CN113213984A - 一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥及其制备方法和应用 - Google Patents

一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种死谷芽孢杆菌与秸秆有机肥结合二次固体发酵制备生物有机肥及其制备方法和应用。本发明以二次固体发酵结束后生物有机肥中死谷芽孢杆菌含量为检测指标，通过单因素法及多因素多水平正交法，筛选获得生物有机肥最优培养条件组合，优化了生物有机肥的发酵工艺。特别是以玉米秸秆有机肥为基质、死谷芽孢杆菌SZ‑4为生防菌源研制开发的BIO‑4生物有机肥，对腐皮镰孢菌引起的根腐病具有良好的防控效果，且对作物生长具有促进作用，有利于提高作物产量及改善品质。

Description

一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肥料生产技术领域，具体涉及一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥及其制备方法和应用。
背景技术
人参Panax ginseng C.A.Meyer为名贵中药，有“百草之王”的美誉，在中国、韩国等均有广泛种植。我国是人参种植大国。由于“退耕还林”等政策出台，传统的“伐林栽参”受到限制，我国人参栽培模式已逐渐转型为农田栽参。但由于人参种植技术不够成熟，土传病害频发问题突出，人参的品质和产量得不到保证，严重影响了我国人参产业在国际市场中的竞争力。因此，寻找一条绿色、安全、高效的病害防治途径是目前人参种植业亟待解决的重要问题。与传统农业防治及化学防治相比，生物防治具有环境友好和无药物残留等优点，且不会引起病害抗药性，是目前国内外防控植物病害的研究热点。近年来，生物有机肥作为一种兼具有机肥料以及功能性菌株优势的生物肥料广泛受到关注，其在病害防控、作物促生以及土壤改良等方面均表现出了良好的作用效果。因此，可将生物有机肥引入“农田栽参”种植体系，用以防控人参土传病害，提高人参产量，同时对栽参土壤进行有效性改善，保持参地土壤肥力，有利于缓解人参连作对人参品质及产量的的影响，对人参种植业的可持续性发展意义深远。
在生物有机肥生产中，有益菌含量是衡量其质量的重要标准，研究表明适宜的发酵条件对提高生物有机肥质量具有重要意义，发酵时间、接种量、发酵温度、含水量、尿素添加量、翻抛次数均为固体发酵生物有机肥的关键因素。研究发现，适宜的接种量及翻抛次数可显著提高生物有机肥中功能性菌株的数量。微生物的繁殖需要大量的碳源、氮源提供支持，秸秆堆肥有机质含量丰富且经过长期的发酵腐熟过程后其碳水化合物、脂肪族化合物以及木质素被分解为小分子化合物，可为固体发酵过程中生防细菌的生长提供碳源。氮源添加剂种类多种多样，其中尿素是一种小分子化合物，可直接被微生物吸收利用，作为固体发酵的氮源添加剂。
死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)SZ-4是本课题组前期分离获得的一株对人参根腐病等真菌性病害具有良好防治效果的生防细菌。该菌株现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(保藏编号为CGMCC No.8273)，并申请名称为“一种死谷芽孢杆菌及其应用”，授权公告号为CN103952329B 的发明专利，但是对于包含该菌株的生物肥的报道较为罕见。
发明内容
本发明提供了一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)活化死谷芽孢杆菌；
(2)制备死谷芽孢杆菌发酵液；
(3)制备生物有机肥基质；
(4)使用死谷芽孢杆菌发酵液对生物有机肥基质进行二次发酵，得到含死谷芽孢杆菌的生物有机肥。
根据本发明的实施方案，所述死谷芽孢杆菌优选死谷芽孢杆菌SZ-4(保藏编号：CGMCC No.8273)；
根据本发明的实施方案，步骤(1)中采用牛肉膏蛋白胨培养基对死谷芽孢杆菌进行活化；所述牛肉膏蛋白胨培养基每1000mL去离子水含有牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂16g、pH 6.8-7.0，121℃湿热灭菌 30min；
