KR20110084516A

KR20110084516A - 곤충병원성 진균 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20110084516A
Application number: KR1020117011111A
Authority: KR
Inventors: 스티븐 레이놀드 포드
Original assignee: 그린타이드 리미티드
Priority date: 2008-10-14
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2011-07-25
Also published as: US20150050244A1; US20110280839A1; CN102341493A; EP2350261A1; ZA201103593B; WO2010044680A1; CN102341493B; AU2009304001B2; EP2350261A4; AU2009304001A1; CA2756429A1; NZ592832A

Abstract

본 발명은 곤충병원성 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주, 상기 곤충병원성 진균 균주 또는 상기 균주의 대사산물을 포함하는 조성물, 및 생물학적 방제 제제로서 상기 곤충병원성 진균 균주 및 조성물의 용도를 제공한다. 선택적으로 다른 곤충병원성 진균[레카니실리움종(Lecanicillium spp .), 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus)의 균주로부터 선택된 진균을 포함함]을 함께 포함하는, 곤충병원성 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 진균 균주 또는 이의 1 이상의 대사산물 및 상기 진균 또는 이의 대사산물을 포함하는 조성물을 사용하는 식물병원성 곤충의 생물학적 방제 방법이 또한 제공된다.

Description

곤충병원성 진균 및 이의 용도{ENTOMOPATHOGENIC FUNGI AND USES THEREOF}

본 발명은 곤충병원성 진균(entomopathogenic fungi) 및 이의 대사산물(metabolites), 상기 곤충병원성 진균 또는 이의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물, 및 생물학적 방제 제제(biological control agents)로서 상기 곤충병원성 진균 및 조성물의 용도에 관한 것이다. 곤충병원성 진균, 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 및 상기 진균 또는 이의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물을 사용하여, 진딧물(aphids), 총채벌레(thrips), 왕흰나방(white fly), 벚나무깍지 벌레(mealy bug) 등을 포함하는 식물병원성 곤충들(phytopathogenic insects)의 생물학적 방제를 위한 방법도 또한 제공된다.

곤충과 같은 병원균에 의해서 야기되는 식물 질병은 식물계 농업 및 산업에 서의 경제적인 비용이 크다. 수확 전 및 수확 후 둘 다에서 발생되는 손상, 식물 그 자체의 손실 또는 성장력과 생산력에서의 감소를 통한 손실이 커질 수 있다.

전통적으로 식물 병원균의 방제는 다수의 화학적 살충제를 사용하여 이루어지고 있다. 화학물질의 사용은 다수의 단점이 있다. 병원균들은 시간이 흐르면서 화학물질에 대한 내성이 생길 수 있으며, 생성된 내성을 가지므로 내성 집단을 생성한다. 실제로, 살충제에 대한 내성은 원예 산업의 실행 가능성에 대한 가장 큰 도전이다.

특히 다수의 경제적으로 중요한 식물병원성 곤충과 관련된 문제점이 나타나 있다. 전 세계적인 서양꽃 총채벌레(western flower thrips)의 집단이 하기 예를 포함하는 살충제 중 대부분의 그룹에 대한 내성이 있는 것으로 보고되었다: 아세페이트(acephate), 아바멕틴(abamectin), 클로르피리포스(chlorpyrifos), 엔도설판(endosulfan), 메토밀(methomyl), 메티카르브(methiocarb), 오메토에이트(omethoate), 피라조포스(pyrazophos) 및 타우-플루발리네이트(tau-fluvalinate). 뉴질랜드의 양파 총채벌레(onion thrips) 집단은 델타메트린(deltamethrin)에 대한 내성이 생성되었으며, 국소 집단에서 디아지논(diazinon) 및 디클로르보스(dichlorvos)에 대한 내성이 있는 것으로 보고되었다. 미국의 양파 총채벌레는 여러 살충제에 내성이 있는 것으로 보고되었다(Grossman, 1994). 온실 왕흰나방(Greenhouse whitefly)는 유기염소, 유기인, 카르바메이트 및 피레스로이드계 살충제에 내성이 생성된 것으로 보고되었다(예를 들면 Georghiou 1981, Anis & Brennan 1982, Elhag & Horn 1983, Wardlow 1985 및 Hommes 1986). 내성은 새로운 살충제, 즉 부프로페진(buprofezin) 및 테플루벤즈우론(teflubenzuron)에서도 또한 보고되었다(Gorman 등 2000).

화학적 잔류물도 또한 환경적인 위험들이 제기될 수 있으며, 건강상의 관심이 커질 수 있다. 지난 20 년에 걸친 세균성 살충제와 같은 생물학적 방제에 대한 관심이 화학적 유독성에 대한 관심에 응하여 대중의 압력으로 바로 회복되었다. 생물학적 방제는 화학물질에 대한 의존성을 감소시킬뿐 아니라 현재 방법들 보다 잠재적으로 더 효과적이며 특이적인 식물 병원균들을 방제하는 대안적인 수단이 분명하다. 이러한 생물학적 방제 방법들은 대중의 수용이 크며, 환경적 오염이 감소하며, 지속가능성이 큰 이점을 갖는 살충제에 대한 "천연" 대안 방법으로서 알려져 있다.

생물학적 방제의 메카니즘 다양하다. 효과적으로 알려져 있는 하나의 메카니즘은 식물병원성 곤충을 방제하기 위한 박테리아와 같은 길항적 미생물의 사용이다. 예를 들면 바실러스 츄린기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 대규모 생성은 뉴질랜드 오크랜드의 페인트 사과 나방(painted apple moth)을 방제하기 위한 상기 박테리오-살충제(bacterio-insecticide)를 사용할 수 있다.

곤충병원성 진균의 성공적인 응용에 대한 정보는 거의 없으며, 이들의 산업적 생성은 여전히 비교적 단순하다. 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium)[이전에는 베르티실리움 레카니(Verticillium lecanii)로 알려져 있음], 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 및 메타리지움 안이소필래(Metarhizium anisopliae)를 사용하는 생물학적 방제 제제(BCAs)로서 곤충병원성 진균의 응용은 미국, 유럽, 아프리카 및 러시아에서 개발되었다. 그러나 지금까지 당 분야에 존재하는 환경적인 가변성을 신속하게 구축하거나 및/또는 생존시키는 것에 실패하여 이상적으로 및 가능한 입증된 후보 물질이 없다. 실제로 존재하는 후보 물질은 현저하게 큰 수용성을 만족시키지 않으며, 비경제적인 것으로 인지될 수 있다.

상기는 예를 들면 방제 조건 때문에 또 다른 나라의 원예학자에 대한 하나의 나라에서 개발된 곤충병원성 진균의 유용성의 지연 또는 흔한 비유용성에 의해 합성된다. 또한 많은 비-자생종 진균은 현지 상황에 적합하게 되거나, 또는 생존할 수 있거나 또는 잘 자랄 수 있을 것 같지 않다.

놀랍게도 본 출원인들은 현재 효과적인 BCA로서 이전에 보고되지 않은 부베리신 균주를 동정하고 분리하였다. 본 출원인들은 이러한 종들이 이에 제한하지는 않지만 총채벌레(thrips), 진딧물(aphids) 및 왕흰나방(white fly)를 포함하는 식물병원성 곤충을 방제하는데 매우 효과적이라는 것을 확인하였으며, 이러한 분야에서 성공적으로 생존 및 구축된다는 것도 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 식물병원성 곤충의 생물학적 방제에 유용한 뷰베리아 균주를 제공하고, 또는 적어도 대중에게 유용한 선택을 제공한다.

따라서 하나의 측면에서 본 발명은 2008년 9월 23일에 수탁된 가입 번호 V08/025855의 호주 국가 측정 기관(NMIA)에 수탁된 뷰베리아 바시아나 진균 균주 K4B3의 생물학적으로 순수한 배양을 제공하거나 또는 이의 규명된 특성을 갖는 배양을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 진균으로부터 수득가능한 포자를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 조성물의 제조에 적어한 하나의 담체와 함께 적어도 상기에서 균정한 진균의 용도를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 조성물의 제조에 적어도 하나의 담체와 함께 적어도 하나의 상기에서 규정된 진균으로부터의 포자의 용도를 제공한다.

하나의 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 진균은 생존적 생균 형태 및 양으로 이용된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 담체와 함께 상기에서 규정한 적어도 하나의 진균을 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게 상기 적어도 하나의 진균은 생존적 생균 형태 및 양으로 이용된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 담체와 함께 본 발명의 적어도 하나의 진균으로부터 수득가능한 포자를 포함하는 조성물을 제공한다.

바람직하게, 상기 조성물은 생물학적 방제 조성물이며, 보다 바람직하게는 상기 생물학적 방제 조성물은 곤충병원성 조성물이다.

바람직하게, 상기 생물학적 방제 조성물은 적어도 하나의 농업적으로 허용가능한 담체를 포함한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 담체와 함께 수탁 번호 V08/025855인 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3의 적어도 하나의 대사산물을 포함하는 조성물을 제공한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 적어도 하나의 대사산물은 곤충병원성 제제이며, 예를 들면 상기 적어도 하나의 대사산물은 분비된 대사산물, 예컨대 분비된 독소이다.

바람직하게, 상기 적어도 하나의 담체는 농업적으로 허용가능한 담체이며, 보다 바람직하게 충전 자극제(filler stimulant), 고화방지제(anti-caking agent), 습윤제, 유화제 및 산화방지제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 조성물은 충전 자극제, 고화방지제, 습윤제, 유화제 및 산화방지제 각각 중 적어도 하나를 포함한다.

바람직하게, 상기 충전 자극제는 탄수화물 공급원이며, 예컨대 슈크로스, 프락토스, 글로코스 또는 덱스트로스를 포함하는 디사카라이드이며, 상기 고화방지제는 탈크, 실리콘 디옥사이드, 칼슘 실리케이트 또는 카올린 클레이로부터 선택되며, 상기 습윤제는 탈지유 분말이며, 상기 유화제는 대두계 유화제, 예컨대 레시틴 또는 식물계 유화제, 예컨대 모노디글리세라이드이며, 및 상기 산화방지제는 소듐 글루타메이트 또는 시트르산이다.

바람직하게, 상기 조성물은 생물학적 방제 조성물이며, 보다 바람직하게는 곤충병원성 조성물이다.

보다 바람직하게, 상기 생물학적 방제 조성물은 약 2 주 이상, 바람직하게는 약 1 개월 이상, 약 2 개월, 약 3 개월, 약 4 개월, 약 5 개월 이상, 보다 바람직하게는 약 6 개월 이상의 기간 동안 곤충병원성 유효성을 보유할 수 있거나 또는 진균의 생존 능력을 지지할 수 있는 안정된 조성물이다.

특정 실시양태에서, 상기 조성물은 단일 진균 균주, 즉 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3(2008년 9월 23일에 수탁된 NMIA 번호 V08/025855)를 포함한다.

대안적으로 상기 조성물은 상기 진균의 다수 균주를 포함하지만, 3개 균주 미만을 포함하는 것이 바람직하다. 적당하게, 상기 조성물은 균주 NMIA 번호 NM05/44593, 균주 NMIA 번호 NM05/44594, 균주 NMIA 번호 NM05/44595, 균주 NM06/00007, 균주 NM06/00008, 균주 NM06/00009, 균주 NM06/00010 및 상기 균주들 중 임의의 하나의 규명된 특성들을 갖는 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 균주와 함께 NMIA 번호 V08/025855를 포함한다.

바람직하게, 상기 조성물은 적어도 하나의 농업적으로 허용가능한 담체와 함께, 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1(NMIA 번호 NM05/44593) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2(NMIA 가입 번호 NM05/44594) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 뮤카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V4 (NMIA 가입 번호 NM06/00007) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B1 (NMIA 가입 번호 NM05/44595) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B2 (NMIA 가입 번호 NM06/00010) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론기스포룸(Lecanicillium longisporum) 균주 KT4L1 (NMIA 가입 번호 NM06/00009) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus) 균주 K4P1 (NMIA 가입 번호 NM06/00008) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주로부터 선택된 1 이상의 균주와 함께 NMIA 번호 V08/025855를 생존 능력 형태 및 양으로 포함하는 생물학적 방제 조성물이다.

다른 실시양태에서, 상기 조성물은 추가적으로 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 가입 번호 V08/025855 중 적어도 하나의 대사산물을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 조성물은 적어도 하나의 농업적으로 허용가능한 담체와 함께 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NMIA 번호 NM05/44593) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2 (NMIA 가입 번호 NM05/44594) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V4 (NMIA 가입 번호 NM06/00007) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B1 (NMIA 가입 번호 NM05/44595) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B2 (NMIA 가입 번호 NM06/00010) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론지스포룸(Lecanicillium longisporum) 균주 KT4L1 (NMIA 가입 번호 NM06/00009) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 및 패시로마이세스 푸모소로세어스(Paecilomyces fumosoroseus) 균주 K4P1 (NMIA 가입 번호 NM06/00008) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주로 이루어진 군으로 부터 선택된 1 이상의 균주와 함께 뷰베리아 바시아나 균주 K4B3 가입 번호 V08/025855 중 적어도 하나의 대사산물을 포함하는 생물학적 방제 조성물이다.

또 다른 추가의 측면에서, 본 발명은 선택적으로 여기서 기재하고 있는 것과 같은 1 이상의 다른 곤충병원성 진균과 함께 뷰베리아 바시아나 V08/025855를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 농업적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 부형제와 본 발명의 곤충병원성 진균의 생존적 생균 형태를 결합시키는 단계를 포함한다.

바람직하게, 상기 다른 진균은 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NMIA 가입 번호 NM05/44593) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2 (NMIA 가입 번호 NM05/44594) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V4 (NMIA 가입 번호 NM06/00007) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B1 (NMIA 가입 번호 NM05/44595) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B2 (NMIA 가입 번호 NM06/00010) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론기스포룸(Lecanicillium longisporum) 균주 KT4L1 (NMIA 가입 번호 NM06/00009) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 및 패시로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus) 균주 K4P1 (NMIA 가입 번호 NM06/00008) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 방제 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) K4B3 V08/025855의 배양물을 제공하는 단계;

적어도 하나의 대사산물의 제조에 적합한 조건 하에 상기 배양물을 유지하는 단계; 및

하기 공정 i), ii), iii) 및 iv) 중 하나의 단계:

i) 담체와 적어도 하나의 대사산물을 결합시키는 공정; 또는

ii) 여기서 기재하는 1 이상의 곤충병원성 진균과 적어도 하나의 대사산물을 결합시키는 공정; 또는

iii) 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) K4B3 V08/025855로부터 적어도 하나의 대사산물을 분리하는 공정; 또는

iv) 상기 (i) 내지 (iii) 중 두 단계 이상을 결합시킨 공정.

또 다른 실시양태에서, 상기 대사산물은 세포내 대사산물이다. 특히 상기 실시양태에서, 상기 방법은 단계 하나 또는 세포-용해 공정들을 유지시킨 후에 추가적으로 포함할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 상기 분리 단계는 원심분리 또는 여과에 의한 것이다.

다양한 실시양태에서, 상기 분리는 뷰베리아 바시아나 K4B3 V08/025855 중 약 50 % 이상, 약 55 % 이상, 약 60 % 이상, 약 65 % 이상, 약 70 % 이상, 약 75 % 이상, 약 80 % 이상, 약 85 % 이상, 약 90 % 이상, 약 95 % 이상, 약 99 % 이상 또는 약 ,약 100 %의 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) K4B3 V08/025855를 제거하는데 효과적이다.

따라서, 하나의 특별하게 고려된 실시양태에서, 상기 방법은 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) K4B3 V08/025855의 배양물을 제공하는 단계, 적어도 하나의 분리 대사산물의 제조에 적합한 조건 하에 상기 배양물을 유지하는 단계 및 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) K4B3 V08/025855로부터 적어도 하나의 분리 대사산물을 분리하는 단계를 포함한다.

바람직하게, 상기 담체는 농업적으로 허용가능한 담체이며, 바람직하게는 적어도 하나의 담체는 충전 자극제, 고화방지제, 습윤제, 유화제 및 산화방지제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 조성물은 충전 자극제, 고화방지제, 습윤제, 유화제 및 산화방지제 각각 중 적어도 하나를 포함한다.

본 발명은 1 이상의 식물병원성 곤충를 방제하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 추가로 제공한다.

바람직하게, 상기 1 이상의 식물병원성 곤충은 총채벌레(Thysanoptera), 진딧물, 나무이류(Psyllids), 스케일(Scale) 또는 왕흰나방(Hemiptera), 벚나무깍지 벌레(mealy bug), 나방 및 나비의 애벌레(Lepidoptera) 및 바로아 응애(Varroa mite)를 포함하는 진드기(mites)로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 1 이상의 식물병원성 곤충을 방제하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 선택적으로 여기서 기재하고 있는 적어도 하나의 다른 곤충병원성 진균과 함께 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) V08/025855의 생존성 생균 형태 및 양을 식물 또는 이의 주위에 도포하는 단계를 포함한다.

