CN104718281A - 具有抗真菌、抗菌和生长促进活性的芽孢杆菌属(bacillus sp.)菌株 - Google Patents

具有抗真菌、抗菌和生长促进活性的芽孢杆菌属(bacillus sp.)菌株 Download PDF

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Abstract

本文中公开一种产生具有杀虫活性的代谢物的芽孢杆菌(Bacillus)菌株芽孢杆菌属(Bacillus sp.)分离物F727。还提供衍生自芽孢杆菌属分离物F727的培养物的能够控制害虫的生物活性组合物和代谢物；以及使用所述菌株和其代谢物用于控制害虫的方法。

Description

具有抗真菌、抗菌和生长促进活性的芽孢杆菌属(BACILLUS SP.)菌株
相关申请案的交叉引用
本申请案主张2012年8月14日申请的美国临时专利申请案第61/683,174号和2013年3月15日申请的美国专利申请案第13/835,677号的益处；所述专利申请案的公开内容特此出于所有目的以全文引用的方式并入。
技术领域
本发明属于生物杀虫剂和害虫控制；特定言之微生物杀虫剂和产生所述微生物杀虫剂的微生物菌株的领域。
背景技术
天然产物是由微生物、植物和其它有机体产生的物质。微生物天然产物提供丰富的化学多样性来源，并且出于医药目的利用天然产物存在悠久的历史。尽管强调天然产物用于人类治疗法，其中超过50％衍生自天然产物，但仅有11％的杀虫剂衍生自天然来源。尽管如此，天然产物杀虫剂具有在常规和有机农场两者中在控制害虫方面起到重要作用的潜能。由微生物(细菌、放线菌和真菌)产生的二级代谢物提供新颖的化合物，其可以单独使用或与已知化合物组合使用以有效控制昆虫害虫并且降低抗性发展的风险。存在若干成功作为农业杀虫剂的微生物天然产物的众所周知的实例(Thompson等人,2000；Arena等人,1995；Krieg等人1983)。
微生物杀虫剂的发展开始于在纯培养物中分离微生物。其随后在温室中和在野外使用活体外、活体内或中试规模试验继续进行功效和波谱筛选。同时，由微生物产生的活性化合物经分离和识别。为了商业化微生物杀虫剂，微生物必须通过以工业规模发酵并且与审批通过的生物相容性添加剂一起调配来经济地生产，以增加功效并且最大化易于应用。随着对化学杀虫剂逐渐增加的抗性发展，可用杀虫剂的范围变窄。另外，非天然存在的杀虫剂可能具有有害的环境影响。因此，需要植物病原体尚未对其产生抗性并且具有最低限度环境影响的新的天然存在的杀虫剂。
发明内容
本文中公开一种具有杀虫活性的微生物菌株，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)分离物F727。这种菌株产生在控制害虫和促进植物生长中呈活性的生物活性代谢物。还公开了使用芽孢杆菌属分离物727和其代谢物用于控制害虫和促进植物生长的方法。在一具体实施例中，芽孢杆菌属可以具有NRRL B-50768的识别特征中的至少一个。
此外，芽孢杆菌属可以具有16S rRNA基因序列，其与在SEQ ID NO:3中阐述的共有序列具有至少99％的一致性并且确切地说99.5％的一致性，并且所述序列包含正向序列，其与在SEQ ID NO:1中阐述的序列具有至少99％的一致性并且确切地说995％的一致性，以及反向序列，其与在SEQ ID NO:2中阐述的序列具有至少99％的一致性并且确切地说99.5％的一致性。
更提供实质上纯的培养物或全细胞培养液，其包含所述菌株或细胞分离物、提取物、上清液及/或衍生自所述菌株或其提取物的物质或化合物。
更提供用于调节植物的害虫侵扰的方法，其包含向植物和/或其种子和/或用于生长所述植物的基质施加有效调节所述害虫侵扰的量的所述芽孢杆菌属分离物F727(和/或培养物、细胞分离物、提取物、上清液及/或衍生自所述菌株或提取物的物质或化合物)。在某些实施例中，害虫是植物真菌，例如霜霉属(Bremia)、葡萄孢属(Botrytis)、核盘菌属(Sclerotinia)、单丝壳属(Sphaerotheca)、丝核菌属(Rhizoctonia)、炭疽菌属(Colletotrichum)、镰孢菌属(Fusarium)、轮枝孢属(Verticillium)、疫霉属(Phytophthora)或离蠕孢属(Bipolaris)。在其它实施例中，害虫是细菌，例如欧文菌属(Erwinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、食酸菌属(Acidovorax)或棍状杆菌属(Clavibacter)。
还提供促进植物生长和/或种子发芽的方法，其中所述方法包含向植物和/或其种子和/或用于生长所述植物的基质施加有效促进植物生长和/或种子发芽的量的所述芽孢杆菌属分离物F727(和/或培养物、细胞分离物、提取物、上清液和/或衍生自所述菌株或提取物的物质或化合物)。
在具体实施例中，所述芽孢杆菌产生选自由以下组成的群组的化合物：
(a)化合物“A”，其
(i)可自芽孢杆菌属，确切地说芽孢杆菌属分离物727获得；
(ii)具有杀虫活性；
(iii)如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定，具有约1020-1060并且更确切地说1044的分子量；
(iv)具有δ7.15、6.72、4.81、4.70、4.65、4.40、4.35、4.25、4.15、3.85、3.65、3.50、3.22、2.85、2.80、2.65、2.45、2.35、2.30、2.20、1.95、1.55、1.31、1.20和0.85的1H NMR值；
(v)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18 HPLC(菲罗门(Phenomenex)，Luna 5μC18(2)100A，100×4.60mm)管柱上具有约6-12分钟，更确切地说约8分钟并且甚至更确切地说约8.31分钟的高压液相色谱(HPLC)滞留时间；
(vi)任选地含有47个碳、72个氢、12个氮和15个氧；并且
(vii)任选地是肽，并且可以包含谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)和天冬酰胺(3单位)；
(b)化合物“B”，其
(i)具有杀虫活性；
(ii)如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定，具有约1030-1080并且更确切地说1058的分子量；
(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18 HPLC管柱上具有约6-14分钟，更确切地说约8分钟并且甚至更确切地说约8.67分钟的高压液相色谱(HPLC)滞留时间；
(iv)任选地包含48个碳、74个氢、12个氮和15个氧；并且
(v)任选地是肽，并且可以包含谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)和天冬酰胺(3单位)；以及
(c)化合物“C”，其
(i)具有杀虫活性；
(ii)如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定，具有约1050-1120并且更具体地说1072的分子量；
(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18 HPLC管柱上具有约6-14分钟，更确切地说约9分钟并且甚至更确切地说约9.19分钟的高压液相色谱(HPLC)滞留时间；
(iv)任选地含有49个碳、76个氢、12个氮和15个氧；并且
(v)任选地是肽，并且可以包含谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)和天冬酰胺(3单位)。
本文中还提供具有以下特征的芽孢杆菌菌株：
(a)以下中的至少一者：
(1)与在SEQ ID NO:3中阐述的16SrRRNA序列具有至少99.5％一致性的核苷酸序列；
(2)与在SEQ ID NO:10中阐述的recA序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及
(3)与在SEQ ID NO:13中阐述的反向phoR序列具有至少90％一致性的核苷酸序列；
(b)产生一或多种化合物，其
(i)具有杀虫活性；
(ii)如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定，具有约1020-1120的分子量，并且
(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18HPLC管柱上具有约6-15分钟的高压液相色谱(HPLC)滞留时间；
(iv)任选地是肽；
(c)对卡那霉素(Kanamycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、氨苄青霉素(Ampicillin)、青霉素(Penicillin)、头孢呋辛(Cefuroxime)、哌拉西林(Piperacillin)、四环素具有抗性；并且
(d)具有碱性磷酸酶、酯酶、酸性磷酸酶以及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性。
还提供包含所述芽孢杆菌属分离物F727、衍生自所述菌株或其提取物的实质上纯的培养物、细胞分离物、提取物、上清液以及物质、代谢物或化合物，以及(a)可以是化学或生物杀虫剂的第二物质中的至少一个和(b)载剂、稀释剂、表面活性剂、佐剂中的至少一个。所述组合可以是组合物并且可以涂覆到种子上。
更提供用于调节植物的害虫侵扰的方法，其包含向植物和/或其种子和/或用于生长所述植物的基质施加有效调节所述害虫侵扰的量的所述组合。在某些实施例中，害虫是植物真菌，例如霜霉属、葡萄孢属、核盘菌属、单丝壳属、丝核菌属、炭疽菌属、镰孢菌属、轮枝孢属、疫霉属或离蠕孢属。在其它实施例中，害虫是细菌，例如欧文菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属、食酸菌属或棍状杆菌属。
更提供组合物，任选地与一或多种第二物质组合以调配杀虫组合物的用途，其中所述组合物选自由以下中的一或多者组成的群组：
(a)芽孢杆菌属分离物F727的实质上纯的培养物，
(b)芽孢杆菌属分离物F727的培养物的细胞分离物，
(c)自芽孢杆菌属分离物F727的培养物获得的上清液，
(d)自芽孢杆菌属分离物F727的培养物获得的滤液，
(e)(a)、(b)、(c)或(d)中的任一者的提取物，
(f)由芽孢杆菌属分离物F727的培养物产生的代谢物，
(g)化合物A，
(h)化合物B，和
(i)化合物C；
并且第二物质选自由以下组成的群组：
(a)杀虫剂，
(b)植物生长促进剂，
(c)载剂，
(d)佐剂，
(e)表面活性剂，
(f)肥料，以及
(g)抗植物病原剂。
附图说明
图1显示用于自培养物培养液获得本发明化合物的纯化流程的示意性图示。
图2描绘化合物“A”的ESI-LCMS色谱图。
图3描绘化合物“A”的(+)ESIMS。
图4描绘化合物“B”的ESI-LCMS色谱图。
图5描绘化合物“B”的(+)ESIMS。
图6描绘化合物“C”的ESI-LCMS色谱图。
图7描绘化合物“C”的(+)ESIMS。
图8描绘VLC溶离份3(图中的F727F3)和HPLC-纯化化合物A(图中的F727F3H11)、化合物B(图中的F727F3H14)以及化合物C(图中的F727F3H17)针对以下四种真菌病原体的生物活性：灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(图中的葡萄孢属)、银斑病病菌(Sclerotinia homeocarpa)(图中的核盘菌属)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)(图中的丝核菌属)以及玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)(图中的离蠕孢属)。
图9显示F727上清液对番茄中的灰葡萄孢的效果。以图中所指示的浓度用灰葡萄孢孢子接种，并且用来自芽孢杆菌属F727发酵的上清液(左起第二个条管柱)或(左起第三个条管柱)处理植株。对照物包括未接种植株(最左边的条管柱)和用两种不同浓度的真菌接种的未经杀虫剂处理的植株(左起第四和第五个条管柱)。
图10显示F727上清液对莴苣中的霜霉病(Downy Mildew)的效果。植株用芽孢杆菌属分离物F727上清液(F727)；瑞毒霉(Ridomil)处理或未经处理(UTC)。
图11比较F727上清液与环酰菌胺(Fenhexamid)对番茄中的葡萄孢属的效果。对已经以实验方式感染灰葡萄孢的植株用F727上清液再喷洒一次(F727上清液)或两次(F727上清液×2)，用水或环酰菌胺(())再喷洒，并且鉴定疾病严重程度。
图12比较F727上清液与环酰菌胺对胡椒中的葡萄孢属的效果。用来自芽孢杆菌属分离物F727发酵(F727)的上清液、水、(UTC)或环酰菌胺()喷洒植株。经喷洒植株随后以实验方式感染灰葡萄孢、生长并且在13天之后鉴定其疾病严重程度。
