等同物和衍生物旨在指，所述活性剂仍然具有有用的昆虫致病活性。优选地，保持的活性为原始活性的至少约35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，99或100％，并且可从这些数值的任意两者之间选择有用范围(例如，从约35至约100％，从约50至约100％，从约60至约100％，从约70至约100％，从约80至约100％，和从约90至约100％)。例如，在本发明中有用的具有特定菌株之鉴定特征的菌株应当保持昆虫致病活性，即保持该特定菌株的昆虫致病活性的至少约35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，99或100％。由此，具有球孢白僵菌K4B3的鉴定特征的菌株，例如球孢白僵菌K4B3的同源物或突变体，应当保持球孢白僵菌K4B3的昆虫致病活性的至少约35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，99或100％。类似地，本发明的优选组合物能够帮助维持其包含的昆虫病原剂的昆虫致病活性，并可被称为保持昆虫致病活性，理想地直到使用本文的方法对其进行应用前。 
如本文使用的，当与本发明的组合物相关使用时，术语“稳定的”指组合物能够在数周内，优选约1、约2、约3、约4、优选约5、更优选约6个月或更长时间内支持昆虫病原真菌的繁殖活力或支持(例如昆虫病原真菌的一种或多种代谢物的)昆虫致病效力。 
“具有[规定菌株的]鉴定特征的菌株”，或“具有[规定菌株的]鉴定特征的培养物”，包括规定菌株的同源物或突变体，与规定菌株紧密相关(即与其享有共同祖先)或来源于规定菌株，但通常与规定菌株在一种或多种 基因型或表型特征上有差异。通常通过遗传差异的评估，可鉴定突变体。通过评估遗传、生化和形态差异程度和使用分类学方法，包括例如分支系统学的分析，可鉴定同源物。然而，具有[规定菌株的]鉴定特征的菌株，包括规定菌株的同源物或突变体，将保持昆虫致病效力，可与其他细菌菌株区分，并可使用本文描述的技术鉴定为亲本菌株的同源物或突变体。 
术语“周围”，当就接受本发明真菌、方法和组合物的植物对象而言使用时，包括邻近或围绕植物或其根、块茎等等的土壤、水、落叶层和/或生长培养基，相邻植物、所述植物的插枝、支持物、待对植物施用的水、和包衣，包括种衣剂。其还包括贮存、包装或加工材料例如保护性包衣、盒子和包装物，和种植、维持或收获装置。 
植物病原体的控制 
本发明认识到许多国家包括例如美国、新西兰和许多欧洲国家的园艺部门正面临着植物病原有害昆虫中增强的农药抗性的问题。在一些管理制度下由于管理壁垒造成新的化学杀虫剂的可得性降低，这使情况恶化。 
使用昆虫病原真菌作为生物控制剂为此问题提出了一种解决方案。根据生物控制剂使靶植物病原昆虫或昆虫群体失去能力或杀死靶植物病原昆虫或昆虫群体的能力，可选择有效的生物控制剂。在有利条件下，植物病原昆虫例如蚜虫、蓟马和粉虱可感染植物及其周围，包括土壤、落叶层、相邻植物、支持物等等。可应用昆虫病原真菌，以使植物病原昆虫失去能力和/或杀死植物病原昆虫，由此防止或限制病原体的致病能力。这些昆虫病原真菌在田间的有效性又依赖于其在各种气候条件例如中断的湿润期和干燥下存活的能力。 
在某些管理制度下即使可能，昆虫病原真菌的进口常常是成问题的、代价高且不现实的。例如，因为管理和立法性排除，在给定国家以外可得的昆虫病原真菌可能不能被该国家中的园艺学家得到。本发明因此认识到鉴定和培养能够在广泛环境条件下茂盛生长的菌株具有明显优势。 
可从环境中，包括例如从植物、其周围和从所述植物的病原体中方便 地获得本发明真菌的分离株。在某些实施方案中，可从靶昆虫或从待随后应用包含所述真菌的生物控制剂或包含所述真菌的组合物的植物物种(或周围)中获得所述真菌的分离株。 
测定所述真菌在不同条件，包括不同温度和在不同培养基或其他基质上的生长的方法是本领域熟知的。本文描述了测定真菌在不同温度下的生长能力的示例方法，并描述了方法以测定一个给定分离株在给定温度是死的还是休眠的。 
类似的，本文举例说明了确立分离株是否能够在给定人工培养基上生长的方法。这些方法的使用公认，分离株必须能够以足够量生长才能使其适于作为生物控制剂使用。本文进一步讨论了培养足够量的本发明真菌的方法。 
有效对抗植物病原昆虫因而适用于本发明用途的真菌菌株，例如白僵菌菌株，可以被鉴定为这样的菌株，相对于与该菌株或菌株的一种或多种代谢物进行比较的对照处理，该菌株可以有效减少靶昆虫物种群体达统计上显著的量。这样的菌株可以被认为具有昆虫致病效力。如本文描述的，靶昆虫群体的减少可通过多种拮抗机制实现。例如，真菌可寄生于植物病原昆虫、使其失去能力、使其不育和/或优选地杀死植物病原昆虫。真菌也可通过使环境，例如真菌所用于的植物或其周围，不利于植物病原昆虫，从而减少靶昆虫的群体。在此实施方案中，可认为真菌起驱避剂的作用并减少在植物或其周围的附近中的靶昆虫的有效群体。 
优选地，合适的菌株展示约5％的昆虫致病效力，至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、更优选至少约50％的昆虫致病效力，所述效力以与对照处理相比相关昆虫物种群体减少的百分比表示。用于举例说明，应用了本文描述的方法鉴定有效对抗多种靶昆虫的白僵菌分离株，而与本文描述的方法类似的程序可应用于其他真菌和昆虫物种。 
尽管昆虫致病效力对于分离株被视为适用作生物控制剂是首要的必备条件，但真菌分离株应具有适于用作生物控制剂的另外特征。 
例如，真菌应当能够以存活的形式在合理的期限内储存，以便最终允许其以有效作为生物控制剂的形式和浓度施用到靶植物或其周围。 
为了适于用作生物控制剂，当对植物或其周围应用时真菌还应当能够达到感染阈值。如本文使用的，感染阈值指真菌在靶植物或其周围上进行定植从而其后具有昆虫致病效力所需要的真菌浓度。可以理解，为了得到感染阈值，一些真菌分离株可能需要以高达不现实或不可行的比例应用。此外，无论其应用的浓度或比例，一些真菌分离株可能不能达到感染阈值。当以不低于1010孢子每公顷的比例应用时或当以不低于107孢子每毫克组合物的浓度应用且所述组合物以约1kg/1000L/公顷的比例应用时，合适的昆虫病原真菌能够达到感染阈值。 
确定感染阈值的方法是本领域熟知的，本文展示了该方法的示例。在某些实施方案中，可直接确定感染阈值，例如通过分析从靶植物、其周围和/或所述植物的病原体中获得的一种或多种样品，并测定在所述样品中或上的真菌的存在或量。在其他实施方案中可间接测定感染阈值，例如通过观察一种或多种植物病原昆虫群体的减少。也设想这些方法的组合。 
球孢白僵菌是攻击未成熟和成年昆虫两者，包括例如蝗虫、蚜虫、蓟马、蛾和几种其他物种，的土传真菌。通常可从昆虫尸体例如蚜虫、螟和蓟马中分离球孢白僵菌，也可从土壤中分离球孢白僵菌。下面更详细的描述本发明的昆虫病原球孢白僵菌菌株K4B3。 
菌丝体：易于在MEA上生长。菌落通常为白色，在边缘变为奶油色至浅黄色。极少见为微红色。菌丝体的叶状体(thallus)的底面将红色色素注入琼脂。 
分生孢子梗：大量，自菌丝产生。1-2μm宽，带有成群的簇生产孢细胞3-6x 3-5μm，其可分支以产生更多产孢细胞，球形至瓶形，具有良好发育的长达20μm宽1μm的柄，曲膝状具有宽达1μm的小齿。 
分生孢子：2-3x 2-2.5μm的透明球状分生孢子。在深层培养中形成芽生孢子。疏水。在琼脂上聚集，灰尘状颗粒外观。K4B3在琼脂上产生极度簇集的颗粒状聚集体。孢子聚集体的颜色在成熟时变为深的近似彩虹色 的黄色。将K4B3引入深层培养产生极红的颜色和刺鼻的金属气味。 
球孢白僵菌菌株K4B3分离自一群死亡的蝉蛹。在实施例中描述了获得此分离株所应用的分离和选择方法的细节。依据用于专利程序的布达佩斯条约，此球孢白僵菌分离株已在2008年10月14日保藏于澳大利亚国家计量院(NMIA，前身为澳大利亚政府分析实验室(Australian Government Analytical Laboratories)(AGAL)，1 Suakin Street，Pymble，New South Wales，澳大利亚。分离株已被给予保藏号V08/025855。 
由此，在一个方面本发明提供了球孢白僵菌菌株K4B3，NMIA No.V08/025855的生物纯的培养物。类似地提供了具有菌株K4B3，NMIA No.V08/025855的鉴定特征的白僵菌。 
球孢白僵菌菌株K4B3是特别有效的生物控制剂，其能够在田间活过中断的湿润期、干燥、并定植于植物病原昆虫、使其失去能力和杀死植物病原昆虫，所述植物病原昆虫例如但不限于蚜虫、毛虫(蠋，caterpillar)、粉虱、蛾、瓦螨、蝉和蓟马。使用此球孢白僵菌分离株的芽生孢子或分生孢子组合物杀死粉虱、蓟马和蚜虫的程度一般与种植者应用的常用杀虫剂一样好。然而，昆虫例如蓟马、粉虱和蚜虫对这些杀虫剂的抗性已成为对园艺工业的最大威胁。 
例如，西花蓟马的国外群体对大多数种类的农药具有抗性。以下农药在24小时生物测定试验中提供了不充分的控制：高灭磷、阿巴美丁、毒死蜱、硫丹、灭多虫、灭虫威、氧化乐果、定菌磷和氟胺氰菊酯。 
在新西兰，在北岛和南岛的洋葱蓟马具有对溴氰菊酯的抗性，但仅在奥克兰附近发现对二嗪农和敌敌畏的抗性(Martin等人，准备中)。据报导在美国洋葱蓟马对许多农药具有抗性，但对合成的拟除虫菊酯仍然敏感(Grossman 1994)。 
据来自南澳大利亚的报导，Kelly’s柑橘类蓟马对毒死蜱具有抗性(Purvis 2002)。 