하나의 실시양태에서, 상기 곤충병원성 진균의 포자는 식물 또는 이의 주위에 직접적으로 도포될 수 있다. 바람직하게 상기 포자는 물과 함께 혼합되어 여기서 기재하고 있는 것과 같이 도포된다.

바람직하게 상기 적어도 하나의 다른 진균은 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NMIA 가입 번호 NM05/44593) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2 (NMIA 가입 번호 NM05/44594) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V4 (NMIA 가입 번호 NM06/00007) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B1 (NMIA 가입 번호 NM05/44595) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B2 (NMIA 가입 번호 NM06/00010) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론기스포룸(Lecanicillium longisporum) 균주 KT4L1 (NMIA 가입 번호 NM06/00009) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 및 패시로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus) 균주 K4P1 (NMIA 가입 번호 NM06/00008) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가의 측면에서, 본 발명은 1 이상의 식물병원성 곤충을 방제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 조성물을 식물 또는 이의 주위에 도포하는 단계를 포함한다.

바람직하게, 상기 조성물은 도포하기 이전에 약 0.5 gm/L 내지 약 3 gm/L의 최종 농도, 바람직하게는 약 1 gm/L의 최종 농도로 물과 혼합한다.

바람직하게, 건조 보호제(desiccation protection agent), 보다 바람직하게는 포툰 플러스^TM(Fortune Plus™)를 도포 전에 약 1 ml/L의 최종 농도로 혼합한다.

대표적인 농도 범위는 1 ml 당 약 1 x 10² 내지 1 x 10⁸ 포자, 1 ml 당 약 1 x 10² 내지 1 x 10⁷ 포자, 바람직하게는 약 1 x 10³ 내지 2 x 10⁶, 및 보다 바람직하게는 1 ml 당 1 x 10⁴ 내지 2 x 10⁶ 포자이다.

바람직하게, 상기 조성물은 도포 시에 1 mg 당 적어도 10⁷ 포자를 포함하며, 보다 바람직하게는 상기 도포는 분무에 의해서 이루어진다.

바람직하게, 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B3 (NMIA 가입 번호 V08/025855)를 포함하는 조성물 또는 이의 규명 특성을 포함하는 배양물은 1 헥타르 당 약 1 x 10¹⁰ 내지 약 1 x 10¹⁵ 포자, 바람직하게는, 1 헥타르 당 약 1 x 10¹² 내지 약 1 x 10¹⁴ 포자, 보다 바람직하게는 1 헥타르 당 약 5 x 10¹² 내지 약 1 x 1O¹⁴ 포자, 보다 바람직하게는 1 헥타르 당 약 1-3 x 10¹³ 포자의 범위로 도포된다.

편리하게도, 이러한 도포 비율은 1 mg 또는 그 이상 당 약 10⁷ 포자로 상기 조성물을 제제화하고, 상기 조성물을 1 헥타르 당 약 1 kg의 비율로 도포함으로써 획득될 수 있다. 여기서 설명하고 있는 것과 같이, 상기 도포 비율은 종래에는 예를 들면 물과 같은 다량의 농업적으로 허용가능한 용매에 상기 조성물을 용해시켜 획득될 수 있다.

본 발명과 관련된 당업에 통상의 지식을 가진 사람들에게는 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 본 발명의 응용 및 실시양태를 변화시키고, 구성의 여러 변화를 제한한 것이다. 여기의 상세한 설명 및 개시는 단지 예시적인 것이며, 이것에 제한되는 것은 아니다.

특허 명세서, 다른 외부 문헌 또는 다른 정보 공급처를 구성하는 참고문헌은 본 명세서에서 본 발명의 특성을 설명하기 위한 내용을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특별히 다르게 지시하지 않는 한 상기 외부 문헌에 대한 참고문헌은 상기 문헌, 또는 상기 정보 공급처가 어떠한 다른 외부 문헌 또는 다른 정보 공급처가 어떠한 사법권안에서 종래문헌이며, 당업에 일반적인 지식의의 형태를 형성한다는 것은 인정되지 않는다.

도 1은 여기서 실시예 4에서 기재하고 있는 "뷰베리신-노말 메티오닌(beauvericin-normal methionine)" 스탠다드의 질량 분석기 스캔을 나타낸다. 뷰베리신(beauvericin), 뷰베리신-F 및 바시아놀리드(bassianolide)로서 규명된 피크들이 나타나 있다.
도 2는 여기서 실시예 4에서 기재하고 있는 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) K4B3 균주로부터의 추출물의 질량 분석기 스캔을 나타낸다.

본 발명은 부분적으로 식물병원성 균주에 대항하는 유효성을 갖는 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주에 대한 것이며, 상기 식물병원성 곤충을 방제하는 상기 진균의 용도에 대한 것이다.

정의

"곤충병원성 활성(entomopathogenic activity)" 및 "곤충병원성 유효성(entomopathogenic efficacy)"이라는 구문은 여기서 상호 교환해서 사용하였으며, 특정 제제, 예컨대 특정 미생물의 1 이상의 식물병원성 곤충에 대항하는 활성을 나타낸다.

바람직하게, 상기 곤충병원성 유효성은 1 이상의 식물병원성 곤충을 사멸시키거나, 또는 이에 기생하여 무력화하고, 생식력을 없애고, 이의 성장을 지연시키는 능력이며, 바람직하게는 곤충과의 접촉 14 일 내, 보다 바람직하게는 7 일 내, 보다 바람직하게는 7 일 내에 1 이상의 식물병원성 곤층을 사멸시키는 능력이다.

여기서 사용하는 "생물학적 방제 제제(biological control agent)"(BCA)라는 용어는 1 이상의 식물병원체, 예컨대 식물병원성 곤충의 길항제로서 활성을 갖거나 또는 1 이상의 식물병원체를 방제할 수 있는 생물학적 제제이다. 길항 작용(antagonism)은 다수의 형태를 취할 수 있다. 하나의 형태로 생물학적 방제 제제는 간단하게 리펠런트(repellent)로서의 활성을 가질 수 있다. 또 다른 형태로 상기 생물학적 방제 제제는 식물병원체에 불리한 환경을 줄 수 있다. 추가의 바람직한 형태로 생물학적 방제 제제는 상기 식물병원체에 기생하고, 무력화하고, 생식력을 없애고, 이의 성장의 지연시키고, 및/또는 사멸시킬 수 있다. 따라서, 길항 작용의 메카니즘은 이에 제한하지는 않지만 항생 작용, 기생 생활, 불임 및 독성 효과를 포함한다. 따라서, 1 이상의 식물병원성 곤충의 길항제로서의 활성을 갖는 제제들은 곤충병원성 유효성을 갖는다고 말할 수 있다. 또한 식물병원성 곤충의 길항제인 제제는 곤충병원성 제제라고 말할 수 있다.

여기서 기재하고 있는 것과 같이, "생물학적 방제 조성물(biological control composition)"은 1 이상의 식물병원체의 길항제인 적어도 하나의 생물학적 방제 제제를 포함하거나 또는 함유하는 조성물이다. 상기 방제 제제는 이에 제한하지는 않지만 병원체를 무력화하고, 생식력을 없애고, 및/또는 사멸시키는 제제 및 병원체에 불리한 환경을 제공하는 제제, 리펠런트로서 활성을 갖는 제제를 포함한다.

따라서, 여기서 사용하는 것과 같이 "곤충병원성 조성물(entomopathogenic composition)"은 1 이상의 식물병원성 곤충의 길항제인 적어도 하나의 제제를 포함하거나 또는 함유하는 조성물이다. 상기 조성물은 여기서 곤충병원성 유효성을 갖는 것으로 생각한다.

본 명세서에서 사용하는 "포함하는(comprising)"이라는 용어는 "적어도 일부분으로서 구성하는(consisting at least in part of)"이라는 것을 의미한다. "포함하는(comprising)"이라는 용어를 포함하는 본 명세서에서 각 설명을 해석하는 경우, 상기 용어로 서문을 쓰는 것들 또는 그 이외의 특성들도 존재할 수 있다. 관련된 용어들, 예컨대 "포함한다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"는 동일한 방식으로 해석한다.

여기서 사용하는 것과 같은 "방제하다(control)" 또는 "방제하는(controlling)"이라는 용어는 일반적으로 식물병원체 감염을 예방하고, 감소시키고 또는 근절시키거나, 또는 상기 감염의 비율 및 정도를 억제하거나, 또는 식물 또는 이의 주위 내에 또는 식물 또는 이의 주위 상의 식물병원체 집단을 감소시키는 것을 포함하며, 상기 감염(들) 또는 집단(들)에서의 예방 또는 감소는 비처리된 감염(들) 또는 집단(들)에 대해서 통계적으로 현저하다. 요법(Curative treatment)도 또한 고려한다. 바람직하게 상기 방제는 식물병원체 집단에 대한 증가된 사멸율에 의해서 획득된다.

여기서 사용하는 "대사산물(metabolite)" 이라는 용어는 본 발명의 곤충병원성 진균에 의해서 분비, 방출 또는 생성되는 임의의 물질을 포함하는, 본 발명의 진균에 의해서 생성되는 임의의 물질, 또는 본 발명의 진균에서 발생하는 대사 반응에 참여하는 임의의 물질을 포함한다.

여기서 사용하는 "식물(plant)"이라는 용어는 뿌리, 잎, 꽃, 씨앗, 줄기, 유합 조직, 넛트와 과실, 구근, 덩이줄기, 구경, 곡물, 커팅스, 근경 또는 자근을 포함하는 식물 생성물뿐만 아니라 전체 식물 및 식물의 일부분, 커팅스도 포함하며, 성장 중의 예비-식물 및 채취시 또는 채취 후의 식물의 임의의 식물 물질도 포함된다. 본 발명의 이용에 유리할 수 있는 식물은 농업 및 원예 작물의 넓은 범위를 포함한다. 본 발명의 조성물은 또한 유기 제조 시스템의 적용에 특히 유리할 수 있다.

곤충병원성 제제에 대해, 가령 곤충병원성 진균 균주를 사용하는 경우, "곤충병원성 유효성의 보유(retaining entomopathogenic efficacy)"라는 구문, 및 이의 문법적으로 동등한 구문 및 이의 유도 구문은 제제가 여전히 유용한 곤충병원성 활성을 갖는 다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 바람직하게 보유 활성은 원래 활성의 적어도 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100 %이며, 유용한 범위는 상기 값들 중 임의의 값 사이(예를 들면 약 35 내지 약 100 %, 약 50 내지 약 100 %, 약 60 내지 약 100 %, 약 70 내지 약 100 %, 약 80 내지 약 100 % 및 약 90 내지 약 100 %)에서 선택될 수 있다. 예를 들면 본 발명에서 유용한 것은 특정된 균주의 규명 특성을 갖는 균주가 곤충병원성 활성을 보유해야 하며, 즉 규명된 균주의 곤충병원성 활성 중 적어도 약 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100 %를 보유해야 한다. 따라서, 뷰베리아 바시아나(B. bassiana) K4B3, 예컨대 뷰베리아 바시아나(B. bassiana) K4B3의 돌연체 또는 동족체의 규명 특성을 갖는 균주는 뷰베리아 바시아나(B. bassiana)의 곤충병원성 활성 중 적어도 약35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100 %를 보유해야 한다. 유사하게, 본 발명의 바람직한 조성물은 이들이 포함하는 곤충병원성 제제(들)의 유용한 곤충병원성 활성을 유지하는 것을 도울 수 있으며, 이상적으로는 여기서 포함되는 방법을 사용하여 도포하기까지 곤충병원성 활성을 보유하는 것으로 말할 수 있다.

본 발명의 조성물에 관해서 여기서 사용하는 "안정된(stable)"이라는 용어는 몇 주 동안, 바람직하게는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 바람직하게는 약 5, 보다 바람직하게는 약 6 개월 또는 그 이상 동안 곤충병원성 진균의 생존 능력을 지지할 수 있거나 또는 (예를 들면 곤충변원성 진균의 1 이상의 대사산물의) 곤충병원성 유효성을 지지할 수 있는 조성물을 의미한다.

특정 균주의 동족체 또는 돌연체를 포함하는 "[특정 균주(a specificed strain)]의 규명 특성을 갖는 균주(strain having the identifying characteristics)" 또는 "[특정 배양물(a specificed culture)]의 규명 특성을 갖는 배양물(culture having the identifying characteristics)"은 밀접하게 관련이 있으며(즉, 선조가 동일함) 또는 특정 균주로부터 유래되지만 일반적으로 1 이상의 유전자형 또는 표현형 특성에서 특정 균주와는 상이할 것이다. 돌연체는 일반적으로 유전적 상이함의 평가를 통해서 규명가능하다. 동족체는 예를 들면 분석, 예컨대 분지학을 포함하는 분류학상 방법을 사용 및 유전적, 생화학적 및 형태학적 차이 정도를 평가하여 규명할 수 있다. 그러나 특정 균주의 동족체 또는 돌연체의 (특정 균주의) 규명 특성을 갖는 균주는 곤충병원성 유효성을 보유할 것이며, 다른 박테리아성 균주와는 구별될 것이며, 및 여기서 기재하는 기술들을 사용하여 모 균주의 동족체 또는 돌연체로서 규명될 것이다.

본 발명의 진균, 방법 및 조성물에 대한 식물 피험체에 관련하여 사용하는 경우의 "주위(surroundings)"라는 용어는 토양, 물, 나뭇잎 리터(leaf litter) 및/또는 식물 또는 뿌리, 이의 덩이 줄기 등의 근처 또는 식물 또는 뿌리, 이의 덩이 줄기 등에 인접한 성장 매체(growth media), 인접한 식물들, 상기 식물의 커팅스, 서포트, 식물에 투여된 물 및 씨앗 코팅을 포함하는 코팅을 포함한다. 또한 저장, 포장 또는 처리 물질, 예컨대 보호 코팅재, 박스 및 커버, 및 식재, 유지 또는 수확 장비들을 포함한다.

식물병원체의 방제

본 발명은 예를 들면 미국, 뉴질랜드 및 유럽의 여러 나라들을 포함하는 여러 나라들의 원예 분야가 식물병원성 해충에 대항하는 증가된 살충 내성의 문제점에 직면한 것을 인식하였다. 상기는 조절 장벽 때문에 신규의 화학적 살충제의 유용성이 감소함으로써 몇몇 조절 방법 하에 혼합되었다.

생물학적 방제 제제로서의 곤충병원성 진균의 사용은 상기 문제의 해결책을 제공한다. 효과적인 생물학적 방제 제제는 표적 식물병원성 곤충 또는 곤충 집단을 무력화하거나 또는 사멸시키는 이들의 능력에 따라서 선택될 수 있다. 도움이 되는 조건하에서 식물병원성 곤충들, 예컨대 진딧물, 총채벌레 및 왕흰나방은 식물, 및 토양, 나뭇잎 리터, 인접한 식물들, 서포트 등을 포함하는 이들 주위를 감염시킬 수 있다. 곤충병원성 진균을 도포하여 식물병원성 곤충을 무력화시키거나 또는 사멸시켜 병원체의 질병 야기 능력을 막거나 또는 제한할 수 있다. 본 분야에서의 이러한 곤충병원성 진균의 유효성은 다양한 기후 조건, 예컨대 비연속적인 습식 기간 또는 건조 기간에서 생존할 수 있는 이들의 능력에 따라서 결국은 달라진다.

곤충병원성 진균의 수입이 흔히 문제가 되며, 많은 비용이 들고, 특정 조절 방법 하에 불가능하지 않다면 실행불가능하다. 예를 들면, 정해진 나라 밖에서 이용가능한 곤충병원성 진균은 그 나라 내에서 원예학자에 의해서 이용가능할 수 없으며, 조절 및 입법적인 방해때문이다. 따라서 본 발명은 광범위하게 다양한 환경적 조건하에서 잘 자랄 수 있는 균주를 규명하고 배양하는데 뚜렷한 이점들이 있다.

상기 진균의 분리물은 예를 들면 식물, 이들의 주위 및 상기 식물의 병원체를 포함하는 환경으로부터 편리하게 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 진균의 분리물은 상기 진균을 포함하는 조성물을 이후에 도포하는 표적 곤충 또는 식물 종(또는 주위)으로부터 수득될 수 있다.

상이한 매질 또는 다른 물질 상 및 상이한 온도를 포함하는 상이한 조건하에서의 상기 진균의 성장을 확인하기 위한 방법은 당업에 잘 공지되어 있다. 다양한 온도에서 성장시키기 위한 진균의 능력을 확인하는 방법의 예들이 특정 분리물이 특정 온도에서 사멸했는지 성장을 중단했는지 확인하기 위한 방법으로서, 여기에 기재되어 있다.

유사하게, 분리물이 특정 인공 배지 상에서 성장할 수 있는지를 밝히기 위한 방법이 여기에 예시되어 있다. 상기 방법의 사용은 분리물이 생물학적 방제 제제로서 사용하기 적당하게 되도록 하기 위한 효과적인 양으로 성장할 수 있도록 한다고 인식된다. 본 발명의 진균을 효과적인 양으로 성장시키는 방법은 추가로 여기에 기재되어 있다.