图13显示对感染白粉病(powdery mildew)并且用不同F727制剂处理的黄瓜的疾病控制的测量值。F727细胞在三种不同的培养基：SPY、SMP和TSB中生长，如图中所指示。对于这些生长条件中的每一者获得全细胞培养液、细胞(悬浮于10mM MgSO4中)以及上清液。水(图中的“去离子水”)用作阴性对照。还包括用于SMP培养基、SPY培养基、TSB培养基以及10mM MgSO4的空白。
图14显示对感染灰葡萄孢并且用不同F727制剂处理的番茄植株的疾病控制的测量值。F727细胞在三种不同的培养基：SPY、SMP和TSB中生长，如图中所指示。对于这些生长条件中的每一者获得全细胞培养液、细胞(悬浮于10mM MgSO4中)以及上清液。水(图中的“去离子水”)用作阴性对照。还包括用于SMP培养基、SPY培养基、TSB培养基以及10mM MgSO4的空白。
图15显示对感染白粉病的黄瓜植株的疾病控制的测量值。在用真菌孢子接种之前，用以下各者喷洒植株：水(图中的“去离子水”，阴性对照)、来自分离物F727发酵的全细胞培养液(MBI-110WCB)或多种商业杀虫剂(Double(Certis，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株D747)、(枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilus))、(短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus))或(大虎杖(Reynoutria sachalinensis))，或(大虎杖)与F727WCB的组合。
图16显示在感染致病疫霉(Phytophthora infestans)的番茄植株中的疾病控制的测量值。在用致病疫霉接种之前，用水(图中的“去离子水”，阴性对照)、Double(Certis，解淀粉芽孢杆菌菌株D747)或来自分离物F727发酵的全细胞培养液(MBI-110WCB)喷洒植株。
图17显示在活体外鉴定中，来自F727发酵的上清液和对照物对齐整小核菌(S.rolfsii)菌丝生长的效果。显示水(去离子水)、未过滤的F727上清液(未过滤的F727)、过滤的F727上清液(过滤的F727)和的效果。对于每一测试物质和对照物，评估两种体积：在每对条管柱中，最左边的条管柱显示使用25μL的结果，并且最右边的条管柱显示使用50μL的结果。
图18显示F727WCB土壤浸透对莴苣的霜霉病感染的效果。UTC：感染有大致5×l04个霜霉病孢子的未处理对照物莴苣植株；F727浸透：在用大致5×l04个霜霉病孢子接种之前一小时经历用F727 WCB土壤浸透的莴苣植株。以叶子/子叶被患病组织覆盖的百分比来测量疾病严重程度。
图19显示化合物A的ESIMS/MS结果。
图20显示化合物A的结构的示意图。
具体实施方式
尽管本文中公开的组合物和方法易受各种修改和替代形式影响，但本文中将详细描述例示性实施例。然而，应理解，不打算将本发明限制于所公开的具体形式，但是相反地，目的是覆盖属于如所附权利要求书所定义的本发明的精神和范围的所有修改、等效物和替代方案。
当提供一个范围的数值时，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在所述范围上下限之间的达到下限单位十分之一的各中间值，和所述范围内的任何其它所述值或中间值都包括在其中。还包括更小范围。这些更小范围的上限和下限也包括在其中，但不包括所述范围中的任何特定排除的界限。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的一般技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本发明的操作或测试中也可以使用与本文所描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但现在描述优选方法和材料。
必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如本文中和所附权利要求书中所用的单数形式“一(a/and)”和“所述”包括多个参考物。
如本文中所定义，“衍生自”意谓自具体来源直接分离或获得，或作为替代方案具有自具体来源分离或获得的物质或有机体的识别特征。在所述“来源”是有机体的情况下，“衍生自”意谓其可以自所述有机物本身或自用于培养或生长所述有机体的培养基分离或获得。
如本文中所定义，术语“全培养液培养物”或“全细胞培养液”是指含有细胞和培养基两者的液体培养物。如果细菌在培养盘上生长，那么可以在水或其它液体中采集细胞以提供全培养液培养物。
术语“上清液”是指当生长在培养液中或自琼脂培养盘在另一液体中采集的细胞通过离心、过滤、沉降或所属领域中熟知的其它手段经去除时剩余的液体。
如本文中所定义，“滤液”是指来自已经穿过膜的全培养液培养物的液体。
如本文中所定义，“提取物”是指通过溶剂(水、清洁剂、缓冲剂)自细胞去除并且通过离心、过滤或其它方法自细胞分离的液体物质。
如本文中所定义，“代谢物”是指自具有杀虫，并且确切地说杀菌或杀真菌活性的微有机体获得的微有机体或上清液、滤液或提取物的发酵的化合物、物质或副产物。如本文中所定义，“分离化合物”基本上不含其它化合物或物质，例如，至少为约20％纯净、优选地至少约40％纯净、更优选地约60％纯净、甚至更优选地约80％纯净、最优选地约90％纯净、并且甚至更优选地约95％纯净，如通过分析方法所测定，所述分析方法包括但不限于色谱法和电泳法。术语“代谢物”和“化合物”可以互换使用。
如本文中所定义，“载剂”是惰性、有机或无机材料，活性成份与其混合或调配以促进其应用到植物或其它待处理的目标，或促进其存储、运输和/或处理。
如本文中所定义，术语“调节”用于意谓改变害虫侵扰的量或害虫侵扰扩散的速率。
如本文中所定义，“害虫侵扰”是害虫以造成有害影响的量存在，所述有害影响包括宿主群体的疾病或感染或在生长系统中不希望出现的野草。
如本文中所定义，“杀虫剂”是衍生自增加植物害虫死亡率或抑制其增长率的生物产品或化学物质的物质，并且包括但不限于杀线虫剂、杀虫剂、植物杀真菌剂、植物杀菌剂以及植物杀病毒剂。
芽孢杆菌属F727的识别和特征
使用合并16S rRNA序列测定、脂肪酸分析、MALDI-TOF蛋白质分析和使用若干生物化学鉴定的表征的多相方法将芽孢杆菌属分离物F727识别为芽孢杆菌的新颖菌株。参见实例1到实例4，下文。
通过芽孢杆菌属F727的发酵产生的代谢物经分离和表征。参见下文实例5、实例25和实例26。这些代谢物中的某些针对真菌和细菌病原体在活体外和活体内两者展现活性。参见下文实例6到实例17、实例20、实例22、实例23以及实例27到实例29。还在多种植物上观察到来自芽孢杆菌属F727和其代谢物的植物生长促进效果。参见下文实例18和实例19以及实例21和实例24。
因此，芽孢杆菌属F727和/或其代谢物可在农业中用作用于控制真菌和细菌疾病；并且用于促进植物生长的天然产物。
生产方法
如上文所指出，化合物或代谢物可以从具有芽孢杆菌F727菌株的一或多种识别特征的有机体获得，为自其获得的或可以自其衍生。方法包含培养这些有机体并且通过从这些有机体的培养物分离这些化合物获得本发明的化合物和/或组合物。
确切地说，有机体在养分培养基中使用所属领域中已知的方法培养。有机体可以在允许细胞生长的条件下，通过振荡烧瓶培养、在合适的培养基中进行的在实验室或工业发酵器中的小规模或大规模发酵(包括但不限于连续、分批、分批进料或固态发酵)来培养。培养可以在包含碳和氮气来源以及无机盐的合适的养分培养基中使用所属领域中已知的程序进行。合适的培养基可以从商业来源获得或可以根据已公布的组合物制备。
在培养之后，所述芽孢杆菌菌株(例如，芽孢杆菌属F727)的上清液、滤液和/或提取物或衍生自所述芽孢杆菌菌株的滤液和/或提取物可用于调配杀虫组合物。
或者，在培养之后，可以自培养物培养液提取、浓化和/或纯化化合物和/或代谢物。
提取物可以通过色谱法分馏。可以使用所属领域中已知的方法鉴定色谱溶离份针对例如真菌(例如，葡萄孢属、核盘菌属、丝核菌属和离蠕孢属)的毒性活性。分馏可以使用相同或不同的色谱方法重复一或多次。
在一个实施例中，通过菌株F727产生的组合物包含一或多种化合物，所述化合物(i)具有杀虫活性；(ii)具有1020-1120之间的分子量，如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定；(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18HPLC管柱上具有6-15分钟之间的高压液相色谱(HPLC)滞留时间；并且任选地获自芽孢杆菌物种。化合物在一个实施例中是肽。
在一特定实施例中，化合物“A”(i)获自芽孢杆菌物种；(ii)对害虫呈毒性；(iii)具有约1020-1060并且更确切地说1044的分子量，如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定；(iv)具有δ7.15、6.72、4.81、4.70、4.65、4.40、4.35、4.25、4.15、3.85、3.65、3.50、3.22、2.85、2.80、2.65、2.45、2.35、2.30、2.20、1.95、1.55、1.31、1.20、0.85的1H NMR值；并且(v)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18 HPLC(菲罗门，Luna 5μC18(2)100A，100×4.60mm)管柱上具有约6-12分钟，更确切地说约8分钟并且甚至更确切地说约8.31分钟的高压液相色谱(HPLC)滞留时间。另外，化合物“A”揭示47个碳、72个氢、12个氮以及15个氧的信号，如通过1H NMR、l3CNMR和MS分析测定。1H NMR谱显示典型肽的特征。通过1H NMR、13C NMR、MS/MS和胺基酸分析对化合物“A”的详述分析揭示存在谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)以及天冬酰胺(3单位)。
在另一具体实施例中，通过菌株F727产生的化合物是化合物“B”，其(i)具有杀虫活性；(ii)具有约1030-1080并且更确切地说1058的分子量，如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定；并且(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18 HPLC管柱上具有约6-14分钟，更确切地说约8分钟并且甚至更确切地说约8.67分钟的高压液相色谱(HPLC)滞留时间。来自1H和13C NMR谱以及MS数据的数据揭示48个碳、74个氢、12个氮以及15个氧的信号。1H NMR谱显示典型肽的特征。通过1H NMR、13C NMR、MS/MS和胺基酸分析对化合物“B”的详述分析揭示存在谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)以及天冬酰胺(3单位)。
在又一具体实施例中，通过菌株F727产生的化合物是化合物“C”，其(i)具有杀虫活性；(ii)具有约1050-1120并且更确切地说1072的分子量，如通过液相色谱法/质谱分析(LC/MS)测定；并且(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％ CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18 HPLC管柱上具有约6-14分钟，更确切地说约9分钟并且甚至更确切地说约9.19分钟的高压液相色谱(HPLC)滞留时间。来自1H和13C NMR谱以及MS数据的数据揭示49个碳、76个氢、12个氮以及15个氧的信号。1H NMR谱显示典型肽的特征。通过1H NMR、13C NMR、MS/MS和胺基酸分析对化合物“C”的详述分析揭示存在谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)以及天冬酰胺(3单位)。
组合物
组合物可以包含芽孢杆菌菌株，确切地说具有芽孢杆菌属分离物F727的识别特征中的至少一个的芽孢杆菌菌株的全培养液培养物、全细胞培养液、液体培养基或悬浮液或自其衍生的全培养液培养物、全细胞培养液、液体培养基或悬浮液，以及自所述芽孢杆菌属获得的上清液、滤液或提取物。组合物还可以包含衍生自芽孢杆菌属分离物F727的一或多种代谢物或分离化合物，其尤其具有杀菌、杀真菌和/或植物生长促进活性。
以上所阐述的组合物可以任何方式调配例示性调配物包括但不限于可乳化浓缩液(EC)、可湿性粉剂(WP)、可溶液体(SL)、气雾剂、超低体积浓缩液溶液(ULV)、可溶粉剂(SP)、微型胶囊、水分散粒剂、流体(FL)、微乳液(ME)、纳米乳液(NE)等。在本文所描述的任何调配物中，活性成份的百分比在0.01％到99.99％范围内。
组合物可以呈液体、凝胶或固体形式。可以通过将固体载剂悬浮于一或多种活性成份的溶液中并且在温和条件下干燥所述悬浮液(诸如在室温下蒸发，或在65℃或低于65℃下真空蒸发)来制备固体组合物。