已有温室粉虱的杀虫剂抗性报导，但仅最近，才证明其对噻嗪酮的抗性(Workman&Martin 1995)。在国外，温室粉虱已产生对有机氯、有机 磷酸酯、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯杀虫剂的抗性(例如Georghiou 1981，Anis&Brennan 1982，Elhag&Horn 1983，Wardlow 1985，和Hommes1986)。也已经发现了对较新的杀虫剂噻嗪酮和伏虫隆的抗性(Gorman等人2000)。 
因此显而易见的，许多植物病原昆虫已对许多杀虫剂产生抗性；在这些和其他情况中，根据本发明选择的球孢白僵菌分离株提供了用于昆虫控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性结合未观察到任何由球孢白僵菌K4B3或其一种或多种代谢物诱导的植物病原性，证明此分离株具有用作生物控制剂的期望属性。 
在本发明的其他实施方案中，可使用球孢白僵菌K4B3制备包含球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物的组合物，其中该一种或多种代谢物为昆虫病原剂。 
如上所述，当在有利条件下生长时球孢白僵菌K4B3的菌丝体是微红色的，当在琼脂上生长时球孢白僵菌K4B3将红色色素注入琼脂。类似的，如在本文实施例1中描述的，当在深层培养中生长时，球孢白僵菌K4B3产生极红的颜色和刺鼻的金属气味并将一种或多种有毒代谢物注入培养溶液。本文特别考虑了包含一种或多种该有毒代谢物的组合物。一种示例性组合物包含培养基，该培养基已用于生长或维持过球孢白僵菌K4B3，而不管之后是否已经从培养基中去除球孢白僵菌K4B3。另一个示例性组合物为已经用于生长或维持过球孢白僵菌K4B3的培养基、或已经用于生长或维持过球孢白僵菌K4B3的培养基的提取物，该提取物具有本文图2中所示图所特征性的质谱图。 
由此，本发明提供了制备包含球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物和特别是球孢白僵菌K4B3的一种或多种分泌性代谢物的组合物的方法。 
在一个实施方案中，所述方法包括在适于产生至少一种代谢物的条件下维持球孢白僵菌K4B3 V08/025855的培养物；和从球孢白僵菌K4B3V08/025855中分离该至少一种代谢物。 
在一个实施方案中，组合物包含白僵菌素、白僵菌素-F和类白僵菌素 中的一种或多种，优选白僵菌素、白僵菌素-F和类白僵菌素中的2种或更多种。在一个实施方案中，组合物为包含白僵菌素、白僵菌素-F和类白僵菌素的协同组合物。 
在另一个实施方案中，组合物包含低于约1mgL-1的白僵菌素，低于约0.5mgL-1的白僵菌素，低于约0.1mgL-1的白僵菌素，低于约0.05mgL-1的白僵菌素，低于约0.01mgL-1的白僵菌素，低于约0.005mgL-1的白僵菌素，低于约0.001mgL-1的白僵菌素，低于约0.0005mgL-1的白僵菌素，或低于约0.0001mgL-1的白僵菌素。 
在另一个实施方案中，组合物包含低于约1mgL-1的白僵菌素-F，低于约0.5mgL-1的白僵菌素-F，低于约0.1mgL-1的白僵菌素-F，低于约0.05mgL-1的白僵菌素-F，低于约0.01mgL-1的白僵菌素-F，低于约0.005mgL-1的白僵菌素-F，低于约0.001mgL-1的白僵菌素-F，低于约0.0005mgL-1的白僵菌素-F，或低于约0.0001mgL-1的白僵菌素-F。 
本发明的球孢白僵菌菌株K4B3可单独使用，或与本文描述的其他昆虫病原真菌组合使用。其他昆虫病原真菌的示例在下面更详细的描述。 
球孢白僵菌菌株K4B1从新西兰Bombay的松林中的螟幼虫中分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，此球孢白僵菌分离株已在2005年3月16日保藏于澳大利亚国家计量院，1 Suakin Street，Pymble，New South Wales，Australia。分离株已被给予保藏号NM05/44595。 
球孢白僵菌分离株K4B1显示了对成年蓟马的偏好，并也对未成年蓟马和蓟马蛹、蚜虫和粉蝶具有致病性。K4B1的分生孢子形成奶油色聚集体。
球孢白僵菌分离株K4B2从新西兰Aka Aka平原的向日葵上的鳞翅目幼虫中分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，此球孢白僵菌分离株已在2006年3月3日保藏于澳大利亚国家计量院。分离株已被给予保藏号NM06/00010。 
球孢白僵菌分离株K4B2展示了对毛虫，包括大豆尺蠖幼虫和白粉蝶和粘虫幼虫的偏好。此分离株也对未成年蓟马、成年蓟马和蓟马蛹、蚜虫 和粉虱具有致病性。K4B2的分生孢子形成黄色灰尘状聚集体。 
NMIA No.NM05/44595，NMIA No.NM06/00010和其他合适的球孢白僵菌分离株可与本发明的球孢白僵菌菌株K4B3组合使用，或与球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物组合使用，并为特别有效的生物控制剂，其能够在田间活过中断的湿润期、干燥、并定植于植物病原昆虫、使其失去能力和杀死植物病原昆虫，所述植物病原昆虫例如但不限于田间的蚜虫、毛虫、粉虱、蛾、瓦螨和蓟马。使用这些球孢白僵菌分离株杀死粉虱、蓟马和蚜虫的程度一般与如上所述的常用杀虫剂一样好。针对这些杀虫剂的抗性已产生；在这些和其他情况中，根据本发明选择的球孢白僵菌分离株提供了用于昆虫控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性结合未观察到任何由球孢白僵菌引起的植物病原性，证明这些物种的分离株具有用作生物控制剂的期望属性。 
蜡蚧霉是具有广谱宿主(包括同翅类昆虫和其他节肢动物类型)的昆虫病原真菌。蜡蚧霉被认为是物种综合体(species complex)，其包括具有不同形态学和生化特征的分离株。一般地可从昆虫尸体例如蚜虫、蓟马、粉虱和粉蚧中分离蜡蚧霉，也可从土壤中分离蜡蚧霉。 
分离株具有以下鉴定特征： 
菌丝体：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、麦芽提取物琼脂(MEA)或燕麦粉琼脂(OA)上菌落为白色、奶油状、薄、棉花状，背面为无色至浅或深的黄色。 
分生孢子梗：瓶梗单个地或直接地从菌丝体形成、或在3或4个直立分生孢子梗的轮(很像营养菌丝体)中形成。瓶梗精巧(delicate)，取决于菌株和培养物的年龄二者有不同尺寸。尺寸从8.5-16x0.8-1.2μm至30-40x2-2.2μm的范围。 
分生孢子：在粘质基质中单个地产生并在瓶梗顶的头上聚集。椭圆形至圆柱形，具有圆形末端，根据菌株而尺寸不同，尺寸从2.3-3.4x1-1.3μm至7.2-10x2.1-2.6μm。在深层培养中产生芽生孢子。亲水。 
蜡蚧霉菌株K4V1从新西兰Pukekohe的温室番茄作物中的粉虱中分 离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，此蜡蚧霉分离株已在2005年3月16日保藏于澳大利亚国家计量院。分离株已被给予保藏号NM05/44593。 
K4V1具有另外的鉴定特征——在粉虱若虫(whitefly scale)中60％分生孢子1.0x1.0微米，在未成年蓟马(若虫)中30％分生孢子2.0x1.0微米，在蓟马蛹中10％分生孢子2.5x1.3微米。菌丝体的叶状体的底面有稀疏皱纹，很容易从琼脂中移出菌丝体叶状体。 
蜡蚧霉菌株K4V2从新西兰Ruakaka的黄瓜温室中的粉虱中分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，此蜡蚧霉分离株已在2005年3月16日保藏于澳大利亚国家计量院。分离株已被给予保藏号NM05/44594。 
K4V2具有另外的鉴定特征——50％分生孢子2.0x1.5μm，30％分生孢子2.0x1.0μm，20％分生孢子1.0x1.0μm，对成年粉虱有致病性，而芽生孢子对蚜虫有致病性。菌丝体叶状体的底面时常皱折，很难从琼脂表面移出菌丝体叶状体。 
蜡蚧霉菌株K4V4从室外有机树番茄(tamarillo)作物中分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，此蜡蚧霉分离株已在2006年3月3日保藏于澳大利亚国家计量院。分离株已被给予保藏号NM06/00007。 
K4V4具有另外的鉴定特征——50％分生孢子1.0x0.5μm，对粉虱若虫(whitefly scale)和成虫有致病性，在低湿度65-75％、高温度28-32℃非常具攻击性。通常v.1＞75％。50％分生孢子0.5x0.5μm。菌丝体叶状体的底面稀疏皱折，菌丝体叶状体扩散奶黄色至浅橙色色素在培养基中。 
NMIA No.NM05/44593，NMIA No.NM05/44594，NMIA No.NM06/00007和其他合适的蜡蚧霉分离株可与本发明的球孢白僵菌菌株K4B3组合使用，或与球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物组合使用，并为特别有效的生物控制剂，其能够在田间活过中断的湿润期、干燥、并定植于植物病原昆虫、使其失去能力和杀死植物病原昆虫，所述植物病原昆虫例如但不限于蚜虫、粉虱、粉蚧、瓦螨和蓟马。使用这些蜡蚧霉分离株杀死粉虱、蓟马和蚜虫的程度一般与如上所述的常用杀虫剂一样好。对这些杀虫剂的抗性已产生；在这些和其他情况中，根据本发明选择的蜡蚧 霉分离株提供了用于昆虫控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性结合未观察到任何由蜡蚧霉引起的植物病原性，证明这些物种的分离株具有用作生物控制剂的期望属性。 