진균의 균주, 예를 들면 식물병원성 곤충에 대해 효과적이므로 본 발명에 따라 사용하기에 적당한 뷰베리아 균주는 균주 또는 상기 균주의 1 이상의 대사산물과 비교하는 방제 처리에 대해 통계적으로 효과적인 양에 의해서 표적 곤충 집단을 감소시키는데 효과적인 균주로서 규명된다. 이러한 균주는 곤충병원성 유효성을 갖는 것으로 생각할 수 있다. 여기서 기재하고 있는 것과 같이, 목표 곤충 집단의 감소는 다양한 길항적 메카니즘에 의한 것일 수 있다. 예를 들면 진균은 식물병원성 곤충에 기생하거나, 무력화하거나, 생식력을 없애거나 및/또는 바람직하게는 사멸시킬 수 있다. 상기 진균은 또한 환경, 예를 들면 진균을 도포하는 식물 또는 이의 주위를 식물병원성 곤충에 있어서 불리하도록 함으로써 목표 곤충의 집단을 감소시킬 수도 있다. 이러한 환경에서, 상기 진균은 리펠런트로서 활성을 갖고, 식물 또는 이의 주위의 근처에서 목표 곤충의 효과적인 집단을 감소시키는 것으로 생각할 수 있다.

바람직하게, 적당한 균주는 대조군 처리한 것과 비교해서 관련 곤충 종의 집단의 감소 퍼센트로서 표현하는 약 5 %의 곤충병원성 유효성, 적어도 약 10 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 25 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 35 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 45 %, 보다 바람직하게는 적어도 약 50 %의 곤충병원성 유효성을 나타낸다. 예시를 통해, 여기서 기재하는 방법은 다양한 표적 곤충에 효과적으로 대항하는 뷰베리아 분리물을 규명하기 위해 이용하였으며, 반면에 여기서 기재하는 것과 동일한 절차들은 다른 진균 및 곤충 종들에 대해서 이용할 수 있다.

곤충병원성 유효성은 생물학적 방제 제제로서 사용하기 위해 적당하다고 생각되는 분리물에 있어서의 주요한 필요한 요건이지만, 진균 분리물은 생물학적 방제 제제로서 사용하기 적당하도록 추가의 특성들을 가져야 한다.

예를 들면, 진균은 상당한 기간 동안 생존 형태로 저장될 수 있어야 하며, 최종적으로 생물학적 방제 제제로서 효과적인 형태 및 농도로 표적 식물 또는 이의 주위에 도포되도록 해야 한다.

진균은 또한 생물학적 방제 제제로서 사용하기 적당하게 되도록 식물 또는 이의 주위에 도포되는 경우 감염 한계점을 획득할 수 있어야 한다. 여기서 사용하는 것과 같이, 감염 한계점은 표적 식물 또는 이의 주위 상에 진균이 구축되어 곤충병원성 유효성을 가지도록 하기 위해 필요한 진균 농도를 나타낸다. 알 수 있 수 있는 바와 같이, 감염 한계점을 획득하기 위해서 몇몇 진균 분리물은 높은 비율로 적용하여 실행되지 않거나 또는 생존하지 않도록 하는 것이 필요하다. 또한 몇몇 진균 분리물은 도포하는 비율의 농도에도 불구하고 감염 한계점을 획득할 수 없다. 적당한 곤충병원성 진균은 1 헥타르 당 10¹⁰ 포자 이상의 비율로 도포되거나 또는 상기 조성물이 약 1 kg/1000L/헥타르 비율로 도포되는 경우의 조성물 1 mg 당 10⁷ 이상의 농도로 도포되는 경우 감염 한계점을 획득할 수 있다.

감염 한계점의 측정 방법은 당업에 잘 공지되어 있으며, 상기 방법의 예는 여기에 나타냈다. 특정 실시양태에서, 감염 한계점은 예를 들면 목표 식물, 이의 주의 및/또는 상기 식물의 병원체로부터 수득되는 1 이상의 샘플을 분석하고, 상기 샘플 상 또는 샘플 내의 진균의 존재 또는 진균의 양을 측정하여 직접적으로 결정할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 감염 한계점은 예를 들면 1 이상의 식물병원성 곤충 집단에서의 감소를 관찰하여 간접적으로 결정할 수 있다. 상기 방법들을 결합한 방법도 또한 포함된다.

뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana)는 예를 들면 메뚜기(grasshoppers), 진딧물, 총채벌레, 나방 및 몇몇 다른 종들을 포함하는 유충 및 성충 곤충 둘 다를 공격하는 토양계 진균이다. 통상적으로 뷰베리아 바시니아(B. bassiana)는 곤충 사체, 예컨대 진딧물, 천곤충 및 총채벌레로부터 분리할 수 있으며, 토양으로부터도 분리할 수 있다. 본 발명의 곤충병원성 뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana) 균주 K4B3은 하기에 보다 상세하게 기재하였다.

마이셀리움(Mycelium): MEA 상에서 용이하게 성장한다. 콜로니는 일반적으로 가장자리가 백색이며, 크림색에서 밝은 노란색으로 변한다. 아주 가끔은 불그스름하다. 마이셀리움 탈루스(mycelium thallus)의 아랫면은 레드 블러시 색소가 아가로 물든다.

분생포자병(Conidiophores): 균사로부터 일어나 풍부해진다. 추가의 코니디오제너스 세포(conidiogenous cells)로 증가하도록 나뉠 수 있는 클러스터화 코니디오제너스 세포 3-6x 3-5μm의 군을 함유하는 1-2 um 폭, 1 um 폭으로 20 um 길이로 적층되어 잘 생성된 플라스크 모양의 공 형태, 1 um 폭 까지의 이 모양의 돌기를 갖는 굽은 모양임.

분생포자(Conidia): 2-3x 2-2.5μm의 투명한 구형 분생포자. 소수성. 아가 상에서 군집형태로 나타나는 윤기가 없는 과립. 아가 상에 K4B3은 집괴 과립 집합체를 생성함. 포자 집합체의 색상은 성숙 단계에서 색상이 짙은 거의 무지개빛 노랑색으로 변화함. 수중 배양물에서의 K4B3의 도입으로 강한 붉은색 및 자극성의 금속성 악취를 생성함.

뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B3는 사멸한 매미 번데기(cicada pupae) 군으로부터 분리하였다. 상기 분리물을 수득하기 위해 이용한 분리 및 선별 공정의 상세한 설명은 실시에에서 나타냈다. 상기 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2008년 9월 23일에 호주 뉴사우스 웨일스 핌블 수아킨 스트리트 1의 호주 국가 측정 기관(National Measurement Institute of Australia, NMIA, 이전에는 Australian Government Analytical Laboratories (AGAL)임)에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 V08/025855로 부여되었다.

따라서, 하나의 측면에서 본 발명은 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) 균주 K4B3, 즉 NMIA 번호 V08/025855의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다. 유사하게 균주 K4B3, 즉 NMIA 번호 V08/025855의 규명 특성을 갖는 뷰베리아(Beauveria)를 제공한다.

뷰베리아 바시니아(B. bassiana) 균주 K4B3는 특히 효과적인 생물학적 방제 제제이며, 비연속적 습식 기간, 건조 기간에 생존 및 콜로니화할 수 있으며, 이에 제한하지는 않지만 본 분야에서 진딧물, 애벌레, 왕흰나방, 나방, 바로아 응애, 매미 및 총채벌레와 같은 식물병원성 곤충을 사멸 및 무력화시킬 수 있다. 뷰베리아 바시니아(Beauveha bassiana)의 상기 분리물에 의한 출아 포자 및 콘디알(condial) 조성물을 사용하여 왕흰나방, 총채벌레 및 진딧물을 사멸시키는 정도는 일반적으로 재배자에 의해 이용되는 통상적으로 사용하는 살충제 만큼 양호하다. 그러나 곤충, 예를 들면 왕흰나방 및 진딧물에 의한 이러한 살충제에 대한 내성은 원예 산업에서 가장 큰 위협이 되었다.

예를 들면 서양꽃 총채벌레의 국외 집단은 대부분의 살충제 군에 대해 내성이 있다. 하기의 살충제는 24 시간 생물학적 정량으로 방제에 부적절하다: 아세페이트, 아바멕틴, 클로르피리포스, 엔도설판, 메토밀, 메티카르브, 오메토에이트, 피라조포스 및 타우-플루발리네이트.

뉴질랜드에서는 델타메트린에 대한 내성이 북쪽 및 남쪽 섬에서의 파총채벌레에 존재하지만 디아지논 및 디클로르보스에 대한 내성은 단지 오크랜드 근처에서만 발견되었다(Martin 등이 준비). 파총채벌레는 미국에서 많은 살충제에 대한 내성이 있는 것으로 보고되었지만 합성 피레스로이드(synthetic pyrethroids)에 대해서는 여전히 민감한 것으로 보고되었다(Grossman 1994).

켈리의 감귤 총채벌레(Kelly's citrus thrips) 중의 클로르피리포스에 대한 내성은 남 호주에서 보고되었다(Purvis 2002).

부프로페진(buprofezin)에 대한 온실 왕흰나방의 살충제 내성이 가장 최근이긴 하지만 확인되었음이 보고되었다(Workman & Martin 1995). 국외 온실 왕흰나방은 유기염소, 유기인, 카바메이트 및 피레스로이드계 살충제에 대한 내성이 생성되었다(예를 들면 Georghiou 1981, Anis & Brennan 1982, Elhag & Horn 1983, Wardlow 1985, 및 Hommes 1986). 내성은 또한 새로운 살충제, 즉 부프로페진 및 테플루벤주론(buprofezin and teflubenzuron)에서도 발견되었다(Gorman 등 2000).

따라서 많은 식물 병원성 곤충이 다수의 살충제에 대한 내성이 개발되었으며; 상기 및 다른 예로서 본 발명에 따라 선택된 뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana) 분리물은 곤충 대조군에서 효과적인 대안물을 제공한다. 뷰베리아 바시니아 K4B3 또는 이의 1 이상의 대사산물에 의해 유도되는 식물 병원성의 관찰의 부재와 결합한 식물 질명의 제어에서의 이러한 잠재적인 활성은 상기 분리물이 생물학적 방제 제제로서 사용하기 위해 목적하는 특성을 가진다는 것을 설명한다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3는 1 이상의 대사산물이 곤충병원성 제제인 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물을 제조하기 위해서 사용할 수 있다.

상술한 바와 같이, 좋은 조건 하에서 성장시키는 경우 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3의 마이셀리움은 불그스레하며, 아가 상에서 성장시키는 경우 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3는 레드 색소가 아가로 스며든다. 유사하게, 실시예 1에서 설명하고 있는 것과 같이, 수중 배지에서 성장하는 경우 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3는 강한 붉은 색상과 자극적 금속성 악취를 생성하며, 1 이상의 독성 대사산물이 배지 용액으로 스며든다. 1 이상의 독성 대사산물을 포함하는 조성물은 특별히 여기에서 고려하였다. 하나의 대표적인 조성물은 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3가 성장 또는 유지되며, 이후에 배지에서 제거되거나 또는 제거되지 않는 배지를 포함한다. 추가의 대표적인 조성물은 도 2에서 도시하는 질량 분석기 프로파일 특성을 가지며 뷰베리아 바시니아 K4B3이 성장 또는 유지되는 배지 추출물 또는 뷰베리아 바시니아 K4B3이 성장 또는 유지되는 배지이다.

따라서, 본 발명은 뷰베리아 바시니아 K4B3의 1 이상의 대사산물 및 특히 뷰베리아 바시니아 K4B3의 1 이상의 분비 대사산물을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.

하나의 실시양태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 대사산물의 제조에 적당한 조건 하에서 뷰베리아 바시니아 K4B3 V08/025855의 배양을 유지하는 단계; 및 뷰베리아 바시니아 K4B3 V08/025855로부터의 적어도 하나의 대사산물을 분리하는 단계를 포함한다.

하나의 실시양태에서, 상기 조성물은 뷰베리신, 뷰베리신-F 및 바시아놀리드 중 1 이상, 바람직하게는 뷰베리신, 뷰베리신-F 및 바시아놀리드 중 두개 이상을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 조성물은 뷰베리신, 뷰베리신-F 및 바시아놀리드를 포함하는 합성 조성물이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 약 1 mgL^-1 이하의 뷰베리신, 약 0.5 mgL^-1 이하의 뷰베리신, 약 0.1 mgL^-1 이하의 뷰베리신, 약 0.05 mgL^-1 이하의 뷰베리신, 약 0.01 mgL^-1 이하의 뷰베리신, 약 0.005 mgL^-1 이하의 뷰베리신, 약 0.001 mgL^-1 이하의 뷰베리신, 약 0.0005 mgL^-1 이하의 뷰베리신 또는 약 0.0001 mgL^-1 이하의 뷰베리신을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 약 1 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F, 약 0.5 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F, 약 0.1 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F, 약 0.05 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F, 약 0.01 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F, 약 0.005 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F, 약 0.001 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F, 약 0.0005 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F 또는 약 0.0001 mgL^-1 이하의 뷰베리신-F을 포함한다.

본 발명의 뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana) 균주 K4B3는 단독으로 사용하거나 또는 여기서 기재하는 다른 곤충병원성 진균과 결합하여 사용할 수 있다. 다른 곤충병원성 진균의 예로는 하기에 보다 상세하게 기재하였다.

뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana) 균주 K4B1은 뉴질랜드 봄베이의 소나무 숲 내의 유충 천공충(borer larva)에서 분리하였다. 상기 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2005년 3월 16일에 호주 뉴사우스 웨일스 핌블 수아킨 스트리트 1의 호주 국가 측정 기관에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 NM05/44595로 부여되었다.

뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana) 분리물 K4B1는 총채벌레 성충을 선호하는 것으로 나타났으며, 또한 총채벌레 유생 및 번데기, 진딧물 및 왕흰나방에 대한 병원성이 있다. K4B1의 분생포자는 크림 집합체를 형성한다.

뷰베리아 바시니아 분리물 K4B2는 뉴질랜드 아카아카 플래이츠(Aka Aka flats)에서 해바라기의 레피돕테라 애벌레(Lepidoptera caterpillar)로부터 분리하였다. 상기 뷰베리아 바시니아 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2006년 3월 3일에 호주 국가 측정 기관에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 NM06/00010으로 부여되었다.

뷰베리아 바시니아 분리물 K4B2는 대두 자벌레 애벌레(soybean looper caterpillar) 및 백색 나비 및 아미 웜 애벌레(army worm caterpillar)를 포함하는 애벌레를 선호하는 것으로 나타났다. 상기 분리물은 또한 총채벌레 유생, 성충 및 번데기, 진딧물 및 왕흰나방에 병원성이 있다. K4B2의 분생포자는 노란색의 윤기가 없는 집합체를 형성한다.

뷰베리아 바시니아의 NMIA 번호 NM05/44595, NMIA 번호 NM06/00010 및 기타 적당한 분리물은 본 발명의 뷰베리아 바시니아 K4B3과 결합하여, 또는 뷰베리아 바시니아 K4B3의 1 이상의 대사산물과 결합하여 사용할 수 있으며, 특히 생물학적 방제 제제로서 효과적이라서 비연속적 습식 기간 및 건조 중에 생존 및 콜로니화할 수 있으며, 이에 제한하지는 않지만 본 분야에서의 진딧물, 애벌레, 왕흰나방, 나방, 바로아 응애 및 총채벌레와 같은 식물병원성 곤충을 무력화 및 사멸시킬 수 있다. 뷰베리아 바시니아의 이러한 분리물에 의한 왕흰나방, 총채벌레 및 진딧물의 사멸 정도는 일반적으로 상기에서 기재한 통상적으로 사용되는 살충제 만큰 양호하다. 이러한 살충제에 대한 내성이 발생되었다: 상기 및 다른 예에서 본 발명에 따라 분리된 뷰베리아 바시니아 분리물은 곤충 방제를 위한 효과적인 대안물을 제공한다. 뷰베리아 바시니아에 의해 유도된 식물 병원성의 관찰의 부재와 결합하여 식물 질병의 방제에서의 이러한 잠재적인 활성으로 이러한 종들의 분리물이 생물학적 방제 제제로서 사용하기에 바람직한 속성을 가진다는 것을 설명한다.

레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium)은 동시류 곤충 및 다른 절지동물 군을 포함하는 넓은 숙주 범위를 갖는 곤충병원성 진균이다. 레카니실리움 무스카리움(L. muscarium)은 다양한 형태 및 생화학적 특성을 갖는 분리물을 포함하는 종 복합체라고 생각된다. 통상적으로 레카니실리움 무스카리움(L. muscarium)은 곤충 사체, 예컨대 진딧물, 총채벌레, 왕흰나방 및 기루깍지 벌레(mealy bugs)로부터 분리할 수 있으며, 토양으로부터도 또한 분리할 수 있다.

분리물은 하기와 같은 규명 특성들을 갖는다:

마이셀리움: 포테이토 덱스트로스 아가(PDA), 말트 추출물 아가(MEA) 또는 오트밀 아가(OA) 상의 콜로니는 흐리거나 또는 짙은 노랑색의 반대쪽의 무색을 갖는 백색, 크림색, 얇고, 솜털 같다.

