BR112015003123B1

BR112015003123B1 - Composição compreendendo meio de células inteiras de fermentação de cepa de bacillus sp. com atividade pesticida e promotora do crescimento, método para modulação de infestação por fungos e do crescimento de plantas e semente revestida com dita composição

Info

Publication number: BR112015003123B1
Application number: BR112015003123-4A
Authority: BR
Inventors: Ratnakar Asolkar; Ana Lucia Cordova-Kreylos; Christopher Mccort; Debora Wilk; Carly Todd; Hai Su; Pamela Marrone
Original assignee: Marrone Bio Innovations, Inc
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2021-04-13
Also published as: CN104718281A; NZ703932A; HUE048611T2; DK2885398T3; US10258048B2; EP2885398A1; CA2880276C; BR112015003123A2; US9125419B2; PL2885398T3; AU2013302740A1; EP2885398B1; MX357462B; PT2885398T; UY34978A; WO2014028521A1; CA2880276A1; HRP20200348T1; JP2015534457A; ES2774163T3

Abstract

composição compreendendo meio de células inteiras de fermentação de cepa de bacillus sp. com atividade pesticida e promotora do crescimento, método para modulação de infestação por pragas e do crescimento de plantas, e semente. a presente invenção refere-se a uma cepa de bacillus, isolado f727 de bacillus sp. que produz metabólitos com atividades pesticidas. também são fornecidas composições bioativas e metabólitos derivados de culturas do isolado f727 de bacillus sp. capazes de controlar pragas; bem como processos de uso da cepa e seus metabólitos para o controle de pragas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTES RELACI-ONADOS

[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 61/683.174 depositado em 14 de agosto de 2012 e do Pedido de Patente U.S. No. 13/835.677, depositado em 15 de março de 2013; cujas divulgações são incorporadas aqui como referência em suas totalidades para todas as finalidades.

CAMPO TÉCNICO

[0002] A presente divulgação está no campo de biopesticidas e controle de pragas; em particular pesticidas microbianos e as cepas microbianas que produzem os mesmos.

ANTECEDENTES

[0003] Produtos naturais são substâncias produzidas por micro organismos, plantas e outros organismos. Produtos naturais microbianos oferecem uma fonte abundante de diversidade química e há um longo histórico de utilização de produtos naturais para finalidades farmacêuticas. Apesar da ênfase sobre os produtos naturais para agentes terapêuticos para seres humanos, quando mais de 50% são derivados de produtos naturais, apenas 11% dos pesticidas são derivados de fontes naturais. Todavia, pesticidas de produtos naturais possuem um potencial de desempenhar uma função importante no controle de pragas tanto em fazendas convencionais quanto orgânicas.

[0004] Os metabólitos secundários produzidos por micro-organis mos (bactérias, actinomicetos e fungos) fornecem novos compostos químicos que podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com compostos conhecidos por controlarem eficientemente pragas de insetos e por reduzirem o risco de desenvolvimento de resistência. Há vários exemplos bem conhecidos de produtos naturais microbianos que são bem sucedidos como inseticidas para a agricultura (Thompson e outros, 2000; Arena e outros, 1995; Krieg e outros 1983).

[0005] O desenvolvimento de um pesticida microbiano começa com o isolamento de um micro-organismo em uma cultura pura. Este então prossegue com eficácia e verificação do espectro utilizando testes in vitro, in vivo ou em escala piloto em uma estufa e no campo. Ao mesmo tempo, compostos ativos produzidos pelo micro-organismo são isolados e identificados. Para a comercialização de um pesticida microbiano, o micro-organismo tem que ser produzido de forma econômica por fermentação em uma escala industrial e formulado com aditivos biologicamente compatíveis aprovados para aumentar a eficácia e para maximizar a facilidade de aplicação.

[0006] Com o desenvolvimento de resistência crescente a pesticidas químicos, o espectro de pesticidas disponíveis está diminuindo. Em adição, pesticidas que não ocorrem naturalmente podem ter efeitos ambientais nocivos. Consequentemente, há uma necessidade de novos pesticidas que ocorrem naturalmente para os quais os agentes patogênicos de plantas não desenvolveram resistência e que possuem efeitos ambientais mínimos.

SUMÁRIO

[0007] É divulgada aqui uma cepa microbiana, isolado F727 de Bacillus sp., que possui atividade pesticida. Esta cepa produz metabólitos bioativos ativos no controle de pragas e que promovem crescimento de plantas. Também são divulgados métodos para utilização do isolado 727 de Bacillus sp. e seus metabólitos para o controle de pragas e para promover o crescimento de plantas. Em uma modalidade particular, o Bacillus sp. pode ter pelo menos uma das características de identificação de NRRL B-50768.

[0008] Além disso, o Bacillus sp. pode ter uma sequência do gene de rRNA 16S com pelo menos 99% de identidade e particularmente 99,5% de identidade em relação à sequência consenso apresentada na SEQ ID NO: 3 e que compreende uma sequência para frente que possui pelo menos 99% de identidade e particularmente 99,5% de identidade em relação à sequência apresentada na SEQ ID NO:1 e uma sequência inversa que possui pelo menos 99% de identidade e particularmente 99,5% de identidade em relação à sequência apresentada na SEQ ID NO:2.

[0009] É adicionalmente fornecida uma cultura substancialmente pura ou meio de células inteiras que compreende a dita cepa ou fração celular, extrato, sobrenadante e/ou substâncias ou compostos derivados da dita cepa ou extrato da mesma.

[00010] É adicionalmente fornecido um método para a modulação da infestação por pragas em uma planta que compreende a aplicação na planta e/ou nas sementes da mesma e/ou no substrato utilizado para o crescimento da dita planta de uma quantidade do dito isolado F727 de Bacillus sp. (e/ou uma cultura, uma fração celular, um extrato, um sobrenadante e/ou substâncias ou compostos derivados da dita cepa ou extrato) que é eficiente para modular a dita infestação por pragas. Em certas modalidades, a praga é um fungo de planta tal como, por exemplo, Bremia, Botrytis, Sclerotinia, Sphaerotheca, Rhizoctonia, Colletotrichum, Fusarium, Verticillium, Phytophthora ou Bipolaris. Em modalidades adicionais, a praga é uma bactéria tal como, por exemplo, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Acidovorax ou Clavibacter.

[00011] Também são fornecidos métodos para promover o crescimento de plantas e/ou a germinação de sementes, em que os métodos compreendem a aplicação na planta e/ou nas sementes da mesma e/ou no substrato utilizado para o crescimento da dita planta de uma quantidade do dito isolado F727 de Bacillus sp. (e/ou uma cultura, uma fração celular, um extrato, um sobrenadante e/ou substâncias ou compostos derivados da dita cepa ou extrato) que é eficiente para promover o crescimento de plantas e/ou a germinação de sementes.

[00012] Em modalidades particulares, o dito Bacillus produz um composto selecionado do grupo que consiste de: (a) composto " A " que (i) pode ser obtido partindo de Bacillus sp., particularmente, isolado 727 de Bacillus sp. 727; (ii) possui atividade pesticida; (iii) possui um peso molecular de aproximadamente 10201060 e mais particularmente, 1044 que é determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (iv) possui valores de 1H RMN de δ 7,15, 6,72, 4,81, 4,70, 4,65, 4,40, 4,35, 4,25, 4,15, 3,85, 3,65, 3,50, 3,22, 2,85, 2,80, 2,65, 2,45, 2,35, 2,30, 2,20, 1,95, 1,55, 1,31, 1,20 e 0,85; (v) possui um tempo de retenção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) de aproximadamente 6-12 minutos, mais especificamente aproximadamente 8 minutos e ainda mais especificamente aproximadamente 8,31 min em uma coluna C-18 de HPLC em fase inversa (Phenomenex, Luna 5μ C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN aquoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm; (vi) opcionalmente contém 47 carbonos, 72 hidrogênios, 12 nitrogênios e 15 oxigênios; e (vii) é opcionalmente um peptídeo e pode compreender glutamina (1 unidade), prolina (1 unidade), serina (1 unidade), tirosina (1 unidade) e asparagina (3 unidades); (b) Composto "B " que (i) possui atividade pesticida; (ii) possui um peso molecular de aproximadamente 10301080 e mais particularmente, 1058 que é determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (iii) possui um tempo de retenção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) de aproximadamente 6-14 minutos, mais especificamente aproximadamente 8 minutos e ainda mais especificamente aproximadamente 8,67 min em uma coluna em fase inversa C-18 de HPLC utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN aquoso, 2024 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm; (iv) opcionalmente compreende 48 carbonos, 74 hidrogênios, 12 nitrogênios e 15 oxigênios; e (v) é opcionalmente um peptídeo e pode compreender glutamina (1 unidade), prolina (1 unidade), serina (1 unidade), tirosina (1 unidade) e asparagina (3 unidades); e (c) Composto " C " que (i) possui atividade pesticida; (ii) possui um peso molecular de aproximadamente 10501120 e mais particularmente, 1072 que é determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (iii) possui um tempo de reteção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) de aproximadamente 6-14 minutos, mais especificamente aproximadamente 9 minutos e ainda mais especificamente aproximadamente 9,19 min em uma coluna em fase inversa C-18 de HPLC utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN aquoso, 2024 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm; (iv) opcionalmente contém 49 carbonos, 76 hidrogênios, 12 nitrogênios e 15 oxigênios; e (v) é opcionalmente um peptídeo e pode compreender glutamina (1 unidade), prolina (1 unidade), serina (1 unidade), tirosina (1 unidade) e asparagina (3 unidades).

[00013] Também é fornecida aqui uma cepa de Bacillus que possui as características a seguir: (a) pelo menos um de: (1) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 99,5% de identidade em relação a uma sequência de 16SrRRNA apresentada na SEQ ID NO:3; (2) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 95% de identidade em relação a uma sequência de recA apresentada na SEQ ID NO: 10 e (3) uma sequência de nucleotídeos que possui pelo menos 90% de identidade em relação a uma sequência de phoR inversa apresentada na SEQ ID NO: 13; (b) produz um ou mais compostos que (i) possuem atividade pesticida; (ii) possuem um peso molecular de aproximadamente 1020 -1120 que é determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS) e (iii) possuem um tempo de retenção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos em uma coluna em fase inversa C-18 de HPLC utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN aquoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm e (iv) são opcionalmente peptídeos; (c) é resistente a Canamicina, Cloranfenicol, Ampicilina, Penicilina, Cefuroxima, Piperacilina, Tetraciclina; e (d) possui atividade de fosfatase alcalina, esterase, fosfatase ácida e naftol-AS-BI-fosfohidrolase.

[00014] É também fornecida uma combinação que compreende o dito isolado F727 de Bacillus sp., uma cultura substancialmente pura, fração celular, extrato, sobrenadante e substâncias, metabólitos ou compostos derivados da dita cepa ou extrato da mesma e pelo menos um de (a) uma segunda substância que pode ser um pesticida químico ou biológico e (b) pelo menos um de um carreador, um diluente, um tensoativo, um adjuvante. A combinação pode ser uma composição e pode ser revestida sobre uma semente.