长孢蚧霉是对蚜虫特别具有致病性的昆虫病原真菌。长孢蚧霉菌株KT4L1从新西兰奥克兰Franklin的大麦围银行植物(Banker plant)中的蚜虫中分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，此长孢蚧霉分离株已在2006年3月3日保藏于澳大利亚国家计量院。分离株已被给予保藏号NM06/00009。 
分离株KT4L1具有以下鉴定特征：100％分生孢子6.0x2.1μm，菌丝体叶状体为灰白色至黄色，非常粗糙地生长，在一致性上可将其描述为凸凹不平的。菌丝体叶状体将浅红褐色色素扩散至琼脂。 
NMIA No.NM06/00009和其他合适的长孢蚧霉分离株可与本发明的球孢白僵菌菌株K4B3组合使用，或与球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物组合使用，并为特别有效的生物控制剂，其能够在田间活过中断的湿润期、干燥、并定植于植物病原昆虫、使其失去能力和杀死植物病原昆虫，所述植物病原昆虫例如但不限于蚜虫。使用这些长孢蚧霉分离株的芽生孢子或分子孢子组合物杀死蚜虫的程度一般与种植者应用的常用杀虫剂一样好。 
如上所述，许多植物病原昆虫已对多种杀虫剂产生抗性；在这些和其他情况中，根据本发明选择的长孢蚧霉分离株提供了用于昆虫控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性结合未观察到任何由长孢蚧霉引起的植物病原性，证明这些物种的分离株具有用作生物控制剂的期望属性。 
玫烟色拟青霉是在感染和死亡的昆虫和一些土壤中发现的昆虫病原真菌。玫烟色拟青霉一般感染粉虱、蓟马、蚜虫和毛虫。 
满足上面要求的玫烟色拟青霉K4P1菌株从新西兰Runciman的卷心菜中存在的小菜蛾幼虫中分离。根据用于专利程序的布达佩斯条约，此玫烟色拟青霉分离株已在2006年3月3日保藏于澳大利亚国家计量院。分离 株已被给予保藏号NM06/00008。 
玫烟色拟青霉菌株K4P1具有以下鉴定特征： 
在昆虫中的生长：产生简单的单丝(mononematous)分生孢子梗或明显但疏松的束丝。束丝直立，长达3cm并可分支，看上起灰尘状，带有分生孢子。 
在琼脂中的生长：在麦芽琼脂(MA)和PDA上，室温(25℃)生长速度中度，14天内4-8cm，具有毡状基底(basal felt)，毡状基底上具有规则或不规则的凸起丛毛状过度生长，或可以是较薄的、灰尘状和颗粒状，并产生明确的孢梗束，当首次分离时为粉末状的。最初为白色，保持白色或变为深深浅浅的粉红色，随年龄增长，可变为淡灰色。 
营养菌丝：壁光滑，透明，1-5-3.5μm直径。 
分生孢子结构：倾向于复杂，由自毡状基底或自气生菌丝产生的直立分生孢子梗组成。 
分生孢子梗：单个地产生或一起地产生以形成束丝，达100μm长x1.5-2(3)μm直径。壁光滑，透明，带有分支轮，上又带有3-6个瓶梗的轮生体，偶尔瓶梗在与分支相同的水平上在同一轮中产生。有时候轮生形式被破坏，单枝不规则地生在分生孢子梗上。 
瓶梗：5-7x2.5(3)μm，具有膨大的基底，其逐渐变细为约0.5μm直径的细长颈。 
分生孢子：圆柱形至纺锤形，具有圆形末端，光滑，透明，链生，2-4x1-2μm，偶尔长达5μm。 
在昆虫上产孢器官趋向更紧密，分支和瓶梗膨胀，略微更短和更圆，3.5-6x1-2.5μm。分生孢子和培养中的一样。 
NMIA No.NM06/00008和其他合适的玫烟色拟青霉分离株可与本发明的球孢白僵菌菌株K4B3组合使用，或与球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物组合使用，并为特别有效的生物控制剂，其能够在田间活过中断的湿润期、干燥、并定植于植物病原昆虫、使其失去能力和杀死植物病原昆虫，所述植物病原昆虫例如但不限于粉虱、瓦螨和鳞翅目幼虫。使用芽 生孢子或分生孢子组合物通过这些玫烟色拟青霉分离株杀死粉虱、瓦螨、蓟马和蚜虫的程度一般与种植者应用的常用杀虫剂一样好。 
如上所述，许多植物病原昆虫已对多种杀虫剂产生抗性；在这些和其他情况中，根据本发明选择的玫烟色拟青霉分离株提供了用于昆虫控制的有效替代方案。在植物疾病控制中的此有力活性结合未观察到任何由玫烟色拟青霉引起的植物病原性，证明这些物种的分离株具有用作生物控制剂的期望属性。 
在另一个方面本发明提供了包含球孢白僵菌菌株K4B3或球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物、或包含球孢白僵菌K4B3和球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物二者、和任选地一种或多种其他昆虫病原真菌、以及至少一种载体的组合物。 
组合物可包括多种昆虫病原真菌菌株，在某些实施方案中，可利用多个菌株靶向多个植物病原物种，或单个植物病原体的多种不同发育阶段，或甚至上述之组合。例如，可使用一种真菌菌株靶向植物病原昆虫的蛹形式，而可用另一种真菌菌株靶向所述植物病原昆虫的成年形式，其中两种菌株都包含在本发明的组合物中。在另一个实施方案中，优选3种或更少种菌株，常常优选单菌株。 
合适地，组合物包含选自以下的真菌：蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA No.NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。 
特别考虑：包含球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物和蜡蚧霉菌株K4V1(NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株的组合物，包含球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物和蜡蚧霉菌株K4V2(NM05/44594)或具有其鉴 定特征的菌株的组合物，和包含球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物和蜡蚧霉菌株K4V1(NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株二者的组合物，包含球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物和蜡蚧霉菌株K4V2(NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株的组合物。 
包含昆虫病原真菌的组合物的示例是本领域熟知的，包括在例如Mycotech公司的WO95/10597(以PCT/US94/11542公开)，由农业部长代表的美国的WO2003/043417(以PCT/US2002/037218公开)，McCabe等人的美国专利号4,530,834和Wright等人的美国专利申请号10/657,982(以US 2004/0047841公开)中描述的那些，这些专利文献在本文中分别以其整体引入作为参考。 
为了适于对植物或其周围应用，所述至少一种载体为农业上可接受的载体，更优选地，其选自填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂，更优选地所述组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂之各至少一种。优选地，所述填料刺激剂为碳水化合物源，例如二糖，包括例如蔗糖、果糖、葡萄糖或右旋糖，所述抗结块剂选自滑石、二氧化硅、硅酸钙或高岭土，所述湿润剂为脱脂奶粉，所述乳化剂为基于大豆的乳化剂例如卵磷脂或基于植物的乳化剂例如甘油单/二酯(monodiglyceride)，和所述抗氧化剂为谷氨酸钠或柠檬酸。然而，也可用本领域熟知的其他实施替换，条件是能够维持组合物支持真菌生活力的能力。 
优选地，所述组合物为生物控制组合物。为了有效地作为生物控制剂，组合物中存在的本发明昆虫病原真菌或其一种或多种代谢物的所需浓度可取决于最终用途、植物的生理条件；病原体感染的类型(包括昆虫物种)、浓度和程度；温度、季节、湿度、在生长季中的阶段和植物的年龄；正在应用的传统杀虫剂或其他处理(包括杀真菌剂)的数量和种类；和植物处理(例如去叶和修剪)而变化，在配制组合物时这些因素都要考虑。 
为了用作生物控制剂，当在组合物中存在时，本发明的昆虫病原真菌应当为具繁殖活力的形式。如本文使用的术语“具繁殖活力的”包括真菌 的菌丝体和孢子形式。例如，对于大多数目的，期望真菌菌株以孢子(分生孢子或芽生孢子)的形式掺入组合物。可从本发明的所有真菌菌株中获得孢子，并且可使用本领域的技术产生孢子。从本发明的真菌菌株获得的孢子构成本发明的另一个方面。组合物中的真菌孢子的浓度将取决于组合物所要投入的应用。示例性浓度范围为约1x106至1x1012孢子每毫升，优选从约1x107至2x1010，和更优选1x107至1x108孢子每毫升。 
理论上，一个感染单位应当足够感染宿主，但在实际情况下需要最低感染单位数以起始感染。在化学农药中常规使用的致死剂量(LD)的概念对微生物农药是不适用的，在后者中昆虫致病效力依赖于昆虫病原真菌在植物或其周围中的定植。感染剂量(ID)或感染浓度(IC)的概念更精确或合适。ID或IC指起始感染所需的实际感染单位数或暴露于病原体后导致死亡的感染单位数。因此，在田间或温室中针对病原体应用的感染单位数将影响控制程度。重要的是在正确的时间合适地位置应用期望浓度的抗植物病原细菌，以取得对害虫的良好控制：这被称为“感染阈值”。 