组合物可以包含凝胶囊封的一或多种活性成份。可以通过将凝胶形成剂(例如，明胶、纤维素或木质素)与活或不活化芽孢杆菌属菌株F727细胞的培养物或悬浮液，或与芽孢杆菌属菌株F727培养物或悬浮液的无细胞滤液或细胞分离物，或与芽孢杆菌属菌株F727的喷雾或冷冻干燥的培养物、细胞或细胞分离物；或与本发明的方法中所用的杀虫化合物的溶液混合；并且诱发剂的凝胶形成来制备所述凝胶囊封材料。
组合物可以另外包含用于以下目的的表面活性剂：乳化、分散、湿润、扩散、整合、控制崩解、稳定活性成份以及改良流动性或抑制衰退。在一具体实施例中，表面活性剂是非植物毒性非离子表面活性剂，其优选属于EPA清单4B。在另一具体实施例中，所述非离子表面活性剂为聚氧化乙烯(20)单月桂酸酯。一或多种表面活性剂的浓度可以在全部调配物的0.1％至35％范围内，优选范围是5％至25％。分散剂及乳化剂(例如非离子、阴离子、两性以及阳离子分散剂和乳化剂)的选择和用量由组合物的性质和试剂促进所述组合物分散的能力确定。
以上阐述的组合物可以与另一剂、微有机体和/或杀虫剂(例如，杀线虫剂、杀菌剂、杀真菌剂、杀螨剂、杀昆虫剂)组合。微生物包括但不限于芽孢杆菌属(例如，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、短小芽抱杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、拟青霉菌属(Paecilomyces sp.)、淡紫拟青霉菌(P.lilacinus)、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria sp.)、穿透巴斯德氏芽菌(P.penetrans)、铬细菌属(Chromobacterium sp.)、假单胞菌属、芽孢短杆菌属(Brevabacillus sp.)、轮枝菌属、白粉寄生孢属(Ampelomyces sp.)、伪曲霉菌属(Pseudozyma sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)(比基尼链霉菌(S.bikiniensis)、哥斯达黎加链霉菌(S.costaricanus)、阿维链霉菌(S.avermitilis))、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)、木霉菌属(Trichoderma sp.)、胶霉属(Gliocladium sp.)、阿维菌素(avermectin)、漆斑菌属(Myrothecium sp.)、拟青霉菌属(Paecilomyces spp.)、鞘胺醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)、线虫捕捉菌属(Arthrobotrys sp.)、Chlorosplmium、紫螺菌(Neobulgaria)、炭球菌(Daldinia)、曲霉菌(Aspergillus)、毛壳菌属(Chaetomium)、溶杆菌属(Lysobacter spp.)、纸形粒毛盘菌(Lachnum papyraceum)、萨克拉轮枝菌(Verlicilliumsuchlasporium)、少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)、厚孢轮枝菌(Verticilliumchlamydosporium)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)、厚垣普奇尼亚菌(Pochoniachlamydosporia)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)、发光类脐菇(Omphalotus olearius)、月夜菌(Lampteromyces japonicas)、布氏菌属(Brevudimonas sp.)、麝香霉属(Muscodorsp.)。
所述剂可以是具有杀线虫、杀真菌、杀菌和/或杀虫活性的天然油或油产品(例如石蜡油、茶树油、柠檬草油、丁香油、肉桂油、柑桔油、迷迭香油、除虫菊、柑桔油(包括但不限于苦橙、橙和柠檬油)；迷迭香油、多香果、香柑、蓝桉、甘菊、香茅、月橘、欧洲刺柏、普通薰衣草、普通没药、野薄荷(field mint)、小苍兰、灰色神圣亚麻(gray santolina)、神香草、圣罗勒(holy basil)、土沉香树、茉莉、熏衣草、万寿菊、薄荷、胡椒薄荷、金盏花、绿薄荷、依兰树、皂苷)。
此外，杀虫剂可以是单一位点抗真菌剂，其可包括(但不限于)苯并咪唑、去甲基化抑制剂(DMI)(例如，咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯氨基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外部抑制剂、喹啉、二甲酰亚胺、甲酰亚胺、苯基酰胺、苯氨基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烃、肉桂酸、羟基苯胺、抗生素、多氧菌素、酰胺、邻苯二甲酰亚胺、苯环型化合物(二甲苯基丙酸胺)；选自由以下组成的群组的去甲基化抑制剂：咪唑、哌嗪、嘧啶和三唑(例如，联苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、三唑酮、糠菌唑、环丙唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑)、腈菌唑以及醌外部抑制剂(例如，嗜球果伞素)。嗜球果伞素可以包括但不限于嘧菌酯、醚菌酯或肟菌酯。在又一具体实施例中，抗真菌剂是醌，例如喹氧灵(quinoxyfen)(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。抗真菌剂也可以衍生自虎杖(Reynoutria)提取物。
杀真菌剂也可以是多位点非无机化学杀真菌剂，其选自由以下组成的群组：氯腈、喹喔啉、磺酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸盐、氯化烷基硫代物(chloralkythios)、苯基吡啶胺以及氰基乙酰胺肟。
如上文所指出，组合物可以更包含杀线虫剂。杀线虫剂可包括(但不限于)化学物质，例如有机磷酸酯、氨基甲酸酯和熏剂，以及微生物产品，例如阿维菌素、漆斑菌属生物群系(坚强芽孢杆菌)、巴斯德氏芽菌属、拟青霉菌属，以及有机产品，例如皂苷和植物油。
组合物可以使用所属领域中已知的方法来施加。确切地说，这些组合物可以施加到并且围绕植物或植物部分。在本上下文中，植物应理解为意谓所有植物和植物群体，例如所需和非所需的野生植物或农作物植物(包括天然存在的农作物植物)。农作物植物可以是可以通过常规植物育种和最佳化方法，或通过生物技术和遗传工程改造方法，或通过这些方法的组合获得的植物，包括受植物育种者权利保护或不受其保护的转基因植物和植物品种。植物部分应理解为意谓植物在地面以上和地面以下的所有部分和器官，诸如枝条、树叶、花和根，可能提及的实例为叶子、针叶、秆、茎、花、果实体、果实、种子、根、块茎和根茎。植物部分还包括收获的物质，以及无性和有性繁殖物质，例如插条、块茎、根茎、分枝和种子。
用上文阐述的组合物处理植物和植物部分可以直接进行或通过使组合物通过例如浸没、喷洒、蒸发、成雾、分散、涂刷或注入来对植物的周围环境、生境或存储空间起作用。
本文中公开的组合物也可以使用所属领域中已知的方法施加到土壤。这些方法包括但不限于(a)滴灌或化学灌溉；(b)土壤合并；(c)土壤浸透；(d)种子处理和拌种；以及(e)裸根浸渍。
种子处理
种子处理包括在播种之前任选地与其它生物活性、拮抗或共生剂组合将如本文中所公开的组合物施加到种子的表面。本文中所公开的杀虫毒素、蛋白质和/或化合物可以在种植之前以干燥粉末、泥浆粉末的形式施加到种子或喷洒在种子上。
本文中所公开的组合物可以以下模式中的任一者经调配用于种子处理：干燥粉末、水可泥浆化粉末、液体熔液、可流动浓缩物或乳剂、乳液、微胶囊、凝胶或水可分散颗粒。
在干燥粉末的情况下，活性成份类似于可湿润粉末经调配，但要添加例如矿物油的粘着剂而非湿润剂。举例来说，按照由莱达古玛(Nandakumar)等人(2001)所描述的方法，在无菌条件下混合一公斤纯化滑石粉末(经除菌12小时)、15g碳酸钙以及10g羧甲基纤维素。以1:2.5比率(悬浮液比干燥混合物)混合一或多种活性成份，并且阴干产物以将水分含量减小到20-35％。
在将本文中所公开的组合物施加到种子的实施例中，可以在种植种子之前使用一或多种种衣剂以一或多个涂层的形式施加组合物，所述种衣剂包括(但不限于)乙二醇、聚乙二醇、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、泥煤苔、树脂以及蜡。也可以使用所属领域中已知的方法以单一位点、多位点或未知作用模式将组合物与例如化学杀真菌剂或杀菌剂组合施加到种子。
在其它实施例中，所公开的组合物可以通过种子渗吸或以粉末状接种物的形式施加到种子。
所述种子可以是常规种子或可以是转基因种子，例如自由链接(Liberty Link)(拜耳作物科学(Bayer CropScience))、朗达普立得种子(Roundup Ready Seed)(孟山都(Monsanto))，或其它除草剂抗性种子，和/或经工程改造为昆虫抗性的种子，或“pyrimaded”具有除草剂抗性和昆虫抗性基因的种子。
植物生长促进
在根围中的植物-细菌相互作用是土壤繁殖力和植物健康的重要决定因素。有益于植物生长的独立生存的细菌称为促植物生长的根围细菌(PGPR)。通常，植物生长促进剂以以下三种方法中的一者起作用：通过合成植物生长调节剂，通过促进土壤养分的摄取和/或通过防止植物疾病。因此，PGPR的效果可以是直接的以及间接的。间接植物生长促进可以涉及针对植物病原体的拮抗效果。这可以例如通过产生噬铁素、合成抗生素以及产生HCN和/或细胞壁降解酶来实现。直接植物生长促进效果是通过调节植物激素(其有助于植物和根发育以及针对逆境进行保护)以及溶解矿物磷酸酯和其它养分来实现。
本文中所公开的组合物、确切地芽孢杆菌属分离物F727和/或自芽孢杆菌属F727的培养物获得的上清液、滤液、提取物、化合物、代谢物或细胞部分可用于调节或更确切地促进植物生长，所述植物例如农作物，例如水果(例如，草莓)、蔬菜(例如，番茄、南瓜、胡椒、茄子)、豆科植物或谷类农作物(例如，大豆、小麦、水稻、玉米)、树、花、观赏植物、灌木(例如，棉花、玫瑰)、草皮(例如，一年生黑麦草、爬根草、野牛草(buffalo grass)、细弱剪股颖、匍匐翦股颖、马蹄金、硬羊茅、早熟禾、克育草(kikuyugrass)、多年生黑麦草、紫羊茅、粗茎早熟禾、海滨雀稗、野牛草(St.Augustinegrass)、高羊茅、结缕草等)、鳞基植物(例如，洋葱、大蒜)或藤本植物(例如，葡萄藤蔓)。组合物也可以用于调节一或多种植物的一或多种种子的发芽。
本文中所公开的组合物或调配产物可单独使用或以槽混合或以在生长季期间具有预定顺序和施加间隔的计划(连续施加称为轮换)与如下文所描述的一或多种其它组分(例如生长促进剂和/或抗植物病原体剂)组合使用。当与上述产品以低于产品标签上所建议的浓度组合使用时，两种或两种以上产品(其中的一种是本文中所公开的所述组合物)的组合功效在某些实施例中高于每一个别组分的效果的总和。因此，通过这两种(或更多种)产品之间的协同作用增强了效果，并且减少了植物病原性菌株的杀虫剂抗性发展的风险。
组合物可以通过在移植时的根浸渍施加，确切地通过在将水果或蔬菜移植入土壤中之前，将水果或蔬菜的根浸渍在所述组合物的悬浮液(约0.25％到约1.5％，并且更确切地约0.5％到约1.0％，按体积计)中用所述组合物处理水果或蔬菜。
或者，可以通过滴灌或其它灌溉系统施加组合物。确切地，组合物可以注入滴灌系统中。在一具体实施例中，组合物以1×108个集落形成单位(CFU)/毫升的浓度以每英亩大约11到大约4夸脱的体积施加。
在又一实施例中，组合物可以沟内施加的形式添加。确切地，可以使用经校准以输送2-6加仑/英亩的总输出的喷嘴在种植时将组合物以沟内喷雾的形式添加。将喷嘴放置在种植器上的开沟器中以使得杀虫剂施加与种子落入犁沟中同时进行。
所公开的组合物与例如固体或液体佐剂的混合物以已知方式制备。举例来说，可以通过均匀混合和/或研磨活性成分连同增量剂制备混合物，所述增量剂例如溶剂、固体载剂以及在适合情况下的表面活性化合物(表面活性剂)。组合物也可以含有其它成分以便获得特殊效果，所述其它成分例如稳定剂、粘度调节剂、粘合剂、佐剂以及肥料或其它活性成分。
与植物生长促进剂之组合
本文中所公开的组合物可与其它生长促进剂组合使用，所述生长促进剂例如合成或有机肥料(例如，呈颗粒状或液体形式的二铵磷酸盐)，堆肥茶，海菜提取物，单独或与例如IBA(吲哚丁酸)和NAA(萘乙酸)的植物生长调节剂组合用于对移植物进行生根激素处理的植物生长激素，例如IAA(吲哚乙酸)，以及生长促进微生物，例如PPFM(粉红着色兼性甲基营养生物)、芽孢杆菌属、假单胞菌、根瘤菌以及木霉菌。
抗植物病原性剂
本文中所公开的组合物也可以与其它抗植物病原性剂组合使用，所述抗植物病原性剂例如植物提取物、生物杀虫剂、无机农作物保护剂(例如铜)、表面活性剂(例如鼠李醣脂；甘地(Gandhi)等人,2007)，或具有杀虫特性的天然油，例如石蜡油和茶树油，或具有单一位点、多位点或未知作用模式的化学杀真菌剂或杀菌剂。如本文中所定义，“抗植物病原性剂”是调节植物病原体，确切地说导致植物的土传疾病的病原体的生长，或作为替代方案通过植物病原体防止植物感染的剂。植物病原体包括但不限于真菌、细菌、放线菌或病毒。