[00015] É adicionalmente fornecido um método para a modulação da infestação por pragas em uma planta que compreende a aplicação na planta e/ou nas sementes da mesma e/ou no substrato utilizado para o crescimento da dita planta de uma quantidade da dita combinação eficiente para modular a dita infestação por pragas. Em certas modalidades, a praga é um fungo de planta tal como, por exemplo, Bremia, Botrytis, Sclerotinia, Sphaerotheca, Rhizoctonia, Colletotrichum, Fusarium, Verticillium, Phytophthora ou Bipolaris. Em modalidades adicionais, a praga é uma bactéria tal como, por exemplo, Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Acidovorax ou Clavibacter.

[00016] É adicionalmente fornecido o uso de uma composição, opcionalmente em combinação com uma ou mais segundas substâncias, para formular uma composição pesticida, em que a composição é selecionada do grupo que consiste de um ou mais de: (a) uma cultura substancialmente pura do isolado F727 de Bacillus sp., (b) uma fração celular de uma cultura do isolado F727 de Bacillus sp., (c) um sobrenadante obtido partindo de uma cultura do isolado F727 de Bacillus sp., (d) um filtrado obtido partindo de uma cultura do isolado F727 de Bacillus sp., (e) um extrato de qualquer um de (a), (b), (c) ou (d), (f) um metabólito produzido por uma cultura do isolado F727 de Bacillus sp., (g) composto A, (h) composto B e (i) composto C; e a segunda substância é selecionada do grupo que consiste de: (a) um pesticida, (b) um agente que promove o crescimento de plantas, (c )um carreador, (d) um adjuvante, (e) um tensoativo, (f) um fertilizante, e (g) um agente antifitopatogênico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00017] A Figura 1 mostra uma representação esquemática do esquema de purificação para a obtenção dos compostos da invenção partindo do meio de cultura.

[00018] A Figura 2 representa o cromatograma de ESI-LCMS para o composto "A".

[00019] A Figura 3 representa o (+) ESIMS para o composto "A".

[00020] A Figura 4 representa o cromatograma de ESI-LCMS para o composto "B".

[00021] A Figura 5 representa o (+) ESIMS para o composto "B".

[00022] A Figura 6 representa o cromatograma de ESI-LCMS para o composto "C".

[00023] A Figura 7 representa o (+) ESIMS para o composto "C"

[00024] "C".

[00025] A Figura 8 representa a atividade biológica da fração 3 de VLC (F727F3 na Figura) e o Composto A (F727F3H11 na Figura), o Composto B (F727F3H14 na Figura) e o Composto C (F727F3H17 na Figura) purificados por HPLC contra quatro agentes patogênicos fúngicos: Botrytis cinerea (Botrytis na Figura), Sclerotinia homeocarpa (Sclerotina na Figura), Rhizoctonia solani (Rhizoctonia na Figura) e Bipolaris maydis (Bipolaris na Figura).

[00026] A Figura 9 mostra o efeito do sobrenadante de F727 sobre Botrytis cinerea no tomate. As plantas foram inoculadas com esporos de B. cinerea nas concentrações indicadas na Figura e foram tratadas com o sobrenadante proveniente de uma fermentação de Bacillus sp. F727 (segunda barra partindo da esquerda) ou Switch® (terceira barra partindo da esquerda). Os controles incluíam plantas inoculadas (barra mais à esquerda) e plantas não tratadas com pesticida inoculadas com duas concentrações diferentes do fungo (quarta e quinta barras partindo da esquerda).

[00027] A Figura 10 mostra o efeito do sobrenadante de F727 sobre Míldio Felpudo na alface. As plantas foram tratadas com o sobrenadante do isolado F727 de Bacillus sp. (F727); Ridomil ou não foram tratadas (UTC).

[00028] A Figura 11 compara o efeito do sobrenadante de F727 com Fenhexamid sobre Botrytis no tomate. As plantas que foram infectadas de forma experimental com B. cinerea foram pré-pulverizadas uma vez (sobrenadante de F727) ou duas vezes (sobrenadante de F727 x 2) com o sobrenadante de F727, com água ou com Fenhexamid (Elevate®) e a gravidade da doença foi analisada.

[00029] A Figura 12 compara o efeito do sobrenadante de F727 com Fenhexamid sobre Botrytis em pimentas. As plantas foram pulverizadas com o sobrenadante proveniente de um fermentação com o isolado F727 de Bacillus sp. (F727), água, (UTC) ou Fenhexamid (Elevate®). As plantas pulverizadas foram então infectadas de forma experimental com B. cinerea, crescidas e analisadas após 13 dias em relação à gravidade da doença.

[00030] A Figura 13 mostra medidas de controle de doença em pepinos infectados com míldio pulverulento e tratados com preparações de F727 diferentes. As células F727 foram crescidas em três meios diferentes: SPY, SMP e TSB, como indicado na figura. Meio com células inteiras, células (suspensas em MgSO4 a 10 mM) e sobrenadante foram obtidos para cada uma destas condições de crescimento. A água ("Água DI" na figura) foi utilizada como um controle negativo. Brancos para o meio SMP, o meio SPY, o meio TSB e MgSO4 a 10 mM também foram incluídos.

[00031] A Figura 14 mostra medidas de controle de doença em plantas de tomate infectadas com Botrytis cinerea e tratadas com preparações de F727 diferentes. As células F727 foram crescidas em três meios diferentes: SPY, SMP e TSB, como indicado na figura.

[00032] Meio com células inteiras, células (suspensas em MgSO4 a 10 mM) e sobrenadante foram obtidos para cada uma destas condições de crescimento. A água ("Água DI" na figura) foi utilizada como um controle negativo. Brancos para o meio SMP, o meio SPY, o meio TSB e MgSO4 a 10 mM também foram incluídos.

[00033] A Figura 15 mostra medidas de controle de doença em plantas de pepino infectadas com míldio pulverulento. Antes da inoculação com esporos de fungo, as plantas foram pulverizadas com água ("água DI" na Figura, controle negativo), meio com células inteiras proveniente da fermentação com o isolado F727 (MBI-110 WCB) ou um de um número de pesticidas comerciais (Double Nickel® (Certis, Bacillus amyloliquefaciens cepa D747) Sonata® (Bacillus subtilus), Vacciplant®, Companion®, Serenade® (Bacillus pumilus) ou Regalia® (Reynoutria sachalinensis) ou uma combinação de Regalia® (Reynoutria sachalinensis) e F727 WCB).

[00034] A Figura 16 mostra medidas de controle de doença em plantas de tomate infectadas com Phytophthora infestans. Antes da inoculação com P. infestans, as plantas foram pulverizadas com água ("água DI" na Figura, controle negativo), Regalia®, Double Nickel® (Certis, Bacillus amyloliquefaciens cepa D747) ou meio com células inteiras proveniente da fermentação com o isolado F727 (MBI-110 WCB).

[00035] A Figura 17 mostra os efeitos de sobrenadantes provenientes da fermentação com F727 e controles, sobre o crescimento de micélios de S. rolfsii em um ensaio in vitro. Os efeitos da água (água DI), do sobrenadante de F727 não filtrado (F727 não filtrado), do sobrenadante de F727 filtrado (F727 filtrado) e Pristine® são mostrados. Para cada material de teste e controle, dois volumes foram avaliados: em cada par de barras, a barra mais à esquerda mostra resultados utilizando 25 μL e a barra mais à direita mostra os resultados utilizando 50 μL.

[00036] A Figura 18 mostra o efeito de um banho do solo com F727 WCB sobre a infecção causada pelo Míldio Felpudo de alface. UTC: plantas de alface de controle não tratadas infectadas com aproximadamente 5x104 esporos de Míldio Felpudo; banho com F727: plantas de alface que sofreram um banho do solo com F727 WCB uma hora antes da inoculação com aproximadamente 5x104 de esporos de Míldio Felpudo. A gravidade da doença foi medida na forma da porcentagem de cobertura de folhas/cotilédones com tecido doente.

[00037] A Figura 19 mostra resultados de ESIMS/MS para o composto A.

[00038] A Figura 20 mostra um diagrama esquemático da estrutura do Composto A.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00039] Embora as composições e os métodos divulgados aqui sejam suscetíveis a várias modificações e formas alternativas, exemplos de modalidades serão descritos aqui em detalhes. Deve ser entendido, entretanto, que não há intenção de limitar a invenção às formas particulares divulgadas, mas ao contrário, a intenção é cobrir todas as modificações, os equivalentes e as alternativas que se encaixam dentro do espírito e do âmbito da invenção que são definidos pelas reivindicações em anexo.

[00040] Quando uma faixa de valores é fornecida, é entendido que cada valor intermediário, até a décima parte da unidade do limite inferior a não ser que o contexto determine claramente o contrário, entre o limite superior e o limite inferior de tal faixa e qualquer outro valor citado ou intermediário em tal faixa citada, é incluído na mesma. Faixas menores também são incluídas. Os limites superior e inferior destas faixas menores também são incluídos aqui, sujeitos a qualquer limite especificamente excluído na faixa citada.

[00041] A não ser que seja definido o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que é comumente entendido por um perito comum na arte à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui também possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos são descritos agora.

[00042] Tem que ser citado que como utilizado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural a não ser que o contexto determine claramente o contrário.

[00043] Como definido aqui, "derivado de" significa diretamente isolado ou obtido partindo de uma fonte particular ou alternativamente que possui características de identificação de uma substância ou um organismo isolado ou obtido partindo de uma fonte particular. No evento de que a "fonte" é um organismo, "derivado de" significa que este pode ser isolado ou obtido partindo do próprio organismo ou meio utilizado para cultivar ou crescer o dito organismo.

[00044] Como definido aqui, os termos "cultura em meio total" e "meio com células inteiras" referem-se a uma cultura líquida que contém tanto as células quanto o meio. Se as bactérias forem crescidas sobre uma placa as células podem ser coletadas em água ou outro líquido, para fornecer uma cultura em meio total.

[00045] O termo "sobrenadante" refere-se ao líquido remanescente quando as células que são crescidas em meio ou coletadas em outro líquido partindo de uma placa com ágar são removidas por centrifugação, filtração, sedimentação ou outros meios bem conhecidos na arte.

[00046] Como definido aqui, "filtrado" refere-se ao líquido proveniente de uma cultura em meio total que foi passado através de uma membrana.

[00047] Como definido aqui, "extrato" refere-se à substância líquida removida de células por um solvente (água, detergente, tampão) e separada das células por centrifugação, filtração ou outro método.

[00048] Como definido aqui, "metabólito" refere-se a um composto, uma substância ou um subproduto de uma fermentação de um microorganismo ou sobrenadante, filtrado ou extrato obtido partindo de um micro-organismo que possui atividade pesticida e particularmente, bactericida ou fungicida. Como definido aqui, um "composto isolado" é essencialmente livre de outros compostos ou substâncias, por exemplo, pelo menos aproximadamente 20% puro, preferencialmente pelo menos aproximadamente 40% puro, mais preferencialmente aproximadamente 60% puro, ainda mais preferencialmente aproximadamente 80% puro, mais preferencialmente aproximadamente 90% puro e ainda mais preferencialmente aproximadamente 95% puro, como é determinado por métodos analíticos, incluindo, mas não limitados a métodos cromatográficos e eletroforéticos. Os termos "metabólito" e "composto" podem ser utilizados de forma intercambiável.