분생포자병: 필라리드(phialides)가 마이셀리움으로부터 단독으로 또는 직접적으로 형성되며, 영양 마이셀리움과 아주 같은 3 또는 4개의 똑바로 선 분생포자병의 나선형이다. 필라리드는 배양 균주 및 배양 나이 둘 다에 따라 달라지는 가변적 크기의 허약한 것이다. 크기 범위는 8.5- 16x 0.8-1.2μm 내지 30-4Ox 2-2.2μm이다.

분생포자: 단독으로 생성되고, 점액질 매트릭스에서 필라리드에 정통하게 헤드 상에서 응집된다. 둥근 끝을 갖는 타원체 및 원통체는 2.3-3.4x 1-1.3μm 내지 7.2-1Ox 2.1-2.6μm의 균주와 함께 크기가 다양하다. 출아 포자는 수중 배지에서 생성된다. 친수성이다.

레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1는 뉴질랜드의 푸케코에에서 온실 감자 작물 중의 왕흰나방로부터 분리하였다. 상기 레카니실리움 무스카리움(L. muscarium) 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2005년 3월 16일에 호주 국가 측정 기관에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 NM05/44593으로 부여되었다.

K4V1는 추가의 규명 특성을 갖는다: 왕흰나방 스케일 상의 60 % 분생포자 1.0x1.0 미크론, 총채벌레 약충(nymphs) 상의 30 % 분생포자 2.0x1.0 미크론, 총채벌레 번데기 상의 10 % 분생포자 2.5x1.3 미크론. 마이셀리움 탈루스(mycelium thallus)의 아랫면은 드물게 주름이 있으며, 마이셀리움 탈루스는 아가로부터 아주 용이하게 제거된다.

레카니실리움 무스카리움(L. muscarium) 균주 K4V2는 뉴질랜드 루아카카에서 온실 오이 중 왕흰나방에서 분리하였다. 상기 레카니실리움 무스카리움(L. muscarium) 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2005년 3월 16일에 호주 국가 측정 기관에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 NM05/44594로 부여되었다.

K4V2는 추가의 규명 특성을 갖는다: 50 % 분생포자 2.0 x 1.5μm, 30 % 분생포자 2.0 x l.Oμm, 20 % 분생포자 1.0 x l .Oμm, 왕흰나방 성충에 병원성, 진딧물에 백색 출아 포자 병원성. 마이셀리움 탈루스(mycelium thallus)의 아랫면은 빈번하게 주름이 있으며, 마이셀리움 탈루스는 아가 표면로부터 제거하기 어렵다.

레카니실리움 무스카리움(L. muscarium) 균주 K4V4는 외부 유기 타마릴로 작물로부터 분리하였다. 상기 레카니실리움 무스카리움(L. muscarium) 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2006년 3월 3일에 호주 국가 측정 기관에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 NM06/00007로 부여되었다.

K4V4는 추가의 규명 특성을 갖는다: 50 % 분생포자 1.0 x0.5μm, 왕흰나방 스케일 및 성충에 병원성, 낮은 습도 65-75 % 및 고온 28-32°에서는 응집력이 강함. 일반적으로 v.l > 75 %. 50 % 콘디디아 0.5 x 0.5μm. 마이셀리움 탈루스(mycelium thallus)의 아랫면은 드물게 주름이 있으며, 마이셀리움 탈루스는 배지에서 커스터드 노랑색에서 오랜지 색소로 확산된다.

레카니실리움 무스카리움의 NMIA 번호 NM05/44593, NMIA 번호 NM05/44594, NMIA 번호 NM06/00007 및 다른 적당한 분리물은 본 발명의 뷰베리아 바시니아 K4B3 균주와 결합하여, 또는 뷰베리아 바시니아 K4B3의 1 이상의 대사산물과 결합하여 사용할 수 있으며, 특히 효과적인 생물학적 활성을 가져, 특히 비연속적 습식 기간 및 건조에서 생존 및 콜로니화할 수 있으며, 에이 제한하지는 않지만 본 분야에서 진딧물, 왕흰나방, 가루깍지 벌레, 바로아 응애 및 총채벌레와 같은 병원성 곤충을 무력화 및 사멸시킬 수 있다. 이러한 레카니실리움 무스카리움의 분리물에 의한 왕흰나방, 총채벌레 및 진딧물의 사멸 정도는 일반적으로 상기에서 기재한 것과 같은 통상적으로 사용되는 살충제 만큼 양호하다. 이러한 살충제에 대한 내성이 생성되었다: 상기 및 다른 예에서, 본 발명에 따라 선택된 레카니실리움 무스카리움(L. muscarium)은 곤충 방제이 있어서 효과적인 대안물을 제공한다. 레카니실리움 무스카리움에 의해 유도되는 식물 병원성의 관찰의 부재와 결합된 식물 질병의 방제에 있어서의 이러한 잠재적인 활성은 이러한 종들의 분리물이 생물학적 방제 제제로서 사용하기에 바람직한 속성을 가진다는 것을 보여준다.

레카니실리움 론기스포룸(Lecanicillium longisporum)은 특히 진딧물에 병원성이 있는 곤충병원성 진균이다. 레카니실리움 론기스포룸(Lecanicillium longisporum) 균주 KT4L1는 뉴질랜드 오클랜드 프랜클린의 보리순 뱅커 식물(Barley grass Banker plants)에서의 진딧물로부터 분리하였다. 상기 레카니실리움 론기스포룸(L. longisporum) 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2006년 3월 3일에 호주 국가 측정 기관에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 NM06/00009로 부여되었다.

상기 분리물 KT4L1는 하기 규명 특성을 갖는다: 100 % 콘디디아 6.0 x 2.1 μm, 마이셀리움 탈루스(Mycelium thallus)는 오프화이트에서 노랑색이며, 일관성있는 덩어리로서 설명할 수 있는 매우 거칠게 성장한다. 마이셀리움 탈루스는 밝은 래드 브라운 컬러를 아가로 확산시킨다.

엘. 론기스포룸(L. longisporum)의 NMIA 번호 NM06/00009 및 기타 적당한 분리물은 본 발명의 뷰베리아 바시니아 K4B3 균주와 결합하거나 또는 뷰베리아 바시니아 K4B3의 1 이상의 대사산물과 결합하여 사용할 수 있으며, 특히 효과적인 생물학적 활성을 가져, 비연속적 습식 기간 및 건조에서 생존 및 콜로니화할 수 있으며, 이에 제한하지는 않지만 본 분야에서의 진딧물과 같은 병원성 곤충을 무력화 및 사멸시킬 수 있다. 레카니실리움 무스카리움의 이러한 분리물에 의한 출아 포자 또는 콘디알 조성물을 사용함으로써의 진딧물의 사멸 정도는 일반적으로 재배자가 사용하는 통상적으로 이용되는 살충제의 것 만큼 양호하다.

상기에서 언급한 것과 같이, 여러 식물 병원성 곤충들은 다수의 살충제에 내성이 나타났다: 상기 및 다른 예에서, 본 발명에 따라 선택되는 레카니실리움 무스카리움 분리물은 곤충 방제에 있어서 효과적인 대안물을 제공한다. 레카니실리움 무스카리움에 의해 유도되는 식물 병원성의 관찰의 부재와 결합하여 식물 질병의 방제에 있어서의 이러한 잠재적인 활성은 이러한 종들의 분리물이 생물학적 방제 제제로서 사용하기 바람직한 속성을 갖는 것을 보여준다.

패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus)는 감염된 및 사멸 곤충, 및 몇몇 토양에서 발견되는 곤충병원성 진균이다. 패실로마이세스 푸모소로세우스(P. fumosoroseus)는 왕흰나방, 총채벌레 및 진딧물, 및 애벌레를 감염시킨다.

상기 요구사항을 만족시키는 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus)의 K4P1 균주는 뉴질랜드 런시맨의 양배추에 존재하는 다이아몬드 백 나방 애벌레(Diamond Back Moth caterpillar)에서 분리하였다. 상기 패실로마이세스 푸모소로세우스(P. fumosoroseus) 분리물은 특허 절차의 목적으로 부다페스트 조약에 따라 2006년 3월 3일에 호주 국가 측정 기관에 수탁하였다. 상기 분리물은 수탁 번호 NM06/00008로 부여되었다.

패실로마이세스 푸모소로세우스(P. fumosoroseus) 균주 K4P1은 하기의 규명 특성을 갖는다:

곤충에서의 성장: 단순한 모노네마투스 코니디오포러스 또는 분명하지만 느슨한 시네마타(simple mononematous conidiophores or distinct but loose synnemata)를 생성함. 상기 세네마타는 3 cm 길이까지 똑 바로 서 있으며, 가지를 쳐서 분생포자를 갖는 더스티(dusty)가 나타난다.

아가에서의 성장: 말트 아가 (MA) 및 PDA 상에서, 성장은 14 일 동안 4-8 cm 상온 (25 ℃)에서 적당하게 신속하며, 규칙적으로 또는 불규칙적으로 올른 양모같이 지나치게 성장한 기초가 되는 필트와 함께이며, 또는 연하며, 윤기가 없으며 및 과립일 수 있고, 첫번째로 분리하는 경우에는 분말인 뚜렷한 코레미아(Coremia)를 생성한다. 첫번째는 백색으로 남아있거나 또는 시간이 지나면 틴지드 회색이 될 수 있는 핑크 음영으로 변화한다.

영양 균사: 매끄러운 벽이 있는 히알린, 직경 1-5 - 3.5 μm.

코니디알 구조: 기초가 되는 펠트 또는 공중 포자로부터 일어선 똑바로 선 분생포자병로 구성되는 복합체인 경향이 있음.

분생포자병: 단독으로 또는 함께 생성되어 100 μm 길이 x 1.5-2 (3) μm 직경까지의 시네마타를 형성함. 매끄러운 벽이 있는 히알린은 윤생체 가지를 함유하며, 결국 3-6 피아리드의 나선형을 함유하며, 가지와 동일한 수준 및 동일한 윤생체로 생성되는 비정기적인 피아리드를 함유한다. 때때로 윤생 패턴이 깨지며, 단일 가지들은 코니디오포레 상에서 불규칙적으로 생성된다.

피라리드(Phialides): 약 0.5 μm 직경의 길고 얇은 넥으로 끝이 점점 가늘어지는 부푼 베이스와 함께 5-7 x 2.5 (3) μm임.

분생포자: 때때로 5μm 길이까지이며 2-4 x l-2μm의 사슬로 지탱되는 끝이 둥글며, 매끄러운 히알린이 있는 방추 모양의 원통형임.

곤충 상에서 코니디오제너스 장치(conidiogenous apparatus)는 3.5-6 x 1-2.5 μm로 약간 짧고 보다 둥근, 가지 및 부푼 피아리드로 보다 컴팩트하게 되어 있는 경향이 있다. 배양 중에서와 같은 분생포자.

패실로마이세스 푸모소로세우스(P. fumosoroseus)의 NMIA 번호 NM06/00008 및 기타 적당한 분리물은 본 발명의 뷰베리아 바시니아 K4B3 균주와 결합하거나 또는 뷰베리아 바시니아 K4B3의 1 이상의 대사산물과 결합하여 사용할 수 있으며, 특히 생물학적 방제 제제로 효과적이어서, 비연속적 습식 기간 및 건조에서 생존 및 콜로니화할 수 있으며, 이에 제한하지는 않지만 본 분야의 왕흰나방, 바로아 응애 및 레피돕테라 애벌래와 같은 병원성 곤충을 무력화 및 사멸시킬 수 있다. 왕흰나방, 바로아 응애, 및 총채벌레 및 진딧물의 패실로마이세스 푸모소로세우스의 상기 분리물에 의한 출아 포자 또는 코디알 조성물을 사용함으로써의 사멸 정도는 일반적으로 재배자가 사용하는 통상적으로 사용되는 살충제 만큼 양호하다.

상기에서 기재한 것과 같이, 여러 식물 병원성 곤충은 다수의 살충제에 대한 내성이 생겼다: 상기 및 다른 예에서 본 발명에 따라 선택된 패실로마이세스 푸모소로세우스 분리물은 곤충 방제에 있어서 효과적인 대안물을 제공한다. 패실로마이세스 푸모소로세우스에 의해 유도된 식물 관찰의 부재와 결합한 식물 질병의 방제에서의 이러한 잠재적인 활성은 이러한 종들의 분리물들이 생물학적 방제 제제로서 사용하기 바람직한 속성을 갖는다는 것을 설명한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 담체와 함께, 선택적으로 1 이상의 기타 곤충병원성 진균과 함께 뷰베리아 바세니아 K4B3 또는 뷰베리아 바세니아 K4B3의 1 이상의 대사산물을 포함하거나 또는 부베리아 바세니아 K4B3 및 부베리아 바세니아 K4B3 중 1 이상 둘 다를 포함한다.

상기 조성물은 곤충병원성 진균의 복수의 진균을 포함할 수 있으며, 특정 실시양태에서, 복수의 균주는 다수의 식물병원성 종들, 또는 다수의 상이한 발달 단계의 단일 식물병원체 또는 실제로 이들의 결합물을 목표로하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들면, 식물병원성 곤충의 번데기 형태는 하나의 진균 균주를 목표로할 수 있으며, 반면에 식물병원성 곤충의 성충 형태는 또 다른 진균 균주를 목표로 할 수 있고, 상기 두개의 균주는 본 발명의 조성물에 포함된다. 다른 실시양태에서, 3가지 균주 또는 그 이하가 바람직할 것이며, 흔히 단일 균주가 바람직하다.

적당하게, 상기 조성물은 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NMIA 가입 번호 NM05/44593) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2 (NMIA 가입 번호 NM05/44594) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V4 (NMIA 가입 번호 NM06/00007) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana) 균주 K4B1 (NMIA 가입 번호 NM05/44595) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시니아(Beauveria bassiana) 균주 K4B2 (NMIA 가입 번호 NM06/00010) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론기스포룸(Lecanicillium longisporum) 균주 KT4L1 (NMIA 가입 번호 NM06/00009) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus) 균주 K4P1 (NMIA 가입 번호 NM06/00008) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 진균을 포함한다.

특히 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3 및 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NM05/44593) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물, 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3 및 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2 (NM05/44594) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물, 및 뷰베리시아 바시니아(B. bassiana) K4B3 및 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NM05/44593) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물, 및 뷰베리아 바시니아(B. bassiana) K4B3 및 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2 (NM05/44594) 또는 이의 규명 특성을 갖는 균주의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

곤충병원성 진균을 포함하는 조성물의 예는 당업에 잘 공지되어 있으며, 이의 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 각각 포함되어 있는, 예를 들면 Mycotech Corporation의 WO95/10597 (PCT/US94/11542로 공개), The Secretary of Agriculture의 대표되는 것으로서 미국의 WO2003/043417 (PCT/US2002/037218 공개됨), McCabe 등의 US 특허 번호 4,530,834 및 Wright 등의 미국 특허 출원 번호 10/657,982 (US 2004/0047841로 공개)에 기재된 것들을 포함한다.

식물 또는 이의 주위에 응용하기 적당한 것으로서, 상기 적어도 하나의 담체는 농업적으로 허용가능한 담체이며, 보다 바람직하게는 충전 자극제, 고화방지제, 습윤제, 유화제 및 산화방지제로 이루어진 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 조성물은 충전 자극제, 고화방지제, 습윤제, 유화제 및 산화방지제 각각 중 적어도 하나를 포함한다. 바람직하게, 상기 충전 충진제는 카보하이드레이트 공급원, 예컨대 예를 들면 슈크로스, 프락토스, 글루코스 또는 덱스트로스를 포함하는 디사카라이드이며, 상기 고화방지제는 탈크, 실리콘 디옥사이드, 칼슘 실리케이트 또는 카올린 클레이로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 습윤제는 탈지유 분말이며, 상기 유화제는 대두계 유화제, 예컨대 레시틴 또는 식물계 유화제, 예컨대 모노디글리세라이드이며, 및 상기 산화방지제는 소듐 글루타메이트 또는 시트르산이다. 그러나, 진균 생존력을 지지하기 위한 조성물의 능력이 유지되는 것으로서 당업에 잘 공지되어 있는 기타 예들로 대체될 수 있다.

바람직하게, 상기 조성물은 생물학적 방제 조성물이다. 생물학적 방제 제제로서 유효하도록 요구되는 조성물내 존재하는 본 발명의 곤충병원성 진균의 농도 및 이의 1 이상의 대사산물은 최종 용도에 따라 가변될 수 있고, 식물의 생리학적 상태; 타입(곤충 종을 포함함), 병원체 감염의 정도 및 농도, 계절, 습도, 식물의 연령 및 성장 시기에서 단계; 종래 살충제 또는 사용되는 다른 처리법(살진균제를 포함함)의 수 및 타입; 및 식물 처리법[가령, 디리핑(deleafing) 및 프루닝(pruning)]이 상기 조성물을 제제화하는데 모두 고려될 수 있다.