显而易见地，为了应用而配制的组合物中的真菌孢子浓度可低于为了例如储存而配制的组合物中的浓度。申请人已测定了在使用本发明的昆虫病原真菌的情况下，当以约1L每公顷的比例应用时，感染阈值出现在约107孢子每毫升喷洒溶液。由此，在一个示例中，为了应用而配制的组合物优选地具有至少约107孢子每毫升的浓度。在另一个示例中，为了储存而配制的组合物(例如，能够配制为适于应用的组合物的组合物，如可湿润粉末)将优选地具有约1010孢子每毫升的浓度。显而易见地，为了储存和之后配制为适于应用的组合物而配制的组合物中，孢子浓度必须足够高以允许所述用于应用的组合物也具有足够浓度从而能够应用以达到感染阈值。 
优选地，组合物为在长于约2周，优选地长于约1个月、约2个月、约3个月、约4个月、约5个月，更优选地长于约6个月的时期内能够支持真菌的繁殖活力或昆虫致病效力的稳定组合物。为适于用作生物控制组合物，组合物优选地能够在长于约6个月的时期内支持真菌的繁殖活力或 昆虫致病效力。 
使用本领域熟知的传统固体基质和液体发酵技术，可将本发明的昆虫病原真菌培养至足够量以允许用作生物控制剂。例如，使用营养膜、深层培养和稻基质培养技术(rice substrate growing teniques)，可大量产生选定菌株的孢子用于田间应用。类似的，使用这些培养技术可产生足够量的本发明真菌的代谢物，在本文的实施例中展示了示例性技术。一般在需氧条件和满足生物生长的任何温度，进行生长。例如，对球孢白僵菌，优选从10至32℃，优选25至30℃，和最优选23℃的温度范围。生长培养基的pH为弱酸至中性，即约5.0至7.0，最优选5.5。培养时间足够分离株达到稳定生长期，当在23℃培养时约21天，在正常光周期下发生。 
可通过本领域熟知的方法例如通过传统过滤或沉淀方法(例如离心)收获孢子，或使用气旋系统收获干燥。孢子可被立即使用或储存，在0℃至6℃，优选2℃冷藏，时间长至它们保持繁殖活力。然后一般优选，当不掺入本发明的组合物时，在收获2周内进行使用。 
类似的，当需要时，可使用本领域熟知的方法，例如通过传统过滤或沉淀方法(例如离心)，组合(例如，对细胞内代谢物)或不组合(例如，对分泌至生长培养基的代谢物)一个或多个细胞裂解步骤，从球孢白僵菌K4B3中分离球孢白僵菌K4B3的一种或多种代谢物。 
本发明的组合物可还包括一种或多种载体，优选一种或多种农业上可接受的载体。在一个实施方案中载体例如农业上可接受的载体可为固体或液体。本文中有用的载体包括一般用于配制农用组合物的任何物质。 
在一个实施方案中，农业上可接受的载体可选自填料、溶剂、赋形剂、表面活性剂、悬浮剂、展着剂/粘着剂(黏合剂)、消泡剂、分散剂、湿润剂、减少漂移剂(drift reducing agent)、辅助剂、助剂或其混合物。 
可通过已充分建立的操作，将本发明的组合物配制为例如浓缩物、溶液、喷雾剂、气雾剂、浸浴剂(immersion bath)、浸蘸剂(dip)、乳剂、可湿润的粉末、可溶粉末、悬浮浓缩物、粉剂(dust)、颗粒、水可分散的颗粒、微囊、糊剂、凝胶和其他制剂类型。 
这些操作包括混合和/或研磨活性成分和农业上可接受的载体物质，例如填料、溶剂、赋形剂、表面活性剂、悬浮剂、展着剂/粘着剂(黏合剂)、消泡剂、分散剂、湿润剂、减少漂移剂、辅助剂、助剂。 
在一个实施方案中固体载体包括但不限于矿物土例如硅酸、硅胶、硅酸盐、滑石、高岭土、无水硅酸铝白土、石灰岩、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、氧化铝硫酸钙、硫酸镁、氧化酶、磨碎的塑料、肥料例如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵和尿素，和植物产物例如谷物粗粉、树皮粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉、纤维质粉末等等。以下适用作颗粒剂的固体载体：压碎或分级分离的天然岩石例如方解石、大理石、浮石、海泡石和白云石；无机或有机粗粉的合成颗粒；有机材料例如锯末、椰壳、玉米芯、玉米壳或烟草杆的颗粒；硅藻土、磷酸三钙、粉状软木或活性炭黑；水溶性聚合物、树脂、蜡；或固体肥料。如果需要，固体组合物可包含一种或多种相容的湿润剂、分散剂、乳化剂或着色剂，当为固体时其也可充当稀释剂。 
在一个实施方案中载体也可为液体，例如水；醇，特别是丁醇或乙二醇，以及它们的醚或酯，特别是醋酸甲基乙二醇酯；酮，特别是丙酮、环己酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮或异佛尔酮；石油馏分例如石蜡或芳香烃，特别是二甲苯或烷基萘；矿物或植物油；脂肪族氯化烃，特别是三氯乙烷或二氯甲烷；芳香族氯化烃，特别是氯苯；水溶性或强极性溶剂例如二甲基甲酰胺、二甲亚砜或N-甲基吡咯烷酮；液化的气体；等等，或它们的混合物。 
在一个实施方案中，表面活性剂包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和/或两性表面活性剂，并促进聚集物在喷洒时保留在溶液中的能力。 
展着剂/粘着剂促进本发明的组合物粘附在植物表面的能力。表面活性剂、展着剂/粘着剂的示例包括但不限于Tween和Triton(Rhom and Hass Company)， 
Figure BDA0000067808060000251
Pulse，C. 
Figure BDA0000067808060000252
Codacide 
Figure BDA0000067808060000253
D-C. 
Figure BDA0000067808060000254
Supamet Oil， Penetrant， 
Figure BDA0000067808060000256
和Freeway， 
Figure BDA0000067808060000257
Fortune  PlusTM，Fortune Plus Lite，Fruimec，Fruimec lite，芳族磺酸例如木质素磺酸、酚磺酸、萘磺酸和二丁基萘磺酸和脂肪酸的碱金属、碱土金属和铵盐，烷基和烷基芳基磺酸盐，和烷基、月桂基醚和脂肪醇硫酸盐，和硫酸化的十六醇、十七醇和十八醇的盐，脂肪醇乙二醇醚的盐，磺酸化的萘和萘衍生物和甲醛的缩合产物，萘或萘磺酸和酚及甲醛的缩合产物，聚氧乙烯辛基酚醚，乙氧基化异辛基酚，乙氧基化辛基酚和乙氧基化壬基酚，烷基酚聚乙二醇醚，三丁基苯基聚乙二醇醚，烷基芳基聚醚醇，异十三烷基醇，脂肪醇环氧乙烷缩合物，乙氧基化蓖麻油，聚氧乙烯烷基醚，乙氧基化聚氧丙烯，月桂醇聚乙二醇醚缩醛，山梨糖醇酯，木质素亚硫酸盐废液和甲基纤维素。当选择包含时，一种或多种农用表面活性剂例如Tween期望地根据已知方案包括在组合物中。 
湿润剂降低组合物中水的表面张力，因此增加给定量的组合物可应用的表面区域。湿润剂的示例包括但不限于聚丙烯酸的盐，木质素磺酸盐，酚磺酸或萘磺酸的盐，环氧乙烷和脂肪醇或脂肪酸或脂肪酯或脂肪胺的缩聚物，取代的酚(特别是烷基酚或芳基酚)，磺基琥珀酸酯的盐，牛磺酸衍生物(特别是烷基牛磺酸盐)，环氧乙烷和酚的缩聚物或醇的磷酸酯，脂肪酸和酚的酯，或上面的化合物的硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐功能衍生物。 
在一个实施方案中应用本发明的化合物或组合物的优选方法是通过手喷枪或商用鼓风机喷洒稀释的或浓缩的溶液。 
如上所述，本发明的组合物可单独使用，或与一种或多种其他农用试剂组合使用，所述农用试剂包括农药、杀昆虫剂、杀螨剂、杀真菌剂(前提是这些杀真菌剂对本发明的真菌无害或无毒)、杀细菌剂、除草剂、抗生素、抗微生物剂、杀线虫剂、灭鼠剂、昆虫病原体、信息素、引诱剂、植物生长调节剂、植物激素、昆虫生长调节剂、化学不育剂、微生物害虫控制剂、驱避剂、病毒、诱食剂、植物营养素、植物肥料和生物控制。当与其他农用试剂组合使用时，2种试剂的施用可为分开的、同时的或顺序的。这些农用试剂的具体示例是本领域技术人员已知的，并且许多可容易的购买到。 
植物营养素的示例包括但不限于氮、镁、钙、硼、钾、铜、铁、磷、锰、钼、钴、硼、铜、硅、硒、镍、铝、铬和锌。 
抗生素的示例包括但不限于土霉素和链霉素。 
杀真菌剂的示例包括但不限于以下种类的杀真菌剂：羧酰胺类、苯并咪唑类、三唑类、羟基吡啶类、二甲酰胺类、苯基酰胺类、噻二唑类、氨基甲酸酯类、氰基肟类、肉桂酸衍生物、吗啉类、咪唑类、β-甲氧基丙烯酸酯类和吡啶类/嘧啶类。 
杀真菌剂的其他示例包括但不限于天然杀真菌剂、有机杀真菌剂、基于硫的杀真菌剂、铜/钙杀真菌剂和植物宿主防御的诱导物。 
天然杀真菌剂的示例包括但不限于全乳、乳清、脂肪酸或酯化的脂肪酸。 
有机杀真菌剂的示例包括但不限于通过有机认证标准的任何杀真菌剂例如生物控制剂、天然产物、诱导物(其中一些也可被归为天然产物)和硫和铜杀真菌剂(限于局限的使用)。 
基于硫的杀真菌剂的示例为KumulusTM DF(BASF，Germany)。铜杀真菌剂的示例为 2000 DF(Griffin Corporation，USA)。 
诱导物的示例包括但不限于壳聚糖、Bion、BABA(DL-3-氨基-正丁酸，β-氨基丁酸)和Milsana(Western Farm Service，Inc.，USA)。 
在某些实施方案中可应用非有机杀真菌剂。非有机杀真菌剂的示例包括但不限于Bravo(用于葫芦的PM控制)；SupershieldTM(Yates，NZ)(用于玫瑰上的葡萄孢和PM控制)； 
Figure BDA0000067808060000272