[00049] Um "carreador" como definido aqui é um material orgânico ou inorgânico inerte, com o qual o ingrediente ativo é misturado ou formulado para facilitar sua aplicação a uma planta ou outro objeto que será tratado ou para facilitar seu armazenamento, transporte e/ou manipulação.

[00050] O termo "modular" como definido aqui é utilizado para significar alterar a quantidade de infestação por pragas ou a taxa de espalhamento da infestação por pragas.

[00051] O termo "infestação por pragas", como definido aqui, é a presença de uma praga em uma quantidade que causa um efeito prejudicial incluindo uma doença ou uma infecção em uma população hospedeira ou emergência de uma erva daninha indesejada em um sistema de crescimento.

[00052] Um "pesticida" como definido aqui, é uma substância derivada de um produto biológico ou uma substância química, que aumenta a mortalidade ou inibe a taxa de crescimento de pragas de plantas e inclui, mas não é limitado a nematocidas, inseticidas, fungicidas para plantas, bactericidas para plantas e agentes antivirais para plantas.

Identificação e Caracterização de Bacillus sp. F727

[00053] O isolado F727 de Bacillus sp. foi identificado como uma nova cepa de Bacillus utilizando uma abordagem polifásica que combina a determinação de sequência do rRNA 16S, a análise de ácidos graxos, a análise de proteína por MALDI-TOF e a caracterização utilizando vários ensaios bioquímicos. Ver os Exemplos 1-4, infra.

[00054] Os metabólitos produzidos por fermentação de Bacillus sp. F727 foram isolados e caracterizados. Ver os Exemplos 5, 25 e 26 infra. Certos destes metabólitos demonstravam atividade contra agentes patogênicos fúngicos e bacterianos tanto in vitro quanto in vivo. Ver os Exemplos 6-17, 20, 22, 23 e 27-29 infra. Os efeitos que promovem o crescimento de plantas, partindo de Bacillus sp. F727 e seus metabólitos, também foram observados em um número de plantas. Ver os Exemplos 18 e 19 e 21, 24 infra.

[00055] Assim o Bacillus sp. F727 e/ou seus metabólitos, podem ser utilizados como produtos naturais para o controle de doenças fúngicas e bacterianas na agricultura; e para promover o crescimento de plantas.

Métodos de Produção

[00056] Como citado anteriormente, os compostos ou os metabólitos podem ser obtidos, são obtiveis ou podem ser derivados de um organismo que possui uma ou mais características de identificação de uma cepa F727 de Bacillus. Os métodos compreendem o cultivo destes organismos e a obtenção dos compostos e/ou das composições da presente invenção através do isolamento destes compostos partindo da cultura destes organismos.

[00057] Em particular, os organismos são cultivados em meio com nutrientes utilizando métodos conhecidos na arte. Os organismos podem ser cultivados por cultivo em frasco de agitação, fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo, mas não limitada a fermentações contínuas, em batelada, em batelada alimentada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizada em meio adequado e sob condições que permitem o crescimento celular. O cultivo pode ocorrer em meio com nutrientes adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, utilizando procedimentos conhecidos na arte. Os meios adequados estão disponíveis partindo de fontes comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas.

[00058] Após o cultivo, um sobrenadante, um filtrado e/ou um extrato de ou derivado da dita cepa de Bacillus (por exemplo, Bacillus sp. F727) pode ser utilizado na formulação de uma composição pesticida.

[00059] Alternativamente, após o cultivo, os compostos e/ou os metabólitos podem ser extraídos, enriquecidos e/ou purificados partindo do meio de cultura.

[00060] O extrato pode ser fracionado por cromatografia. As frações cromatográficas podem ser analisadas em relação à atividade tóxica contra, por exemplo, fungos (por exemplo, Botrytis, Sclerotinia, Rhizoctonia & Bipolaris) utilizando métodos conhecidos na arte. O fracionamento pode ser repetido uma ou mais vezes utilizando os mesmos métodos cromatográficos ou diferentes.

[00061] Em uma modalidade, uma composição produzida pela cepa F727 compreende um ou mais compostos que (i) possuem atividade pesticida; (ii) possuem pesos moleculares entre 1020 -1120 que são determinados por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (iii) possuem tempos de retenção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) entre 6-15 minutos em uma coluna em fase inversa C-18 de HPLC utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN aquoso, 2024 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm; e (iv) podem opcionalmente ser obtidos partindo de uma espécie de Bacillus. Os compostos em uma modalidade são peptídeos.

[00062] Em uma modalidade específica, o composto "A " (i) pode ser obtido partindo de uma espécie de Bacillus; (ii) é tóxico para uma praga; (iii) possui um peso molecular de aproximadamente 1020-1060 e mais particularmente, 1044 que é determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); (iv) possui valores de 1H RMN de δ 7,15, 6,72, 4,81,4,70, 4,65, 4,40, 4,35, 4,25, 4,15, 3,85, 3,65, 3,50, 3,22, 2,85, 2,80, 2,65, 2,45, 2,35, 2,30, 2,20, 1,95, 1,55, 1,31, 1,20, 0,85; e (v) possui um tempo de retenção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) de aproximadamente 6-12 minutos, mais especificamente aproximadamente 8 minutos e ainda mais especificamente aproximadamente 8,31 min em uma coluna C-18 em fase inversa de HPLC (Phenomenex, Luna 5μ C18(2) 100 A, 100 x 4,60 mm) utilizando uma água: acetonitrila (CH3CN) com um sistema de solventes em gradiente (0-20 min; 90-0% de CH3CN aquoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm. Em adição, o Composto " A " revela sinais para 47 carbonos, 72 hidrogênios, 12 nitrogênios e 15 oxigênios que são determinados por análises de 1H RMN, 13C RMN & MS. O espectro de 1H RMN exibe características de um peptídeo típico. A análise detalhada do Composto " A " por análises de 1H RMN, 13C RMN, MS/MS e aminoácidos revelou a presença de glutamina (1 unidade), prolina (1 unidade), serina (1 unidade), tirosina (1 unidade) e asparagina (3 unidades).

[00063] Em outra modalidade particular, um composto produzido pela cepa F727 é um composto "B " que (i) possui atividade pesticida; (ii) possui um peso molecular de aproximadamente 1030-1080 e mais particularmente, 1058 que é determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); e (iii) possui um tempo de retenção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) de aproximadamente 6-14 minutos, mais especificamente aproximadamente 8 minutos e ainda mais especificamente aproximadamente 8,67 min em uma coluna em fase inversa C-18 de HPLC utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN aquoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm. Os dados provenientes dos espectros de 1H e 13C RMN, junto com dados de MS, revelam sinais para 48 carbonos, 74 hidrogênios, 12 nitrogênios e 15 oxigênios. O espectro de 1H RMN exibe características de um peptídeo típico. A análise detalhada do Composto "B " pelas análises de 1H RMN, 13C RMN, MS/MS e aminoácidos revelou a presença de glutamina (1 unidade), prolina (1 unidade), serina (1 unidade), tirosina (1 unidade) e asparagina (3 unidades).

[00064] Ainda em outra modalidade preferida, um composto produzido pela cepa F727 é um composto "C " que (i) possui atividade pesticida; (ii) possui um peso molecular de aproximadamente 10501120 e mais particularmente, 1072 que é determinado por Cromatografia Líquida/Espectroscopia de Massa (LC/MS); e (iii) possui um tempo de retenção na Cromatografia Líquida em Alta Pressão (HPLC) de aproximadamente 6-14 minutos, mais especificamente aproximadamente 9 minutos e ainda mais especificamente aproximadamente 9,19 min em uma coluna em fase inversa C-18 de HPLC utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0 % de CH3CN aquoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90 % de CH3CN aquoso, 27-30 min; 90% de CH3CN aquoso) à vazão de 0,5 mL/min e detecção por UV em 210 nm. Os dados provenientes dos espectros de 1H e 13C RMN, junto com os dados de MS, revelam sinais para 49 carbonos, 76 hidrogênios, 12 nitrogênios e 15 oxigênios. O espectro de 1H RMN exibe características de um peptídeo típico. A análise detalhada do Composto " C " por análises de 1H RMN, 13C RMN, MS/MS e aminoácidos revelou a presença de glutamina (1 unidade), prolina (1 unidade), serina (1 unidade), tirosina (1 unidade) e asparagina (3 unidades).

Composições

[00065] As composições podem compreender culturas em meio total, meios com células inteiras, culturas líquidas ou suspensões de ou derivadas de uma cepa de Bacillus, especificamente uma cepa de Bacillus que possui pelo menos uma das características de identificação do isolado F727 de Bacillus sp., bem como sobrenadantes, filtrados ou extratos obtidos partindo do dito Bacillus sp. As composições também podem compreender um ou mais metabólitos ou compostos isolados derivados do isolado F727 de Bacillus sp., que em particular possuem atividade bactericida, fungicida e/ou que promove o crescimento de plantas.

[00066] As composições apresentadas anteriormente podem ser formuladas de qualquer maneira.

[00067] Os exemplos de formulações incluem, mas não estão limitados a concentrados que podem ser emulsificados (EC), pós que podem ser umedecidos (WP), líquidos solúveis (SL), aerossóis, soluções concentradas de volume ultra baixo (ULV), pós solúveis (SP), microencapsulados, grânulos dispersos em água, agentes de escoamento (FL), micro-emulsões (ME), nano-emulsões (NE) etc. Em qualquer formulação descrita aqui, a porcentagem do ingrediente ativo fica dentro de uma faixa de 0,01% até 99,99%.

[00068] As composições podem estar na forma de um líquido, um gel ou um sólido. Uma composição sólida pode ser preparada através da suspensão de um carreador sólido em uma solução de ingrediente(s) ativo(s) e da secagem da suspensão sob condições brandas, tal como evaporação à temperatura ambiente ou evaporação a vácuo a 65°C ou inferior.

[00069] Uma composição pode compreender ingrediente(s) ativo(s) encapsulado(s) em gel. Tais materiais encapsulados em gel podem ser preparados através da mistura de um agente formador de gel (por exemplo, gelatina, celulose ou lignina) com uma cultura ou uma suspensão de células da cepa F727 de Bacillus sp. vivas ou inativadas ou com um filtrado isento de células ou uma fração celular de uma cultura ou uma suspensão da cepa F727 de Bacillus sp. ou com uma cultura, uma célula ou uma fração celular seca por spray ou por congelamento da cepa F727 de Bacillus sp.; ou com uma solução de compostos pesticidas utilizada no método da invenção; e da indução da formação de gel do agente.

[00070] A composição pode adicionalmente compreender um tensoativo que será utilizado com a finalidade de emulsificação, dispersão, umedecimento, espalhamento, integração, controle de desintegração, estabilização de ingredientes ativos e aprimoramento da fluidez ou da inibição de ferrugem. Em uma modalidade particular, o tensoativo é um tensoativo não iônico não fitotóxico que preferencialmente pertence a Lista 4B de EPA. Em outra modalidade particular, o tensoativo não iônico é monolaurato de polioxietileno (20). A concentração de tensoativo(s) pode variar entre 0,1-35% da formulação total, uma faixa preferida é 5-25%. A escolha dos agentes de dispersão e emulsificantes, tais como agentes de dispersão e emulsificantes não iônicos, aniônicos, anfotéricos e catiônicos e a quantidade empregada, são determinadas pela natureza da composição e pela capacidade do agente de facilitar a dispersão das composições.