如上文所指出，抗植物病原性剂可以是单一位点抗真菌剂，其可包括(但不限于)苯并咪唑、去甲基化抑制剂(DMI)(例如咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯氨基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外部抑制剂、喹啉、二甲酰亚胺、甲酰亚胺、苯基酰胺、苯氨基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烃、肉桂酸、羟基苯胺、抗生素、多氧菌素、酰胺、邻苯二甲酰亚胺、苯环型化合物(二甲苯基丙酸胺)。在一更具体的实施例中，抗真菌剂是去甲基化抑制剂，其选自由以下组成的群组：咪唑、哌嗪、嘧啶以及三唑(例如，联苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、三唑酮、糠菌唑、环丙唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑)。在一最具体的实施例中，抗真菌剂是腈菌唑。在又一具体实施例中，抗真菌剂是醌外部抑制剂(例如，嗜球果伞素)。嗜球果伞素可以包括(但不限于)嘧菌酯、醚菌酯或肟菌酯。在又一具体实施例中，抗真菌剂是醌，例如喹氧灵(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。
在又一实施例中，杀真菌剂是多位点非无机化学杀真菌剂，其选自由以下组成的群组：氯腈、喹喔啉、磺酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、氯化烷基硫代物、苯基吡啶胺以及氰基乙酰胺肟。
在又一实施例中，抗植物病原性剂可以是链霉素、四环素、土霉素、铜或春雷霉素(kasugamycin)。
实例
实例1：通过16S rRNA、recA和phoR序列分离和表征芽孢杆菌属分离物F727
使用传统的培养盘稀释方法将芽孢杆菌属菌株F727从在加利福尼亚州(CA)的琼斯维尔(Jonesville)收集的土壤样品分离。通过PCR扩增以及使用通用细菌(UniversalBacterial)引物将16S rRNA、recA和phoR基因定序将分离物识别为黄杆菌属。塞里托斯(Cerritos)等人(2008)国际系统细菌学与净化(Int.J.Sys.Evol Microbiol.)58:919-923；郭(Guo)等人(2012)加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol)58:1295-1305。
用无菌环从24小时的马铃薯右旋糖培养盘上刮下生长物，并且使其再悬浮于DNA提取缓冲液中。使用MoBio超洁净微生物(MoBio Ultra Clean Microbial)DNA提取试剂盒提取DNA。通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5uL等分试样来检查DNA提取物的品质/数量。
rRNA序列
通过将2μL洁净DNA提取物与25μL GoTaq绿色预混液(Green Mastermix)、1.5μL正向引物(FD1引物，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO:4)以及1.5μL反向引物(RD1引物，5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'(SEQ ID NO:5))组合以设置用于扩增16S rRNA基因的PCR反应。用无菌不含核酸酶的水将反应体积调节到50μL。在以下条件下使用热循环仪机进行扩增反应：在95℃(初始变性)下10分钟，在94℃下30个45秒的周期，在55℃下45秒并且在72℃下2分钟，随后在72℃(最终延伸)及最终保持温度10℃下5分钟。
通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5μL等分试样并且比较产物条带与质量阶梯来评估扩增产物的尺寸、质量和数量。
使用MoBio PCR清理试剂盒将过量引物、核苷酸、酶以及模板从PCR产物中去除。使用上文描述的引物使清洁PCR产物经受直接定序。
使用生物编辑(BioEdit)软件将正向序列与反向序列进行比对，并且创建1459bp共有序列。
F727 FD1 16S序列：
TATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCNAGAACCTTACCANGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACNNNGGNGCATGGNNGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTAAGTCCCGCACNAGCGCAACCCNTTGATCTTANTTGCCAGCATTCANTTGGNNNNNNNNNNNNNACTGCCNNNACNANCCGNNNAAGGNNNGGGNATNACGTNNANNNATNCNNGCCCNNNNTGACNNNNNNCACNCCNNNNNNNNNNANNGNNNNNNAANNANNGGGNCNNNNNGNNNNNNAAANNNCNNNCNCNNNNGNGNN(SEQ ID NO：1)
F727 RD1 16S序列：
TCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCCACGCTTTCGCTCCCTCAGCGTCAGTTACAGACCCAGAGAGTCGCCTTCGCCCCACTGGTGTTCCTCCACATCCTCTACGCATTTCACCCGGCTACAACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCCAGTTTCCAATGACCCCTCCCCGGTTGAGCCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAAGAAACCCGCGTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACACGCTTGGCCACCTACGTATTACCGCGCTTGCTTGGCACGTTAGTAGCCGTGGCTTTTCTGGTTAGTTAACCGTCAGTGCCGCCTATTCGGAACGGTACTTGTTCTTCCCTACACAGAGCTTTACGATCGAAACTCATCACCTCCACGCGCGTGCTCGTCAGAACTTTCGTCATGCGAAGATCCTACTGCTGCCTCCGTAGGGTTGGCGTTTCTCTCAGTCCAGTGGCCATACGTCAGTAGCTAGCCATCGTGCCTAGTGAGCGTTACCTCACCCACCTAGGC(SEQ ID NO：2)
F727共有16S序列：
TATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGGTTTCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGGCTCAACCGGGGAGGGGTCATTGGAAACTGGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTTGTAGCCGGGTGAAATGCGTAGAGGATGTGGAGGAACACCAGTGGGGCGAAGGCGACTCTCTGGGTCTGTAACTGACGCTGAGGGAGCGAAAGCGTGGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA(SEQ ID NO：3)
使用BLAST将菌株F727的16S rRNA基因共有序列与细菌域的代表的那些可获得的序列相比较。最接近的物种匹配是与芽孢杆菌属(寄存编号GU250449.1)，相似性为99％。公开可获得的数据库中没有一个16S序列显示与菌株F727的100％相似性。
另外，使用EzTaxon-e服务器(eztaxon-e.ezbiocloud.net/；金(Kim)等人，2012)基于16S rRNA序列数据分析共有序列。最接近的匹配(在表1中显示)包括属芽孢杆菌属的若干物种的类型菌株，所述物种不能仅基于16S rRNA序列区分。
表1
recA序列
通过将2μL洁净DNA提取物与25μL GoTaq绿色预混液、1.5μL正向引物(recAf，5'-GATCGTCARGCAGSCYTWGAT-3'，SEQ ID NO:6)以及1.5μL反向引物(recAr，5'-TTWCCRACCATAACSCCRAC-3'，SEQ ID NO:7)组合以组装用于扩增recA基因的PCR反应。用无菌不含核酸酶的水将反应体积调节到50μL。在以下条件下使用热循环仪机进行扩增反应：在95℃(初始变性)下5分钟，在95℃下30个30秒的周期，在45℃下30秒并且在72℃下1分钟，随后在72℃(最终延伸)及最终保持温度4℃下5分钟。
通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5μL等分试样并且比较产物条带与质量阶梯来评估PCR产物的尺寸、质量和数量。
使用MoBio PCR清理试剂盒将过量引物、核苷酸、酶以及模板从PCR产物中去除。使用上文描述的引物使清洁PCR产物经受直接定序。
使用生物编辑软件将正向序列与反向序列进行比对，并且创建505bp共有序列。
F727正向recA序列：
AACATTCGGCAAGGTTCCATCATGAAACTCGGGGAAAAGACGGATACAAGAATTTCAACAGTTCCGAGCGGTTCCCTTGCACTTGATACCGCTCTCGGAATAGGCGGATACCCGCGCGGACGGATTATTGAAGTATACGGACCTGAAAGCTCAGGTAAAACGACTGTAGCGCTTCATGCGATTGCTGAAGTTCAGGAGAAAGGCGGACAAGCCGCATTTATTGATGCTGAGCATGCCCTTGACCCTGTTTACGCGCAAAAGCTCGGTGTAAATATTGAGGAGCTGCTGCTTTCTCAGCCTGATACGGGAGAGCAGGCGCTTGAGATTGCCGAAGCGCTGGTACGAAGCGGAGCCGTCGATATCGTAGTTGTCGACTCTGTTGCGGCGCTTGTCCCGAAAGCTGAAATCGAAGGAGACATGGGGGATTCCCACGTCGGTTTGCAGGCCCGTTTGATGTCTCAAGCGCTCCGTAAGCTTTCCGGTGCCATCAATAAATCTAAAACAATCGCAATCTTTATTAACCAAATTCGTGAAAAAGTCGGCGTTAGGGTCGGAAAAAA(SEQ ID NO：8)
F727反向recA序列：
GTATAAGATTGCGATTGTTTTAGATTTATTGATGGCACCGGAAAGCTTACGGAGCGCTTGAGACATCAAACGGGCCTGCAAACCGACGTGGGAATCCCCCATGTCTCCTTCGATTTCAGCTTTCGGGACAAGCGCCGCAACAGAGTCGACAACTACGATATCGACGGCTCCGCTTCGTACCAGCGCTTCGGCAATCTCAAGCGCCTGCTCTCCCGTATCAGGCTGAGAAAGCAGCAGCTCCTCAATATTTACACCGAGCTTTTGCGCGTAAACAGGGTCAAGGGCATGCTCAGCATCAATAAATGCGGCTTGTCCGCCTTTCTCCTGAACTTCAGCAATCGCATGAAGCGCTACAGTCGTTTTACCTGAGCTTTCAGGTCCGTATACTTCAATAATCCGTCCGCGCGGGTATCCGCCTATTCCGAGAGCGGTATCAAGTGCAAGGGAACCGCTCGGAACTGTTGAAATTCTTGTATCCGTCTTTTCCCCGAGTTTCATGATGGAACCTTTGCCGAATTGTTTTTCTATTTGCTTAAGAGCCATATCWAAGRCTGWAWTRAMRATCAA(SEQ ID NO：9)
F727共有recA序列：
AAGGTTCCATCATGAAACTCGGGGAAAAGACGGATACAAGAATTTCAACAGTTCCGAGCGGTTCCCTTGCACTTGATACCGCTCTCGGAATAGGCGGATACCCGCGCGGACGGATTATTGAAGTATACGGACCTGAAAGCTCAGGTAAAACGACTGTAGCGCTTCATGCGATTGCTGAAGTTCAGGAGAAAGGCGGACAAGCCGCATTTATTGATGCTGAGCATGCCCTTGACCCTGTTTACGCGCAAAAGCTCGGTGTAAATATTGAGGAGCTGCTGCTTTCTCAGCCTGATACGGGAGAGCAGGCGCTTGAGATTGCCGAAGCGCTGGTACGAAGCGGAGCCGTCGATATCGTAGTTGTCGACTCTGTTGCGGCGCTTGTCCCGAAAGCTGAAATCGAAGGAGACATGGGGGATTCCCACGTCGGTTTGCAGGCCCGTTTGATGTCTCAAGCGCTCCGTAAGCTTTCCGGTGCCATCAATAAATCTAAAACAATCGCAATCTT(SEQ ID NO：10)