200EW(用于葡萄和葫芦的PM控制)；FlintTM(用于苹果和葫芦的PM控制)； 
Figure BDA0000067808060000273
WG(用于谷类的锈菌和PM控制)；和CaptanTM，DithaneTM，EuparenTM，RovralTM，ScalaTM，ShirlanTM，SwitchTM和TeldorTM(用于葡萄的葡萄孢控制)。 
农药的示例包括但不限于腈嘧菌酯(azoxystrobin)，双苯三唑醇(bitertanol)，萎锈灵(carboxin)，Cu2O，清菌脲(cymoxanil)，环唑醇(cyproconazole)，环丙嘧啶(cyprodinil)，dichlofluamid， 醚唑(difenoconazole)，烯唑醇(diniconazole)，氧唑菌(epoxiconazole)，拌种咯 (fenpiclonil)，氟 
Figure BDA0000067808060000281
菌(fludioxonil)，fluquiconazole，氟硅唑(flusilazole)，粉唑醇(flutriafol)，呋氨丙灵(furalaxyl)，双胍盐(guazatin)，己唑醇(hexaconazole)，土菌消(hymexazol)，烯菌灵(imazalil)，酰胺菌(imibenconazole)，环戊唑醇(ipconazole)，亚胺菌(kresoxim-methyl)，代森锰锌(mancozeb)，甲霜灵(metalaxyl)，R-甲霜灵，环戊唑菌(metconazole)， 
Figure BDA0000067808060000282
霜灵(oxadixyl)，稻瘟酯(pefurazoate)，戊菌唑(penconazole)，戊菌隆(pencycuron)，丙氯灵(prochloraz)，丙环唑(propiconazole)，pyroquilone，SSF-109，螺 
Figure BDA0000067808060000283
茂胺(spiroxamine)，戊唑醇(tebuconazole)，涕必灵(thiabendazole)，tolifluamid，唑菌嗪(triazoxide)，三唑酮(triadimefon)，唑菌醇(triadimenol)，氟菌唑(triflumizole)，戊叉唑菌(triticonazole)和烯效唑(uniconazole)。 
非本发明真菌菌株的生物控制剂的示例是包含奥德曼细基格孢(Ulocladium oudemansii)的BotryZenTM生物控制剂。 
组合物也可包含广泛的用于增强活性成分的添加剂例如稳定剂和渗透剂和用于改善孢子活力、萌芽和生存性的所谓“应激”(stressing)添加剂例如氯化钾、甘油、氯化钠和葡萄糖。添加剂也可包括帮助维持微生物在长期储存中的存活力的组合物，例如未精炼的玉米油和所谓的反相乳液(在外侧包含油和蜡的混合物，在内侧包含水、海藻酸钠和分生孢子)。 
重要的是使用的任何添加剂以不影响生物控制剂的有效性的量存在。 
US 5780023提供了包括载体、防腐剂、表面活性剂和湿润剂、展着剂和营养素的合适组合物的示例，在本文中以其整体引入作为参考。 
申请人也已确定许多常用杀真菌剂不会不利地影响本发明的昆虫病原真菌。本发明的组合物因此也可包括这些杀真菌剂。可选地，在控制程序中本发明组合物可联合此类杀真菌剂但是分开地使用。 
本发明还提供了制备包含一种或多种本发明的昆虫病原真菌的组合物的方法，所述方法包括获得所述昆虫病原真菌的具繁殖活力的形式，和将所述昆虫病原真菌的所述具繁殖活力的形式与至少一种农业上可接受的载体组合。 
可将组合物制备为多种形式。一种制品包含可撒在植物或其周围上的粉末形式的本发明组合物。在另一种形式中，组合物与稀释剂例如水混合以形成喷雾剂、泡沫、凝胶或浸蘸剂并使用已知的方案合适地应用。在目前优选的实施方案中，使用加压喷雾器以约1gm/L或约1至3kg/ha在每公顷不低于1000L的水中将如上述配制的球孢白僵菌组合物与水混合。优选地，以约1ml/L将Fortune PlusTM加入组合物作为紫外线和干燥防护剂。可以以类似的方式应用包含蜡蚧霉、长孢蚧霉或玫烟色拟青霉的组合物。 
也可以按需要使用为其他应用方法例如注射、擦或刷而配制的组合物，其可为任何已知的本领域方法。对植物周围或环境例如土壤、水间接应用组合物或将其作为种子包衣是潜在可能的。 
如上面讨论的，包含本发明昆虫病原真菌或其一种或多种代谢物的组合物作为有效生物控制剂应用的浓度将取决于最终用途、植物的生理条件；病原体感染的类型(包括昆虫物种)、浓度和程度；温度、季节、湿度、在生长季中的阶段和植物的年龄；正在应用的常规杀虫剂或其他处理(包括杀真菌剂)的数量和类型；和植物处理(例如叶的采摘和修剪)而变化。 
例如，在某些应用中，可以以约1x1010至约1x1015孢子每公顷，优选从约1x1012至约1x1014孢子每公顷，更优选从约5x1012至约1x1014孢子每公顷，更优选约1-3x1013孢子每公顷的比例，应用包含球孢白僵菌的组合物。 
在另一个方面，本发明提供了控制一种或多种植物病原昆虫的方法，所述方法包括对植物或其周围应用球孢白僵菌菌株K4B3的具繁殖活力的形式和量。 
在一个实施方案中，球孢白僵菌菌株K4B3与如本文描述的一种或多种其他昆虫病原真菌联合应用。 
优选地，所述一种或多种其他真菌选自蜡蚧霉菌株K4V1(NMIA No.NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(NMIA保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(NMIA保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(NMIA保 藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(NMIA保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(NMIA保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(NMIA保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。 
此外，尽管可在控制方法中应用具有对抗一种或多种植物病原昆虫物种之活性的多种本发明昆虫病原真菌菌株，但通常在方法中使用3种或更少的菌株。 
也考虑在一个作物周期中的相同或不同时间重复应用。可在季节的早期或晚期应用本发明的昆虫病原真菌和包含本发明的昆虫病原真菌或其一种或多种代谢物的组合物。这可为在开花时间内(over flowering)或在结果期期间。也可在临收获前或收获后立即应用本发明的昆虫病原真菌和包含本发明的昆虫病原真菌或其一种或多种代谢物的组合物，以迅速定植坏死的或开始衰老的叶、果、茎、机收秆等等，从而防昆虫定植。也可对冬季的休眠植物应用本发明的昆虫病原真菌或本发明的组合物，以延缓昆虫在休眠组织上的生长。 
应用可在裂芽(bud burst)前或后和收获前和后的时间。然而，优选在开花和收获之间进行处理。为了增加效力，优选多次应用(例如，在开花阶段到结果阶段的期间应用2至6次)本发明的昆虫病原真菌或本发明的组合物。 
也应考虑在雨后重复应用本发明的昆虫病原真菌或组合物。使用昆虫感染性预测模型或感染分析数据，也可安排BCA应用的时间以针对昆虫感染风险期。 
在目前优选的实施方案中，以溶液的形式应用本发明的昆虫病原真菌或包含本发明的昆虫病原真菌或其一种或多种代谢物的组合物，例如如上所述的，使用加压喷雾器。应当对植物部分轻轻地喷洒直至溶液即将流下前的程度。可对植物和/或其周围的任何部分进行应用，例如对全部植物冠层，对冠层中花和正在成熟的果集中的区域，或对植物茎和/或对根、块茎附近或周围的土壤、水或生长培养基等等。 
优选地包含昆虫病原真菌的组合物是稳定的。如本文使用的，术语“稳定的”指组合物能够在数周内，优选约1、约2、约3、约4、优选约5、更优选约6个月或更长时间内支持所述真菌的繁殖活力。优选地，组合物是稳定的，不需要在特殊条件下储存，例如冷藏或冷冻。 
应用的组合物将控制植物病原昆虫。植物病原昆虫对许多收获前和收获后疾病负责，其攻击植物部分并降低感染植物的生长速度、开花、结果、产量并可引起感染植物的死亡。如本文使用的，植物病原昆虫包括其自身为植物病原体的昆虫和可作为其他植物病原体例如植物病原真菌和细菌的载体的昆虫。显而易见地，通过控制作为其他植物病原体载体的宿主昆虫可减少植物疾病的发病率和/或严重度。 
下表1显示了感染在新西兰生长的多种重要园艺作物的主要植物病原昆虫。 
表1.主要昆虫害虫 
Figure BDA0000067808060000311
特别考虑使用本发明的组合物和方法控制上述的作物中的粉虱、蓟马、 蚜虫和毛虫。还特别考虑使用球孢白僵菌K4B3(单独或与其他球孢白僵菌菌株一起，或与蜡蚧霉或玫烟色拟青霉一起)和包含其的本发明组合物控制瓦螨。 
本发明的方法特别可以应用于收获前或收获后的植物和植物产品。例如，可对上面列举类型的储存产品，包括水果、蔬菜、切花和种子，应用本发明的组合物。合适的应用技术包括上面的那些，特别是喷雾。 
相对直接对植物应用，组合物可潜在地用于处理或预处理土壤或种子。组合物可应用于植物加工材料例如保护性包衣、盒子和包装物。 
本发明还涵盖用本发明的昆虫病原真菌活性菌株或本发明的组合物直接处理的植物、植物产品、土壤和种子。 
在另一个方面，本发明延及本发明的昆虫病原真菌在本发明的组合物中的用途。 
本发明在前面进行了描述，下面给出实施例，所述实施例仅旨在举例说明本发明，而不以任何方式对其范围构成限制。 