[00071] As composições apresentadas anteriormente podem ser combinadas com outro agente, micro-organismo e/ou pesticida (por exemplo, nematocida, bactericida, fungicida, acaricida, inseticida). Os micro-organismos incluem, mas não estão limitados a Bacillus sp. (por exemplo, Bacillus firmus, Bacillus thuringiensis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis), Paecilomyces sp. (P. lilacinus) , Pasteuria sp. (P. penetrans) , Chromobacterium sp., Pseudomonas sp., Brevabacillus sp., Lecanicillium sp., Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp (S. bikiniensis, S. costaricanus, S. avermitilis), Burkholderia sp., Trichoderma sp., Gliocladium sp., avermectina, Myrothecium sp., Paecilomyces spp., Sphingobacterium sp., Arthrobotrys sp., Chlorosplrnium, Neobulgaria, Daldinia, Aspergillus, Chaetomium, Lysobacter spp, Lachnum papyraceum, Verticillium suchlasporium, Arthrobotrys oligospora, Verticillium chlamydosporium, Hirsutella rhossiliensis, Pochonia chlamydosporia, Pleurotus ostreatus, Omphalotus olearius, Lampteromyces japonicas, Brevudimonas sp., Muscodor sp.

[00072] O agente pode ser um óleo natural ou produto oleoso que possui atividade nematocida, fungicida, bactericida e/ou inseticida (por exemplo, óleo parafínico, óleo de melaleuca, óleo de capim limão, óleo de cravo da Índia, óleo de canela, óleo de frutos cítricos, óleo de alecrim, píretro, óleo de frutos cítricos (incluindo, mas não limitados aos óleos de lima, laranja e limão); óleo de alecrim, pimenta inglesa, bergamota, eucalipto comum, camomila, citronela, jasmim comum, zimbro comum, lavanda comum, mirra comum, hortelã-brava, frésia, santolina cinzenta, hissopo herbáceo, manjericão santo, árvore de incenso, jasmim, lavanda, cravo de defunto, hortelã, hortelã-pimenta, calêndula, hortelã- verde, árvore de ylang-ylang, saponinas).

[00073] Além disso, o pesticida pode ser um agente antifúngico de sítio isolado que pode incluir, mas não é limitado a benzimidazol, um inibidor de desmetilação (DMI) (por exemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolina, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inibidor de quinona externo, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarbono aromático, ácido cinâmico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, benzenoide (xililalanina); um inibidor de desmetilação selecionado do grupo que consiste de imidazol, piperazina, pirimidina e triazol (por exemplo, bitertanol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol), miclobutanil e um inibidor de quinona externo (por exemplo, estrobilurina). A estrobilurina pode incluir, mas não é limitada a azoxistrobina, kresoxim-metoil ou trifloxistrobin. Ainda em outra modalidade preferida, o agente antifúngico é uma quinona, por exemplo, quinoxifen (5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofenil éter). O agente antifúngico também pode ser derivado de um extrato de Reynoutria.

[00074] O fungicida também pode ser um fungicida químico não inorgânico de vários locais selecionado do grupo que consiste de cloronitrila, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquitios, fenilpiridin-amina e ciano-acetamida oxima.

[00075] Como citado anteriormente, a composição pode compreender ainda um nematocida. O nematocida pode incluir, mas não é limitado a agentes químicos tais como organofosfatos, carbamatos e agentes de fumigação e produtos microbianos tal como avermectina, Myrothecium sp. Biome (Bacillus firmus), Pasteuria spp., Paecilomyces e produtos orgânicos tais como saponinas e óleos vegetais.

[00076] As composições podem ser aplicadas utilizando métodos conhecidos na arte.

[00077] Especificamente, estas composições são aplicadas nas e ao redor das plantas ou partes das plantas. As plantas devem ser entendidas como significando no presente contexto todas as plantas e as populações de plantas tais como plantas selvagens ou plantas de cultivo desejadas e não desejadas (incluindo plantas de cultivo que ocorrem naturalmente). As plantas de cultivo podem ser plantas que podem ser obtidas através de métodos de cruzamento e de otimização de plantas convencionais ou através de métodos biotecnológicos e de engenharia genética ou através de combinações destes métodos, incluindo plantas transgênicas e cultivares de plantas que podem ser protegidos ou não protegidos pelos direitos dos cultivadores de plantas. As partes das plantas devem ser entendidas como significando todas as partes e os órgãos de plantas acima e abaixo do solo, tais como broto, folha, flor e raiz, os exemplos que podem ser mencionados sendo folhas, agulhas, pedúnculos, caules, flores, corpos de frutificação, frutos, sementes, raízes, tubérculos e rizomas. As partes das plantas também incluem material colhido e material de propagação vegetativa e produtiva, por exemplo, mudas, tubérculos, rizomas, ramos e sementes.

[00078] O tratamento de plantas e partes das plantas com as composições apresentadas anteriormente pode ser realizado diretamente ou permitindo que as composições atuem sobre a vizinhança, o habitat ou o espaço de armazenamento de uma planta, por exemplo, através de imersão, pulverização, evaporação, nebulização, dispersão, pintura na superfície ou injeção.

[00079] As composições divulgadas aqui também podem ser aplicadas no solo utilizando métodos conhecidos na arte. Estes incluem, mas não estão limitados a (a) irrigação gota a gota ou "chemigation"; (b) incorporação no solo; (c) encharcamento do solo; (d) tratamento e encharcamento das sementes; e (e) imersão da raiz nua.

Tratamentos das Sementes

[00080] Os tratamentos das sementes incluem a aplicação de uma composição que é divulgada aqui, opcionalmente em combinação com outros agentes bioativos, antagonistas ou simbióticos na superfície de uma semente antes da semeadura. Toxinas, proteínas e/ou compostos pesticidas divulgados aqui podem ser aplicados nas sementes na forma de pós secos, pós em suspensão ou borrifados sobre a semente antes do plantio.

[00081] As composições divulgadas aqui podem ser formuladas para tratamentos das sementes em qualquer um dos modos a seguir: pó seco, pó que pode ser suspenso em água, solução líquida, concentrado ou emulsão que pode ser escoada, emulsão, microcápsulas, gel ou grânulos que podem ser dispersos em água.

[00082] No caso de um pó seco, o ingrediente ativo é formulado similarmente a um pó que pode ser umedecido, mas com a adição de um agente adesivo, tal como óleo mineral, ao invés de um agente umectante. Por exemplo, um kg de pó de talco purificado (esterilizado durante 12 h), 15 g de carbonato de cálcio e 10 g de carboximetil celulose são misturados sob condições assépticas seguindo o método descrito por Nandakumar e outros (2001). O(s) ingrediente(s) ativo(s) é/são misturado(s) em uma proporção de 1:2,5 (suspensão em relação à mistura seca) e o produto é seco à sombra para reduzir o teor de umidade para 20-35%.

[00083] Em modalidades em que as composições divulgadas aqui são aplicadas a uma semente, uma composição pode ser aplicada na forma de um ou mais revestimentos antes do plantio da semente utilizando um ou mais agentes de revestimento de semente incluindo, mas não limitados a, etileno glicol, polietileno glicol, quitosana, carboximetil quitosana, limo de turfa, resinas e ceras. As composições também podem ser aplicadas nas sementes em combinação com, por exemplo, fungicidas ou bactericidas químicos com um modo de ação em único sítio, em vário sítios ou desconhecido, utilizando métodos conhecidos na arte.

[00084] Em modalidades adicionais, as composições divulgadas podem ser aplicadas às sementes através de imbibição das sementes ou na forma de um inóculo em pó.

[00085] As sementes podem ser sementes convencionais ou podem ser uma semente modificada geneticamente tal como sementes Liberty Link (Bayer CropScience), Roundup Ready (Monsanto) ou outra semente resistente a herbicidas e/ou sementes engenheiradas para serem resistentes a insetos ou sementes que estão com "pyrimaded" com genes de resistência a herbicidas e a insetos.

Promoção do Crescimento de Plantas

[00086] Interações planta-bactérias na rizosfera são determinantes importantes de fertilidade do solo e saúde da planta. As bactérias que vivem livres que são benéficas para o crescimento de plantas são conhecidas como rizobactérias que promovem o crescimento de plantas (PGPR). Geralmente os promotores do crescimento de plantas funcionam em uma de três maneiras: através da síntese de reguladores de crescimento de plantas, através da facilitação da captação de nutrientes do solo e/ou através da prevenção de doença da planta. Portanto, os efeitos de PGPRs podem ser tanto diretos quanto indiretos. A promoção do crescimento de plantas indireto pode envolver efeito antagonista contra agentes fitopatogênicos. Isto pode ser conseguido, por exemplo, através da produção de sideróforos, da síntese de antibióticos e da produção de HCN e/ou enzimas que degradam a parede celular. Os efeitos de promoção do crescimento de plantas direto são conseguidos através da regulação de fitohormônios (que ajudam no desenvolvimento da planta e de raízes e na proteção contra estresses) e da solubilização de fosfatos minerais e outros nutrientes.

[00087] As composições divulgadas aqui, em particular, o isolado F727 de Bacillus sp. e/ou um sobrenadante, um filtrado, um extrato, um composto, um metabólito ou uma fração celular obtida partindo de uma cultura de Bacillus sp. F727, podem ser utilizadas para modular ou mais particularmente para promover o crescimento de plantas, por exemplo, plantas de cultivo tais como plantas de cultivo de frutos (por exemplo, morango), vegetais (por exemplo, tomate, abóbora, pimenta, berinjela), legumes ou grãos (por exemplo, soja, trigo, arroz, milho), árvore, flor, plantas ornamentais, moitas (por exemplo, algodão, rosas), turfa (por exemplo, azevém anual, capim das Bermudas, capim de búfalo, capim colonial, capim rastejante, dicondra, festuca dura, capim do Kentucky, Pennisetum clandestinum, azevém perene, festuca vermelha, Poa trivialis, Paspalum vaginatum, capim de Santo Agustinho, festuca alta, zoysia etc.), plantas de bulbo (por exemplo, cebola, alho) ou vinha (por exemplo, uva para vinho). As composições também podem ser utilizadas para modular a germinação de semente(s) em planta(s).

[00088] As composições descritasaqui ou o produto formulado, pode ser utilizado isoladamente ou em combinação com um ou mais outros componentes que são descritos a seguir, tais como agentes que promovem o crescimento e/ou agentes antifitopatogênicos em uma mistura em tanque ou em um programa (aplicação sequencial chamada de rotação) com ordem e intervalo de aplicação pré-determinados durante a estação de crescimento. Quando utilizados em uma combinação com os produtos mencionados anteriormente, em uma concentração menor que a recomendada no rótulo do produto, a eficácia combinada dos dois ou mais produtos (dos quais um é a dita composição divulgada aqui) é, em certas modalidades, maior que a soma de cada efeito do componente individual. Consequentemente, o efeito é intensificado por sinergia entre estes dois (ou mais) produtos e o risco para o desenvolvimento de resistência a pesticidas entre as cepas patogênicas de plantas é reduzido.