根据本发明的实施方案，所述对死谷芽孢杆菌进行活化方法为：将死谷芽孢杆菌试管种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，32-35℃恒温振荡培养18-24 h，传代2-3次，挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，32℃，180r/min 振荡培养24-36h，得到SZ-4细菌种子液；
所述牛肉膏蛋白胨培养液的配方为：不加琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基质；
根据本发明的实施方案，步骤(2)中所述死谷芽孢杆菌发酵液的制备方法：将种子液按5％接种量接入BPY发酵液中，32-35℃、180r/min振荡培养36-48h，得到死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液；所述SZ-4发酵液的含菌量可以为106-1010CFU/mL，例如108CFU/mL；
所述BPY发酵液每1000mL去离子水含有牛肉膏2.5-5g、蛋白胨7-15g、酵母浸膏1-5g、葡萄糖1-5g、NaCl 1-5g、pH 6.8-7.0
在一个实施方案中，以1000mL去离子水计，牛肉膏5g、蛋白胨10g、酵母浸膏5g、葡萄糖5g、NaCl 5g，pH 6.8-7.0，115℃湿热灭菌20min；
根据本发明的实施方案，步骤(3)中所述生物有机肥基质的制备方法将风干的玉米秸秆粉碎，过0.9-1.25mm筛；将蒸馏水150份，红糖10份，秸秆发酵粉剂1份混匀，装入密封容器，于30-40℃条件下厌氧发酵6-10d得到秸秆发酵菌液；将玉米秸秆粉、蒸馏水、秸秆发酵菌液依次按200份、70-80 份、1份比例混匀；将混合均匀的物料打堆发酵，控制温度在25-35℃之间，每隔4d翻堆一次，发酵时间为1个月，经121℃湿热灭菌，得到生物有机肥基质；
根据本发明的实施方案，步骤(4)中所述二次发酵方法：将步骤(2) 中制备的发酵液按一定接种量接入步骤(3)制备的生物有机肥基质中，调节发酵含水量，添加尿素作为氮源，恒温发酵，按照一定的翻抛频率进行翻抛，可得到所述含死谷芽孢杆菌的生物有机肥；
根据本发明，所述二次发酵方法中发酵液接种量(发酵液与生物有机肥基质的体积质量比，单位为mL/g)可以为0.5％-25％，例如：2％、5％、8％、 10％、15％，优选为10％；所述发酵液中死谷芽孢杆菌的菌落浓度108 CFU/mL；
根据本发明，所述二次发酵方法中含水量(水与生物有机肥基质的体积质量比，单位为mL/g)可以为30％-70％，例如：45％、50％、55％、60％、 65％，优选为45％；
根据本发明，所述二次发酵方法中添加尿素至生物有机肥C/N可以为5- 40，例如：15、20、25、30、35，优选为15；
根据本发明，所述二次发酵方法中恒温发酵温度可以为15-42℃，例如： 23℃、28℃、30℃、32℃、37℃，优选为32℃；
根据本发明，所述二次发酵方法中恒温发酵时间可以为0.5-10d，例如： 2d、3d、4d、5d、6d、7d，优选为4d；
根据本发明，所述二次发酵方法中翻抛频率可以为1次/6h-1次/60h或0 次，例如：1次/12h、1次/24h、1次/36h、1次/48h、0次，优选为1次/48h。
本发明还提供一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥，是死谷芽孢杆菌与生物质有机肥基质发酵制备得到。
根据本发明，所述死谷芽孢杆菌是经活化和发酵的死谷芽孢杆菌发酵液。
根据本发明，死谷芽孢杆菌是SZ-4菌株(保藏编号：CGMCC No.8273)；
根据本发明，所述生物有机肥的含菌量可以为(0.5-15)×109CFU/g，例如2.01×109CFU/g。
根据本发明，所述含死谷芽孢杆菌的生物有机肥为按照上述制备方法制备得到。
本发明还提供所述含死谷芽孢杆菌SZ-4的生物有机肥的应用，其可用于防治植物真菌病害及促进植物生长；所述植物优选为人参；所述真菌优选为腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)。
有益效果
本发明通过将秸秆有机肥与保藏号为CGMCC No.8273的死谷芽孢杆菌 SZ-4结合研制生物有机肥，获得了生物有机肥的最佳培养条件。与优化前的发酵条件相比，采用最优发酵条件组合后生物有机肥中的含菌量提高了 81.66％。本发明为含死谷芽孢杆菌生物有机肥的生产工艺优化提供技术支撑。