使用BLAST将菌株F727(SEQ ID NO：10)的recA基因共有序列与代表性细菌序列相比较。最接近的物种匹配是与解淀粉芽孢杆菌(寄存编号CP002927.1)的全基因组，相似性为92％。
phoR序列
通过将2μL洁净DNA提取物与25μL GoTaq绿色预混液、1.5μL正向引物(phoR-f：5′-TTYARYTCATGRGAVACATT-3′，SEQ ID NO：11)以及1.5μL反向引物(phoR-r：5′-GGNTAYAAANARGAGGAGCC-3′，SEQ ID NO：12)组合以组装用于扩增phoR基因的PCR反应。用无菌不含核酸酶的水将反应体积调节到50μL。在以下条件下使用热循环仪机进行扩增反应：在95℃(初始变性)下5分钟，在95℃下35个45秒的周期，在48℃下45秒并且在72℃下1分钟，随后在72℃(最终延伸)及最终保持温度4℃下10分钟。
通过在1％琼脂糖凝胶上电泳5μL等分试样并且比较产物条带与质量阶梯来评估PCR产物的尺寸、质量和数量。
使用MoBio PCR清理试剂盒将过量引物、核苷酸、酶以及模板从PCR产物中去除。使用上文描述的引物使清洁PCR产物经受直接定序。
使用上文描述的反向引物获得998核苷酸phoR序列。
F727反向phoR序列：
TCGTTGTCTGTATCATATTGGTTTTCAGTGTTCTCGGCCTTTTCTTGCAGCAGCTCATTTCTTCATCCGCCAAGGAAAGAACGGAGGGACAGCTTGAAAAGGAAGCCGCATACATAGCCGGACTCCTTGACGCCGGCCAAGTAAACAATAAAAGAAACGAAACGGTCATTAAAGATGCCAGCCGTACATTAGATATCGACGTGTCCGTATTAAATGAAAAAGGCCGCGGTTTATATCACTCAGGCAGACGCGCTGATGACTCGGCTATAAAGGAATTCGTCTCCCGTAATAAAAATGCGGCGGCGATTCAGAACGGAGAGAAAGTATGGCATGGAACGGCCCTTAAAAACGCCGCCGGCCAAACGGCGGGATATGTGCTCGTTTCCTCGCGGATCGATAAAGGTTCGAATATAACAGGGGAAATGTGGGGCATGCTGGCTGCAAGCCTTTGTACTGCTTTTATTATTATCGTTTTCTTCTATACGAATATGACCTCCCGTTACAAAAGGTCAATCGACTCCGCGACAAAAGTGGCCACTGAGCTGTCTAAGGGGAACTATGACGCCCGCTCCTACGGCGGGTACGCAAGACGCTCAGACCGTCTCGGGCGCGCTATGAACAGCCTCGCTGTGGATTTGATGGAAATGACGAGAACGCAGGATATGCAGCGCGACCGCCTGCTGACCGTCATCGAAAATATCGGATCAGGTTTGATTTTAATAGACGGGAGAGGCTTTATTAATCTCGTGAACAGGTCGTATACGAAGCAGTTCCATACAAATCCTGAACGTCTGCTTCGGCGTCTCTACCATGACGCATTTGAGCATGAGGAAATCATTCGGCTGGTCGAAGACATCTTTATGACAGAAACGAAGAAACGCCAGCTGCTCACGCTTCCCATCAAAATCGAACGGCGCTATTTTGAGGTTGACGGCGTCCCGATTATGGGCCCTGACGATGAATGGAAAAGGCATTGTTCTCGTGTTTCATGATATGAC(SEQ ID NO：13)
使用BLAST将phoR反向序列与代表性细菌序列相比较。最接近的物种匹配是与若干解淀粉芽孢杆菌菌株的全基因组，相似性仅为83％。
实例2：分离物F727的脂肪酸组合物
根据商业标准，在MIDI实验室公司(MIDI Labs，Inc)(特拉华州(DE)，纽瓦克(Newark))进行分离物F727的脂肪酸表达谱。结果在表2中显示。其脂肪酸表达谱与RTSBA6 6.10脂肪酸数据库的比较显示，分离物F727与枯草芽孢杆菌具有0.885的相似性指数。
表2
实例3：通过MALDI-TOF蛋白质表达谱表征分离物F727
在MIDI实验室公司(特拉华州，纽瓦克)进行分离物F727的MALDI-TOF质谱蛋白质文图。分离物F727显示不同于存在于质谱数据库中的任何其它微有机体的MALDI-TOF蛋白质表达谱的MALDI-TOF蛋白质表达谱。观察到一些与死谷芽孢杆菌、莫氏芽孢杆菌以及枯草芽孢杆菌的蛋白质表达谱的相似性；然而，没有一个相似性评分足够高以指示即使是通用匹配。
实例4：芽孢杆菌属分离物F727的生物化学表征
革兰氏(Gram)染色
革兰氏染色是基于细胞壁的物理特性，主要是肽聚糖的组成分化细菌的方法。革兰氏阳性细菌分离物具有厚肽聚糖层，其产生紫色/蓝色染色；而革兰氏阴性细菌分离物在细胞壁中具有较薄肽聚糖层，其产生红色/粉色染色。在革兰氏染色之后对分离物F727的显微检查揭示紫色细胞，其指示芽孢杆菌属分离物F727是革兰氏阳性细菌。
尿素酶活性
使用尿素酶测试检测酶尿素酶的活性，所述活性催化尿素到氨和碳酸氢盐的转化。尿素培养液含有尿素和pH指示剂酚红。指示剂在酸性环境中变黄并且在碱性环境中变粉。如果存在尿素酶酶活性，那么培养液中的尿素被降解以产生氨，并且培养基变粉，从而指示阳性测试。
在用分离物F727接种之后，尿素培养液从红色到黄色改变颜色，从而指示对于尿素酶活性的阴性测试。因此，芽孢杆菌属分离物F727创建酸性环境，其指示不存在尿素酶活性。
过氧化氢酶活性
过氧化氢酶测试用于检测酶，过氧化氢酶的活性。过氧化氢酶将过氧化氢分解为氧和水。当用过氧化氢处理时，具有过氧化氢酶活性的有机体产生气泡。在将试剂施加到芽孢杆菌属分离物F727的培养物的数秒内形成气泡，其指示这种有机体具有过氧化氢酶活性。
氧化酶活性
氧化酶测试用于检测是否存在细胞色素c氧化酶活性。含有细胞色素c作为其呼吸链一部分的细菌为氧化酶阳性并且使试剂变紫。相反，氧化酶阴性的细菌不氧化试剂，使其保持无色。芽孢杆菌属分离物F727使试剂变紫，表明其具有氧化酶活性。
TSI琼脂
三糖铁(TSI)琼脂用于测定微有机体发酵葡萄糖、乳糖和/或蔗糖的能力，以及肠道细菌产生硫化氢的能力。培养基含有pH指示剂酚红以及硫酸亚铁，其与硫化氢反应以产生黑色沉淀。当分离物F727经测试时，倾斜保持红色而尾部从红色变为黄色，并且没有观察到黑色。这些结果指示分离物F727不产生硫化氢，并且仅发酵葡萄糖而不发酵乳糖或蔗糖。
抗生素易感性
使用抗生素盘在穆勒-辛顿(Muller-Hinton)培养基上测试芽孢杆菌属分离物F727的抗生素易感性。使一铂环量的F727再悬浮于1mL无菌去离子水中，并且将100μL这种悬浮液划到米勒-辛顿(Mueller-Hinton)琼脂培养盘上。在条纹被吸收入琼脂中之后，将预装载抗生素盘放置在培养盘上，并且在25℃下培育培养盘48小时。结果呈现于表3中。
*+++指示高度易感(无生长)；++指示中度易感(减少的生长)；-指示不易感
API ZYM条带
API ZYM条带(BioMerrieux)提供测试微生物的各种酶活性的方法。根据制造商的说明书进行鉴定，并且结果的概述在表4中显示。
表4
API 20NE条带
20NE条带由20个含有脱水基质的微管组成。常规测试用重组成培养基的芽孢杆菌属分离物F727悬浮液接种。代谢在微管中产生颜色变化。同化测试用基本培养基接种，并且如果细菌能够利用基质，那么芽孢杆菌属分离物F727生长。根据制造商的读数表分析反应，并且结果概括在表5中。
实例5：化合物A、B和C的分离与表征
纯化程序
以下程序(在图1中概述)用于纯化从芽孢杆菌属分离物F727的细胞培养物提取的化合物。
用安伯来特(Amberlite)XAD-7树脂(阿苏卡(Asolkar)等人,2006)通过在室温下以155rpm振荡细胞悬浮液连同树脂两小时从芽孢杆菌属分离物F727在生长介质中的1-L发酵提取培养物培养液。通过用粗棉布过滤来收集树脂和细胞团块，并且用去离子水洗涤以去除盐。随后将树脂、细胞团块和粗棉布在丙酮中浸没2小时，之后过滤丙酮，并且使用旋转式蒸发器在真空下将其干燥以得到粗提取物。
使粗提取物经受逆相C18真空液相色谱(VLC，H2O/CH3OH；梯度80:20到0:100％)以产生6份溶离份。使用旋转式蒸发器浓缩这些溶离份到干燥，并且使用琼脂-盘鉴定筛检所得干燥残余物的生物活性。参见下文实例16。这一鉴定将C-18 VLC溶离份3识别为具有杀真菌活性。
使活性溶离份3经受反相HPLC(光谱系统P4000(Spectra System P4000)(赛默科技公司(Thermo Scientific))以得到纯化合物，随后以上述生物鉴定对其进行筛检以定位/识别活性化合物。
使用在8mL/min流动速率下的水:乙腈(CH3CN)(含有0.01％ TFA)梯度溶剂系统(0-10min；70％水性CH3CN，10-20min；70-45％水性CH3CN，20-40min；45-30％水性CH3CN，40-60min；30-0％CH3CN，60-65min；100％ CH3CN，65-70min；0-30％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在HPLC C-18管柱(菲罗门，Luna 10u C18(2)100A，250×30)上进一步纯化活性溶离份3。获得三种纯化化合物：
化合物A(F727F3H11)，其具有35.95min的滞留时间，
化合物B(F727F3H14)，其具有37.26min的滞留时间，以及
化合物C(F727F3H17)，其具有38.11min的滞留时间。
质谱分析
在LCQ DECA XPplus质谱仪(热电子公司(Thermo Electron Corp.,)，圣何塞(SanJose)，加利福尼亚州)上以全扫描模式(m/z 100-1500Da)使用正电离及负电离模式，在热菲尼根(Thermo Finnigan)LCQ Deca XP Plus电喷雾(ESI)仪器上进行化合物A、B和C的质谱分析。使用配备有菲尼根测量器(Finnigan Surveyor)PDA加检测器，自动取样器加MS泵，以及4.6mm×100mm Luna C18 5μm管柱(菲罗门)的热高效液相色谱法(HPLC)仪器。溶剂系统由水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成。移动相开始于10％溶剂B，并且历经20分钟线性增加到100％溶剂B并且随后维持在100％溶剂B下4分钟，并且最后历经3分钟返回到10％溶剂B并且维持在10％ B下3分钟。流动速率为0.5mL/min。注射体积是10μL，并且使样本在室温下保持在自动取样器中。
利用LC和反相色谱法通过LC-MS分析化合物。在以下条件下进行本发明化合物的质谱分析：将氮气的流动速率分别固定在鞘流和辅助/吹扫气体流动速率的30和15arb下。用设定为5000V的喷雾电压和35.0V的毛细管电压进行电喷雾电离。毛细管温度设定在400℃下。在Xcalibur软件上分析数据。
基于以负电离模式的在1043.84(M-H)处的分子态离子峰，化合物A(F727F3H11)的分子量测定为1044(图2)。这一测定结果由正电模式ESIMS中的电离模式支持，其显示在1045.48(M+H)处的峰以及在1067.55(M+Na)处的伪分子态离子峰(图3)。
基于以负电离模式的在1057.83(M-H)处的分子态离子峰，化合物B(F727F3H14)的分子量测定为1058(图4)。这一测定结果由正电模式ESIMS中的电离模式支持，其显示在1059.56(M+H)处的峰以及在1081.63(M+Na)处的伪分子态离子峰(图5)。
基于以负电离模式的在1071.85(M-H)处的分子态离子峰，化合物C(F727F3H17)的分子量测定为1072(图6)。这一测定结果由正电ESIMS中的电离模式支持，其显示在1073.57(M+H)处的峰以及在1095.62(M+Na)处的伪分子态离子峰(图7)。
用于溶离份和纯化合物的抗真菌测试的加鉴定方法
如下测试溶离份和纯化合物的抗真菌活性。将过滤盘放置在培养基大小的皮氏培养皿(petri dish)的每一四分之一部分中(总共四个盘)。每一个盘都放置在距离培养皿中心2cm处。将15μL管柱溶离份或纯化合物(20mg/mL)分配到两个彼此相对的盘中的每一者的表面上。将乙醇分配在其它两个盘上作为对照物。装载过滤盘之后，将较小的真菌栓(大约l×1cm)放置在皮氏培养皿的中心。所使用的真菌病原体为玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)、灰葡萄孢、银斑病病菌以及水稻纹枯病菌。在25℃下培育培养板，并且在48小时之后，测量每一过滤盘周围的抑制区。VLC溶离份3以及化合物A、B和C的结果在图8中显示；并且其指示，所有三种化合物都具有显著的杀真菌活性。