实施例1球孢白僵菌菌株K4B3的鉴定和分离 
球孢白僵菌K4B3最早从新西兰Bombay的松林中已达到土壤表面并大量死亡的一群死亡蝉蛹中分离。使用标准程序从昆虫样品中分离真菌，这包括在24℃和93％相对湿度下生长以最大化孢子形成。然后在MEA上传代培养单菌落以产生纯菌株用于筛选昆虫致病效力。 
白僵菌特征 
使用本领域熟知的分类学依据，将分离株鉴定为球孢白僵菌。 
形态学特征 
分离株K4B3对未成年蓟马、成年蓟马和蓟马蛹，蚜虫和粉虱具有致病性。此分离株具有以下鉴定特征： 
菌丝体：易于在MEA上生长。菌落通常为白色，在边缘变为奶油色至浅黄色。极少见为淡红色。菌丝体叶状体的底面将红色(red blush)色素注入琼脂。 
分生孢子梗：大量，产生自菌丝。1-2μm宽，带有成群的簇集的产孢细胞3-6x3-5μm，其可分支以产生更多产孢细胞，球形至瓶形，具有良好发育的达20μm长x1μm宽的柄，曲膝状具有宽达1μm的小齿。 
分生孢子：2-3x2-2.5μm的透明球状分生孢子。在深层培养中形成芽生孢子。疏水。在琼脂上产生极度簇集的颗粒状聚集体。孢子聚集体的颜色在成熟时变为深的近似彩虹色的黄色。将K4B3引入深层培养产生极红的颜色和刺鼻的金属气味，同时向溶液中注入毒性代谢物。 
保藏 
本文中提及的保藏物在澳大利亚国家计量院(NMIA，前身为澳大利亚政府分析实验室(AGAL))进行，如显示。如本文使用的，提及AGAL登记号或保藏号应视为等同于提及NMIA登记或保藏号。K4B3在2008年9月23日保藏于澳大利亚国家计量院并分配了保藏号V08/025855。 
实施例2-比较使用K4B3和化学杀虫剂的粉虱控制 
引言 
此实施例描述了为评估球孢白僵菌菌株K4B3作为粉虱的生物控制剂的效力而进行的田间试验，并将其与已建立的化学处理程序相比较。试验在2个1680m2的Venlo型Faber温室中进行，温室具有燃煤蒸发器和Chemtest环境和灌溉控制器。除了滚落液(runoff)的流泄外，温室在所有方面是一样的。在温室1中进行化学农药方案，在温室2中进行本发明的BCA试验。 
方法 
温室1 
在此温室中种植De Ruiter品种Antarctica。如在建植后的通常做法，允许植物达到膝盖的高度，之后通过100ml/1000m2的灌溉，应用Vydate(240gm/L杀线威(oxamyl))。随着作物的生长，将Vydate的剂量增加至200ml/100m2并当作物达到肩膀的高度时最终增至300ml/1000m2。在收获的4周内必须停止使用LD50为37mg/kg的Vydate从而不超过水果 中的杀线威最大推荐水平(MRL)。然后接着进行Lannate(200gm/L灭多虫)和Thiodan(350gm/L硫丹)混合物，Chess(250gm/kg拒嗪酮(Pymetrozine))和Attack(25gm/L氯菊酯(permethrin)加上475gm/L甲基虫螨磷(pirimiphos-methyl))的通常方案。 
温室2 
在此温室中种植De Ruiter品种Toronto。此品种是比温室1中种植的Antarctica品种更难管理的品种。如通常做法，最初使用Vydate进行粉虱控制，按照上述的用于温室1的相同方案。在停止使用Vydate后应用球孢白僵菌菌株K4B3。将球孢白僵菌菌株K4B3放入1L 0.1％Tritonx100，并使用血球计数仪建立1010/ml的孢子浓度。将孢子溶液冷却至2℃，然后立刻转移至温室2。然后将此孢子溶液加入100L喷雾罐以得到107/ml的孢子计数以达到感染阈值。然后以100ml/100L的比例加入Fortune PlusTM，一种食品级植物油，作为湿润剂。 
在下降的温度和高湿度下应用孢子，使温室在夜间超过80％rH。在下一个月中重复4次此过程，然后在后2个月中重复4次。 
结果 
评估了作物健康和在各株作物的下部叶片上的粉虱若虫(scale)数。通过计数各温室中代表数量的植物上粉虱若虫数，定量确定感染率，从而确定每株植物的粉虱若虫平均数。 
讨论 
结果显示应用了BCA的植物处于非常好的状态，比1号温室的植物具有明显更少的粉虱若虫，这支持球孢白僵菌菌株K4B3的昆虫致病效力。 
结果显示用BCA制剂处理的植物上的粉虱若虫的平均数比用化学杀虫剂处理的植物上的低，这支持以下结论，即球孢白僵菌菌株K4B3提供了非常好的粉虱控制，并具有简单的应用方法。 
实施例3-球孢白僵菌的制备 
引言 
此实施例描述了球孢白僵菌菌株K4B3的大规模固相生长和包含其一种或多种代谢物的组合物的制备。 
方法 
分生孢子的萌芽 
最优的孢子形成需要饱和大气和25至30℃的温度。在孢子形成后，将孢子转移至干燥的可封口的容器中并储存于8℃。孢子可被这样储存长达635天。 
固相，大规模生长 
在储存300天后，从储存物中取出疏水孢子粉并如下检测其存活力。 
制备pH5.5的麦芽提取物琼脂(添加20,000I.U.青霉素/L和40mg链霉素/L)。将1mL等分试样的孢子悬浮物加入麦芽提取物琼脂，涂抹并在24℃孵育14天。 
在第15天，将真菌收获至添加0.01％Tritonx100的无菌水中至104分生孢子/mL的浓度。然后检查溶液是否有污染。如果存在任何污染，则丢弃孢子溶液。 
如上制备麦芽提取物琼脂并加入无菌的玻璃bulking-up盘中，然后将其置于潮湿袋，密封并冷却至30℃。然后将20mL孢子溶液加入盘，之后孵育14天。再次将真菌收获至添加0.01％Tritonx100的无菌水中，这次至104分生孢子/mL的浓度。然后检查溶液是否有污染。再一次的，如果存在任何污染则丢弃孢子溶液。 
制备1.6kg粗磨的红小麦并与320mL无菌水一起加入生长袋(使用无菌管通风)。然后通过微波3分钟灭菌袋子并使其冷却至室温。 
将混合酵母提取物(2g/L)的320mL孢子溶液置于包含小麦的各个生长袋并将袋在24℃和模拟正常光周期的人工光照下孵育7天。 
在第7天，去除通风管。通过在袋中加入3L添加0.01％Tritonx100的无菌水，摇动内含物，然后将内含物倾倒至大桶中，以收获完全生长的培养物。重复一次该收获步骤。 
将得到的上清经1μM滤器过滤以移走所有白僵菌和酵母孢子，然后 使用柠檬酸将其调节为pH3.9。 
结果 
在袋中孵育时，球孢白僵菌K4B3的菌丝体变为粉红至偏粉红的红色，袋中的小麦和浓缩的湿气被注入粉红色。不希望受到任何理论的束缚，申请人认为在部分灭菌的小麦中存在的面包酵母开始竞争营养源，促使球孢白僵菌K4B3分泌生物毒素或生物毒素复合物至培养基，该生物毒素或生物毒素复合物可能为粉红至偏粉红的红色的代谢物或可能与之相关。 
实施例4-分析白僵菌培养物的白僵菌素和其他生物毒素 
引言 
此实施例描述了对球孢白僵菌菌株K4B3产生的生物毒素的分析。 
方法 
白僵菌素标准品的制备 
将1.22mg白僵菌素粉末(AnaSpec Inc.San Jose，Lot#AE6017)在甲醇中混合并配成10mL的体积。制备了4个样品，其中2个包含高或正常蛋氨酸。 
LCMS 
使用具有UV二极管阵列检测器(DAD)的Waters 2698 HPLC和Quattro Ultima三重四级杆质谱(Waters-Micromass Ltd，UK)生成质谱以检测样品中存在的白僵菌素和其他活性成分。使用Phenomenex Luna C18柱(50x2mm)进行层析分离，使用甲醇梯度洗脱。 
以监视200-1600amu的正全扫描模式和监视200-400nm的DAD，获取数据。 
球孢白僵菌菌株K4B3提取物的制备 
如上面的实施例3描述的，制备多个过滤后的K4B3培养物上清的样品。 
结果 
在各个标准样品中检测到的白僵菌素量和在多个球孢白僵菌菌株 K4B3提取物中存在的白僵菌素量显示于表2。 
如上述进行白僵菌素-正常蛋氨酸标准品的质谱分析，显示在图1中。观察到被鉴定为白僵菌素、白僵菌素-F和类白僵菌素的峰。 
如上述也进行了球孢白僵菌菌株K4B3样品3的质谱分析。在提取物中没有观察到白僵菌素。 
表2：白僵菌素样品的定量 
Figure BDA0000067808060000371
实施例5-由球孢白僵菌K4B3产生的真菌肉汤的效力和毒性 
引言 
此实施例报导了K4B3提取复合物作为对抗蚜虫和木虱的杀虫剂的效力。 
方法 
如上面实施例3中描述的，制备K4B3提取物。如上面实施例3中描述的，制备纯化的白僵菌素的溶液。 
将2mL K4B3提取物应用于受蚜虫和木虱感染的作物。最初通过手工喷洒至滚落点进行应用(在下表3和4中报导的试验)。之后，使用Potters Tower应用溶液(在下表5至7中报导的试验)。 
在处理后48和72小时评估昆虫的发病率。 
结果 
K4B3的过滤后肉汤和培养物提取物具有对抗蚜虫和木虱的活性，如下表3至6中所示。 
表3：成年和未成年蚜虫——处理后48小时。 
Figure BDA0000067808060000381
表4：成年和未成年木虱-——处理后72小时。 
Figure BDA0000067808060000382
Figure BDA0000067808060000391
(n)＝在其上观察到青霉菌菌丝体的死亡木虱数 
蚜虫死亡率 
下面的表5展示了在亚洲芸苔叶盘上存在的绿豌豆蚜虫(Myzus persicae)中观察到的死亡率。将亚洲芸苔叶盘置于培养皿中的1％水琼脂上，将培养皿置于Potters Tower中。使用Potter Tower施加喷雾，使用2，5，10，15和20mL溶液。将喷洒过的培养皿背侧向下置于纸巾上使表面干燥。每种处理进行5次重复。应用后24小时评估死亡率。 
表5：处理后24小时的蚜虫死亡率。 
喷洒水的对照 
Figure BDA0000067808060000392