本发明的优点在于由保藏号为CGMCC No.8273的死谷芽孢杆菌SZ-4及玉米秸秆有机肥制得的生物有机肥对腐皮镰孢菌(Fusarium solani)引起的根腐病具有良好的防治效果，且对植物生长具有促进作用，对实现植物生态化绿色种植具有重要意义。生物有机肥施入植物栽培土壤后可以减少农药化肥的使用量，提高植物的品质和产量，对土壤化学性质、生物学性质具有一定的改善作用，有机肥与死谷芽孢杆菌共同作用，有利于生物有机肥防病作用的发挥，有效地提高了对病害的防控效能。
附图说明
图1:A为发酵时间对BIO-4生物有机肥发酵的影响；B为接种量对BIO-4 生物有机肥发酵的影响。
图2:A为含水量对BIO-4生物有机肥发酵的影响；B为翻抛次数对BIO-4 生物有机肥发酵的影响。
图3:A为发酵温度对BIO-4生物有机肥发酵的影响；B为尿素添加量对 BIO-4生物有机肥发酵的影响。
图4为人参根腐病发病程度参考示意图。
图5为BIO-4生物有机肥对人参根腐病的防治效果，A为BIO-4生物有机肥；B为有机肥；C为农药；D为对照)。
图6为BIO-4生物有机肥对人参根部生长的影响，A为BIO-4生物有机肥；B为有机肥；C为对照。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
以下实施例中死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液的接种量是指发酵液和生物有机肥基质的体积质量比，单位为mL/g；含水量是指水分和生物有机肥基质的体积质量比，单位为mL/g。
实施例1
死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)SZ-4由吉林农业大学省部共建生态恢复与生态系统管理国家重点实验室保存。
死谷芽孢杆菌SZ-4的活化采用牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g，琼脂16g，去离子水1000mL，pH 6.8-7.0)；发酵种子液的制备采用牛肉膏蛋白胨培养液(不含琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基质)；发酵液的制备采用BPY发酵液(牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5 g，葡萄糖5g，NaCl 5g，去离子水1000mL，pH 6.8-7.0)。
菌株SZ-4发酵液的制备：将死谷芽孢杆菌SZ-4试管种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃恒温振荡培养24h，传代3次，挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，32℃，180r/min振荡培养24h，得到SZ-4细菌种子液。按5％接种量接入BPY发酵液中，32℃、180r/min振荡培养48h，血球计数法调节含菌量至约108CFU/mL，得到死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液。
生物有机肥基质的制备：将风干的玉米秸秆粉碎，过0.9mm筛；将蒸馏水150份，红糖10份，秸秆发酵粉剂1份混匀，装入密封容器，于30℃条件下厌氧发酵10d得到秸秆发酵菌液；将玉米秸秆粉、蒸馏水、秸秆发酵菌液依次按200份、80份、1份比例混匀；将混合均匀的物料打堆发酵，控制温度在35℃，每隔4d翻堆一次，发酵时间为1个月，经121℃湿热灭菌30min，冷却后作为生物有机肥基质(简称为有机基质)备用。
采用平板稀释涂布法对以下发酵工艺的优化中制备的生物有机肥中死谷芽孢杆菌SZ-4的数量进行测定，具体方法为：称取8g相应的生物有机肥于80mL无菌水中，180r/min下震荡30min，按稀释度10-4、10-5、10-6得到生物有机肥稀释液，用移液器各取0.1mL涂布于死谷芽孢杆菌选择性培养基平板中，每个梯度各3次重复，32℃恒温箱中培养36h后计数。最终死谷芽孢杆菌的数量以每g肥料干质量计算，表示为CFU/g。
发酵工艺的优化：
采用单因素法进行生物有机肥二次固体发酵试验。共包括发酵时间 (d)，接种量(％)，含水量(％)，翻抛次数(次/h)，发酵温度(℃)，尿素添加量6个因素。