化合物A、B和C的氨基酸分析
通过液相水解(6N HCl、1％苯酚，110℃，24小时，在真空中)水解化合物A(F727F3H11，0.05mg)。在冷却之后，干燥反应混合物并且将水解产物溶解于正白氨酸稀释缓冲液中达到1.0mL的体积。将这一样品的50μL等分试样装载到离子交换管柱上用于分析。
为了标准和校准，使用用于在基于钠的日立(Hitachi)8800(西格马(Sigma)，A-9906)上的蛋白质水解产物的氨基酸标准溶液来测定反应因素，并且因此校准日立8800分析器用于所有氨基酸。每一注射含有正白氨酸作为内标，以允许校正结果用于样品体积的变量和色谱变量。所述系统利用皮克林(Pickering)钠缓冲剂、皮尔斯斯昆纳(Pierce Sequanal)等级HCl(水解)、跨基因组离子交换(Transgenomic Ion-Exchange)管柱以及由分子结构设施(Molecular Structure Facility)(MSF)，UC戴维斯(UC Davis)开发的最佳化方法。报导了存在于每一样品中的个别氨基酸。发现存在于化合物A中的氨基酸为谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)以及天冬酰胺(3单位)。
以类似方式分析化合物B和C的氨基酸组合物。发现化合物B和C具有与化合物A相同比率的相同氨基酸。
实例6：芽孢杆菌属分离物F727对番茄植株中的葡萄孢属的效果
用来自F727发酵的上清液处理番茄植株(Solanum lycopersicum)变种罗马(Roma)。用大约3ml无细胞发酵上清液喷洒每一植株。使植株干燥，并且随后用浓度为6.67×107个孢子/毫升的2ml灰葡萄孢孢子悬浮液接种。以14盎司/100加仑/英亩的速率，用去离子水喷洒对照植株，两个阴性对照植株仅用孢子喷洒(浓度为1×107个孢子/毫升以及6.67×l07个孢子/毫升)，并且用65.2WG(嘧菌环胺(Cypronidil)和咯菌腈(Fludioxonil)，由拜耳农作物科学有限公司(Bayer Crop Sciences,Inc.)出售)喷洒阳性对照植株。一式三份进行处理。将植株放置在具有光和恒定温度控制的生长房间中的透明塑料储仓中。在处理之后8天进行疾病评级。通过目测评估疾病的叶区域症状评估植株的疾病严重程度，并且获得疾病评级。参见例如，WC詹姆斯(WC James)(1971)“植株疾病评估关键手册(A Manual of Assessment Keys in Plant Diseases)”，美国植物病理学协会(American Phytopathological Society).ISBN 978-0-89054-081-7。在图9中显示的结果显示，在用F727上清液处理的感染植株中疾病严重程度从65％(感染，未处理对照物)降低到40％。
在额外实验中，测试了F727 WCB的两倍、四倍以及十倍稀释液。使用来自两个独立发酵的WCB，在所有三种稀释液下观察到疾病严重程度的降低。
实例7：芽孢杆菌属F727对莴苣中的霜霉病(Downey Mildew)的效果
以每盆四株幼苗的密度种植莴苣植株(Lactuca sativa)变种芹莴(Celtuce)。每盆用2ml F727发酵上清液喷洒。
使植株干燥，并且随后用2ml莴苣霜霉病菌(Bremia lactuca)(霜霉病)孢子悬浮液(1×105个孢子/毫升)接种。用5份复制品进行处理。在15℃下于生长箱中伴以12小时光周期，在用塑料盖密封的托盘中培育经处理植株。在处理之后10天，如实例6中所描述评估疾病严重程度。
结果在图10中显示。未处理对照物中的平均疾病严重程度是54.47％，而用F727处理的植株显示仅14.64％的疾病严重程度。F727处理植株中的疾病严重程度与在用化学对照物GOLD EC(4％ w/w甲霜灵(metalaxyl)-M和64％ w/w代森锰锌(mancozeb))(150ppm活性成分)(先正达(Syngenta))处理植株之后获得的疾病严重程度相当，其提供11.67％的严重程度。
在额外实验中，测试了F727 WCB的两倍、四倍以及十倍稀释液。使用来自两个独立发酵的WCB，在所有三种稀释液下观察到疾病严重程度的降低。
实例8：芽孢杆菌属F727与艾勒维特的效果的比较
用3ml F727发酵上清液处理番茄植株(Solatium lycopersicum)变种罗马并且使其干燥。随后用大致2ml灰葡萄孢孢子悬浮液(2.8×107个孢子/毫升)接种植株。在2小时之后或在初步处理干燥之后用F727再次喷洒感染植株的子组。还用水(阴性对照)和 50 WDG(环酰菌胺，拜耳农作物科学有限公司)(作为阳性对照)处理接种植株。
用4份复制品进行处理。在处理之后九天，如实例6中所描述评估疾病严重程度。结果在图11中显示。水对照物的疾病严重程度是38.3％，而阳性对照(50 WDG，环酰菌胺，拜耳农作物科学有限公司)将疾病严重程度降低到13.33％。用1×和2×F727上清液处理的植株分别具有8.3％和5％的疾病严重程度。
实例9：F727上清液对胡椒中的灰葡萄孢(B.cinerea)感染的效果
用大致2ml F727上清液喷洒胡椒植株(Capscicum annuum)变种墨西哥辣椒(Serrano)并且使其干燥。随后用2ml灰葡萄孢的孢子悬浮液(2.7×107个孢子/毫升)接种植株。一式三份处理植株。在处理之后十三天，评估疾病严重程度，并且与未处理对照物(用水喷洒)和以标签速率施加的阳性对照(用50 WDG(环酰菌胺，拜耳农作物科学有限公司)喷洒)相比较。
在图12中显示的结果指示，在已经用F727处理的灰葡萄孢感染植株中的疾病控制与通过用处理植株所获得的疾病控制相当。
实例10：针对黄瓜上的白粉病评估通过在三种培养基中发酵所产生的F727全细胞培养液、上清液和细胞。
在三种不同的生长培养基(SPY、SMP和TSB)中发酵F727细胞。用获自这三种发酵中的每一者的大致3mL F727全细胞培养液、F727上清液或F727细胞喷洒两周龄黄瓜植株(Cucumis sativus)变种SMR58。将细胞球粒化，随后再悬浮于10mM硫酸镁中用于喷洒。每一处理重复四次进行。使植株干燥两小时，随后用浓度为3.0×l05个孢子/毫升的大致2mL白粉病孢子悬浮液喷洒，所述悬浮液从感染植株制备。随后在生长房间中培育植株直到疾病发展，并且如实例6中所描述评估疾病严重程度。
表示为疾病控制百分比的结果在图13中显示。对获自所有三种培养基的全细胞、全细胞培养液和细胞上清液都观察到在黄瓜上的抗真菌活性。
实例11：针对番茄上的灰葡萄孢评估通过在三种培养基中发酵所产生的F727全细胞培养液、上清液和细胞的功效。
用大致2mL F727全细胞培养液、F727上清液和F727细胞，其中的每一者都是从不同生长培养基(SPY、SMP和TSB)中的三个独立发酵制备，喷洒两周龄番茄植株(Solanum lycopersicum)变种Stupice。将细胞球粒化，并且再悬浮于10mM硫酸镁中用于喷洒。每一处理重复三次进行。使植株干燥一小时，随后放置在潮湿条件下面对开放气孔。将由十天龄经培养琼脂培养盘以1.0×l07个孢子/毫升在2％沙保罗氏(Sabouraud)麦芽糖培养液中制备的大致1mL灰葡萄孢孢子悬浮液喷洒在每一植株上。在伴以12小时光周期的生长箱中培育植株直到疾病发展，并且如实例6中所描述评估疾病严重程度。
表示为疾病控制百分比的结果在图14中显示。对获自所有三种培养基的全细胞、全细胞培养液和细胞上清液都观察到在番茄上的抗真菌活性。
实例12：评估与混合的F727全细胞培养液、商业基于芽孢杆菌的产品和F727全细胞培养液针对黄瓜上的白粉病的功效。
用大致3mL以下各者在第一真叶时喷洒两周龄黄瓜植株(Cucumis sativus)变种SMR58：在1:2000下的5％(Renoutria sachalinensis，马罗尼生物创新有限公司(Marrone Bio Innovation,Inc.)，加利福尼亚州，戴维斯)、在1:200下的5％、F727全细胞培养液、在1:2000下的F727全细胞培养液+5％、在1:200下的(拜耳农作物科学有限公司)、在1:200下的(拜耳农作物科学有限公司)、在40μL/50mL下的( S.A.实验室(Laboratoires S.A.))、在1:200下的(生长产品有限公司(Growth Products,Ltd.)以及在0.06g/50mL下的Double Nickel(美国Certis,L.L.C.(Certis USA,L.L.C.))。每一处理制备四份复制品。使植株干燥两小时，随后将浓度为3.0×l05个孢子/毫升的大致2mL白粉病孢子悬浮液喷洒在每一植株上。在生长房间中培育植株直到疾病发展。
在图15中显示的结果指示，来自芽孢杆菌属分离物F727发酵的全细胞培养液(在图中被识别为MBI-110WCB)与多种现存杀真菌剂相比对白粉病更有效。具有和不具有F727上清液的的结果在表6中显示。科尔比氏(Colby's)协同系数指示在1:2000下F727全细胞培养液与5％之间存在协同作用。
表6
实例13：评估F727全细胞培养液、和Double Nickel针对番茄上的致病疫霉的功效
用2mL F727全细胞培养液、在1:200下的(马罗尼生物创新有限公司)和在0.06g/50mL下的Double Nickel(美国Certis,L.L.C.)在两真叶阶段喷洒番茄植株(Solanum lycopersicum)变种Stupice。使植株干燥，随后用浓度为104个孢子/毫升、由感染番茄叶子制备的致病疫霉孢子溶液喷洒到覆盖。在20℃生长箱中在人造光下培育植株。在处理之后三天，如实例6中所描述评估植株的疾病严重程度。
在图16中显示的结果指示，来自芽孢杆菌属分离物F727发酵的全细胞培养液(在图中被识别为MBI-110WCB)提供针对蕃茄的致病疫霉感染的稳固保护。
实例14：活体外评估F727对齐整小核菌的控制
分离物F727在液体培养基中发酵，并且上清液通过离心去除。一半上清液由0.2μm过滤器过滤。将齐整小核菌的单个菌核放置在10cm皮氏培养板的中心，并且将每一培养盘四个0.5cm直径盘放置在距离真菌2cm处并且其彼此之间的距离相同。以12.5μL等分试样的形式将F727上清液、经过滤F727上清液和在0.5mL/L下的(巴斯夫(BASF))添加到所述盘中，直到两个相对盘保持总共25μL并且其它两个保持50μL。每一处理制备两个培养盘。在25℃下培育培养盘三天。
通过测量从菌核到朝向每一盘的菌落的最远边缘的菌丝生长来测定每一测试物质的抑制百分比。在图17中显示的结果指示，F727的经过滤和未经过滤上清液在盘鉴定中都有效抑制齐整小核菌的生长。未经过滤的上清液始终比经过滤上清液更有效，并且其有效性与商业标准的有效性相当。
实例15：评估F727对大豆上的水稻纹枯病菌的控制
用水稻纹枯病菌接种无菌贝雷(barley)谷物并且对其培育1-2周。干燥谷物，将其与沙子以一对一比率掺合并且混合以产生水稻纹枯病菌接种物。土壤与这一接种物彻底混合达到每盆500mL土壤的体积，用100mL水浇灌并且在生长房间中培育24小时。以100％、50％和25％浓度制备分离物F727全细胞培养液。随后用40mL每一培养液稀释液浸透土壤，并且将九个大豆种子种植在每一盆中。对于每个复制品，有三个盆，并且每一处理有三个复制品。在生长房间中培育植株14天。评估发芽、植株高度、新鲜芽重量和新鲜根重量。
测定芽托(表7)、出苗(表8)、平均芽重量(表9)和平均芽高度(表10)的测量值。结果指示，F727全细胞培养液增加水稻纹枯病菌感染大豆植株的出苗、芽重量和芽高度。
表7
表8
表9
表10
实例16：活体外评估F727对细菌植株病原体的控制
用一环以下来自经培养马铃薯右旋糖琼脂(PDA)培养盘的细菌植株病原体中的每一者接种一毫升无菌水：梨火疫病菌(Erwinia amylovora)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae)、仙人掌杆菌(Bacillus cereus)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、树生黄单胞菌(Xanthomonas arboricola)和密执安棍状杆菌(Clavibacter michiganensis)密执安(michiganensis)亚种。将细菌再悬浮，并且将100μL病原体再悬浮液划到PDA琼脂培养盘上并且使其被吸收到培养盘中10-15分钟。将无菌过滤盘施加到琼脂并且装载20μL F727 VLC溶离份(在甲醇中的10mg/mL)或VLC溶离份的组合。自如上文实例5中所描述的V8培养基中的芽孢杆菌属分离物F727的发酵获得溶离份。
培育培养盘24-48小时，并且随后围绕过滤盘检查抑制区的出现，从而指示病原体对F727溶离份的易感性。结果在表11中显示。
表11：细菌植物病原体对F727溶离份的易感性
关键词：+++极易感，++易感，-抗性
对溶离份3观察到对最大数目细菌物种的抑制。因此，这一溶离份经受进一步分馏，如上文实例5中所描述。另外，溶离份5显示针对仙人掌杆菌、胡萝卜软腐欧文氏菌和棍状杆菌属的抗菌活性。
实例17：活体外评估在不同培养基中制备的F727上清液和粗提取物对于真菌病原体发芽的控制