生物毒素复合物 
Figure BDA0000067808060000401
下面的表6展示了在亚洲芸苔叶盘上存在的绿豌豆蚜虫(Myzus persicae)中观察到的死亡率。将亚洲芸苔叶盘置于培养皿中的1％水琼脂上。如显示的稀释K4B3提取物，使用Potters Tower喷洒2mL的各个稀释液。将喷洒的培养皿背侧向下置于纸巾上使表面干燥。应用后24小时评估死亡率。 
表6：蚜虫死亡率-K4B3浓度的影响。 
Figure BDA0000067808060000402
下面的表7展示了在亚洲芸苔叶盘上存在的绿豌豆蚜虫(Myzus persicae)中观察到的死亡率。将亚洲芸苔叶盘置于培养皿中的1％水琼脂中。使用Potters Tower喷洒2mL的K4B3提取物、白僵菌素溶液(50μg/mL，补加2.5mL millennium油/L)和水对照。将喷洒的培养皿背侧向下置于纸 巾上使表面干燥。每种处理进行5次重复。应用后48小时评估死亡率。 
表7：蚜虫死亡率-K4B3和白僵菌素的比较 
讨论 
K4B3提取物导致一致地高的蚜虫死亡率。此作用是剂量依赖性的(如在表6中所示)。作为比较，纯白僵菌素显示了非常低的死亡率，甚至在50,000μg/L的浓度下。实际上，如在表7中所示，在单独的白僵菌素中观察到的死亡率和在水对照中观察到的没有显著差异。 
不希望受任何理论束缚，申请人认为，在K4B3提取物中存在的低白僵菌素浓度(约7.5μg/L)和同等低的类白僵菌素浓度提示K4B3提取复合物的昆虫致病效力可能不能归因于仅白僵菌素或类白僵菌素。不希望受任何理论束缚，申请人认为，所述昆虫致病效力实际上可能是由于K4B3的一种或多种代谢物引起的，所述代谢物可能自身具有昆虫致病效力，或加强提取物中存在的一种或多种昆虫病原剂的昆虫致病效力或与之协同。 
实施例6-在球孢白僵菌K4B3提取物中存在的生物毒素的鉴定 
引言 
此实施例描述了对球孢白僵菌菌株K4B3产生的提取物中存在的生物 毒素的鉴定。 
方法 
球孢白僵菌提取物的制备和生物毒素的鉴定 
如在实施例3中描述的制备球孢白僵菌K4B3提取物和如在实施例4中描述的使用LCMS检测生物毒素。 
结果 
观察到被鉴定为白僵菌素、白僵菌素-F和类白僵菌素的峰(如图2中显示)。也检测到未鉴定的峰(见图2)。 
讨论 
不希望受任何理论束缚，申请人认为，负责质谱中存在的未鉴定峰之一个或多个的一种或多种代谢物可能负责观察到的K4B3提取物的昆虫致病效力。 
实施例7-在哺乳动物模型中球孢白僵菌K4B3提取物的毒性 
引言 
此实施例报导了在哺乳动物模型中评估K4B3提取复合物的毒性。 
方法 
如上面实施例3中描述的制备K4B3提取物。 
根据OECD指导原则425(急性经口毒性——上下增减剂量法)在小鼠中进行检测。由于预计此物质没有高毒性，选择通过口腔插管的2,000mg/kg单次剂量水平的限度检测(Limit test)。除非在特殊情况下，此剂量是OECD推荐的评估急性毒性的最高剂量。 
通过口腔插管对5只雌性Swiss小鼠施用单次2,000mg/kg剂量的K4B3复合物，如下述。 
检测条件 
在约4pm对小鼠中的一只停止供应食物并测量其体重。第二天早晨，再次对该小鼠称重并计算提供2,000mg/kg剂量所需的K4B3提取物的重量。称量此量并用150μl水稀释。经管饲对小鼠施用所有体积。 
在给药后，允许小鼠立即获得食物。在给药后60分钟密切观察，然后在给药当天和之后的数天中的几个间隔时间点观察，如2000年10月的用于化学试剂的检测的OECD指导原则，修正草案指导原则425中具体描述的。在此第一只小鼠后48小时对第二只小鼠给药K4B3提取物，再次以2,000mg/kg体重的剂量。之后以48小时的间隔对第3、第4和第5只小鼠给药，都以2,000mg/kg的剂量。 
小鼠单独笼养，无水和食物限制(除了给药前过夜空腹)。在施用后2周每天1次观察小鼠并测量体重。在给药后1天、1周和2周时记录体重，之后通过吸入二氧化碳处死动物并对其进行死后检查。 
结果 
在施用K4B3复合物后没有观察到毒性作用，小鼠在整个观察期内维持良好的健康状态。小鼠在给药后很快开始进食，它们在给药当天和在整个试验中的行为都完全正常。未观察到腹泻的迹象，小鼠的粪粒为正常稠度。 
体重。表8显示了在整个试验中不同时间间隔点上小鼠的平均体重和每只小鼠的个体值。 
表8.接受K4B3提取物的小鼠体重 
Figure BDA0000067808060000431
在过夜空腹后，小鼠体重平均减少了2.4克。此减少的体重到第二天在给药后恢复食物供应后大部分地重获。在给药后在整个2周观察期内小鼠维持其重量。 
死后调查的结果。尸检时在小鼠中未记录到异常，小鼠的肝、肾、脾、心、肺和肠(幽门至肛门)的重量在其正常范围内，如表9所示。 
表9.接受K4B3的小鼠的相对器官重量 
Figure BDA0000067808060000441
讨论 
以2,000mg/kg的剂量对小鼠口服施用K4B3没有导致可辨别的副作用。没有发生死亡，并且小鼠的行为完全正常。在尸检时没有发现异常，并且器官重量在正常范围内。 
K4B3复合物展示了低急性经口毒性，具有大于2,000mg/kg体重的LD50。此结果表明在新西兰有害物质和新生物(HSNO)条例1996下，K4B3复合物将被归类为最低危害目录。 
实施例8-BCA组合物的比较 
引言 
此实施例描述了评估使用市售的杀虫剂产品MycotalTM和使用本发明的组合物获得的温室粉虱控制。 
方法 
V+K4B3和MycotalTM的制备 
从Millennium Microbes，NZ获得的VertikilTM包含蜡蚧霉菌株K4V1和K4V2的分生孢子，以包含109孢子/mL的各蚧霉菌株的悬浮液形式提供。然后将提供的悬浮液与如实施例3所述制备的K4B3生物毒素提取物组合。在本文中将此组合的组合物称为V+K4B3。在水中稀释所述悬浮液 用于喷雾应用。 
将包含蜡蚧霉菌株的分生孢子的MycotalTM(Koppert Biological Systems，Netherlands)重悬于水中用于喷雾。 
根据制造商的说明书制备所有喷洒处理剂，并根据建议与合适的助剂联合应用。例如，MycotalTM与0.25％v/v浓度的“Addit”油一起应用。V+K4B3与0.25％v/v浓度的有机硅/植物油助剂“Deep Fried”一起应用。 
昆虫实验 
将无昆虫的番茄幼苗置于遮蔽的笼中并允许成年温室粉虱Trialeurodes vaporariorum在其上产卵96小时。然后去除成年粉虱，之后将幼苗转移至无粉虱的笼中并使卵孵化(在10至14天内)。使若虫再发育14至21天直到其达到三龄晚期——四龄早期。然后从植物上切下叶并将叶柄置于水cyrotube中。基于粉虱若虫数，选择叶，保证群体不过密但至少有20只若虫在检测的每片叶的底面。 
V+K4B3和MycotalTM的应用 
各种产品以以下比例应用： 
1.X＝推荐的喷洒比例(V+K4B3 10mL/L；MycotalTM 1g/L) 
2.0.5X＝推荐的喷洒比例的一半(V+K4B3 5mL/L；MycotalTM 0.5g/L) 
3.0.25X＝推荐的喷洒比例的1/4(V+K4B3 2.5mL/L；MycotalTM 0.25g/L) 
使用改良气刷，应用悬浮液以保证200μL/叶的叶覆盖率。每个应用重复3次并同时检测。在通风的塑料容器中在18-20℃保存叶并在喷洒后7天评估昆虫死亡率和感染。 
统计分析 
通过ANOVA分析死亡率数据以比较2种杀虫处理产品的效力。 
结果 
表10显示了在喷洒处理后7天的平均粉虱死亡率和感染水平。对2种真菌处理，昆虫死亡率和感染水平随产品浓度的增加而增加。在MycotalTM中，从低比例到高比例存在显著线性趋势(p＜0.001)，但在 V+K4B3中没有。在最高浓度的MycotalTM下，100％的死亡若虫感染了真菌，而在V+K4B3处理下85％的死亡若虫感染了真菌。与未处理的对照群体相比，在处理的群体中(在2种产品中)昆虫死亡率和感染显著更高(p＜0.001)。 
表10：温室粉虱死亡率和感染率 
Figure BDA0000067808060000461
跨检测的浓度范围，产品的效力是差不多的。在检测的任何浓度，2种处理的平均百分比死亡率差异不显著。当以低浓度应用时，V+K4B3诱导更高的死亡率和感染水平，而MycotalTM在较高浓度下导致略微更高的昆虫感染水平。值得注意的，在V+K4B3的推荐剂量比例下低但统计上显著数量的未成熟若虫被杀死但未被感染。 
表11：MycotalTM相对V+K4B3的感染和死亡率比较 
Figure BDA0000067808060000462
讨论 
不希望受理论束缚，申请人认为，在V+K4B3处理下观察到的显著数量的死亡但未感染的昆虫支持以下观点，即在V+K4B3中观察到的至少部分死亡率是由于组合物中的K4B3提取物的存在。 
工业实用性 
正如从以上描述中显而易见地，本发明提供了昆虫病原真菌菌株和其一种或多种代谢物，和对植物病原昆虫的控制有用的包含所述真菌或其一种或多种代谢物的组合物。也提供了这些真菌和其代谢物在植物病原昆虫的控制中的用途和控制植物病原昆虫的方法。 
出版物 
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Claims (58)

1.在澳大利亚国家计量院以保藏号V08/025855保藏的球孢白僵菌真菌菌株K4B3的生物纯培养物，或具有其鉴定特征的培养物。
2.可从权利要求1的真菌获得的孢子。
3.权利要求2的孢子，其为分生孢子或芽生孢子。
4.权利要求1的真菌和至少一种载体在制备组合物中的用途。