发酵时间优化试验：将死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液按接种量(与有机基质的体积质量比)10％接入有机基质中，调节发酵含水量至60％，使用尿素作为氮源，添加尿素至生物有机肥碳氮比C/N为25，设置时间梯度为2d、3d、 4d、5d、6d、7d，每个处理设置3个重复，32℃恒温培养，每24h翻抛一次，采用平板稀释涂布法测定生物有机肥中的含菌量。如图1中A所示，从发酵2d到7d，生物有机肥中的含菌量呈现先升高后下降的趋势，在发酵时间为4d时生物有机肥的含菌量达到最大，且与第2d、7d相比，第4d含菌量差异呈极显著(p<0.01)，因此选取发酵时间4d为死谷芽孢杆菌SZ-4二次固体发酵生物有机肥的最优发酵时间，选取发酵时间水平为3d、4d、5d并进行正交试验。
接种量优化试验：将死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液接入有机基质中，调节发酵含水量至60％，使用尿素作为氮源，添加尿素至生物有机肥C/N为25，设置接种量梯度为2％、5％、8％、10％、15％，每个处理设置3个重复，32℃恒温4d，每24h翻抛一次，采用平板稀释涂布法测定生物有机肥中的含菌量。如图1中B所示，随着接种量的增加，生物有机肥中的含菌量逐渐增加，当接种量为8％时含菌量达到最大，接种量为10％和15％时接种量差异不显著(p>0.05)。因此选取接种量8％为SZ-4二次固体发酵生物有机肥的最优发酵接种量，选取接种量水平为5％、8％、10％并进行正交试验。
含水量优化试验：将死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液按8％接种量接入有机基质中，使用尿素作为氮源，添加尿素至生物有机肥C/N为25，设置含水量梯度为45％、50％、55％、60％、65％，每个处理设置3个重复，32℃恒温培养 4d，每24h翻抛一次，采用平板稀释涂布法测定生物有机肥中的含菌量。如图2中A所示，在发酵生物有机肥过程中，随着发酵物料含水量的增加，生物有机肥中的含菌量增高，在含水量为50％达到最大，此后逐渐降低。因此选取物料含水量50％为SZ-4二次固体发酵生物有机肥的最优含水量，选取含水量水平为45％、50％、55％并进行正交试验。
翻抛次数优化试验：将死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液按8％接种量接入有机基质中，调节含水量至50％，使用尿素作为氮源，添加尿素至生物有机肥C/N 为25，设置翻抛次数梯度为1次/12h、1次/24h、1次/36h、1次/48h、0次，每个处理设置3个重复，32℃恒温培养4d，采用平板稀释涂布法测定生物有机肥中的含菌量。如图2中B所示，随着翻抛次数的减少生物有机肥中的含菌量逐渐升高，在翻抛次数为1次/48h时，生物有机肥中的含菌量达到最大，与其它翻抛次数差异显著(p<0.05)，因此选取翻抛次数1次/48h为SZ-4二次固体发酵生物有机肥的最优翻抛次数，选取翻抛次数水平为1次/36h、1次 /48h、0次并进行正交试验。
发酵温度优化试验：将死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液按8％接种量接入有机基质中，调节含水量至50％，使用尿素作为氮源，添加尿素至生物有机肥C/N 为25，设置发酵温度梯度为23℃、28℃、30℃、32℃、37℃，每48h翻抛一次，每个处理设置3个重复，恒温培养4d，采用平板稀释涂布法测定生物有机肥中的含菌量。如图3中A所示，发酵温度为30℃时生物有机肥的含菌量达到最大，较其它温度条件含菌量差异显著(p<0.05)。随着发酵温度持续升高，含菌量呈下降趋势，但发酵温度为32℃和37℃时含菌量差异不显著(p>0.05)。因此选取发酵温度30℃为死谷芽孢杆菌SZ-4二次固体发酵生物有机肥最优发酵温度，选取发酵温度水平为28℃、30℃、32℃进行正交试验。
尿素添加量优化试验：将死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液按8％接种量接入有机基质中，调节含水量至50％，每48h翻抛一次，将尿素作为供给氮源，设置梯度为添加尿素至生物有机肥C/N为15、20、25、30、35，每个处理设置 3个重复，30℃恒温培养4d，采用平板稀释涂布法测定生物有机肥中的含菌量。如图3中B所示，当调节秸秆堆肥C/N为20时，生物有机肥中的含菌量达到最大。因此选取添加尿素至秸秆堆肥C/N为20为死谷芽孢杆菌SZ-4二次固体发酵生物有机肥的最优氮源添加量，选取C/N水平为15、20、25并进行正交试验。
BIO-4生物有机肥多因素多水平正交试验：