分离物F727在12种不同的液体培养基中发酵。在剂量反应孢子发芽鉴定中测试上清液和粗提取物样品。在48孔板中，将100μL上清液或粗提取物样品与200μL1.5×马铃薯右旋糖琼脂(PDA)组合并且使其凝固。以表12中所显示的浓度由真菌植株病原体制备孢子悬浮液，并且将50μL孢子悬浮液分配在PDA/处理混合物上。在25℃下培育培养盘3-5天，并且进行真菌孢子发芽的目测评估。
结果在表13中显示。所有经测试的上清液都在所测试的最低浓度(3.13％)下抑制所有病原体的发芽。粗提取物的活性取决于用于生长F727细胞的培养基变化(粗提取物的0.4％稀释是经测试的最低浓度)。这指示F727提取物的活性可以视生长细胞的培养基而定，并且因此可以基于生长细胞的培养基调节针对特定病原体的理想活性。举例来说，M24培养基可用于生长提取物将标靶镰孢菌属的细胞。
表12
病原体 使用的孢子浓度
草莓枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.fragariae) 104个孢子/毫升
灰葡萄孢 104个孢子/毫升
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae) 105个孢子/毫升
山茶链格孢(Alternaria japonica) 104个孢子/毫升
表13：防止真菌孢子发芽所需要的来自不同培养基的F727粗提取物的最小抑制浓度
培养基 灰葡萄孢 草莓枯萎病病原菌 大丽轮枝菌 山茶链格孢
M1 0.40％ 1.56％ 0.40％ 0.40％
M2 1.56％ 3.13％ 1.56％ 0.78％
M3 0.40％ 0.78％ 0.40％ 0.40％
M4 0.40％ 0.78％ 0.40％ 0.40％
M5 1.56％ 无抑制 3.13％ 0.40％
M6 6.25％ 无抑制 6.25％ 3.13％
M7 25.00％ 无抑制 12.50％ 0.78％
M8 无抑制 无抑制 50.00％ 无抑制
M11 0.40％ 1.56％ 0.40％ 0.40％
M12 0.40％ 3.13％ 0.40％ 0.40％
M23 0.40％ 1.56％ 0.40％ 0.40％
M24 0.40％ 0.40％ 0.40％ 0.40％
实例18：活体外评估F727的植物生长特征
活体外评估分离物F727的植物生长特征，包括溶解磷酸盐、产生ACC-脱氨酶、产生吲哚-3-乙酸(IAA)、产生噬铁素(CAS琼脂)的能力，以及以甲醇作为唯一碳源(AMS琼脂)生长的能力。在溴酚蓝-磷酸盐琼脂中评估磷酸盐溶解，在琼脂培养板上以ACC作为唯一碳和氮源评估ACC-脱氨酶活性，在CAS琼脂上评估噬铁素产生，并且在以甲醇作为唯一碳源经修正的矿物盐琼脂上评估甲基营养。如表14中所示，分离物F727经测试对于所有这些植物生长促进性状呈阳性。
表14
磷酸盐溶解 ACC-脱氨酶 IAA CAS琼脂 AMS琼脂
F727 +++ +++ + ++ ++
关键词：+++：极强阳性反应，++：阳性反应，+：弱阳性反应
实例19：对用F727处理的种子的活力分析
用1％漂白表面除菌玉米、大豆、小麦、水稻、高粱和番茄种子六分钟，并且用无菌水冲洗五次。将种子浸没在制备于10mM硫酸镁中的F727悬浮液中24小时。干燥种子30分钟用于实验1号并且隔夜用于实验2号。使种子在潮湿纸巾中发芽若干天，并且测量种子的总新鲜重量。
结果在表15中显示，并且指示芽孢杆菌属分离物F727细胞促进玉米、大豆、高粱和番茄的生长。
表15
#变种康提玉米(Kandy Korn)
*变种卡车司机最爱黄玉米(Trucker's Favorite Yellow)，布恩县白色与银色国王玉米(Boone County White and Silver King)。
实例20：针对黑曲霉(Aspergillus niger)的抗真菌活性
在果实浸渍鉴定中，在收获后病原体黑曲霉上评估来自芽孢杆菌属分离物F727的发酵的全细胞培养液(WCB)的抑制效果。WCB未经稀释使用，并且在无菌水中稀释到5％、20％和50％的浓度。
将经除菌的绿色葡萄浸渍在每一浓度的WCB中五秒，随后放置在保鲜盒内的托架上。果实干燥之后，使每一箱接受调节到3×103个孢子/毫升的黑曲霉接种物的24次喷洒。将100ml去离子水在托架下方添加到每一箱中以增加湿度，并且将箱子密封并且在室温下培育。实验中包括两个保鲜盒，每一个保鲜盒每一处理含有5个葡萄。A水处理用作阴性对照，并且商业产品Switch用作阳性对照。
通过观察每一葡萄上的菌丝覆盖度测定每一果实的疾病百分比。结果在表16中显示，并且指示F727WCB展现显著的抗曲霉菌活性。
表16.生长12天之后在用F727 WCB浸渍处理之后在葡萄上的黑曲霉的疾病百分比
实例21：对玉米的促生长
以每盆10个种子的密度将玉米种子种植在直径为4英寸的盆中的盆栽土混合物中。在种植时间时浸透经播种的盆，并且在其后一周时用F727全细胞培养液浸透。在温室中培育盆。总共评估每盆10株植株和每一处理9个盆。
在生长2周之后记录总新鲜重量。对照物植株(用水浸透)具有21.48±4.02g的平均新鲜重量，而用F727WCB浸透的植株具有26.5±3.55g的平均新鲜重量。这些差值在统计学上为显著的，如通过杜凯Minitab方差分析(Minitab ANOVA Tukey's)。这些结果提供F727 WCB的生长促进活性的额外证据。
实例22：通过用F727全细胞培养液土壤浸透控制莴苣上的莴苣露菌病霜霉病
通过从生长在培养物箱中的感染植株切割含孢子的叶子，并且在50ml去离子水中振荡叶子来获得霜霉病(莴苣露菌病(Bremia lactucae))孢子。随后通过100μm尼龙筛过滤液体。在血球计上计数过滤液体中的孢子数目，并且用去离子水调节所述液体以使其含有5×l04个孢子/毫升。
为了制备全细胞培养液(WCB)，在25℃下在SPY培养基中生长芽孢杆菌菌株F72724-72小时。
以每盆六个植株的密度将莴苣(变异系数芹莴(Celtuce))种植在2.5英寸的盆中。在伴以12小时光周期的16℃生长箱中培养植株。在生长10天之后，用20ml F727 WCB浸透土壤。
浸透一小时之后，将大致1ml上文描述的霜霉病孢子悬浮液喷洒到每一盆莴苣植株上。就接种之后的第一个48小时而言，在经覆盖的塑料托盘中培育盆。其后，在16℃下伴以12小时光周期对其培育8天。
对于每一子叶，以患病的叶子表面的百分比来评定疾病严重程度，并且对于每一盆植株测定平均严重程度。使用t测试比较处理(土壤浸透)和未处理对照物(UTC)植株的结果，并且所述结果在表17和图18中显示。结果显示，在接受F727全细胞培养液土壤浸透的莴苣植株中霜霉病疾病严重程度统计学上显著地(p＝0.0036)降低。
表17：F727 WCB土壤浸透对莴苣的霜霉病感染的效果(假定相同方差的两个样品t测试)
实例23：在控制黄瓜上的白粉病(Sphaerotheca fuliginea)白粉病中F727全细胞培养液与解淀粉芽孢杆菌之间的协同作用
通过用去离子水冲洗经感染的黄瓜叶子并且通过两层粗棉布过滤冲洗液来制备白粉病的接种物。
用2ml处理剂(参见下文)喷洒处于两真叶阶段的黄瓜植株并且使其干燥三小时，随后通过用2ml浓度为2.5×l05个分生孢子/毫升的白粉病接种物抹红叶子来对植株进行接种。
处理剂如下(每一处理三个复制品)：
1.水(阴性对照)
2.F727全细胞培养液(完整浓度)
3.F727全细胞培养液(50％浓度)
4.F727全细胞培养液(完整浓度)+Double Nickel 55(3磅/英亩)
5.F727全细胞培养液(50％浓度)+Double Nickel 55(3磅/英亩)
6.Double Nickel 55(3磅/英亩)
为了制备全细胞培养液，F727在SPY培养基中生长5天。Double Nickel 55是具有广谱杀真菌活性，包括针对白粉病的活性的商业解淀粉芽孢杆菌制剂(美国Certis，马里兰州(MD)，哥伦比亚(Columbia))。
在接种之后，在大致25℃的温度下在生长房中培育植株十天，在此时间，以肉眼评估其疾病严重程度，将所述疾病严重程度评估为患病叶子表面的百分比。使用Minitab 16统计软件(Minitab，宾夕法尼亚州立大学(State College,PA))分析在表18中显示的结果，并且通过计算科尔比氏协同作用系数来评估可能的协同作用。科尔比(Colby)(1967)“计算除草剂组合的协同和拮抗反应(Calculating synergistic andantagonistic responses of herbicide combinations)”野草(Weeds)15:20-22。
表18：F727全细胞培养液，以及与Double Nickel 55的混合物在控制黄瓜上的白粉病中的效果
处理 疾病严重程度(％)* 控制百分比(E) Ee# E/Ee
水对照物 83.3+2.9(A) 0.0
MBI-110 100％ WCB 77.5+8.7(A) 7.0
MBI-110 50％ WCB 61.3+22.9(A) 26.5
MBI-110 100％ WCB+Double Nickel 55 25.0+0.0(B) 70.0 0.12 5.6
MBI-110 50％ WCB+Double Nickel 55 33.6+25.0(B) 59.5 0.32 1.8
Double Nickel 55 78.8+13.2(A) 5.5
*以平均值和标准偏差的形式呈现疾病严重程度的数据。在使用费舍尔LSD测试时，不具有相同字母的平均值显著不同(p<0.05)。
# Ee是来自考尔比氏公式(科尔比，1967)的预测功效：Ee＝A+B-AB/100，其中A和B是个别产品的功效；如果组合的功效(控制百分比，E)高于Ee(E/Ee>1.0)，那么A协同作用存在。
表18中的结果指示，F727全细胞培养液在对白粉病的控制中与Double Nickel强有力地协同作用，其中对于完整浓度和半浓度全细胞培养液而言，科尔比协同作用系数分别是5.6和1.8。
实例24：使用F727全细胞培养液的滑石调配物的植物生长促进
通过以1:1(w/v)干燥载剂混合物:WCB比率将由滑石(1kg)、羧甲基纤维素(10g)、碳酸钙(15g)制成的干燥载剂与F727全细胞培养液混合来制备滑石调配物。干燥混合物隔夜，并且随后使其经受精细研磨。以两种方法施加这种调配物。在第一种方法中，其在种植时以沟内施加的形式在种子(饲料玉米)下施加到土壤。在第二种方法中，将滑石调配物溶解于水中并且用于在种植之前引发种子隔夜。使用水作为对照物。在温室中生长植株两周，并且对其称重。
这些分析的结果在表19和表20中显示。沟内施加导致平均新鲜重量的16％增加(表19)，而引发导致平均新鲜重量的15％增加(表20)。因此，F727 WCB具有生长促进活性。
表19：沟内施加F727 WCB的滑石调配物
表20：用F727 WCB的滑石调配物的种子引发
每一植株的新鲜重量(g) ％
对照物 0.65 100
F727 0.75 115
实例25：分馏F727全细胞培养液
在25℃下于一升合适的发酵培养基(例如，SPM、SPY、TSB、V8)中生长菌株F727 48-72小时。用安伯来特XAD-7树脂通过在室温下以155rpm振荡细胞悬浮液连同树脂两小时提取一升全细胞培养液。通过用粗棉布过滤来收集树脂和细胞团块，并且用去离子水洗涤以去除盐。随后将树脂、细胞团块和粗棉布在丙酮中浸没2小时，之后过滤丙酮，并且使用旋转式蒸发器在真空下将其干燥以得到粗提取物。
通过反相C-18真空液相色谱分馏粗提取物。在先前分馏流程中(实例5和图1)，在溶离份3(40-60％甲醇馏份)和溶离份4(60-80％甲醇馏份)中发现杀虫活性。为了最大化单个溶离份中的活性量，如表21中所示改变反相C-18 VLC程序以提供50-80％甲醇馏份(溶离份4)。随后由溶离份4如实例5中所描述通过C-18 HPLC纯化化合物A、B和C。
表21：F727安伯来特提取物的VLC溶离份
溶离份： 在其下溶离：
1 20％甲醇
2 40％甲醇
3 50％甲醇
4 80％甲醇
5 100％甲醇
6 50％甲醇:乙腈
实例26：通过MS/MS分析所测定的化合物A的结构
通过电喷雾离子化质谱分析/质谱分析(ESIMS/MS)分析来自溶离份4(化合物A)的1044 MW化合物以获得其组分氨基酸的序列。结果在图19中显示。基于这些结果，化合物A经测定具有在图20中显示的环状肽结构。
实例27：化合物和VLC溶离份的杀菌活性
将胡萝卜软腐欧文氏菌、丁香假单胞菌属、树生黄单胞菌、西瓜嗜酸菌(Acidovorax avenae)西瓜(citrulli)亚种和密执安棍状杆菌密执安亚种涂布在马铃薯右旋糖琼脂上。在积累充足的生质之后，将一铂环量的每一病原体从其培养盘去除并且将其悬浮在无菌水中。将100uL每一悬浮液划到马铃薯右旋糖琼脂培养盘上并且使其被吸收到培养盘中10-15分钟。
如实例25中所描述的VLC溶离份4和5的样品，以及来自在实例25中描述的VLC溶离份4的化合物A(MW＝1044)、B(MW＝1058)和C(MW＝1072)以5mg/mL在甲醇中制备，并且在水中制得5组每一样品的两倍连续稀释液(即，测试在0.15625mg/mL与5mg/mL之间，以两倍浓度增量的浓度)。将无菌过滤盘施加到琼脂板上并且用20uL每一样品装载所述盘。在25℃下培育培养盘3天，并且随后围绕过滤盘观察生长抑制区，从而指示病原体对样品的易感性。如果检测到抑制，那么就测定了样品展现抑制活性的最小浓度。结果在表21中显示。溶离份4和5具有针对胡萝卜软腐欧文氏菌和密执安棍状杆菌的抑制活性，而化合物A和B抑制西瓜嗜酸菌的生长。