[00089] A composição pode ser aplicada por imersão da raiz no transplante, especificamente através do tratamento de um fruto ou vegetal com a composição através da imersão as raízes do fruto ou do vegetal em uma suspensão da dita composição (aproximadamente 0,25 até aproximadamente 1,5 % e mais particularmente aproximadamente 0,5% até aproximadamente 1,0% em volume) antes do transplante do fruto ou do vegetal para dentro do solo.

[00090] Alternativamente, a composição pode ser aplicada por gotejamento ou outro sistema de irrigação. Especificamente, a composição pode ser injetada dentro de um sistema de irrigação gota a gota. Em uma modalidade particular, a composição é aplicada em uma concentração de 1x108 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL em um volume de aproximadamente 11 até aproximadamente 4 quartos por acre.

[00091] Ainda em outra modalidade, a composição pode ser adicionada na forma de uma aplicação no arado. Especificamente, a composição pode ser adicionada na forma de um spray dentro do arado no plantio utilizando bocais calibrados para fornecer uma saída final de 2-6 galões/acre. Os bocais são colocados no abridor de arado sobre o plantador de forma que a aplicação de pesticida e a queda de semente dentro do arado sejam simultâneas.

[00092] As misturas das composições divulgadas com, por exemplo, um adjuvante sólido ou líquido são preparadas de maneira conhecida. Por exemplo, as misturas podem ser preparadas através de mistura de forma homogênea e/ou da trituração dos ingredientes ativos com diluentes tais como solventes, carreadores sólidos e, quando apropriado, compostos tensoativos. As composições também podem conter ingredientes adicionais tais como estabilizantes, reguladores de viscosidade, agentes aglutinantes, adjuvantes bem como fertilizantes ou outros ingredientes ativos com a finalidade de se obter efeitos especiais.

Combinações com Agentes Promotores do Crescimento de Plantas

[00093] As composições divulgadas aqui também podem ser utilizadas em combinação com outros agentes que promovem o crescimento tais como fertilizantes sintéticos ou orgânicos (por exemplo, di-amônio fosfato, na forma granular ou líquida), compostagens, extratos de algas marinhas, hormônios de crescimento de plantas tais como IAA (ácido indol acético) utilizados em um tratamento com hormônio de enraizamento para transplantes isoladamente ou em combinação com reguladores do crescimento de plantas tais como IBA (ácido indol butírico) e NAA (ácido naftaleno acético) e microorganismos que promovem o crescimento, tais como, por exemplo, PPFM (metilotrofos facultativos pigmentados de cor de rosa), Bacillus spp., Pseudomonads, Rhizobia e Trichoderma.

Agentes Anti-Fitopatogênicos

[00094] As composições divulgadas aqui também podem ser utilizadas em combinação com outros agentes anti-fitopatogênicos, tais como extratos vegetais, biopesticidas, agentes de proteção inorgânicos de plantas de cultivo (tal como cobre), tensoativos (tais como ramnolipídeos; Gandhi e outros, 2007) ou óleos naturais tais como óleo parafínico e óleo de melaleuca que possuem propriedades pesticidas ou fungicidas ou bactericidas químicos com modo de ação em único sítio, em vários sítios ou desconhecido. Como definido aqui, um "agente anti-fitopatogênico" é um agente que modula o crescimento de um agente patogênico de plantas, particularmente um agente patogênico que causa doença gerada pelo solo sobre uma planta ou alternativamente previne a infecção de uma planta por um agente patogênico de plantas. Um agente patogênico de plantas inclui, mas não é limitado a um fungo, bactérias, actinomiceto ou vírus.

[00095] Como citado anteriormente, o agente anti-fitopatogênico pode ser um agente antifúngico de sítio único que pode incluir, mas não é limitado a benzimidazol, um inibidor de desmetilação (DMI) (por exemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol), morfolina, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inibidor de quinona externo, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarbono aromático, ácido cinâmico, hidroxianilida, antibiótico, polioxina, acilamina, ftalimida, benzenoide (xililalanina). Em uma modalidade mais particular, o agente antifúngico é um inibidor de desmetilação selecionado do grupo que consiste de imidazol, piperazina, pirimidina e triazol (por exemplo, bitertanol, miclobutanil, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol). Em uma modalidade mais particular, o agente antifúngico é miclobutanil. Ainda em outra modalidade preferida, o agente antifúngico é um inibidor de quinona externo (por exemplo, estrobilurina). A estrobilurina pode incluir, mas não é limitada a azoxistrobin, kresoxim-metil ou trifloxistrobin. Ainda em outra modalidade preferida, o agente antifúngico é uma quinona, por exemplo, quinoxifen (5,7-dicloro-4-quinolil 4-fluorofenil éter).

[00096] Ainda em uma modalidade adicional, o fungicida é um fungicida químico não inorgânico de vários sítios selecionado do grupo que consiste de cloronitrila, quinoxalina, sulfamida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquitios, fenilpiridina-amina e ciano-acetamida oxima.

[00097] Ainda em uma modalidade adicional, o agente anti- fitopatogênico pode ser estreptomicina, tetraciclina, oxitetraciclina, cobre ou kasugamicina.

EXEMPLOS Exemplo 1: Isolamento e caracterização do isolado F727 de Bacillus sp. por sequências de rRNA 16S, recA e phoR

[00098] A cepa F727 de Bacillus sp. foi isolada partindo de uma amostra do solo coletada em Jonesville, CA, utilizando métodos de diluição de placas tradicional. O isolado foi identificado como um Bacillus sp. através da amplificação pela PCR e do sequenciamento dos genes 16S rRNA, recA e phoR utilizando iniciadores bacterianos universais. Cerritos e outros (2008) Int. J. Sys. Evol. Microbiol. 58:919923; Guo e outros (2012) Can. J. Microbiol. 58: 1295-1305.

[00099] O crescimento partindo de uma placa com dextrose de batata de 24 horas foi raspado com uma alça esterilizada e ressuspenso em tampão de extração de DNA. O DNA foi extraído utilizando o kit de extração MoBio Ultra Clean Microbial DNA. O extrato de DNA foi verificado em relação à qualidade/quantidade através da eletroforese de uma alíquota de 5 μL em um gel de agarose a 1%.

Sequências de rRNA

[000100] As reações de PCR para a amplificação do gene 16S rRNA foram montadas através da combinação de 2 μL do extrato de DNA limpo com 25 μL de GoTaq Green Mastermix, 1,5 μL de iniciador para frente (iniciador FD1, 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO:4) e 1,5 μL de iniciador inverso (iniciador RD1, 5'- AAGGAGGTGATCCAGCC-3' (SEQ ID NO:5)). O volume de reação foi ajustado para 50 μL com água livre de nucleasse esterilizada. A reação de amplificação foi conduzida utilizando uma máquina termocicladora sob as condições a seguir: 10 minutos a 95°C (desnaturação inicial), 30 ciclos de 45 segundos a 94°C, 45 segundos a 55°C e 2 minutos a 72°C, seguidos por 5 minutos a 72°C (extensão final) e uma temperatura de espera final de 10°C.

[000101] O tamanho, a qualidade e a quantidade do produto de amplificação foram avaliados por eletroforese de uma alíquota de 5 μL em um gel de agarose a 1% e comparação da banda do produto com uma escala de massa.

[000102] Os iniciadores, os nucleotídeos, a enzima e o molde em excesso foram removidos do produto da PCR utilizando o MoBio PCR clean up Kit. O produto da PCR limpo foi submetido ao sequenciamento direto utilizando os iniciadores descritos anteriormente.

[000103] As sequências para frente e inversas foram alinhadas utilizando o software BioEdit e uma sequência consenso de 1459 pb foi criada. Sequência de 16S FD1 de F727: TATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGTCCCTGATGT TAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG ACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTT TGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTT ACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGC TCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGC CACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTA GGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT AATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGG GCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCA ACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGA GGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGT GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGA CGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCC TGGTAGTCCACGCCGTAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTT CCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGC CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCNAGAACCTTACCANGTCTTGACATCCTCTG ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACNN NGGNGCATGGNNGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTAA GTCCCGCACNAGCGCAACCCNTTGATCTTANTTGCCAGCATTCAN TTGGNNNNNNNNNNNNNACTGCCNNNACNANCCGNNNAAGGNNN GGGNATNACGTNNANNNATNCNNGCCCNNNNTGACNNNNNNCAC NCCNNNNNNNNNNANNGNNNNNNAANNANNGGGNCNNNNNGNN NNNNAAANNNCNNNCNCNNNN GNGNN (SEQ ID NO: 1) Sequência de 16S RD1 de F727: TCATCTGTCCCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCA CCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGT GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCG ATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGA TCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTT TCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGG TCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGG TTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCA ACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATC TCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGC CCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAA GACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCT CCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCT TGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTTAATGCGTTAGCTGCA GCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTT ACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCCACG CTTTCGCTCCCTCAGCGTCAGTTACAGACC CAGAGAGTCGCCTTCGCCCCACTGGTGTTCCTCCACATCCTCTAC GCATTTCACCCGGCTACAACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGC ACTCAAGTTTCCCCAGTTTCCAATGACCCCTCCCCGGTTGAGCCC GGGGGCTTTCACATCAGACTTAAAGAAACCCGCCTGCGAGCCCTT TACGCCCAATAATTCCGGACACGCTTGGCCACCTACGTATTACCG CGCTTGCTTGGCACGTTAGTAGCCGTGGCTTTTCTGGTTAGTTAA CCGTCAGTGCCGCCTATTCGGAACGGTACTTGTTCTTCCCTACAC AGAGCTTTACGATCGAAACTCATCACCTCCACGCGCGTGCTCGTC AGAACTTTCGTCATGCGAAGATCCTACTGCTGCCTCCGTAGGGTT GGCGTTTCTCTCAGTCCAGTGGCCATACGTCAGTAGCTACCCATC GTGCCTAGTGAGCGTTACCTCACCCACCTAGGC (SEQ ID NO:2) Sequência de 16S Consenso de F727: TATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGTCCCTGATGT TAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAG ACTGGGATAACTCCGGGAAACCGG GGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAA GGTGGCTTCGG CTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAG GTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGG TGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACG GAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTC TGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCGAATAGGGCGGCACCTT GACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGG GCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGGTTTCTTTAAGTCTGATGTGAAAG CCCCCGGGCTCAACCGGGGAGGGGTCATTGGAAACTGGGGAAAC TTGAGTGCAGAAGA GGAGAGTGGAATTCCACGTTGTAGCCGGGTGAAATGCGTAGAGG ATGTGGAGGAACACCAGTGGGGCGAAGGCGACTCTCTGGGTCTG TAACTGACGCTGAGGGAGCGAAAGCGTGGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAACGATGAGTGC TAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCAT TAAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAA AGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTA ATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACA TCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGA GTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCA GCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACA AACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTAT GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAG CGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTC GGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAA TCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACC CGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTG GGACAGATGA (SEQ ID NO:3)

[000104] A sequência consenso do gene 16S rRNA da cepa F727 foi comparada com aquelas sequências disponíveis representativas do domínio bacteriano utilizando BLAST. A combinação com a espécie mais próxima era com Bacillus sp. (número de acesso GU250449.1), com 99% de similaridade. Nenhuma sequência de 16S isolada nos bancos de dados disponíveis publicamente exibia 100% de similaridade à cepa F727.