基于单因素方法建立6因素3水平模型，设计以发酵时间(3d、4d、5 d)，接种量(5％、8％、10％)，含水量(45％、50％、55％)，翻抛次数 (1次/36h、1次/48h、0)，发酵温度(28℃、30℃、32℃)，尿素添加量(C/N为15、C/N为20、C/N为25)这6种因素(详见表1)，采用DPS 9.50 设计正交表L27(36)，进行正交试验以明确BIO-4生物有机肥二次固体发酵的最佳发酵因素水平组合。首先，需考虑选择供试6因素中的最佳水平条件的问题；其次，需结合提高生产效率、节约劳动成本以及合理缩短发酵周期等问题。通过综合考虑主、次问题，进而获取对生产BIO-4生物有机肥具有现实意义的最佳发酵条件。
表1 BIO-4生物有机肥发酵水平与因素
Figure BDA0002377606960000101
根据死谷芽孢杆菌SZ-4二次固体发酵条件的正交指标优化表(表2)对 6个因素的发酵最优组合进行选取。经F检验法分析可知，6个因素的F值均呈极显著差异(p<0.01)，发酵各因素经极差分析后的主次顺序为：发酵时间>接种量>翻抛次数>尿素添加量>发酵温度>含水量。综合发酵各因素显著分析、极差分析以及各因素水平K值分析，最终将菌株SZ-4的二次固体最佳发酵条件组合选取为：发酵时间4d，接种量10％，含水量45％，翻抛次数1 次/48h，发酵温度32℃，尿素添加至C/N为15，此发酵条件下生物有机肥中菌株SZ-4的含菌量可达到2.01×109CFU/g。
表2 BIO-4生物有机肥最优发酵条件的正交优化
Figure BDA0002377606960000102
发酵优化工艺的试验验证
如表3所示，经二次固体发酵条件优化后，BIO-4生物有机肥含菌量为 2.01×109CFU/g，较优化前的对照组发酵条件组合的含菌量提高了81.66％。差异显著性分析表明，优化后的肥料含菌量较对照组相比呈现极显著差异 (p<0.01)。
表3 BIO-4生物有机肥的含菌量
Figure BDA0002377606960000111
表中数据系平均数±标准差。Duncan氏复极差异法检验，同一行数据不同字母表示差异显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)。
实施例2
菌株SZ-4发酵液的制备：将死谷芽孢杆菌SZ-4试管种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，37℃恒温振荡培养24h，传代3次，挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，32℃、180r/min振荡培养24h，得到SZ-4细菌种子液。将种子液按5％接种量接入BPY发酵液中，32℃、180r/min振荡培养48h，血球计数法调节含菌量至约108CFU/mL，获得死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液。
含菌量计算：采用血球计数板法。将10μL细菌发酵液点接于血球计数板，对血球计数板中间、左上、左下、右上、右下这5个中号方块中的细菌菌体进行记录，并将其依次编号为a1，a2，a3，a4，a5，含菌量(CFU/mL) ＝(a1+a2+a3+a4+a5)×[400×104]×10/80。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0 g，琼脂16.0g，pH 6.8-7.0，去离子水1000mL，121℃湿热灭菌30min，冷却后备用。牛肉膏蛋白胨培养液的配方为：不加琼脂的牛肉膏蛋白胨培养基质。BPY发酵液：牛肉膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，NaCl 5g，去离子水1000mL，pH 6.8-7.0，115℃湿热灭菌20min，冷却后备用。
实施例3
BIO-4生物有机肥制备
BIO-4生物有机肥由死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液和玉米秸秆有机肥二次固体发酵而成，制备方法如下：
将实施例2中SZ-4细菌发酵液(108CFU/mL)按10％接种量接种于实例1中有机基质，调节含水量至45％，尿素添加至C/N为15，而后将其置于无菌塑料箱中，32℃恒温培养4d，每48h翻抛一次。所得生物有机肥将其命名为BIO-4生物有机肥。
实施例4
BIO-4生物有机肥对人参根腐病的盆栽防治试验