5.来自权利要求1的真菌的孢子和至少一种载体在制备组合物中的用途。
6.根据权利要求4或权利要求5的用途，其中所述组合物为生物控制组合物。
7.根据权利要求6的用途，其中所述生物控制组合物为昆虫致病组合物。
8.根据权利要求4至7中任一项的用途，其中所述组合物包含至少一种农业上可接受的载体。
9.一种制备组合物的方法，包括组合权利要求1的真菌的具繁殖活力的形式和至少一种载体。
10.根据权利要求9的方法，其还包括至少一种选自以下的真菌：蜡蚧霉菌株K4V1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。
11.根据权利要求9或权利要求10的方法，其中所述至少一种载体为农业上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
12.根据权利要求9至11之任一项的方法，其中所述至少一种载体选自填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂。
13.根据权利要求12的方法，其中所述组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂之各至少一种。
14.根据权利要求9至13之任一项的方法，其中产生的组合物为生物控制组合物。
15.根据权利要求14的方法，其中生物控制组合物为昆虫病原组合物。
16.包含球孢白僵菌菌株K4B3和至少一种载体的组合物。
17.包含可从球孢白僵菌菌株K4B3获得的孢子和至少一种载体的组合物。
18.包含球孢白僵菌菌株K4B3的一种或多种代谢物和至少一种载体的组合物。
19.根据权利要求16或18的组合物，其中所述至少一种载体为农业上可接受的载体。
20.根据权利要求16至19中任一项的组合物，其中所述至少一种载体选自填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂。
21.根据权利要求20的组合物，其中所述组合物包含填料刺激剂、抗结块剂、湿润剂、乳化剂和抗氧化剂之各至少一种。
22.根据权利要求20或21的组合物，其中所述填料刺激剂为葡萄糖，所述抗结块剂为二氧化硅，所述湿润剂为脱脂奶粉，所述乳化剂为卵磷脂，和所述抗氧化剂为谷氨酸钠。
23.根据权利要求16至22中任一项的组合物，其中所述组合物为生物控制组合物。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述生物控制组合物为昆虫致病组合物。
25.根据权利要求16至24中任一项的组合物，其中所述组合物为能够在长于约2周的时期内支持所述真菌的繁殖活力的稳定组合物。
26.根据权利要求16至25中任一项的组合物，其中所述组合物为能够在长于约1个月的时期内支持所述真菌的繁殖活力的稳定组合物。
27.根据权利要求16至26中任一项的组合物，其中所述组合物为能够在长于约3个月的时期内支持所述真菌的繁殖活力的稳定组合物。
28.根据权利要求16至27中任一项的组合物，其中所述组合物为能够在长于约6个月的时期内支持所述真菌的繁殖活力的稳定组合物。
29.根据权利要求16至28中任一项的组合物，其中所述组合物还包含至少一种选自以下的菌株：蜡蚧霉菌株K4V1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。
30.根据权利要求16至28中任一项的组合物，其中所述组合物还包含选自以下的任何两种或更多种菌株：蜡蚧霉菌株K4V2(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。
31.权利要求29或30的组合物，其中菌株是，或组合物包括，蜡蚧霉菌株K4V1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株。
32.权利要求29或30的组合物，其中菌株是，或组合物包括，蜡蚧霉菌株K4V2(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株。
33.权利要求29或30的组合物，其中菌株是，或组合物包括，蜡蚧霉菌株K4V4(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株
34.权利要求29或30的组合物，其中菌株是，或组合物包括，球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株
35.权利要求29或30的组合物，其中菌株是，或组合物包括，球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株
36.权利要求29或30的组合物，其中菌株是，或组合物包括，长孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株
37.权利要求29或30的组合物，其中菌株是，或组合物包括，玫烟色拟青霉菌株K4P1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株
38.球孢白僵菌菌株K4B3在控制一种或多种植物病原昆虫中的用途。
39.可从球孢白僵菌菌株K4B3获得的孢子在控制一种或多种植物病原昆虫中的用途。
40.权利要求16至37中任一项的组合物在控制一种或多种植物病原昆虫中的用途。
41.根据权利要求38至40中任一项的用途，其中所述一种或多种植物病原昆虫选自蓟马、蚜虫、粉虱、毛虫和瓦螨。
42.控制一种或多种植物病原昆虫的方法，所述方法包括对植物或其周围应用球孢白僵菌菌株K4B3的具繁殖活力的形式和量。
43.权利要求42的方法，其中所述具繁殖活力的形式为孢子。
44.控制一种或多种植物病原昆虫的方法，所述方法包括对植物或其周围应用权利要求16至37中任一项的组合物。
45.根据权利要求42至权利要求44中任一项的方法，其中应用或所述组合物包含至少一种选自以下的另外真菌：蜡蚧霉菌株K4V1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44593)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V2(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的菌株；蜡蚧霉菌株K4V4(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的菌株；球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的菌株；长孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的菌株；和玫烟色拟青霉菌株K4P1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。
46.根据权利要求42至45中任一项的方法，其中所述组合物在应用前与水混合至约1gm/L至约3gm/L的终浓度，更优选地至约1gm/L的终浓度。
47.根据权利要求42至46中任一项的方法，其中在应用前将干燥防护剂混合至约1ml/L的终浓度。
48.根据权利要求47的方法，其中所述干燥防护剂为植物油。
49.根据权利要求42至48中任一项的方法，其中所述组合物在应用时包含至少107真菌孢子每微克。
50.根据权利要求42至49中任一项的方法，其中所述组合物包含真菌孢子且所述组合物以约1x1010至约1x1015真菌孢子每公顷的比例应用。
51.根据权利要求50的方法，其中所述组合物以约1x1012至约1x1014孢子每公顷的比例应用。
52.根据权利要求51的方法，其中所述组合物以约5x1012至约1x1014孢子每公顷的比例应用。
53.根据权利要求52的方法，其中所述组合物以约1-3x1013孢子每公顷的比例应用。
54.根据权利要求42至53中任一项的方法，其中所述组合物包含蜡蚧霉菌株K4V1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44593)或具有其鉴定特征的培养物；蜡蚧霉菌株K4V2(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44594)或具有其鉴定特征的培养物；和/或蜡蚧霉菌株K4V4(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00007)或具有其鉴定特征的培养物。
55.根据权利要求42至54中任一项的方法，其中所述组合物包含长孢蚧霉菌株KT4L1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00009)或具有其鉴定特征的培养物。
56.根据权利要求42至54中任一项的方法，其中所述组合物包含玫烟色拟青霉菌株K4P1(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00008)或具有其鉴定特征的菌株。
57.根据权利要求42至54中任一项的方法，其中所述组合物包含球孢白僵菌菌株K4B1(澳大利亚国家计量院保藏号NM05/44595)或具有其鉴定特征的培养物和/或球孢白僵菌菌株K4B2(澳大利亚国家计量院保藏号NM06/00010)或具有其鉴定特征的培养物。
58.根据权利要求42至57中任一项的方法，其中所述应用通过喷雾进行。
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