表21：样品抑制病原体生长的最小浓度
实例28：化合物和VLC溶离份的杀真菌活性
如实例25中所描述的VLC溶离份4和5的样品，以及来自在实例25中描述的VLC溶离份4的化合物A(MW＝1044)、B(MW＝1058)和C(MW＝1072)以5mg/mL在甲醇中制备。在48孔培养盘中制备每一样品的连续稀释液。每一经测试样品的最高浓度是500μg/mL(初始浓度的10％)，并且其后以两倍增量将样品在水中连续稀释到3.9062μg/mL的浓度。将100μL样品稀释液添加到每一孔，随后添加200μL 1.5×马铃薯右旋糖琼脂(PDA)，并且随后使混合物凝固10-15分钟。
将黑麦炭疽菌(Colletotrichum cereale)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢和大丽轮枝菌涂布在PDA上，并且在室温下培育直到菌丝生长覆盖整个培养盘。将无菌水添加到每一培养盘，并且使用无菌散播器移走菌丝和孢子。使浆料穿过过滤器以分离菌丝和孢子。用血球计计数孢子以计数，并且通过用水稀释将其调节到103-104个孢子/毫升的浓度。
将辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)涂布在PARP琼脂上并且在室温下生长直到观察到充足的菌丝生长。将无菌水添加到培养盘，并且使用散播器移走孢子。在16℃下在康威恩(Conviron)腔室中培育培养盘1-2小时直到孢子囊释放游走孢子。随后将孢子收集在试管中，用血球计计数，并且用水将孢子悬浮液调节到103-104个孢子/毫升的浓度。
将来自每一病原体的50μL孢子溶液接种到样品的每个孔中。在25℃下培育培养盘4-5天，并且随后在井中观察其对孢子发芽的抑制，从而指示病原体对样品的易感性。如果检测到抑制，那么就测定了样品展现抑制活性的最小浓度。结果在表22中显示。
表22：样品抑制孢子发芽的最小浓度
化合物A、B和C以及溶离份4抑制经测试的所有真菌病原体的孢子发芽，除了辣椒疫霉菌。化合物C和溶离份4展现最高抑制活性。
生物材料的寄存
以下生物材料已根据农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research CultureCollection，NRRL)(美国伊利诺伊州61604皮奥里亚市北方大学街1815号(1815N.University Street,Peoria,Illinois 61604 USA))的布达佩斯条约(Budapest Treaty)的条款寄存，并且所述生物材料具有以下编号：
所述菌株已经在以下条件下进行寄存：确保在本专利申请等待审查期间，由专利商标委员会根据37 C.F.R.§1.14和35 U.S.C.§122所授权的人可以获得培养物。寄存物表示寄存菌株的实质上纯的培养物。视需要可以在已经提交本发明的对应物或其成果的国家根据外国专利法获得寄存物。但是，应理解，寄存物的可用度不构成以废除政府活动所授予的专利权的形式实践本发明的许可。
所描述和主张的本发明不受本文中所揭示的特定方面限制在范围中，因为这些方面打算作为本发明的若干方面的说明。任何等效方面打算处于本发明的范围内。实际上，根据前述描述，除本文所展示和描述的修改以外，本发明的各种修改对所属领域的技术人员而言亦将变得显而易见。所述修改也打算处于所附权利要求书的范围内。在有冲突的情况下，将以本发明(包括定义)为准。
本文中引用各种参考文献，其公开内容以全文引用的方式并入。

Claims (22)

1.一种芽孢杆菌(Bacillus)菌株的实质上纯的培养物，其具有以下特征：
(A)以下各者中的至少一者：
(1)与SEQ ID NO：3中阐述的16SrRRNA序列具有至少99.5％一致性的核苷酸序列；
(2)与SEQ ID NO：10中阐述的recA序列具有至少95％一致性的核苷酸序列，以及
(3)与SEQ ID NO：13中阐述的反向phoR序列具有至少90％一致性的核苷酸序列；
(B)杀虫活性；
(C)对卡那霉素(Kanamycin)、氯霉素(Chloramphenicol)、氨苄青霉素(Ampicillin)、青霉素(Penicillin)、头孢呋辛(Cefuroxime)、哌拉西林(Piperacillin)、四环素具有抗性；
(D)具有碱性磷酸酶、酯酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶活性；以及
(E)对脊椎动物是非病原性的。
2.根据权利要求1所述的培养物，其中所述菌株具有芽孢杆菌菌株F727(NRRL寄存编号B-50768)的识别特征中的至少一者。
3.一种滤液、上清液、提取物、细胞分离物或全细胞培养液，其自根据权利要求1所述的培养物获得。
4.一种化合物，其选自由以下组成的群组：
(a)化合物A，其
(i)获自芽孢杆菌属分离物F727；
(ii)具有杀虫活性；
(iii)如通过液相色谱法/质谱分析LC/MS测定，具有约1020-1060并且更确切地1044的分子量；
(iv)具有δ7.15、6.72、4.81、4.70、4.65、4.40、4.35、4.25、4.15、3.85、3.65、3.50、3.22、2.85、2.80、2.65、2.45、2.35、2.30、2.20、1.95、1.55、1.31、1.20和0.85的1H NMR值；
(v)使用在0.5mL/min流动速率下的水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18HPLC(菲罗门(Phenomenex)，Luna 5μC18(2)100A，100×4.60mm)管柱上具有约6-12分钟、更确切地约8分钟并且甚至更确切地约8.31分钟的高压液相色谱HPLC滞留时间；
(vi)任选地含有47个碳原子、72个氢原子、12个氮原子和15个氧原子；和
(vii)任选地是肽，其包含谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)和天冬酰胺(3单位)；
(b)化合物B，其
(i)具有杀虫活性；
(ii)如通过液相色谱法/质谱分析LC/MS测定，具有约1030-1080并且更确切地1058的分子量；
(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18HPLC管柱上具有约6-14分钟、更确切地约8分钟并且甚至更确切地约8.67分钟的高压液相色谱HPLC滞留时间；
(iv)任选地包含48个碳原子、74个氢原子、12个氮原子和15个氧原子；和
(v)任选地是肽，其包含谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)和天冬酰胺(3单位)；以及
(c)化合物“C”，其
(i)具有杀虫活性；
(ii)如通过液相色谱法/质谱分析LC/MS测定，具有约1050-1120并且更确切地1072的分子量；
(iii)使用在0.5mL/min流动速率下的水：乙腈(CH3CN)梯度溶剂系统(0-20min；90-0％水性CH3CN，20-24min；100％CH3CN，24-27min；0-90％水性CH3CN，27-30min；90％水性CH3CN)和在210nm下的UV检测，在反相C-18HPLC管柱上具有约6-14分钟，更确切地约9分钟并且甚至更确切地约9.19分钟的高压液相色谱HPLC滞留时间；
(iv)任选地包含49个碳原子、76个氢原子、12个氮原子和15个氧原子；和
(v)任选地是肽，其包含谷氨酰胺(1单位)、脯氨酸(1单位)、丝氨酸(1单位)、酪氨酸(1单位)和天冬酰胺(3单位)。
5.一种组合物，其包含：
(a)第一物质，其选自由以下组成的群组：
(i)根据权利要求1所述的培养物，
(ii)根据权利要求1所述的培养物的细胞部分，
(iii)从根据权利要求1所述的培养物获得的上清液，
(iv)从根据权利要求1所述的培养物获得的滤液，
(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任一者的提取物，
(vi)由根据权利要求1所述的培养物产生的代谢物，
(vii)化合物A，
(viii)化合物B，
(ix)化合物C；和
(b)以及任选的以下各者中的至少一者：
(i)第二物质，其中所述第二物质是化学或生物杀虫剂、植物生长促进剂、抗植物病原性剂以及肥料中的一或多者；和
(ii)载剂、稀释剂、表面活性剂或佐剂中的至少一者。
6.根据权利要求5所述的组合，其中所述第二物质是化学或生物杀虫剂。
7.根据权利要求5所述的组合，其中所述组合是组合物。
8.一种调节植物的害虫侵扰的方法，其包含向所述植物和/或其种子和/或用于生长所述植物的基质施用可有效调节所述害虫侵扰的量的选自由以下组成的群组的组合物：
(a)根据权利要求1所述的培养物；
(b)根据权利要求1所述的培养物的细胞部分；
(c)从根据权利要求1所述的培养物获得的上清液；
(d)从根据权利要求1所述的培养物获得的滤液；
(e)(a)、(b)、(c)或(d)中的任一者的提取物；
(f)由根据权利要求1所述的培养物产生的代谢物；
(g)化合物A；
(h)化合物B；以及
(i)化合物C。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述害虫是真菌或细菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述真菌选自由以下组成的群组：曲霉菌(Aspergillus)、链格孢属(Alternaria)、莴苣露菌病菌属(Bremia)、单丝壳属(Sphaerotheca)、炭疽菌属(Colletotrichum)、镰孢菌属(Fusarium)、轮枝孢属(Verticillium)、葡萄孢属(Botrytis)、核盘菌属(Sclerotinia)、菌核属(Sclerotium)、丝核菌属(Rhizoctonia)以及离蠕孢属(Bipolaris)。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述组合物抑制孢子发芽。
12.根据权利要求9所述的方法，其中所述细菌选自由以下组成的群组：芽孢杆菌属、欧文菌属(Erwinia)、食酸菌属(Acidovorax)以及棍状杆菌属(Clavibacter)。
13.根据权利要求8所述的方法，其中所述害虫是疫霉菌(Phytophthora)。
14.根据权利要求9所述的方法，其中所述组合物进一步包含杀虫剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述害虫是真菌并且所述杀虫剂选自由以下组成的群组：大虎杖(Reynoutria sachalinensis)(虎杖(knotweed))提取物、以及Double Nickel 55TM。
16.一种调节植物生长和/或种子发芽的方法；所述方法包含使所述植物、其生长基质和/或所述植物的种子与一定量的选自由以下组成的群组的组合物接触：
(a)根据权利要求1所述的培养物；
(b)根据权利要求1所述的培养物的细胞部分；
(c)从根据权利要求1所述的培养物获得的上清液；
(d)从根据权利要求1所述的培养物获得的滤液；
(e)(a)、(b)、(c)或(d)中的任一者的提取物；
(f)由根据权利要求1所述的培养物产生的代谢物；
(g)化合物A；
(h)化合物B；以及
(i)化合物C；
其中所述量有效调节所述植物的生长和/或所述种子的发芽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物进一步包含生长促进剂、表面活性剂、载剂、佐剂和/或肥料。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述组合物是滑石调配物。
19.一种组合物调配杀虫和/或植物生长促进组合物的用途，其中所述组合物选自由以下组成的群组中的一或多者：
(a)根据权利要求1所述的培养物，
(b)根据权利要求1所述的培养物的细胞部分，
(c)从根据权利要求1所述的培养物获得的上清液，
(d)从根据权利要求1所述的培养物获得的滤液，
(e)(a)、(b)(c)或(d)中的任一者的提取物，
(f)由根据权利要求1所述的培养物产生的代谢物，
(g)化合物A，
(h)化合物B，以及
(i)化合物C。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述杀虫或植物生长促进组合物进一步包含选自由以下组成的群组中的一或多者的第二物质：
(a)杀虫剂，
(b)植物生长促进剂，
(c)载剂，
(d)佐剂，
(e)表面活性剂，
(f)肥料，以及
(g)抗植物病原性剂。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述杀虫剂选自由杀菌剂、杀真菌剂以及杀线虫剂组成的群组。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述杀虫剂选自由虎杖提取物以及组成的群组。
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