腐皮镰孢菌的活化：将低温保藏的供试腐皮镰孢菌置于室温条件下恢复30min后，无菌条件下挑取病原菌菌丝体分别接种于PDA平板中央，28℃恒温振荡倒置培养，待菌株长满平板传代培养至第3代备用。PDA培养基的制备方法：马铃薯淀粉5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂22.0g，去离子水1000mL， pH 7.0，121℃湿热灭菌30min。
腐皮镰孢菌孢子悬液的制备：收集腐皮镰孢菌体接种分散至6g/L CMC (羧甲基纤维素钠)溶液，经玻璃珠振荡仪振荡15min，无菌脱脂棉过滤后制成孢子悬液，血球计数板法计算孢子浓度，而后再用无菌去离子水配制浓度约为3×104孢子囊/mL的孢子悬液，4℃保藏，用于人参根腐病侵染。
孢子浓度计算：将10μL孢子悬液点接于血球计数板，对血球计数板中间、左上、左下、右上、右下这5个中号方块中人参病原菌的孢子进行记录，并将其依次编号为a1，a2，a3，a4，a5。
孢子浓度(孢子囊/mL)＝(a1+a2+a3+a4+a5)×[400×104]×10/80。
室外盆栽防病试验
人参根腐病防病试验，共设4个处理：(1)对照(CK)：不施肥料； (2)农药：施加10％多菌灵可湿性粉剂250倍液，50mL/盆；(3)有机肥 (OF)：施加育苗土总质量2％的有机肥；(4)生物有机肥(BIO-4)：施加育苗土总质量2％的BIO-4生物有机肥。具体为：取长势较为接近且根系发达的2年生人参苗，参根表面经消毒清洗(经次氯酸钠润洗后，50℃水中再浸泡5min)，备用。将人参苗移栽至上述各处理的聚丙烯(PP)塑料盆钵 (规格为口径26cm，高18cm)中，每盆3株，每处理30盆；待人参定苗后采用伤根灌注法接种病原真菌，于人参苗1侧，距人参茎基1cm处造成直径约2-3mm的伤口，同时每盆灌注腐皮镰孢菌孢子悬液150mL。室外参棚下常规管理，2个月后调查人参发病情况，计算各处理人参发病的病情指数。人参的病情指数及防治效果的计算公式如下：
病情指数＝∑(病级株数×代表值)/(总株数×最高病级代表值)×100
防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100
人参根腐病发病程度分级标准见图4。
供试土壤为改良土，配方为微生物基质、蛭石、珍珠岩比例为6：2：1，供试人参取自吉林参王植保公司。
BIO-4生物有机肥对人参根腐病的防治效果
对照处理组、农药处理组、有机肥处理组、生物有机肥处理组的病情指数及防病情况如表4所示。接种腐皮镰孢菌60d后，对照处理组的病情指数为55.28，有机肥处理组的病情指数为35.28，农药处理组的病情指数为21.39， BIO-4生物有机肥处理组的病情指数仅为17.50，各处理组间的病情指数差异极显著(p<0.01)。对人参根腐病的防治效果表现为BIO-4生物有机肥>农药 >有机肥，其中BIO-4生物有机肥的防效可达68.35％，优于农药处理组 (p<0.01)。
表4人参根腐病防治效果
Figure BDA0002377606960000131
表中数据系平均数±标准差。Duncan氏复极差异法检验，同一列数据不同字母表示差异显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)。BIO-4表示生物有机肥处理，OF表示堆肥腐熟的玉米秸秆有机肥处理。
实施例5
BIO-4生物有机肥对人参根系生长的影响
试验共设3个处理：(1)CK：不施肥料；(2)有机肥(OF)：施加育苗土总质量2％的有机肥。(3)生物有机肥(BIO-4)：施加育苗土总质量 2％的BIO-4生物有机肥。具体为：取长势较为接近且根系发达的2年生人参苗，参根表面经消毒清洗(经次氯酸钠润洗后，50℃水中再浸泡5min)后，备用。将人参苗移栽至上述各处理的PP塑料盆钵(规格为口径26cm，高18cm)中，每盆3株，每处理30盆，室外参棚下常规管理。于移栽人参4个月后取样，每处理组随机选取人参9株，清水冲洗干净，滤纸吸干根表水分，利用根系扫描仪测定包括总根长、根投影面积、根面积、根体积、根尖5种指标，数据分析采用winRHIZO软件。
供试土壤为改良土，配方为微生物基质、蛭石、珍珠岩比例为6：2：1，供试人参取自吉林参王植保公司。
人参根系分析结果