[000105] Adicionalmente, a sequência consenso foi analisada utilizando o servidor EzTaxon-e (eztaxon-e.ezbiocloud.net/; Kim e outros, 2012) com base nos dados de sequência de rRNA 16S. As combinações mais próximas (mostradas na Tabela 1) incluíam cepas de tipos para várias espécies do gênero Bacillus que não podem ser diferenciadas com base apenas nas sequências de rRNA 16S.Tabela 1

Sequências de recA

[000106] As reações de PCR para a amplificação do gene recA foram montadas através da combinação de 2 μL do extrato de DNA limpo com 25 μL de GoTaq Green Mastermix, 1,5 μL de iniciador para frente (recAf, 5'-GATCGTCARGCAGSCYTWGAT -3', SEQ ID NO:6) e 1,5 μL de iniciador inverso (recAr, 5'-TTWCCRACCATAACSCCRAC-3', SEQ ID NO:7). O volume de reação foi ajustado para 50 μL utilizando água livre de nuclease esterilizada. A reação de amplificação foi conduzida em uma máquina termocicladora sob as condições a seguir: 5 minutos a 95°C (desnaturação inicial), 30 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 45°C e 1 minuto a 72°C, seguido por 5 minutos a 72°C (extensão final) e uma temperatura de espera final de 4 °C.

[000107] O tamanho, a qualidade e a quantidade do produto da PCR foram avaliados por eletroforese de uma alíquota de 5 μL em um gel de agarose a 1% e comparação da banda do produto com uma escala de massa.

[000108] Os iniciadores, os nucleotídeos, a enzima e o molde em excesso foram removidos do produto da PCR utilizando o MoBio PCR clean up Kit. O produto da PCR limpo foi submetido ao sequenciamento direto utilizando os iniciadores descritos anteriormente.

[000109] As sequências para frente e inversas foram alinhadas utilizando o software BioEdit e uma sequência consenso de 505 pb foi criada. Sequência de recA Para Frente de F727: AACATTCGGCAAGGTTCCATCATGAAACTCGGGGAAAAGACGGAT ACAAGAATTTCAACAGTTCCGAGCGGTTCCCTTGCACTTGATACC GCTCTCGGAATAGGCGGATACCCGCGCGGACGGATTATTGAAGT ATACGGACCTGAAAGCTCAGGTAAAACGACTGTAGCGCTTCATGC GATTGCTGAAGTTCAGGAGAAAGGCGGACAAGCCGCATTTATTGA TGCTGAGCATGCCCTTGACCCTGTTTACGCGCAAAAGCTCGGTGT AAATATTGAGGAGCTGCTGCTTTCTCAGCCTGATACGGGAGAGCA GGCGCTTGAGATTGCCGAAGCGCTGGTACGAAGCGGAGCCGTCG ATATCGTAGTTGTCGACTCTGTTGCGGCGCTTGTCCCGAAAGCTG AAATCGAAGGAGACATGGGGGATTCCCACGTCGGTTTGCAGGCC CGTTTGATGTCTCAAGCGCTCCGTAAGCTTTCCGGTGCCATCAAT AAATCTAAAACAATCGCAATCTTTATTAACCAAATTCGTGAAAAAGT CGGCGTTAGGGTCGGAAAAAA (SEQ ID NO: 8) Sequência de recA Inversa de F727: GTATAAGATTGCGATTGTTTTAGATTTATTGATGGCACCGGAAAGC TTACGGAGCGCTTGAGACATCAAACGGGCCTGCAAACCGACGTG GGAATCCCCCATGTCTCCTTCGATTTCAGCTTTCGGGACAAGCGC CGCAACAGAGTCGACAACTACGATATCGACGGCTCCGCTTCGTAC CAGCGCTTCGGCAATCTCAAGCGCCTGCTCTCCCGTATCAGGCTG AGAAAGCAGCAGCTCCTCAATATTTACACCGAGCTTTTGCGCGTA AACAGGGTCAAGGGCATGCTCAGCATCAATAA ATGCGGCTTGTCCGCCTTTCTCCTGAACTTCAGCAATCGCATGAA GCGCTACAGTCGTTTTACCTGAGCTTTCAGGTCCGTATACTTCAAT AATCCGTCCGCGCGGGTATCCGCCTATTCCGAGAGCGGTATCAA GTGCAAGGGAACCGCTCGGAACTGTTGAAATTCTTGTATCCGTCT TTTCCCCGAGTTTCATGATGGAACCTTTGCCGAATTGTTTTTCTATT TGCTTAAGAGCCATATCWAAGRCTGWA WTRAMRATCAA (SEQ ID NO:9) Sequência de recA Consenso de F727: AAGGTTCCATCATGAAACTCGGGGAAAAGACGGATACAAGAATTT CAACAGTTCCGAGCGGTTCCCTTGCACTTGATACCGCTCTCGGAA TAGGCGGATACCCGCGCGGACGGATTATTGAAGTATACGGACCT GAAAGCTCAGGTAAAACGACTGTAGCGCTTCATGCGATTGCTGAA GTTCAGGAGAAAGGCGGACAAGCCGCATTTATTGATGCTGAGCAT GCCCTTGACCCTGTTTACGCGCAAAAGCTCGGTGTAAATATTGAG GAGCTGCTGCTTTCTCAGCCTGATACGGGAGAGCAGGCGCTTGA GATTGCCGAAGCGCTGGTACGAAGCGGAGCCGTCGATATCGTAG TTGTCGACTCTGTTGCGGCGCTTGTCCCGAAAGCTGAAATCGAAG GAGACATGGGGGATTCCCACGTCGGTTTGCAGGCCCGTTTGATG TCTCAAGCGCTCCGTAAGCTTTCCGGTGCCATCAATAAATCTAAAA CAATCGCAATCTT (SEQ ID NO:10)

[000110] A sequência consenso do gene recA da cepa F727 (SEQ ID NO: 10) foi comparada com sequências bacterianas representativas utilizando BLAST. A combinação de espécie mais próxima era com o genoma completo de Bacillus amyloliquefaciens (número de acesso CP002927.1), com 92% de similaridade.

Sequências de phoR

[000111] As reações de PCR para a amplificação do gene phoR foram montadas através da combinação de 2 μL do extrato de DNA limpo com 25 μL de GoTaq Green Mastermix, 1,5 μL de iniciador para frente (phoR- f: 5'-TTYARYTCATGRGAVACATT-3', SEQ ID NO: 11) e 1,5 μL de iniciador inverso (phoR-r: 5'-GGNTAYAAANARGAGGAGCC-3', SEQ ID NO:12). O volume de reação foi ajustado para 50 μL utilizando água livre de nuclease esterilizada. A reação de amplificação foi conduzida em uma máquina termocicladora sob as condições a seguir: 5 minutos a 95°C (desnaturação inicial), 35 ciclos de 45 segundos a 95°C, 45 segundos a 48°C e 1 minuto a 72°C, seguido por 10 minutos a 72°C (extensão final) e uma temperatura de espera final de 4 °C.

[000112] O tamanho, a qualidade e a quantidade do produto da PCR foram avaliados por eletroforese de uma alíquota de 5 μL em um gel de agarose a 1% e comparação da banda do produto com uma escala de massa.

[000113] Os iniciadores, os nucleotídeos, a enzima e o molde em excesso foram removidos do produto da PCR utilizando o MoBio PCR clean up Kit. O produto da PCR limpo foi submetido ao sequenciamento direto utilizando os iniciadores descritos anteriormente.

[000114] Uma sequência de phoR de 998 nucleotídeos foi obtida utilizando o iniciador inverso descrito anteriormente. Sequência de phoR Inversa de F727: TCGTTGTCTGTATCATATTGGTTTTCAGTGTTCTCGGCCTTTTCTTG CAGCAGCTCATTTCTTCATCCGCCAAGGAAAGAACGGAGGGACAG CTTGAAAAGGAAGCCGCATACATAGCCGGACTCCTTGACGCCGG CCAAGTAAACAATAAAAGAAACGAAACGGTCATTAA AGATGCCAGCCGTACATTAGATATCGACGTGTCCGTATTAAATGAA AAAGGCCGCGGTTTATATCACTCAGGCAGACGCGCTGATGACTCG GCTATAAAGGAATTCGTCTCCCGTAATAAAAATGCGGCGGCGATT CAGAACGGAGAGAAAGTATGGCATGGAACGGCCCTTAAAAACGC CGCCGGCCAAACGGCGGGATATGTGCTCGTTTCCTCGCGGATCG ATAAAGGTTCGAATATAACAGGGGAAATGTGGGGCATGCTGGCTG CAAGCCTTTGTACTGCTTTTATTATTATCGTTTTCTTCTATACGAAT ATGACCTCCCGTTACAAAAGGTCAAT CGACTCCGCGACAAAAGTGGCCACTGAGCTGTCTAAGGGGAACT ATGACGCCCGCTCCTACGGCGGGTACGCAAGACGCTCAGACCGT CTCGGGCGCGCTATGAACAGCCTCGCTGTGGATTTGATGGAAATG ACGAGAACGCAGGATATGCAGCGCGACCGCCTGCTGACCGTCAT CGAAAATATCGGATCAGGTTTGATTTTAATAGACGGGAGAGGCTTT ATTAATCTCGTGAACAGGTCGTATACGAAGCAGTTCCATACAAATC CTGAACGTCTGCTTCGGCGTCTCTACCATGACGCATTTGAGCATG AGGAAATCATTCGGCTGGTCGAAGACATCT TTATGACAGAAACGAAGAAACGCCAGCTGCTCACGCTTCCCATCA AAATCGAACGGCGCTATTTTGAGGTTGACGGCGTCCCGATTATGG GCCCTGACGATGAATGGAAAAGGCATTGTTCTCGTGTTTCATGAT ATGAC (SEQ ID NO: 13)

[000115] A sequência inversa de phoR foi comparada com sequências bacterianas representativas utilizando BLAST. A combinação de espécie mais próxima era com o genoma completo de várias cepas de Bacillus amyloliquefaciens com apenas 83% de similaridade.

Exemplo 2: Composição de Ácidos Graxos do Isolado F727

[000116] Um perfil de ácidos graxos do isolado F727 foi obtido nos MIDI Labs, Inc (Newark, DE), de acordo com padrões comerciais. Os resultados são mostrados na Tabela 2. A comparação de seu perfil de ácidos graxos com o banco de dados de ácidos graxos RTSBA6 6.10 mostrou que o isolado F727 tinha um índice de similaridade de 0,885 com Bacillus subtilis.Tabela 2

Exemplo 3: Caracterização do isolado F727 pelo perfil de proteínas por MALDI-TOF

[000117] Uma impressão digital de proteínas por espectroscopia de massa por MALDI-TOF do isolado F727 foi realizada nos MIDI Labs, Inc. (Newark, DE). O isolado F727 exibia um perfil de proteínas por MALDI-TOF diferente daquele de qualquer outro micro-organismo presente no banco de dados de espectros de massa. Algumas similaridades com perfis de proteínas de Bacillus vallismortis, Bacillus mojaviensis e Bacillus subtilis foram observadas; entretanto, nenhum dos escores de similaridade era alto o suficiente para ser indicativo de até mesmo uma combinação genérica.