상기 조성물에 생물학적 방제 제제가 존재하는 경우 생물학적 방제 제제로서 사용하기 위해, 본 발명의 곤충병원성 진균은 재현적으로 생육가능한 형태이어야 한다. 본원 명세서에서 사용되는 용어인 재현적으로 생육가능한(reproductively viable)이라는 표현은 진균의 균사(mycelial) 및 포자(spore) 형태를 포함한다. 예를 들면, 대부분의 목적을 위해서, 진균성 균주는 포자의 형태[분생포자(conidia) 또는 내생포자(blastospore)]로 조성물로 바람직하게 포함된다. 포자는 본 발명의 모든 진균성 균주로부터 수득가능하며, 당분야의 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 본 발명의 진균성 균주로부터 수득되는 포자는 본 발명의 부가의 측면을 형성한다. 상기 조성물에서 진균성 포자의 농도는 조성물이 사용될 용도에 의존할 것이다. 전형적인 농도 범위는 약 1 x 10⁶ - 1 x 10¹² 포자/ml, 바람직하게 약 1 x 10⁷ - 2 x 10¹⁰, 더 바람직하게 1 x 10⁷ - 1 x 10⁸ 포자/ml이다.

이론적으로, 하나의 감염성 유닛(infective unit)은 숙주를 감염시키는데 충분하지만, 그러나 실제 상황에서는 감염성 유닛의 최소치는 감염을 개시하기 위해 요구된다. 화학적 살충제로 규칙적으로 사용된 치사량(lethal dose, LD)의 개념은 곤충병원성 효율이 곤충병원성 진균에 의해 둘러싸인 것 또는 식물의 콜로리화(colonisation)에 의존하는 미생물 살충제에 적당하지 않다. 감염량(infective dose, ID) 또는 감염성 농도(infective concentration, IC)의 개념이 더 정확하게 적용가능하다. ID 또는 IC는 사멸에 이르는 병원체에 노출된 감염성 유닛의 수 또는 감염을 개시하는데 요구되는 감염성 유닛의 실제 수를 나타낸다. 그러므로, 병원체에 대항하는 필드 또는 온실에 사용되는 감염성 유닛의 수는 제어 정도에 영향을 줄 것이다. 해충(pest)에 양호한 방제를 수득하기 위해 항-식물병원성 박테리아(anti-phytopathogenic bacteria)의 목적하는 농도, 적당한 장소 및 정확한 시간을 적용하는 것이 중요하다: 상기는 "감염 역치(infection threshold)"로 알려져 있다.

사용을 위해 제제화된 조성물에서 진균성 포자의 농도는 예를들면 저장 중에 제제화된 조성물에서의 진균성 포자의 농도보다 더 적을 수 있다는 것은 명백할 것이다. 본 출원인은 본 발명의 곤충병원성 진균에 의해서 감염 역치는 헥타아르(hectare) 당 약 1 L의 비율로 적용될 때 분무가능한 용액 1 ml당 약 10⁷ 포자에서 나타나는 것으로 측정하였다. 따라서, 하나의 예에서, 사용을 위해 제제화된 조성물은 바람직하게 ml 당 적어도 약 10⁷ 포자의 농도를 가질 것이다. 또다른 예에서, 보관을 위해서 제제화된 조성물(예를 들면, 사용에 적당한 조성물로 제제 가능한 습식성 분말과 같은 조성물)은 바람직하게 그람당 약 10¹⁰ 포자의 농도를 가질 것이다. 보관을 위해 제제화된 조성물의 포자 농도 및 사용에 적당한 조성물로의 제제화는 사용을 위한 상기 조성물이 감염 역치에 도달하기 위해 적용될 수 있도록 충분히 농축될 수 있도록 충족되어야 한다.

바람직하게, 상기 조성물은 약 2주 이상, 바람직하게 약 1달 이상, 약 2달 이상, 약 3달 이상, 약 4달 이상, 약 5달 이상, 더 바람직하게는 약 6달 이상동안 곤충병원성 유효성(예를 들면, 1 이상의 대사산물) 또는 진균의 재현적으로 생육가능성을 지지할 수 있는 안정한 조성물이다. 생물학적 방제 조성물로서 사용하기에 적당하기 위해서, 상기 조성물은 약 6달 이상 동안 곤충병원성 유효성 또는 진균의 재현적으로 생육가능성을 지지할 수 있다.

당분야에 잘 공지되어 있는 종래의 고체 기질 및 액체 발효 기술을 사용하여, 본 발명의 곤충병원성 진균이 생물학적 방제 제제로서 사용되도록 충분한 양에서 성장될 수 있다. 예를 들면, 선택된 균주로부터 유래된 포자는 박막 수경(nutrient film), 액중 배양(submerged culture) 및 쌀 기질 성장(rice substrate growing) 기술을 사용하여 필드용으로 벌크로 생성될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 진균의 대사산물이 상기 성장 기술을 사용하여 충분한 양으로 생성될 수 있으며, 전형적인 기술은 본원 명세서에서 실시예에 나타내었다. 성장은 생물체의 성장을 위해 만족하는 특정 온도에서 호기성 조건하에 일반적으로 실시된다. 예를 들면, 비. 바시아나(B. bassiana)에 있어서, 10-30 ℃, 바람직하게는 25-30 ℃, 가장 바람직하게 23 ℃의 온도범위가 바람직하다. 성장 배지의 pH는 약간 산성 내지 중성이며, 즉 약 5.0-7.0, 가장 바람직하게는 5.5이다. 배양 시간은 정체 성장 단계(stationary growth phase), 23 ℃에서 배양할 때 약 21일에 도달하기 위해 분리에 충분하며, 보통의 광주기에서 나타날 것이다.

상기 포자는 당분야에 공지된 방법, 예를 들면 종래의 여과(filtering) 또는 침전(sedimentary) 방법(예컨대, 원심분리)에 의해 수확되거나 또는 사이클론 시스템(cyclone system)을 사용하여 건조물(dry)로 수확될 수 있다. 포자는 즉시 사용되거나 또는 보관될 수 있고, 재현적으로 생육가능하게 유지되는 한 0-6 ℃, 바람직하게는 2 ℃에서 냉장된다. 그러나 본 발명의 조성물로 혼입되지 않는 경우 수확하고 2주내에 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.

유사하게, 요구되는 경우, 비. 바시아나(B. bassiana) K4B3의 1 이상의 대사산물이, 1 이상의 세포-용해 단계와 조합하거나(예를 들면, 세포내 대사산물에 대해) 또는 조합하지 않고(예를 들면, 성장 배지로 분비되는 대사산물에 대해), 당분야에 공지된 방법, 예를들면 종래의 여과 또는 침전 방법(예컨대, 원심분리)에 의해서 비. 바시아나(B. bassiana) K4B3으로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 1 이상의 담체(carriers), 바람직하게는 1 이상의 농업적으로 허용가능한 담체(agriculturally acceptable carriers)를 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 담체, 가령 농업적으로 허용가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 본원 명세서에서 유용한 담체는 농업적 조성물(agricultural composition)을 제제화하는데 전형적으로 사용된 물질을 포함한다.

하나의 실시양태에서, 농업적으로 허용가능한 담체는 아마도 충전제(fillers), 용매, 부형제, 계면활성제(surfactants), 현탁제(suspending agents), 스프래더(speaders)/스티커(stickers)[부착제(adhesives)], 소포제, 분산제, 습윤제, 드리프트 감소제(drift reducing agents), 보조제(auxiliaries), 보강제(adjuvants) 또는 이의 혼합물을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 조성물은 예를 들면 농축물, 용액, 스프레이, 에어로졸, 침수욕(immersion baths), 침지(dips), 에멀젼(emulsions), 습윤성 분말, 가용성 분말, 현탁 농축액, 더스트(dusts), 과립(granules), 수분산성 과립(water dispersible granules), 마이크로캡슐(microcapsules), 페이스트(pastes), 겔 및 잘-알려져 있는 절차에 의한 다른 제제 타입으로 제제화될 수 있다.

상기 절차는 농업적으로 담체 물질, 가령 충전제, 용매, 부형제, 계면활성제, 현탁제, 스프래더/스티커(부착제), 소포제, 분산제, 습윤제, 드리프트 감소제, 보조제 및 보강제와 활성 성분의 혼합 및/또는 분쇄를 포함한다.

하나의 실시양태에서, 고형 담체는 이에 한정되는 것은 아니지만 미네랄 토류, 가령 규산, 실리카겔, 실리케이트, 탈크, 카올린, 아타풀거스 클레이(attapulgus clay), 석회석(limestone), 석회(lime), 초크(chalk), 볼(bole), 황토(loess), 클레이, 돌로마이트, 규조토(diatomaceous earth), 알루미나스 칼슘 설페이트, 마그네슘 설페이트, 마그네슘 옥사이드, 분쇄된 플라스틱, 비료, 가령 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄 및 유레아, 및 식물성 생성물, 가령, 그레인밀(grain meals), 바크밀(bark meal), 우드밀(wood meal), 및 너트쉘밀(nutshell meal), 셀룰로스 파우더 등을 포함한다. 과립용 고형 담체로서, 하기가 적당하다: 분쇄되거나 또는 분류된 천연 암석, 가령 칼사이트(calcite), 대리석(marble), 부석(pumice), 세피올라이트(sepiolite) 및 돌로마이트(dolomite); 무기 또는 유기 밀(meals)의 합성 과립: 유기 물질, 가령 톱밥, 코코넛 껍질, 옥수수속, 옥수수 껍질 또는 타바코 줄기; 키젤거(kieselguhr), 인산삼칼슘, 분말 코르크, 또는 흡수성 카본 블랙; 수용해성 폴리머, 수지, 왁스; 또는 고형 비료. 상기 고형 조성물은 목적한다면 고형일때 희석제로서 제공될 수 있는 1 이상의 상용성 습윤제, 분산제, 유화제 또는 착색제를 포함할 수 있다.

하나의 실시양태에서, 담체는 또한 액체, 예를 들면 물; 알콜, 특히 부탄올 또는 글리콜, 뿐만 아니라 이들의 에테르 또는 에스테르, 특히 메틸글리콜 아세테이트; 케톤, 특히 아세톤, 시클로헥사논, 메틸에틸 케톤, 메틸이소부틸케톤, 또는 이소포론; 석유 프랙션, 가령 파라핀 또는 방향족 탄화수소, 특히 크실렌 또는 알킬 나프탈렌; 미네랄 또는 식물 오일; 지방족 염화 탄화수소, 특히 트리클로로에탄올 또는 메틸렌 클로라이드; 방향족 염화 탄화수소, 특히 클로로벤젠; 수용해성 또는 강한 극성 용매, 가령 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭시드, 또는 N-메틸피롤리돈; 액화 가스; 등 또는 이의 혼합물일 수 있다.

하나의 실시양태에서, 계면활성제는 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및/또는 양쪽성(amphoteric) 계면활성제를 포함하며, 분무하는 동안 용액으로 남아 있는 집합체(aggregates)의 역량을 촉진한다.

스프래더/스티커는 식물 표면에 부착하기 위한 본 발명의 조성물의 역량을 촉진한다. 계면활성제, 스프래더/스티커의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 트윈 및 트리톤(Tween and Triton, Rhom and Hass Company제), 포툰(Fortune®), 펄스(Pulse), 시.닥소일(C. Daxoil®), 코다시드 오일(Codacide oil®), D-C 테이트(D-C. Tate®), 수파메트 오일(Supamet Oil), 본드(Bond®), 침투제(Penetrant), 글로웰트(Glowelt®) 및 프리웨이(Freeway), 시토웨트(Citowett®), 포툰 플러스(Fortune Plus™), 포툰 플러스 라이트(Fortune Plus Lite), 프루이멕(Fruimec), 프루이멕 라이트(Fruimec lite), 알칼리 금속, 알칼리토금속, 및 방향족 설폰산의 암모늄염, 예를 들면 리그닌설폰산, 페놀설폰산, 나프탈렌설폰산 및 디부틸나프탈렌설폰산 및 지방산의 암모늄염, 알킬 및 알킬아릴 설포네이트 및 알킬, 라우릴 에테르 및 지방 알콜 설페이트, 및 설페이트 헥사데칸올, 헵타데칸올 및 옥타데칸올의 염, 지방 알콜 글리콜 에테르의 염, 설포네이트 나프탈렌 및 나프탈렌 유도체와 포름알데히드의 축합 생성물, 나프탈렌 또는 나프탈렌설폰산과 페놀 및 포름알데히드의 축합 생성물, 폴리옥시에틸렌 옥틸페놀 에테르, 에톡실화 이소옥틸페놀, 에톡실화 옥틸페놀 및 에톡실화 노닐페놀, 알킬페놀 폴리글리콜 에테르, 트리부틸페놀 폴리글리콜 에테르, 알킬아릴폴리에테르 알콜, 이소트리데실 알콜, 지방 알콜 에틸렌 옥시드 축합물, 에톡실화 캐스터 오일, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르, 에톡실화 폴리옥시프로필렌, 라우릴 알콜 폴리글리콜 에테르 아세탈, 소르비톨 에스테르, 리그닌-설파이드 폐액 및 메틸 셀룰로스를 포함한다. 상기로부터 선택될 때, 1 이상의 농업적 계면활성제, 가령 트윈(Tween)이 공지된 프로토콜에 따라 조성물내에 바람직하게 포함된다.

습윤제는 조성물에서 물의 표면 장력을 감소시키므로, 주어진 양의 조성물이 사용되는 것에 대해서 표면적이 증가된다. 습윤제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 폴리아크릴산의 염, 리그노설폰산의 염, 페놀설폰산 또는 나프탈렌설폰산의 염, 에틸렌 옥사이드와 지방 알콜 또는 지방산 또는 지방산 에스테르 또는 지방 아민의 다중축합물, 치환된 페놀(특히, 알킬페놀 또는 아릴페놀), 설포숙신산 에스테르의 염, 타우린 유도체(특히, 알킬타우린), 알콜의 인산 에스테르, 에틸렌 옥사이드와 페놀의 다중축합물, 지방산과 폴리올의 에스테르, 또는 상기 화합물의 설페이트, 설포네이트 또는 포스페이트 관능성 유도체를 포함한다.

하나의 실시양태에서, 본 발명의 화합물 또는 조성물을 사용하는 바람직한 방법은 핸드건(handgun) 또는 시판용 에어블라스트(commercial airblast)에 의해서 희석물 또는 농축물 용액을 분무하는 것이다.

상기에 기술된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 1 이상의 다른 농업적 제제(agricultural agents), 농약(pesticides), 살충제(insecticides), 살응애제(acaracides), 살진균제(상기 살진균제는 본 발명의 진균에 유해하거나 또는 독성이지 않음), 살박테리아제, 제초제, 항생제, 항균제, 살선충제(nematocides), 쥐약(rodenticides), 곤충병원체(entomopathogens), 페로몬(pheromones), 유인제(attractants), 식물 성장 조절제(plant growth regulators), 식물 호르몬(plant hormones), 곤충 성장 조절제(insect growth regulators), 화학불임제(chemosterilants), 미생물 작물보호제(microbial pest control agents), 방충제(repellents), 바이러스, 식자극제(phagostimulents), 식물 영양제, 식물 비료 및 생물학적 방제 제제와 함께 배합하여 사용될 수 있다. 다른 농업적 제제와 배합하여 사용되는 경우, 2가지 제제는 개별적으로, 동시에 또는 연이어 투여될 수 있다. 상기 농업적 제제의 특정 예로는 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지되어 있으며, 많은 것이 용이하게 상업적으로 입수할 수 있다.

식물 영양제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 질소, 마그네슘, 칼슘, 붕소, 칼륨, 구리, 철, 인, 망간, 몰리부덴, 코발트, 붕소, 구리, 실리콘, 셀레늄, 니켈, 알루미늄, 크롬 및 아연을 포함한다.

항생제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 옥시테트라사이클린 및 스트렙토마이신을 포함한다.

살진균제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 살진균제의 하기이 부류를 포함한다: 카르복스아미드, 벤즈이미다졸, 트리아졸, 히드록시피리딘, 디카르복사미드, 페닐아미드, 티아디아졸, 카르바메이트, 시아노-옥심, 신남산 유도체, 모르폴린, 이미다졸, 베타-메톡시 아크릴레이트 및 피리딘/피리미딘을 포함한다.

살진균제의 부가의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 천연 살진균제, 유기 살진균제, 황계 살진균제, 구리/칼슘 살진균제 및 식물 숙주 방어의 엘리시터(elicitors)를 포함한다.

천연 살진균제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 전유(whole milk), 유장(whey), 지방산 또는 에스테르화 지방산을 포함한다.

유기 살진균제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 유기 인증 기준(organic certification standard)을 통과한 살진균제, 가령 바이오방제 제제(biocontrol agents), 천연 생성물, 엘리시터(이의 일부는 또한 천연 생성물로 분류될 수 있음) 및 황 및 구리 살진균제(제한된 용도로 한정됨)를 포함한다.

황계 살진균제의 예로는 쿠물러스(Kumulus™) DF (BASF제, 독일)가 있다.

구리 살진균제의 예로는 코사이드(Kocide®) 2000 DF (Griffin Corporation제, 미국)가 있다.