如表5所示，生物有机肥(BIO-4)处理组的人参根系生长情况明显优于有机肥(OF)、对照(CK)处理组。与OF、CK处理组相比，BIO-4处理组的人参总根长、根投影面积、根面积、根体积、根尖均有显著提高(p<0.05)。其中，BIO-4处理组的人参总根长较OF、CK处理组分别增加了38.20％、 104.6％；BIO-4处理组的人参根面积较OF、CK处理组分别增加了31.48％、 85.08％；BIO-4处理组的人参总根尖数较OF、CK处理组分别增加了26.15％、61.40％。由此说明，施用BIO-4生物有机肥有利于人参根部的生长发育。
表5不同施肥处理对人参根系的影响
Figure BDA0002377606960000141
Figure BDA0002377606960000151
表中数据系平均数±标准差。Duncan氏复极差异法检验，同一列数据不同字母表示差异显著(p<0.05)。
实施例6
BIO-4生物有机肥对人参植株生物量及参根皂苷含量的影响
试验共设3个处理：(1)CK：不施肥料；(2)有机肥(OF)：施加育苗土总质量2％的有机肥。(3)生物有机肥(BIO-4)：施加育苗土总质量 2％的BIO-4生物有机肥。具体为：取长势较为接近且根系发达的2年生人参苗，参根表面经消毒清洗(经次氯酸钠润洗后，50℃水中再浸泡5min)后，备用。将人参苗移栽至上述各处理的PP塑料盆钵(规格为口径26cm，高18cm)中，每盆3株，每处理30盆，室外参棚下常规管理。于移栽人参4个月后取样，每处理组随机选取9株参苗，清水洗去参苗表面泥土，测量其根粗、整株鲜质量和根鲜质量。然后50℃烘干至恒重，测整株干质量及根干质量。参根干品样品粉碎过筛，称取该样品1.000g，采用超声提取法制备人参皂苷溶液，采用HPLC法对Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rc、Rd和Ro 8种人参单体皂苷含量及总皂苷含量进行测定。
供试土壤为改良土，配方为微生物基质、蛭石、珍珠岩比例为6：2：1，供试人参取自吉林参王植保公司。
人参生长指标的测定结果
如表6所示，施用BIO-4生物有机肥可显著促进人参生长，各指标均表现为BIO-4处理显著高于CK、OF处理(p<0.05)。OF、BIO-4处理的人参根粗分别较CK处理高出5.61％、14.95％。OF处理、BIO-4处理的根干重较CK处理高出6.11％、28.33％。OF处理、BIO-4处理的根鲜重较CK处理高出5.56％、 36.27％。BIO-4处理的人参整株鲜重较CK处理高出33.13％，CK与OF处理差异显著(p<0.05)，且OF处理的整株鲜重较CK处理高出6.58％。OF处理组、BIO-4处理组整株干重分别较CK高出5.60％、29.20％。
表6施用BIO-4生物有机肥对人参生长的影响
Figure BDA0002377606960000161
表中数据系平均数±标准差。Duncan氏复极差异法检验，同一列数据不同字母表示差异显著(p<0.05)。
人参根部皂苷含量的测定结果
如表7所示，施用有机肥(OF)和生物有机肥(BIO-4)均有利于参根皂苷含量的积累，但生物有机肥的作用效果更好。与对照(CK)相比，经生物有机肥处理后，人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re含量均有显著提高 (p<0.05)，有利于单体皂苷Rf、Rg1、Ro的积累。施用BIO-4生物有机肥可显著提高参根的总皂苷含量，较对照处理组相比，参根的总皂苷含量提高了15.98％。由此说明，施用BIO-4生物有机肥对提高参根的皂苷含量有利。
表7不同处理对人参根部皂苷含量的影响
Figure BDA0002377606960000162
Figure BDA0002377606960000171
表中数据系平均数±标准差。Duncan氏复极差异法检验，同一行数据不同字母表示差异显著(p<0.05)。
本发明对死谷芽孢杆菌SZ-4二次固体发酵生物有机肥的培养条件进行了筛选优化，并提供了优化方法，尚需进一步完善发酵制备工艺，以期为工业化发酵生产提供可靠的理论参数。另外，本发明只是在室外参棚条件下进行了盆栽防病试验与促生试验，尚需进一步进行大田试验，以期为生物有机肥对人参田间病害的有效防治提供理论基础。
本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。在本专利的启示下，结合本领域的基本常识，将所述人参生物有机肥用于人参真菌性病害的防治中，都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)活化死谷芽孢杆菌；
(2)制备死谷芽孢杆菌发酵液；