Exemplo 4: Caracterização Bioquímica do isolado F727 de Bacillus sp. Coloração com Gram

[000118] A coloração com Gram é um método de diferenciação de bactérias baseado nas propriedades físicas da parede celular, primariamente da composição de peptidoglicana. Os isolados bacterianos Gram-positivos possuem uma camada de peptidoglicana espessa resultando em uma coloração violeta/azul; enquanto que os isolados bacterianos Gram-negativos possuem uma camada de peptidoglicana mais fina na parede celular, resultando em uma coloração vermelha/cor de rosa. A inspeção microscópica do isolado F727 após a coloração com Gram revelou células violetas, indicando que o isolado F727 de Bacillus sp. é uma bactéria Gram-positiva.

Atividade da urease

[000119] O teste da urease é utilizado para detectar a atividade da enzima urease, que catalisa a conversão de ureia em amônia e bicarbonato. O meio com ureia contém ureia e o indicador de pH vermelho de fenol. O indicador fica amarelo em um ambiente ácido e cor de rosa em um ambiente alcalino. Se a atividade enzimática da urease estiver presente, a ureia no meio é degradada para produzir amônia e o meio fica cor de rosa, indicando um teste positivo.

[000120] Após a inoculação com o isolado F727, o meio com ureia mudou de coloração de vermelho para amarelo, indicando um teste negativo para atividade da urease. Assim, o isolado F727 de Bacillus sp. criou um ambiente ácido, indicativo da ausência de atividade da urease.

Atividade da catalase

[000121] O teste da catalase é utilizado para detectar a atividade da enzima, catalase.

[000122] A catalase decompõe o peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. Os organismos que possuem atividade da catalase produzem bolhas de gás quando tratados com peróxido de hidrogênio. As bolhas se formaram dentro de segundos da aplicação do reagente em uma cultura do isolado F727 de Bacillus sp., indicando que este organismo possui atividade da catalase.

Atividade da oxidase

[000123] O teste da oxidase é utilizado para detectar a presença de atividade da oxidase do citocromo c. As bactérias que contêm citocromo c como parte de sua cadeia respiratória são positivas para a oxidase e tornam o reagente violeta. De modo contrário, as bactérias que são negativas para a oxidase não oxidam o reagente, deixando-o incolor. O isolado F727 de Bacillus sp. tornou o reagente violeta, demonstrando que este possuía atividade da oxidase.

TSI Ágar

[000124] O ágar tríplice açúcar e ferro (TSI) é utilizado para determinar a capacidade de um micro-organismo de fermentar glicose, lactose e/ou sacarose, bem como a capacidade de bactérias entéricas de produzir sulfeto de hidrogênio. O meio contém o indicador de pH vermelho de fenol bem como sulfato ferroso, que reage com sulfeto de hidrogênio para produzir um precipitado preto. Quando o isolado F727 foi testado, o meio inclinado permaneceu vermelho enquanto que o topo mudou de vermelho para amarelo e nenhuma coloração preta foi observada. Estes resultados indicam que o isolado F727 não produz sulfeto de hidrogênio e fermenta apenas glicose, não lactose ou sacarose.

Suscetibilidade a antibiótico

[000125] A suscetibilidade a antibiótico do isolado F727 de Bacillus sp. foi testada utilizando discos de antibiótico sobre meio de Muller-Hinton. Uma alça cheia de F727 foi ressuspensa em 1 mL de água deionizada esterilizada e 100 μL desta suspensão foram estriados sobre uma placa com ágar de Mueller-Hinton. Após a absorção do estriado para dentro do ágar, os discos de antibióticos pré-carregados foram colocados sobre a placa e a placa foi incubada a 25 °C durante 48 horas. Os resultados são apresentados na Tabela 3.

+++ indica altamente suscetível (sem crescimento); ++ indica moderadamente suscetível (crescimento reduzido); - indica nenhuma suscetibilidade

Tira API ZYM

[000126] A tira API ZYM (BioMerrieux) fornece um método para testar várias atividades enzimáticas de um micro-organismo. O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante e um resumo dos dados é mostrado na Tabela 4.

Tira API 20 NE

[000127] A tira API ®20 NE consiste de 20 microtubos que contêm substratos desidratados. Os testes convencionais foram inoculados com uma suspensão do isolado F727 de Bacillus sp. que reconstitui o meio. O metabolismo produziu mudanças na coloração nos microtubos. Os testes de assimilação foram inoculados com um meio mínimo e o isolado F727 de Bacillus sp. cresce se a bactéria for capaz de utilizar o substrato.

[000128] As reações foram analisadas de acordo com a tabela de leitura do fabricante e os resultados são resumidos na Tabela 5.

Exemplo 5: Isolamento e Caracterização de compostos A, B & C Procedimento de purificação

[000129] O procedimento a seguir (descrito na Figura 1) foi utilizado para a purificação de compostos extraídos partindo de uma cultura de células do isolado F727 de Bacillus sp..

[000130] O meio de cultura proveniente de uma fermentação de 1 L do isolado F727 de Bacillus sp. no meio de crescimento foi extraído com resina Amberlite XAD-7 (Asolkar e outros, 2006) através da agitação da suspensão de células com a resina a 155 rpm durante duas horas à temperatura ambiente. A resina e a massa de células foram coletadas por filtração através de gaze de algodão e lavadas com água deionizada para remover sais. A resina, a massa de células e a gaze de algodão foram então encharcadas durante 2 horas em acetona, após as quais a acetona foi filtrada e seca a vácuo, utilizando um evaporador giratório, para fornecer um extrato bruto.

[000131] O extrato bruto foi submetido à cromatografia líquida com vácuo em C18 em fase inversa (VLC, H2O/CH3OH; gradiente de 80:20 até 0:100%) para fornecer 6 frações. Estas frações foram concentradas até a secura utilizando um evaporador giratório e os resíduos secos resultantes foram verificados em relação à atividade biológica utilizando um ensaio com discos no ágar. Ver o Exemplo 16 a seguir. Este ensaio identificou a Fração 3 de VLC com C-18 como possuindo atividade fungicida.

[000132] A fração ativa 3 foi submetida à HPLC em fase inversa (Spectra System P4000, Thermo Scientific) para fornecer compostos puros, que foram então verificados nos ensaios biológicos mencionados anteriormente para localizar/identificar os compostos ativos.

[000133] A fração ativa 3 foi adicionalmente purificada em uma coluna C-18 de HPLC (Fenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30) utilizando um sistema de solventes em gradiente de água:acetonitrila (contendo 0,01% de TFA) (0-10 min; 70% de CH3CN aquoso, 10-20 min; 70-45% de CH3CN aquoso, 20-40 min; 45 - 30 % de CH3CN aquoso, 40-60 min; 30-0% de CH3CN, 60-65 min; 100 % de CH3CN, 65-70 min; 0 - 30% de CH3CN aquoso) à vazão de 8 mL/min com detecção por UV em 210 nm. Três compostos purificados foram obtidos: Composto A (F727F3H11), que possui um tempo de retenção de 35,95 min, Composto B (F727F3H14), que possui um tempo de retenção de 37,26 min e Composto C (F727F3H17), que possui um tempo de retenção de 38,11 min.

Espectroscopia de massa

[000134] A análise por espectroscopia de massa dos compostos A, B e C foi realizada em um instrumento de eletrospray (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus utilizando os modos de ionização tanto positivo quanto negativo em um modo de varredura completa (m/z 1001500 Da) em um LCQ DECA XPplus Mass Spectrometer (Thermo Electron Corp., San Jose, CA). Um instrumento de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) Thermo equipado com detector Finnigan Surveyor PDA plus, autoamostrador plus, bomba MS e uma coluna de 4,6 mm x 100 mm Luna C18 5 μm (Fenomenex) foi utilizado. O sistema de solventes consistia de água (solvente A) e acetonitrila (solvente B). A fase móvel começa em 10% de solvente B e é linearmente aumentada até 100% de solvente B ao longo de 20 min e então mantida em 100% de solvente B durante 4 min e finalmente retornada para 10% de solvente B ao longo de 3 min e mantida em 10% de B durante 3 min. A vazão era de 0,5 mL/min. O volume de injeção era de 10 μL e as amostras foram mantidas à temperatura ambiente em um autoamostrador.

[000135] Os compostos foram analisados por LC-MS utilizando a LC e a cromatografia em fase inversa. A análise por espectroscopia de massa dos presentes compostos foi realizada sob as condições a seguir: a vazão de gás nitrogênio foi fixada em 30 e 15 arb para a vazão de gás de revestimento e aux/varredura, respectivamente. A ionização por eletrospray foi realizada com uma voltagem do spray ajustada em 5000 V e uma voltagem do capilar em 35,0 V. A temperatura do capilar foi ajustada em 400°C. Os dados foram analisados no software Xcalibur.

[000136] O peso molecular do Composto A (F727F3H11) foi determinado como sendo de 1044, com base em um pico de íon molecular em 1043,84 (M - H) no modo de ionização negativa (Figura 2). Esta determinação foi sustentada pelo padrão de ionização em ESIMS no modo positivo, que exibia um pico em 1045,48 (M + H) e um pico de íon pseudomolecular em 1067,55 (M + Na) (Figura 3).

[000137] O peso molecular do Composto B (F727F3H14) foi determinado como sendo de 1058, com base em um pico de íon molecular em 1057,83 (M - H) no modo de ionização negativa (Figura 4). Esta determinação foi sustentada pelo padrão de ionização na ESIMS no modo positivo que exibia um pico em 1059,56 (M + H) e um pico de íon pseudomolecular em 1081,63 (M + Na) (Figura 5).

[000138] O peso molecular do Composto C (F727F3H17) foi determinado como sendo de 1072, com base em um pico de íon molecular em 1071,85 (M - H) no modo de ionização negativa (Figura 6). Esta determinação foi sustentada pelo padrão de ionização na ESEVIS positiva que exibia um pico em 1073,57 (M + H) e um pico de íon pseudomolecular em 1095,62 (M + Na) (Figura 7).

Método de análise em plugue para teste antifúngico de fração e compostos puros

[000139] Frações e compostos purificados foram testados em relação à atividade antifúngica como a seguir. Um disco de filtro foi colocado em cada quadrante de uma placa de Petri de tamanho médio (total de quatro discos). Cada disco foi colocado 2 cm do centro da placa. 15 μL de fração de coluna ou compost purificado (20 mg/mL) foram dispensados sobre a superfície de cada um dos dois discos opostos um ao outro. Etanol foi dispensado sobre os outros dois discos como um controle. Após os discos de filtro serem carregados, plugues pequenos (ca. 1 x 1 cm) de fungos foram colocados no centro da placa de Petri. Os agentes patogênicos fúngicos utilizados eram Bipolaris maydis, Botrytis cinerea, Sclerotinia homeocarpa e Rhizoctonia solani. As placas foram incubadas a 25°C e, após 48 horas, a zona de inibição ao redor de cada disco de filtro foi medida. Os resultados são mostrados na Figura 8 para fração 3 de VLC e compostos A, B e C; e indicam que todos os três compostos possuem atividade fungicida significativa.