엘리시터의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 키토산, 바이온(Bion™), BABA(DL-3-아미노-n-부타노산, β-아미노부티르산) 및 밀사나(Milsana™)(Western Farm Service, Inc.제, 미국)를 포함한다.

몇가지 실시양태에서, 비(非)유기 살진균제가 사용될 수 있다. 비(非)유기 살진균제의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 브라보(Bravo™)(조롱박(cucurbits)에서 PM의 제어를 위해서); 수퍼실드(Supershield™)(Yates제, 뉴질랜드)(장미에서 보트리티스(Botrytis) 및 PM의 제어를 위해서); 토파스(Topas®) 200EW (포도 및 조롱박에서 PM의 제어를 위해서); 플린트(Flint™)(사과 및 조롱박에서 PM의 제어를 위해서); 아미스타르(Amistar®) WG (시리얼에서 녹병 및 PM의 제어를 위해서); 및 캅탄(Captan™), 디탄(Dithane™), 유파렌(Euparen™), 로브랄(Rovral™), 스칼라(Scala™), 시르란(Shirlan™), 스위치(Switch™) 및 텔도르(Teldor™)(포도에서 보트리티스의 제어를 위해서)를 포함한다.

농약의 예로는 이에 한정되는 것은 아니지만 아족시스트로빈, 비테르탄올, 카르복신, Cu₂O, 시목사닐, 시프로코나졸, 시프로디닐, 디클로플루아미드, 디페노코나졸, 디니코나졸, 에폭시코나졸, 펜피클로닐, 플루디옥소닐, 플루퀴코나졸, 플루실라졸, 플루트리아폴, 푸랄락실, 구아자틴, 헥사코나졸, 히멕사졸, 이마잘릴, 이미벤코나졸, 이프코나졸, 크레속심-메틸, 만코제브, 메탈락실, R-메탈락실, 메트코나졸, 옥사딕실, 페푸라조에이트, 펜코나졸, 펜시쿠론, 프로클로라즈, 프로피코나졸, 피로퀴론, SSF-109, 스피록사민, 테부코나졸, 티아벤다졸, 톨리플루아미드, 트리아족시드, 트리아디메폰, 트리아디멘올, 트리플루미졸, 트리티코나졸 및 유니코나졸을 포함한다.

본 발명의 진균류 이외의 생물학적 방제 제제의 예로는 울로클라디움 오우데만시이(Ulocladium oudemansii)를 포함하는 보트리젠(BotryZen^TM) 생물학적 방제 제제이다.

상기 조성물은 또한 넓은 범위의 첨가제, 가령 상기 활성 성분을 향상시키기 위해 사용된 안정화제 및 침투제, 및 포자 생장력, 발아 및 생존력을 향상시키기 위한 소위 "스트레싱(stressing)" 첨가제, 가령 염화칼륨, 글리세롤, 염화나트륨 및 글루코스를 포함할 수 있다. 첨가제는 또한 장기간 보관시에 미생물의 생존성을 유지하는데 도움을 주는 조성물, 예를 들면 정제되지 않은 옥수수 오일 및 외부에서 오일과 왁스의 혼합물 및 내부에서 물, 알긴산나트륨 및 분생포자의 혼합물을 포함하는 전화한(invert) 에멀젼을 포함할 수 있다.

사용된 첨가제는 생물학적 방제 제제의 유효성을 방해하지 않는 양으로 존재하는 것이 중요하다.

담체, 보존제, 계면활성제 및 습윤제, 스프래더 및 영양제를 포함하는 적당한 조성물의 예로는 US 5780023에 제공되며, 이는 본원 명세서에 참고문헌으로 포함된다.

출원인은 또한 다수의 통상적으로 사용되는 살진균제가 본 발명의 곤충병원성 진균에 역효과를 내지 않는 것을 입증하였다. 그러므로, 본 발명의 조성물은 상기 살진균제를 포함한다. 선택적으로, 상기 조성물은 개별적으로 사용될 수 있지만 제어 프로그램에서 상기 살진균제와 배합될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 1 이상의 곤충병원성 진균을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 곤충병원성 진균의 재현적으로 생육가능한 형태를 수득하는 단계, 및 상기 곤충병원성 진균의 재현적으로 생육가능한 형태를 적어도 하나의 농업적으로 허용가능한 담체와 배합하는 단계를 포함한다.

상기 조성물은 수많은 형태로 제조될 수 있다. 하나의 제제는 식물 또는 그 주변에 더스팅(dusting)될 수 있는 본 발명의 조성물의 분말 형태를 포함한다. 부가의 형태에서, 상기 조성물은 물과 같은 희석제와 혼합되어, 스프레이, 포말, 겔 또는 침지를 형성하여 공지된 프로토콜을 사용하여 적당하게 도포된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 상기에 기술된 바와 같이 제제화된 비. 바시아나(B. bassiana) 조성물은 약 1 gm/L에서 가압된 스프레이(pressurised sprayer)를 사용하거나 또는 1 ha당 1000 L 이상의 물에서 약 1-3 kg/ha로 물과 혼합된다. 바람직하게, 포툰 플러스(Fortune Plus™)가 약 1 ml/L에서 UV 및 건조 보호제(UV and desiccation protection agent)로서 조성물에 첨가된다. 엘. 무스카리움(L. muscarium), 엘. 론기스포룸(L. longisporum), 또는 피. 푸모소로세우스(P. fumosoroseus)가 유사한 방식으로 사용될 수 있다.

주입(injection), 연마(rubbing) 또는 브러싱(brushing)과 같은 다른 도포 방법을 위해 제제화된 조성물이 또한 사용될 수 있으며, 실제로 당분야에 공지되어 있다. 식물 주변 또는 환경, 가령 토양, 물 또는 시드 코팅(seed coatings)과 같이 조성물을 간접적으로 도포하는 것이 잠재적으로 가능하다.

상기에서 토의된 바와 같이, 본 발명의 곤충병원성 진균 또는 이의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물이 생물학적 방제 제제가 효과적이도록 사용되는 농도는 최종 용도, 식물의 생리학적 조건; 타입(곤충종을 포함함), 병원체 감염의 농도 및 정도, 계절, 습도, 식물의 연령 및 성장 시기에서 단계; 종래 살충제 또는 사용된 다른 처리(살진균제를 포함)의 타입 및 수; 및 식물 처리(가령 잎의 플러킹(leaf plucking) 및 프루닝(pruning))에 따라 가변될 수 있다.

예를 들면, 특정 용도에서, 비. 바시아나(B. bassiana)를 포함하는 조성물은 헥타아르당 약 1 x 10¹⁰ 내지 약 1 x 10¹⁵ 포자, 바람직하게는 헥타아르당 약 1 x 10¹² 내지 약 1 x 10¹⁴ 포자, 더 바람직하게 헥타아르당 약 5 x 1O¹² 내지 약 1 x 10¹⁴ 포자, 더 바람직하게 헥타아르당 약 1-3 x 10¹³ 포자의 비율(rate)로 사용될 수 있다.

부가의 측면에서, 본 발명은 1 이상의 식물병원성 곤충(phytopathogenic insects)을 제어하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 식물 또는 이의 주변에 비. 바시아나(B. bassiana) 균주 K4B3의 재현적으로 생육가능한 형태의 양을 적용하는 단계를 포함한다.

하나의 실시양태에서, 본원 명세서에서 기술된 바와 같이 1 이상의 다른 곤충병원성 진균과 함께 비. 바시아나(B. bassiana) 균주 K4B3을 사용한다.

바람직하게, 상기 1 이상의 다른 진균은 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 (NMIA 수탁번호 제NM05/44593) 또는 이의 동일한 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V2 (NMIA 수탁번호 제NM05/44594호) 또는 이의 동일한 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V4 (NMIA 수탁번호 제NM06/00007호) 또는 이의 동일한 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B1 (NMIA 수탁번호 제NM05/44595호) 또는 이의 동일한 특성을 갖는 균주; 뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) 균주 K4B2 (NMIA 수탁번호 제NM06/00010호) 또는 이의 동일한 특성을 갖는 균주; 레카니실리움 론기스포룸(Lecanicillium longisporum) 균주 KT4L1 (NMIA 수탁번호 제NM06/00009호) 또는 이의 동일한 특성을 갖는 균주; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus) 균주 K4P1 (NMIA 수탁번호 제NM06/00008호) 또는 이의 동일한 특성을 갖는 균주로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

다시, 1 이상의 식물병원성 곤충종에 대항하는 활성을 갖는 본 발명의 곤충병원성 진균의 다수 균주가 제어 공정에서 사용될 수 있으며, 통상 3개의 균주 또는 그 이하가 상기 공정에서 사용된다.

작물 주기(crop cycle)에서 동일한 또는 상이한 횟수의 반복된 사용으로 또한 실시될 수 있다. 본 발명의 곤충병원성 진균, 본 발명의 곤충병원성 진균을 포함하는 조성물, 또는 이의 1 이상의 대사산물이 계절 초기 또는 후기에 적용될 수 있다. 상기는 개화기 이후 또는 과실기(fruiting) 중 일 수 있다. 본 발명의 곤충병원성 진균, 본 발명의 곤충병원성 진균을 포함하는 조성물, 또는 이의 1 이상의 대사산물은 수확기 직전 또는 수확기 직후에 적용되어 콜로니를 괴사시키거나 또는 잎, 과실, 꼭지, 기계 수확된 줄기 등을 노화시켜서 곤충 콜로니화를 방지할 수 있다. 본 발명의 곤충병원성 진균 또는 본 발명의 조성물이 또한 휴면 조직에서 곤충 성장이 느리기 때문에 겨울에 휴면 식물에 적용될 수 있다.

상기 적용은 발아기 이전 또는 수확 이후에 실시될 수 있다. 그러나, 상기 처리는 개화기와 수확기 사이에 실시하는 것이 바람직하다. 유효성을 증가시키기 위해서, 본 발명의 곤충병원성 진균 또는 본 발명의 조성물을 여러번 사용(예를 들면, 개화기에서 과실기까지의 단계에 걸쳐서 2-6회 사용)하는 것이 바람직하다.

본 발명의 곤충병원성 진균 또는 조성물의 재사용(reapplication)은 또한 비가 온 이후에 고려되어야 한다. 곤충 감염 예측 모델(insect infectivity prediction models) 또는 감염 분석 데이터(infection analysis data)를 사용하여, BCA의 사용 시기가 곤충 감염 위험 기간을 고려할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 곤충병원성 진균 또는 이의 동일하거나 또는 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물이 예를 들면 상기에 기술된 바와 같이 가압 스프레이를 사용하여 용액으로 적용된다. 상기 식물 부분은 실시 직전까지 가볍게 분무되어야 한다. 적용은 식물의 일부 및/또는 이의 주변, 예를들면 전체 식물의 캐노피(whole plant canopy), 꽃 및 생성된 과실이 집중되는 캐노피에서 영역, 또는 식물 꼭지 및/또는 토양, 물 또는 성장 배지 보강제 또는 뿌리, 덩이줄기 등의 주변에 실시될 수 있다.

바람직하게, 곤충병원성 진균-포함 조성물은 안정하다. 본원 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안정한(stable)"은 수주, 바람직하게는 약 1달, 약 2달, 약 3달, 약 4달, 바람직하게 약 5달, 더 바람직하게 약 6달, 또는 그 이상동안 상기 진균의 재현적 생육성을 지지할 수 있는 조성물을 나타낸다. 바람직하게, 상기 조성물은 특정 조건하에서, 가령 예를 들면 냉장 또는 동결 조건하에서 저장 요건 없이 안정하다.

사용된 조성물은 식물병원성 곤충을 제어한다. 식물병원성 곤충은 식물의 일부를 공격하여 성장율, 개화, 과실화, 생산성을 감소시킴으로써 감염된 식물이 사멸할 수 있는 수확 이전 및 수확 이후 질병을 초래한다. 본원 명세서에서 사용된 바와 같이, 곤충은 식물 병원체 자체인 곤충, 및 다른 식물 병원체에 대한 벡터(vector), 예를 들면 식물병원성 진균 및 박테리아로 작용할 수 있는 곤충을 포함한다. 다른 식물병원체에 대한 벡터로서 작용하는 숙주 곤충을 제어하는 것이 인정되었으며, 식물 질병의 발생율 및/또는 심각도가 최소화될 수 있다.

뉴질랜드에서 많은 중요한 원예작물(horticultural crops)을 괴롭히는 주요 식물병원성 곤충의 예를 하기 표 1에 나타내었다.

본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 상기에 기재된 작물에서 왕흰나방, 총채벌레, 진딧물 및 쐐기벌레의 제어가 특히 실시되었다. 비. 바시아나(B. bassiana) 균주 단독, 또는 다른 비. 바시아나(B. bassiana) 균주 또는 엘. 무스카리움(L. muscarium) 또는 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus)와 배합한 비. 바시아나(B. bassiana) 균주 및 상기를 포함하는 본 발명의 조성물을 사용하여 바로아 응애(varroa mite)의 제어가 특히 실시되었다.

본 발명의 방법은 수확 이전 또는 수확 이후에 식물 및 식물 생성물에 특별히 적용된다. 예를들면, 본 발명의 조성물은 과실, 채소, 절화(cut flowers) 및 종자를 포함하는 상기에 기술된 보관된 생성물에 적용될 수 있다. 적당한 적용 기술은 상기에 기술된 방법, 특히 스프레이를 포함한다.

상기 조성물은 식물에 직접 적용하는 것과 반대로 토양 또는 종자를 처리하거나 또는 예비처리하는데 가능하게 사용될 수 있다. 상기 조성물은 식물 가공 물질, 가령 보호 코팅, 박스(boxes) 및 래퍼(wrappers)에서 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 본 발명의 곤충병원성 진균의 활성 균주로 직접 처리된 식물, 식물 생성물, 토양 및 종자가 본 발명에 포함된다.

부가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물에 사용되는 본 발명의 곤충병원성 진균의 용도를 포함한다.

본 발명은 이후에 하기에 제공되는 실시예에서 고찰된 구조에 있으며, 본 발명은 하기의 범위에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 뷰베리아 바시아나 ( Beauveria bassiana ) 균주 K4B3 의 동정( IDENTIFICATION ) 및 분리( ISOLATION )

뷰베리아 바시아나(Beauveria bassiana) K4B3는 토양의 표면에서 나와 뉴질랜드 봄베이에서 소나무 숲에서 대량으로 사멸된 죽은 매미 번데기(dead cicada pupae)로부터 원래 분리된다. 진균은 포자 형성을 최대화하기 위해서 93% 상대 습도에서 24 ℃에서 성장시키는 단계를 포함하는, 표준 방법을 사용하여 곤충 시료로부터 분리된다. 그후 개별의 콜로니가 MEA상에서 서브-배양하여(sub-cultured) 곤충병원성 효율을 위해 스크리닝하기 위해 순수한 균주를 수득한다.

뷰베리움 ( Beauverium ) 특성

상기 분리물은 당 기술 분야에 잘 공지된 분류학적 참고문헌(taxonomic references)을 사용하여 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana)로서 동정된다.

형태학적 특성

상기 분리물 K4B3은 유충(juveniles), 성충(adults) 및 번데기, 진딧물 및 왕흰나방에 대한 병원성이다. 상기 분리물은 하기의 동정 특성을 갖는다:

균사체(Mycelium): MEA에서 용이하게 성장한다. 콜로니는 통상 가장자리에서 흰색이지만 크림 내지 연황색이 된다. 때때로 붉은 색을 띤다. 균사체 아래쪽에, 탈루체(thallus)는 아가를 붉은 색소로 물들인다.

분생자병(Conidiophores): 풍부, 균사로부터 나옴. 1-2 μm 너비를 포함하는 클러스터 분생자병 세포(clustered conidiogenous cells) 3-6x 3-5 μm은 1 μm 너비까지 이모양 돌기(denticles)를 가지고 구부러지고 1 μm 너비당 20 μm 길이까지 성장하는 줄기를 갖는 구형 내지 플라스크 형태의 부가의 분생자병 세포를 제공하도록 분지될 수 있다.

분생포자(Conidia): 2-3x 2-2.5μm인 명확한 구형 분생포자. 출아포자(Blastospores)가 액중 배양(submerged culture)에서 형성된다. 소수성 물질이 아가상에서 매우 덩어리진 과립형 집합체로 생성된다. 포자 집합체의 색상은 성숙하면 색상이 무지개 빛깔의 노란색으로 변화된다. 액중 배양으로 K4B3의 도입은 진한 빨간색의 아린 금속성 냄새(acrid metallic odor)를 형성하며, 독성 대사산물이 상기 용액으로 들어간다.

수탁( Deposits )

본원 명세서에 언급된 수탁은 개시된 바와 같이 이전에 호주 정부 분석 연구소(Australian Government Analytical Laboratories, AGAL) 였던 호주 국립 측정 기관(National Measurement Institute of Australia, NMIA)에서 이루어 졌다. 본원 명세서에서 사용된 바와 같이, AGAL 승인(accession) 또는 수탁 번호(deposit number)에 대한 참고문헌은 NMIA 승인 또는 수탁 번호와 균등한 것으로 간주되어야 한다. K4B3은 호주 국립 측정 기관에 2008년 9월 23일자로 수탁되었고, 수탁 번호는 제V08/025855호로 부여되었다.