(3)制备生物有机肥基质；
(4)使用死谷芽孢杆菌发酵液对生物有机肥基质进行二次发酵，得到含死谷芽孢杆菌的生物有机肥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述死谷芽孢杆菌为死谷芽孢杆菌SZ-4，保藏编号：CGMCC No.8273。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中采用牛肉膏蛋白胨培养基对死谷芽孢杆菌进行活化；
优选地，所述牛肉膏蛋白胨培养基每1000mL去离子水含有牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl 5.0g、琼脂16g、pH 6.8-7.0，121℃湿热灭菌30min；
优选地，所述对死谷芽孢杆菌进行活化方法为：将死谷芽孢杆菌试管种活化于牛肉膏蛋白胨培养基，32-35℃恒温振荡培养18-24h，传代2-3次，挑取单一菌落接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，32℃，180r/min振荡培养24-36h，得到SZ-4细菌种子液；
优选地，所述牛肉膏蛋白胨培养液为不加琼脂的所述牛肉膏蛋白胨培养基质。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述死谷芽孢杆菌发酵液的制备方法为：将种子液按5％接种量接入BPY发酵液中，32-35℃、180r/min振荡培养36-48h，得到死谷芽孢杆菌SZ-4发酵液；
优选地，所述SZ-4发酵液的含菌量为106-1010CFU/mL，例如108CFU/mL；
优选地，所述BPY发酵液每1000mL去离子水含有牛肉膏2.5-5g、蛋白胨7-15g、酵母浸膏1-5g、葡萄糖1-5g、NaCl 1-5g、pH 6.8-7.0。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：将风干的玉米秸秆粉碎，过0.9-1.25mm筛；将蒸馏水150份，红糖10份，秸秆发酵粉剂1份混匀，装入密封容器，于30-40℃条件下厌氧发酵6-10d得到秸秆发酵菌液；将玉米秸秆粉、蒸馏水、秸秆发酵菌液依次按200份、70-80份、1份比例混匀；将混合均匀的物料打堆发酵，控制温度在25-35℃之间，发酵过程中进行翻堆，经湿热灭菌，得到生物有机肥基质；
优选，所述翻堆为每隔4天翻堆一次；
优选，所述打堆发酵时间为1个月。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述二次发酵包括：将步骤(2)中制备的发酵液接种入步骤(3)制备的生物有机肥基质中，调节发酵含水量，添加尿素作为氮源，恒温发酵，进行翻抛，可得到所述含死谷芽孢杆菌的生物有机肥。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二次发酵方法中发酵液接种量(发酵液与生物有机肥基质的体积质量比，单位为mL/g)为0.5％-25％，；所述发酵液中死谷芽孢杆菌的菌落浓度108CFU/mL数量级；
优选地，所述二次发酵方法中含水量(水与生物有机肥基质的体积质量比，单位为mL/g)为30％-70％；
优选地，所述二次发酵方法中添加尿素至生物有机肥C/N为5-40；
优选地，所述二次发酵方法中恒温发酵温度可以为15-42℃，；
优选地，所述二次发酵方法中恒温发酵时间可以为0.5-10d；
优选地，所述二次发酵方法中翻抛频率可以为1次/6h-1次/60h或0次。
8.一种含死谷芽孢杆菌的生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥是由死谷芽孢杆菌与生物质有机肥基质发酵制备得到；
优选地，所述死谷芽孢杆菌是经活化和发酵的死谷芽孢杆菌发酵液；
优选地，所述死谷芽孢杆菌是SZ-4菌株保藏编号：CGMCC No.8273；
优选地，所述生物有机肥的含菌量为(0.5-15)×109CFU/g，例如2.01×109CFU/g。
9.根据权利要求8所述的生物有机肥，其特征在于，所述含死谷芽孢杆菌的生物有机肥为按照权利要求1-7任一项所述制备方法制备得到。
10.权利要求8或9所述生物有机肥的应用，其可用于防治植物真菌病害及促进植物生长；
优选地，所述植物为人参；
优选地，所述真菌为腐皮镰孢菌。
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