실시예 2 - K4B3 및 화학적 살충제를 사용하여 왕흰나방 제어의 비교

도입

본 실시예는 왕흰나방의 생물학적 방제 제제로서 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3의 유효성을 평가하고 상기를 입증된 화학적 처리 절차와 비교하기 위해 실시된 필드 시험(field trials)을 기술하였다. 상기 시험은 석탄 보일러 및 켐테스트 환경(Chemtest environment) 및 관개 제어기(irrigation controller)를 구비한, 2개의 1680 m² 벤로 스타일 파버 온실(Venlo style Faber glasshouses)에서 실시되었다. 상기 온실은 배액(drainage of runoff)과는 별도로 모든 경우에서 동일하다. 화학적 농약(chemical pesticide regime)은 온실 1에서 실시되고, 본 발명의 BCA의 실시는 온실 2에서 실시된다.

방법

온실 1

본 온실은 드 로이터 변형 앤타크티카(De Ruiter variety Antarctica)에 설치되었다. 설치 이후 통상적 실시에 따라, 식물이 무릎 높이에 도달하면 바이데이트(Vydate, 240 gm/L 옥사밀)가 lOOml/1OOOm²에서 관개(irrigation)를 통해 첨가된다. 작물이 성장할 때, 바이데이트의 투여량은 200ml/100m²로 증가되고, 작물이 어깨 높이에 도달하면 최종적으로 300ml/1000m²로 한다. 37mg/kg의 LD50을 갖는 바이데이트는 수확 4주 이내에 회수되어 과일에서 옥사밀에 대한 최대 허용 수준(maximum recommended level, MRL)을 초과하지 않도록 한다. 란네이트(Lannate, 200gm/L 메토밀) 및 티오단(Thiodan, 350gm/L 엔도설판) 혼합물, 체스(Chess, 250gm/kg 피메트로진) 및 어택(Attack, 25gm/L 퍼메트린 + 475gm/L 피리미포스 메틸)이 이후에 실시된다.

온실 2

본 온실은 드 로이터 변형 토론토(De Ruiter variety Toronto)에 설치되었다. 상기 변형은 온실 1에서 설치된 앤타크티카 변형보다 취급의 변형에 더 큰 어려움이 있다. 통상적으로 실시될 때, 왕흰나방 제어는 바이데이트로 초기에 실시되고, 상기 온실 1에서 기술된 바와 같은 동일한 방식으로 실시된다. 바이데이트의 회수시에, 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3이 적용된다. 베아루베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3이 1L의 0.1% 트리톤(Triton) x 100으로 도입되고, 혈구계수기(haemocytometer)를 사용하여 1010/mldnk 포자 농도(spore concentration)로 증가시킨다. 상기 포자 용액은 2 ℃로 냉각된후 온실 2로 즉시 송달한다. 상기 포자 용액은 그후 1OOL 스프레이 탱크로 첨가되어 감염 역치(infection threshold)를 수득하기 위한 10⁷/ml의 포자 계수를 달성한다. 포툰 플러스(Fortune Plus™), 식용 식물성 오일이 그후 1OOml/1OOL의 비율로 휴멕턴트(humectant)로서 첨가된다.

포자가 가을 온도 및 높은 습도에서 적용되어 온실은 밤동안 80% rH를 초과할 것이다. 상기 과정은 다음달에 4회 반복한 이후에 2달 이후에 4회 반복한다.

결과

작물 건강 및 각 작물의 하부 잎에서 흰왕나방 스케일의 수가 평가된다. 감염율은 각 온실에서 대표적인 식물의 수에서 흰왕나방 스케일의 수를 계수함으로써 정량적으로 측정하여 식물당 흰왕나방 스케일 평균을 측정한다.

토의

BCA가 사용된 식물은 온실 1의 것보다 현저하게 적은 흰왕나방 스켈을 갖는 우수한 상태이 있다는 것을 나타내는 결과는 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3의 곤충병원성 유효성을 지지한다.

BCA 제제로 처리된 식물에서 흰왕나방 스케일의 평균 수가 화학적 살충제로 처리된 식물에서보다 낮다는 것을 나타내는 결과는 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3가 간단한 사용 계획과 결합하여 흰왕나방을 우수하게 제어한다는 결과를 지지한다.

실시예 3 - 뷰베리움 바시아나( Beauverium bassiana )의 생성

도입

본 실시예는 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3의 대규모 고형 페이스 성장을 위한 이의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물의 제조 방법을 기술하였다.

방법

분생포자의 발아

최적 포자 형성은 포화 대기 및 25-3O ℃의 온도를 요구한다. 포자 형성 이후에, 포자는 건조 밀봉된 용기로 옮기고 8 ℃에서 보관한다. 상기 포자는 635일까지 보관될 수 있다.

고체상, 대규모 성장

보관하고 300일 이후에, 소수성 포자 분말이 저장으로부터 제거되고 이의 생육성이 하기와 같이 시험된다.

pH 5.5에서 말트 추출물 아가(Malt Extract Agar)(20,000 I.U. 페니실린/L 및 40 mg 스트렙토마이신/L로 보강됨)가 준비된다. 1 mL의 포자 현탁액이 말트 추출물 아가로 첨가하고, 도말하여 24 ℃에서 14일동안 배양된다.

15일에, 진균이 0.01% 트리톤 x 100로 보충된 멸균수로 10⁴ 분생포자/mL의 농도로 수확된다. 그 후 상기 용액은 오염을 확인한다. 오염이 존재한다면, 포자 용액을 폐기한다.

말트 추출물 아가는 상기와 같이 준비되고 멸균 유리 벌크업 트레이(sterile glass bulking-up trays)에 첨가한 후에, 습윤 백(humidity bag)에 넣고, 밀봉하여 30 ℃로 냉각한다. 그후 20 mL의 포자 용액이 상기 트레이로 첨가된 후에, 14일 동안 배양된다. 상기 진균은 다시 0.01% 트리톤 x 100으로 보충된 멸균수로 수확되고, 이때 10⁶ 분생포자/mL의 농도에 도달한다. 그후 상기 용액은 오염을 체크한다. 다시 오염이 존재한다면 포자 용액은 폐기된다.

1.6 kg의 키블된 붉은 밀(kibbled red wheat)이 준비되고, 320 mL의 멸균수와 함께 성장 백(growth bags)(멸균 튜브로 환기됨)으로 첨가한다. 그후 상기 백은 3분동안 마이크로웨이브에 의해 오토클레이브되고 실온으로 냉각된다.

320 mL의 포자 용액이 이스트 추출물(2 g/L)과 배합되고, 통상의 광주기에 필적하는 인공 조명하에서 밀을 포함하는 성장 백과 7일동안 24 ℃에서 배양된 백으로 넣는다.

7일에, 환기관(ventilation tubing)이 제거된다. 완전히 성장된 배양액이 0.01% 트리톤 x 100이 보충된 3L의 멸균수를 상기 백으로 첨가하고, 상기 내용물을 교반한 후에 상기 내용물을 큰 통에 부어서 수확한다. 수확 단계는 한번 반복한다.

수득된 상청액은 모든 뷰베리아(Beauveria) 및 이스트 포자를 제거하기 위해 1μM 필터를 통해 여과한 이후에 시트르산을 사용하여 pH 3.9로 조절한다.

결과

상기 백에서 배양하는 동안, 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) K4B3의 균사체는 분홍색에서 핑키 레드(pinky-red)가 되고, 백에서 밀과 응축된 수분은 분홍색을 띤다. 특정 이론에 한정되지 않고, 본 출원인은 일부 멸균된 밀에서 베이커 이스트(Baker's yeast)의 존재가 영양 공급원에 대해 경쟁하기 시작하여, 분홍색 내지 핑키 레드 색상의 대사산물(들)일 수 있거나 또는 조합될 수 있는 바이오톡신 또는 바이오톡신 복합체를 배지로 분비하도록 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) K4B3을 유발시키는 것으로 사료된다.

실시예 4 - 뷰베리신 ( beauvericin ) 및 다른 바이오톡신에 대한 뷰베리아 클러스터의 분석

도입

본 실시예는 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3에 의해서 생성된 바이오톡신(들)의 분석을 기술하였다.

방법

뷰베리신 기준의 제조

1.22 mg의 뷰베리신 분말(AnaSpec Inc. San Jose, Lot #AE6017)이 메탄올에 혼합되고, 부피 10 mL로 제조한다. 4개의 시료가 준비되고, 이중 2개는 높거나 또는 보통의 메티오닌을 포함한다.

LCMS

UV 다이오드 어레이 검출기(diode array detector, DAD) 및 쿼트로 울티마 삼중 사중극자 질량 분광계(Quattro Ultima triple quadrupole mass spectrometer, Waters-Micromass Ltd, 영국)를 구비한 워터스(Waters) 2698 HPLC가 사용되어, 질량 스펙트럼을 형성하고, 시료내에 존재하는 뷰베리신 및 다른 활성 성분을 검출한다. 크로마토그래피 분리가 메탄올 그래디언트 용리에 의해 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18 컬럼(50 x 2 mm)을 사용하여 실시된다.

데이터가 200-1600 amu를 모니터하는 포지티브 풀 스캔 모드(positive full scan mode)로 수득되고, DAD가 200-400 nm에서 모니터된다.

뷰베리움 바시아나 ( Beauverium bassiana ) 균주 K4B3 추출물의 제조

여과된 K4B3 배양 상청액의 다양한 시료가 상기 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조된다.

결과

각 표준 시료에서 검출된 뷰베리신의 양 및 다양한 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3 추출물에 존재하는 뷰베리신의 양이 표 2에 개시되었다.

뷰베리신-정상 메티오틴 기준의 질량 분광 분석이 상기에 기술된 바와 같이 실시되고, 도 1에 개시하였다. 뷰베리신, 뷰베리신-F 및 바시아노이드로서 확인된 피크가 관찰되었다.

뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3 시료 3의 질량 분광 분석은 상기에 기술된 바와 같이 실시되었다. 상기 추출물에서 뷰베리신이 관찰되지 않았다.

실시예 5 - 뷰베리아 바시아나 ( Beauveria bassiana ) K4B3 에 의해서 생성된 진균 배양액의 유효성 및 독성

도입

본 실시예는 진딧물 및 나무이류(psyllids)에 대항하는 살충제로서 K4B3 추출물 복합체의 유효성을 보고하였다.

방법

K4B3 추출물이 실시예 3에서 상기에 기술된 바와 같이 제조된다. 정제된 뷰베리신의 용액이 실시예 3에서 상기에 기술된 바와 같이 제조된다.

2 mL의 K4B3 추출물이 진딧물 및 나무이류에 의해 감염된 작물에 사용된다. 초기에 빗물(runoff)에 핸드 스프레이에 의해서 사용한다(하기 표 3 및 표 4에 보고된 실험). 연이어, 포터 타워(Potters Tower)가 사용되어 상기 용액을 적용한다(하기 표 5 내지 표 7에 보고된 실험).

곤충 이환율(insect morbidity)이 처리후 18시간 및 72시간에 평가된다.

결과

K4B3 여과된 배양액(broth) 및 배양 추출물이 하기 표 3 내지 표 6에 개시된 바와 같이 진딧물 및 나무이류에 대항하여 활성이 있다.

진딧물 사멸율( Aphid mortality )

하기 표 5는 아시아 브라시카 잎 디스크(Asian brassica leaf discs)에 존재하는 완두콩 진딧물(Myzus persicae) 중에서 관찰된 사멸율을 나타낸다. 아시아 브라시카 잎 디스크를 페트리 디시내 1% 워터 아가(water agar)에 넣고, 상기 디시를 포터스 타워(Potters tower)에 넣는다. 2, 5, 10, 15 및 20 mL의 용액을 사용하여 상기 포터 타워로 스프레이한다. 상기 스프레이된 페트리 디시를 페이퍼 타올에서 아래에 배면으로 두어 표면를 건조시킨다. 각 처리의 5개의 복제를 실시한다. 사멸율이 사용하고 24시간 후에 평가된다.

하기 표 6은 아시아 브라시카 잎 디스크에 존재하는 완두콩 진딧물(Myzus persicae) 중에서 관찰된 사멸율을 나타낸다. 아시아 브라시카 잎 디스크를 페트리 디시내 1% 워터 아가에 넣는다. K4B3 추출물이 개시된 바와 같이 희석되고, 각 2 mL의 희석액을 포터스 타워를 사용하여 스프레이한다. 상기 스프레이된 페트리 디시를 페이퍼 타올에서 아래에 배면으로 두어 표면를 건조시킨다. 사멸율이 사용하고 24시간 후에 평가된다.

하기 표 7은 아시아 브라시카 잎 디스크에 존재하는 완두콩 진딧물(Myzus persicae) 중에서 관찰된 사멸율을 나타낸다. 아시아 브라시카 잎 디스크를 페트리디시내 1% 워터 아가에 넣는다. 2 mL의 K4B3 추출물, 뷰베리신 용액(50μg/mL, 2.5 mL 밀렌늄 오일(millennium oil)/L로 보충됨) 및 워터 컨트롤이 포터스 타워를 사용하여 분무된다. 상기 스프레이된 페트리 디시를 페이퍼 타올에서 아래에 배면으로 두어 표면를 건조시킨다. 각 처리의 5개의 복제를 실시한다. 사멸율이 사용하고 48시간 후에 평가된다.

토의

K4B3 추출물이 일정하게 높은 진딧물 사멸율을 제공한다. 상기 효과는 투여 의존성(dose dependent)이다(표 6에서 개시된 바와 같음). 비교로서, 순수한 뷰베리신은 50,000μg/L에서 조차도 매우 낮은 사멸율을 나타낸다. 실제로, 표 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 뷰베리신 단독으로 관찰된 사멸율은 워터 컨트롤로 관찰된 것과는 상당히 다르지 않다.

출원인은 특정 이론에 한정되지 않고, K4B3 추출물(대략 7.5 μg/L)에 존재하는 낮은 농도의 뷰베리신 및 상당히 낮은 농도의 바시아노라이드는 K4B3 추출물 복합체의 곤충병원성 유효성이 뷰베리신 또는 바시아노라이드 단독에 기인되지 않는다는 것을 제시한다고 생각하였다. 출원인은 다시 특정 이론에 한정되지 않고, 곤충병원성 유효성은 사실상 곤충병원성 효과 자체를 갖거나 또는 곤충병원성 효과를 높이거나 또는 상기 추출물에 존재하는 1 이상의 곤충병원성 제제로 상승 효과를 가질 수 있는 1 이상의 다른 K4B3의 대사산물에 기인할 수 있다고 생각한다.

실시예 6 - 뷰베리아 바시아나 ( Beauveria bassiana ) K4B3 추출물에 존재하는 바이오톡신의 동정

도입

본 실시예는 뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) 균주 K4B3에 의해서 생성된 추출물내 존재하는 바이오톡신의 동정을 기술하였다.

방법

뷰베리움 바시아나 ( Beauverium bassiana ) 추출물의 제조 및 바이오톡신의 동정

뷰베리움 바시아나(Beauverium bassiana) K4B3 추출물이 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조되며, 바이오톡신이 실시예 4에 기술된 바와 같이 LCMS를 사용하여 검출된다.

결과

뷰베리신, 뷰베리신-F 및 바시아노이드로서 확인된 피크가 관찰된다(도 2에 도시됨). 미확인 피크가 또한 검출된다(도 2 참조).

토의

출원인은 특정 이론에 한정되지 않고, 상기 스펙트럼에 존재하는 1 이상의 미확인 피크에 대한 1 이상의 대사산물은 K4B3 추출물의 관찰된 곤충병원성 효과의 원인이 될 수 있다.

실시예 7 - 포유류 모델에서 뷰베리아 바시아나 ( Beauveria bassiana ) K4B3 추출물의 독성

도입

본 실시예는 포유류 모델에서 K4B3 추출물의 독성 평가를 보고하였다.

방법

K4B3 추출물은 실시예 3에서 상기에 기술된 바와 같이 제조되었다.

시험은 OECD 가이드라인 425 [급성 경구 독성(Acute Oral Toxicity)-오르내림법(Up-and-down Procedure)]에 따라 마우스에서 실시되었다. 상기 물질은 높은 독성을 갖는 것으로 기대되지 않기 때문에, 경구 삽관에 의해서 2,000 mg/kg의 단일 투여 수준에 의한 한계 시험(limit test)이 선택되었다. 상기 투여량은 예외적인 환경하에서를 제외하고 급성 독성의 평가를 위해 OECD에 의해서 가장 추천되었다.

K4B3 복합체의 단일 2,000 mg/kg 투여량은 하기와 같이 5마리의 암컷 스위스 마우스(female Swiss mice)에게 경구 삽관에 의해서 투여된다.

시험 조건

음식이 대략 4pm에서 마우스들 중 하나로부터 제거되고, 이의 체중이 측정된다. 다음날 아침, 마우스의 체중을 다시 재고, 2,000 mg/kg의 투여량을 제공하기 위해 요구되는 K4B3 추출물의 중량이 계산되었다. 상기 양을 칭량하고 150 μl의 물로 희석된다. 전체 부피가 위관(gavage)에 의해서 마우스에게 투여된다.

투여 후에, 마우스는 즉시 음식에 접근가능하게 한다. 화학약품 시험에 대한 OECD 가이드라인, Revised Draft Guideline 425, October 2000에 명시된 바와 같이, 투여후 60분동안 집중적으로 관찰한 후 투여일 및 연이은 날들 동안 여러번 간격으로 관찰한다. 두번째 마우스는 처음 처치하고 48시간 후에 K4B4 추출물을 2,000 mg/kg 체중의 투여량으로 투여한다. 세번째, 네번째, 다섯번째 마우스는 48시간 간격으로 모두 2,000 mg/kg에서 연이어 투여한다.

상기 마우스는 개별적으로 물과 음식에 자유롭게 수용한다(투여 전 한밤 금식은 예외). 마우스가 매일 관찰되고 투여하고 2주동안 체중을 측정한다. 체중은 투여후에 1일, 1주 및 2주에 기록되고, 그후 상기 동물을 이산화탄소 흡입에 의해서 죽이고, 사후 검사(post-mortem examination)한다.

결과

K4B3 복합체의 투여 이후에 독성 효과가 관찰되지 않았고, 관찰 기간동안 마우스들은 양호한 건강 상태를 유지했다. 상기 마우스들은 투여 직후에 음식을 먹기 시작하고, 투여일 동안 및 시험 기간동안 이들의 거동은 전체적으로 정상이었다. 설사 증상은 보이지 않았고, 마우스의 대소변 펠렛(faecal pellet)은 정상적으로 일정했다.

체중. 상기 마우스의 평균 체중 및 실험 기간동안 다양한 시간 간격에서 각 마우스에 대한 개별 값이 하기 표 8에 개시되었다.

한밤 금식 이후에, 마우스는 체중이 평균 2.4 g이 빠진다. 상기 손실은 음식에 대한 접근이 투여후에 재개되고 다음날까지는 회복된다. 상기 마우스들은 투여후에 2주 관찰하는 기간동안 이들의 체중을 유지한다.

사후 결과. 검시에서 마우스에서 이상은 기록되지 않았으며, 마우스의 간, 신장, 비장, 심장, 폐 및 장(유문에서 항문까지)은 하기 표 9에서 개시된 바와 같이 정상 범위내에 있다.

토의

2,000 mg/kg의 투여량에서 마우스에게 K4B3의 경구 투여는 인식할 수 있는 역효과는 없었다. 사망은 발생하지 않았고, 마우스의 거동은 전체적으로 정상이었다. 검시에서 이상은 보고되지 않았고, 기관 중량은 정상 범위내에 있다.

K4B3 복합체는 2,000 mg/kg 체중보다 큰 LD₅₀을 갖는 낮은 급성 경구 독성을 나타낸다. 상기 결과는 K4B3 복합체가 뉴질랜드 유해 물질 및 신규 생물체(Hazardous Substances and New Organisms, HSNO) Act 1996하에 최하 위험 카테고리로 분류되었다.

실시예 8 - BCA 조성물의 비교

도입

본 실시예는 상업적으로 입수가능한 살충제 제품인 미코탈(Mycotal™)과 본 발명의 조성물에 의해서 수득된 온실 왕흰나방의 컨트롤의 평가를 기술하였다.

방법

V+ K4B3 및 미코탈(Mycotal™)의 제조

뉴질랜드 Millennium Microbes에서 얻어진 버티킬(Vertikil™)은 레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 균주 K4V1 및 K4V2의 분생포자를 포함하며, 각 레카니실리움(Lecanicillium) 균주 1 mL당 10⁹ 포자를 포함하는 현탁액으로서 제공된다. 그후 상기 제공된 현탁액은 실시예 3에서 기술된 바와 같이 K4B3 바이오톡신 추출물과 배합된다. 상기 배합된 조성물은 본 발명에서 V+K4B3이라 한다. 상기 현탁액은 스프레이 적용을 위해 물로 희석된다.

엘. 무스카리움(L. muscarium) 균주의 분생포자를 포함하는 미코탈(Mycotal™)(Koppert Biological Systems제, 네덜란드)이 스프레이를 위해 물에 재현탁된다.

모든 스프레이 처리는 제조자의 지시에 따라 제조되고, 권고에 따라 적당한 보조제와 배합하여 사용된다. 예를 들면, 미코탈(Mycotal™)은 0.25% v/v의 농도에서 오일 "애디트(Addit)"와 사용된다. V+K4B3은 0.25% v/v의 농도에서 유기실리콘/식물 오일 보조제 "딥 프라이드(Deep Fried)"와 사용된다.

곤충 분석

곤충이 없는 토마토 묘목을 스크린된 케이지(screened cages)에 넣고, 성충 온실 왕흰나방, 트리아류로데스 바포라리오룸(Trialeurodes vaporariorum)을 96 시간동안 산란하도록 한다. 그후 성충 왕흰나방을 제거하고, 묘목을 왕흰나방이 없는 케이지로 옮기고 알을 부화시킨다(10일 내지 14일 이내). 약충(nymphs)은 이들이 3영말 4영초 단계(the late third-early fourth instar stage)에 도달할때까지 성장시키기 위해서 추가 14일 내지 21일동안 남겨둔다. 그후 워터 사이로튜브(water cyrotubes)에서 식물 및 잎자루로부터 잎을 자른다. 잎은 왕흰나방 약충수에 근거하여 선택되고 개체는 너무 밀집되지 않지만 적어도 20개의 약충이 각 시험된 잎의 하부에 존재한다.

V+ K4B3 및 미코탈 ( Mycotal ™) 사용

각 생성물은 하기의 비율로 사용된다:

1. X = 추천된 스프레이 비율(V+K4B3 10 mL/L; 미코탈(Mycotal™) 1 g/L)

2. 0.5X = 추천된 스프레이 비율의 반분(V+K4B3 5 mL/L; 미코탈(Mycotal™) 0.5 g/L)

3. 0.25X = 추천된 스프레이 비율의 사분의 1분(V+K4B3 2.5 mL/L; 미코탈(Mycotal™) 0.25 g/L)

현탁액은 변형된 에어-브러시를 사용하여 200 μL/잎의 잎 피복량으로 도포한다. 각 도포는 3회 복제하고 동시에 시험한다. 잎은 노출된 플라스틱 용기에서 18-20 ℃에서 유지하고, 곤충 사멸율 및 감염은 스프레이하고 7일 후에 평가된다.

통계 분석

사멸율 데이터가 ANOVA에 의해 분석되어 2개의 살충제 처리 방법의 효과를 비교한다.

결과

스프레이 처리하고 7일 후에 평균 왕흰나방 사멸율 및 감염율이 하기 표 10에 개시되었다. 두가지 진균 처리에 있어서, 곤충 사멸율 및 감염 수준은 생성물 농도가 증가될 때 증가한다. V+K4B3가 아니라 미코탈(Mycotal™ (p<O.OOl)에 있어서 낮은 비율에서 높은 비율까지 현저한 선형 경향이 있다. 미코탈(Mycotal™)의 최고 농도에서, 100%의 사멸된 약충이 진균에 의해서 감염되고, 85%의 사멸된 약충은 V+K4B3 처리로부터 진균으로 감염된다. 곤충 사멸율 및 감염율은 처리되지 않은 컨트롤 개체와 비교하여 (2개의 생성물에 대한) 처리된 개체에서 상당히 더 높았다(p<0.001).

생성물 유효성이 시험된 농도 범위에서 비교하였다. 2가지 처리 사이에서 평균 사멸율에서의 차이는 시험된 농도에서 크지 않았다. V+K4B3은 더 낮은 농도에서 사용될 때 더 높은 사멸율 및 감염율을 유도하였고, 미코탈(Mycotal™)은 더 높은 농도에서 곤충 감염율이 약간 더 높은 수준을 유도하였다. 특히, 미성숙한 약충의 낮지만 통계적으로 중요한 수가 사멸되었지만 V+K4B3의 추천된 투여율에서 감염되지 않았다.

토의

출원인은 특정 이론에 한정되지 않고, V+K4B3 처리에 의해서 관찰된 사멸되었지만 감염되지 않은 곤충의 상당수는 V+K4B3에 의해 관찰된 사멸율의 적어도 일부가 조성물에서 K4B3 추출물의 존재에 기인한다는 것을 지지한다고 생각하였다.

상기 설명으로부터 명백한 바와 같이, 본 발명은 곤충병원성 진균의 균주 및 이의 1 이상의 대사산물과, 식물병원성 곤충의 제어에 유용한 상기 진균 또는 이의 1 이상의 대사산물을 포함하는 조성물을 제공한다. 식물병원성 곤충의 제어에 사용되는 상기 진균 및 이의 대사산물의 용도, 및 식물병원성 곤충을 제어하는 방법이 또한 제공된다.

참고문헌

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Claims

수탁번호 V08/025855로서 호주 국립 측정 기관(the National Measurement Institute of Australia)에 수탁 되어있는 뷰베리아 바시아나(Beauveria Bassiana) 진균 품종 K4B3의 생물학적 순수한 배양균 또는 이와 동등한 성질을 갖는 배양물.
제 1 항에 따른 진균로부터 얻을 수 있는 포자.
제 2 항에 있어서,
분생자(conidia) 또는 원구(blastophore)인 포자.
1개 이상의 담체와 함께 조성물의 제조에 사용하는 제 1 항에 따른 진균의 용도.
1개 이상의 담체와 함께 조성물의 제조에 사용하는 제 1 항에 따른 진균의 포자의 용도.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 조성물은 생물학적 방제(biological control) 조성물인 것을 특징으로 하는 용도.
제 6 항에 있어서,
상기 생물학적 방제 조성물은 곤충병원성(entomopathogenic) 조성물인 것을 특징으로 하는 용도.
제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 1개 이상의 농업적으로 허용가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1 항에 따른 진균의 재현적으로 생육가능한 형태와 1개 이상의 담체를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물을 제조하는 방법.
제 9 항에 있어서,
레카니실리움 무스카리움(Lecanicillium muscarium) 품종 K4V1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44593) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 No. NM05/44594) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V4 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00007) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44595) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00010) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 론기스포룸 (Lecanicillium longisporum) 품종 KT4L1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00009) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스(Paecilomyces fumosoroseus) 품종 K4P1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00008) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 진균를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
상기 1개 이상의 담체는 농업적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 첨가제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 1개 이상의 담체는 충전 자극제(filler stimulant), 고화 방지제(an anti-caking agent), 습윤제(a wetting agent), 유화제(emulsifier) 및 산화 방지제로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 12 항에 있어서,
상기 조성물은 충전 자극제, 고화 방지제, 습윤제, 유화제 및 산화 방지제 각각의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
생산된 상기 조성물은 생물학적 방제 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
제 14 항에 있어서,
생물학적 방제 조성물은 곤충병원성 조성물인 것을 특징으로 하는 방법.
뷰베리아 바시아나 품종 K4B3와 1개 이상의 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
뷰베리아 바시아나 품종 K4B3로부터 얻을 수 있는 포자와 1개 이상의 담체를 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
뷰베리아 바시아나 품종 K4B3의 1개 이상의 대사산물과, 1개 이상의 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 또는 제 18 항에 있어서,
상기 1개 이상의 담체는 농업적으로 허용가능한 담체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 1개 이상의 담체는 충전 자극제, 고화 방지제, 습윤제, 유화제 및 산화 방지제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 20 항에 있어서,
상기 조성물은 충전 자극제, 고화 방지제, 습윤제, 유화제 및 산화 방지제 각각의 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
상기 충전 자극제는 글루코오스이고, 상기 고화방지제는 이산화규소이며, 상기 습윤제는 탈지분유이고, 상기 유화제는 레시틴(lecithin)이며, 상기 산화방지제는 글루탐산나트륨인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 생물학적 방제 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 23 항에 있어서,
상기 생물학적 방제 조성물은 곤충병원성 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약 2주 이상의 기간 동안 상기 진균의 재현적 생육가능성을 유지하는 것이 가능한 안정한 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약 1개월 이상의 기간 동안 상기 진균의 재현적 생육가능성을 유지하는 것이 가능한 안정한 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약 3개월 이상의 기간 동안 상기 진균의 재현적 생육가능성을 유지하는 것이 가능한 안정한 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 약 6개월 이상의 기간 동안 상기 진균의 재현적 생육가능성을 유지하는 것이 가능한 안정한 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44593) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44594) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V4 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00007) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44595) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00010) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 론기스포룸 품종 KT4L1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00009) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스 품종 K4P1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00008) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 진균을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44594) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V4 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00007) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44595) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00010) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 론기스포룸 품종 KT4L1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00009) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스 품종 K4P1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00008) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 이상의 진균을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 품종이 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44593) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종이거나, 또는 상기 조성물이 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44593) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 품종이 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44594) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종이거나, 또는 상기조성물이 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44594) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 품종이 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V4 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00007) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종이거나, 또는 상기 조성물이 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V4 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00007) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 품종이 뷰베리아 바시아나 품종 K4B1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44595) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종이거나, 또는 상기 조성물이 뷰베리아 바시아나 품종 K4B1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44595) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 품종이 뷰베리아 바시아나 품종 K4B2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00010) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종이거나, 또는 상기 조성물이 뷰베리아 바시아나 품종 K4B2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00010) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 품종이 레카니실리움 론기스포룸 품종 KT4L1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00009) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종이거나, 또는 상기 조성물이 레카니실리움 론기스포룸 품종 KT4L1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00009) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,
상기 품종이 패실로마이세스 푸모소로세우스 품종 K4P1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00008) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종이거나, 또는 상기 조성물이 패실로마이세스 푸모소로세우스 품종 K4P1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00008) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
하나 이상의 식물병원성(Phytopathogenic) 곤충을 방제하는 것에 사용하는 뷰베리아 바시아나 품종 K4B3의 용도.
하나 이상의 식물병원성 곤충을 방제하는 것에 사용하는 뷰베리아 바시아나 품종 K4B3로부터 얻을 수 있는 포자의 용도.
하나 이상의 식물병원성 곤충을 방제하는 것에 사용하는 제 16 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 식물병원성 곤충은 총채벌레(thrips), 진딧물(aphids), 왕흰나방(whitefly), 쐐기벌레(caterpillars) 및 바로아 응애(varroa mite)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
하나 이상의 식물병원성 곤충을 방제하는 방법으로서,
상기 방법은 재현적으로 생육가능한 형태 및 양의 뷰베리아 바시아나 품종 K4B3를 식물 또는 그 주변에 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항에 있어서,
상기 재현적으로 생육가능한 형태는 포자인 것을 특징으로 하는 방법.
하나 이상의 식물병원성 곤충을 방제하는 방법으로서,
상기 방법은 제 16 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 조성물을 식물 또는 그 주변에 적용하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44593) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44594) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V4 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00007) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44595) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 뷰베리아 바시아나 품종 K4B2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00010) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 레카니실리움 론기스포룸 품종 KT4L1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00009) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종; 및 패실로마이세스 푸모소로세우스 품종 K4P1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00008) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 진균을 추가로 적용하거나, 또는 상기 조성물들이 이들을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서,
적용하기에 앞서, 최종 농도가 약 1 gm/L 내지 약 3gm/L, 더 바람직하게는 최종 농도가 약 1gm/L가 될 때까지 상기 조성물을 물과 함께 섞는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서,
적용하기에 앞서, 최종 농도가 약 1 ml/L가 될 때까지 건조 보호제(desiccation protection agent)를 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 47 항에 있어서,
상기 건조 보호제는 식물유인 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 적용 시 밀리그램 당 10⁷ 개 이상의 진균 균류의 포자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 진균 균류의 포자를 포함하고, 상기 조성물은 헥타아르(hectare) 당 약 1 x 10¹⁰ 개 내지 1 x 10¹⁵ 개의 진균 균류의 포자의 비율이 적용된 것을 특징으로 하는 방법.
제 50 항에 있어서,
상기 조성물은 헥타아르 당 약 1 x 10¹² 개 내지 약 1 x 10¹⁴ 개의 포자의 비율이 적용된 것을 특징으로 하는 방법.
제 51 항에 있어서,
상기 조성물은 헥타아르 당 약 5 x 10¹² 개 내지 약 1 x 10¹⁴ 개의 포자의 비율이 적용된 것을 특징으로 하는 방법.
제 52 항에 있어서,
상기 조성물은 헥타아르 당 약 1 x 10¹³ 내지 약 3 x 10¹³ 개의 포자의 비율이 적용된 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44593) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 배양물; 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44594) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 배양물; 및 레카니실리움 무스카리움 품종 K4V4 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00007) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 배양물로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 레카니실리움 론기스포룸 품종 KT4L1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00009) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 배양물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 패실로마이세스 푸모소로세우스 품종 K4P1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00008) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물은 뷰베리아 바시아나 품종 K4B1 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM05/44595) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 배양물; 및 뷰베리아 바시아나 품종 K4B2 (호주 국립 측정 기관의 수탁번호 NM06/00010) 또는 이와 동등한 성질을 갖는 배양물 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적용은 분무에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.