Análise de aminoácidos dos compostos A, B & C

[000140] O composto A (F727F3H11, 0,05 mg) foi hidrolisado por hidrólise em fase líquida (HCl a 6 N, 1% de Fenol, 110°C, 24 h, a vácuo). Após o resfriamento, a mistura de reação foi seca e o produto hidrolisado foi dissolvido no tampão de diluição de Norleu até o volume de 1,0 mL. Uma alíquota de 50 μL desta amostra foi carregada sobre uma coluna de troca iônica para análise.

[000141] Para padrões e calibração, uma solução padronizada de aminoácido para o hidrolisado de proteína no Na-based Hitachi 8800 (Sigma, A-9906) foi utilizada para determinar fatores de resposta e assim calibrar o analisador Hitachi 8800 para todos os aminoácidos. Cada injeção continha norleucina como um padrão interno, para permitir a corresção dos resultados para variações no volume de amostra e variáveis da cromatografia. O sistema utilizava tampões de Na Pickering, Pierce Sequanal grau HCl (hidrólise), uma coluna Transgenomic Ion-Exchange e um método otimizado desenvolvido pela Molecular Structure Facility (MSF), UC Davis. Os aminoácidos individuais presentes em cada amostra foram relatados. Foi descoberto que os aminoácidos presentes no composto A eram glutamina (1 unidade), prolina (1 unidade), serina (1 unidade), tirosina (1 unidade) e asparagina (3 unidades).

[000142] As composições de aminoácidos dos compostos B e C foram analisadas de maneira similar. Foi observado que os compostos B e C possuem os mesmos aminoácidos, na mesma proporção, que o composto A.

Exemplo 6: Efeito do isolado F727 de Bacillus sp. sobre Botrytis em plantas de tomate

[000143] Plantas de tomate (Solatium lycopersicum) var. Roma foram tratadas com sobrenadante proveniente de uma fermentação com F727. Cada planta foi pulverizada com aproximadamente 3 mL de sobrenadante de fermentação livre de células. Foi permitido que as plantas secassem e estas foram inoculadas com 2 mL de uma suspensão de esporos de Botrytis cinerea em uma concentração de 6,67 x 107 esporos/mL. Uma planta de controle foi pulverizada com água deionizada, duas plantas de controle negativo foram pulverizadas apenas com esporos (em concentrações de 1x107 esporos/mL e 6,67x107 esporos/mL) e uma planta de controle positivo foi pulverizada com SWITCH® 65.2 WG (Cypronidil e Fludioxonil, comercializados pela Bayer Crop Sciences, Inc.) na taxa de 14oz/100gal/acre. Os tratamentos foram realizados em triplicatas. As plantas foram colocadas em um recipiente de plástico transparente em uma câmara de crescimento com luzes e controle de temperatura constante. A classificação de doença foi realizada 8 dias após o tratamento. As plantas foram avaliadas em relação à gravidade da doença por avaliação visual de uma área foliar sintomática da doença e uma classificação de doença foi obtida. Ver, por exemplo, WC James (1971) "A Manual of Assessment Keys in Plant Diseases." American Phytopathological Society. ISBN 978-0-89054081-7. Os resultados, mostrados na Figura 9, mostram que a gravidade da doença foi reduzida de 65% (controle não tratado infectado) para 40% em plantas infectadas tratadas com sobrenadante de F727.

[000144] Em experimentos adicionais, diluições de duas vezes, quatro vezes e dez vezes de F727 WCB foram testadas. Utilizando WCB proveniente de duas fermentações separadas, a redução na gravidade da doença foi observada em todas as três diluições.

Exemplo 7: Efeito de Bacillus sp. F727 sobre Míldio felpudo na alface

[000145] Plantas de alface (Lactuca sativa) var. Celtuce, foram plantadas em uma densidade de quatro mudas por vaso. Cada vaso foi pulverizado com 2 mL de sobrenadante de fermentação de F727.

[000146] Foi permitido que as plantas secassem e foram então inoculadas com 2 mL de uma suspensão de esporos de Bremia lactuca (míldio felpudo) (1x105 esporos/mL). Os tratamentos foram realizados em 5 réplicas. As plantas tratadas foram incubadas em bandejas seladas com uma cobertura plástica, a 15°C em uma câmara de crescimento com um fotoperíodo de 12 horas. 10 dias após o tratamento, a gravidade da doença foi avaliada como descrito no Exemplo 6.

[000147] Os resultados são mostrados na Figura 10. A gravidade média da doença no controle não tratado era de 54,47%, enquanto que plantas tratadas com F727 exibiam uma gravidade da doença de apenas 14,64%. A gravidade da doença nas plantas tratadas com F727 era comparável com aquela obtida após o tratamento das plantas com o controle químico RIDOMIL® GOLD EC (4% em p/p de metalaxil-M e 64% em p/p de mancozeb) (150 ppm a.i.) (Syngenta), que fornecia 11,67% de gravidade.

[000148] Em experimentos adicionais, diluições de duas vezes, quarto vezes e dez vezes de F727 WCB foram testadas. Utilizando WCB proveniente de duas fermentações separadas, a redução na gravidade da doença foi observada em todas as três diluições.

Exemplo 8: Comparação do efeito de Bacillus sp. F727 com ELEVATE

[000149] Plantas de tomate (Solatium lycopersicum) var. Roma foram tratadas com 3 mL de sobrenadante de fermentação de F727 e foi permitido que secassem. As plantas foram então inoculadas com aproximadamente 2 mL de suspensão de esporos de Botrytis cinerea (2,8 x 107 esporos/mL). Um subconjunto das plantas infectadas foi pulverizado uma segunda vez com F727, após 2 horas ou após o primeiro tratamento ter secado. As plantas inoculadas também foram tratadas com água (controle negativo) e ELEVATE® 50 WDG (Fenhexamid, Bayer Crop Science, Inc.) como um controle positivo.

[000150] Os tratamentos foram realizados em réplicas de 4. Nove dias após o tratamento, a gravidade da doença foi avaliada como descrito no Exemplo 6. Os resultados são mostrados na Figura 11. A gravidade da doença para o controle com água era de 38,3%, enquanto que o controle positivo (ELEVATE® 50 WDG, Fenhexamid, Bayer Crop Science, Inc.) reduziu a gravidade da doença para 13,33%. As plantas tratadas com 1x e 2x sobrenadante de F727 tinham uma gravidade da doença de 8,3 e 5% respectivamente.

Exemplo 9: Efeito do sobrenadante de F727 sobre a infecção por B. cinerea em pimentas

[000151] Plantas de pimenta (Capscicum annuum) var. Serrano foram pulverizadas com aproximadamente 2 mL de sobrenadante de F727 e foi permitido que secassem. As plantas foram então inoculadas com 2 mL de uma suspensão de esporos de Botrytis cinerea (2,7x107 esporos/mL). As plantas foram tratadas em triplicata. Treze dias após o tratamento, a gravidade da doença foi avaliada e comparada com um controle não tratado (pulverizado com água) e um controle positivo (pulverizado com Elevate® 50 WDG (Fenhexamid, Bayer Crop Science, Inc.)) aplicado na taxa do rótulo.

[000152] Os resultados, mostrados na Figura 12, indicam que o controle de doença em plantas infectadas com Botrytis cinerea que tinham sido tratadas com F727 era comparável com aquele obtido através do tratamento das plantas com Elevate®.

Exemplo 10: Avaliação de meio com células inteiras, sobrenadante e células com F727 produzidos através da fermentação em três meios contra míldio pulverulento no pepino.

[000153] As células F727 foram fermentadas em três meios de crescimento diferentes (SPY, SMP e TSB). Plantas de pepino de duas semanas de idade (Cucumis sativus) var. SMR58 foram pulverizadas com aproximadamente 3 mL de meio de células inteiras com F727, sobrenadante de F727 ou células F727 obtidas partindo de cada uma destas três fermentações. As células foram peletizadas e então ressuspensas em sulfato de magnésio a 10 mM para pulverização. Quatro réplicas por tratamento foram produzidas. Foi permitido que as plantas secassem durante duas horas antes de serem pulverizadas com aproximadamente 2 mL de uma suspensão de esporos de míldio pulverulento em uma concentração de 3,0x105 esporos/mL, que tinha sido preparada partindo de uma planta infectada. As plantas foram então incubadas em uma câmara de crescimento até o desenvolvimento da doença e a gravidade da doença foi avaliada como descrito no Exemplo 6.

[000154] Os resultados, expressos na forma da porcentagem de controle de doença, são mostrados na Figura 13. A atividade antifúngica no pepino foi observada com células inteiras, meio com células inteiras e sobrendantes de células obtidos partindo de todos os três meios.

Exemplo 11: Avaliação da eficácia de meio com células inteiras, sobrenadante e células com F727 produzidos através da fermentação em três meios contra Botrytis cinerea no tomate.

[000155] Plantas de tomate de duas semanas de idade (Solatium lycopersicum) var. Stupice foram pulverizadas com aproximadamente 2 mL de meio de células inteiras com F727, sobrenadante de F727 e células F727, cada um preparado partindo de três fermentações separadas em meios de crescimento diferentes (SPY, SMP e TSB). As células foram peletizadas e ressuspensas em sulfato de magnésio a 10 mM para pulverização. Três réplicas por tratamento foram produzidas. Foi permitido que as plantas secassem durante uma hora, então colocadas sob condições de umidade para abrirem os estômatos. Aproximadamente 1 mL de uma suspensão de esporos de Botrytis cinerea preparada partindo de uma placa com ágar cultivada de dez dias de idade a 1,0x107 esporos/mL em meio com maltose Sabouraud a 2% foi pulverizado sobre cada planta. As plantas foram incubadas em uma câmara de crescimento com um fotoperíodo de 12 horas até o desenvolvimento da doença e a gravidade da doença foi avaliada como descrito no Exemplo 6.

[000156] Os resultados, expressos na forma da porcentagem de controle de doença, são mostrados na Figura 14. A atividade antifúngica no tomate foi observada com células inteiras, meio com células inteiras e sobrendantes de células obtidos partindo de todos os três meios.

Exemplo 12: Avaliação da eficácia de meio com células inteiras com F727, produtos à base de Bacillus comerciais e meio com células inteiras com F727 misturado com Regalia® contra míldio pulverulento no pepino.

[000157] Plantas de pepino de duas semanas de idade (Cucumis sativus) var. SMR58 foram pulverizadas na primeira folha verdadeira com aproximadamente 3 mL de: Regalia® 5% (Renoutria sachalinensis, Marrone Bio Innovation, Inc., Davis, CA) a 1:2000, Regalia® a 5% a 1:200, meio com células inteiras com F727, meio com células inteiras com F727 + Regalia® a 5% a 1:2000, Serenade® (Bayer Crop Science, Inc.) a 1:200, Sonata® (Bayer Crop Science, Inc.) a 1:200, Vacciplant® (Laboratoires Goêmar S.A.) a 40 μL/50 mL, Companion® (Growth Products, Ltd.) a 1:200 e Double Nickel 55® (Certis USA, L.L.C.) a 0,06 g/50 mL. Quatro réplicas por tratamento foram preparadas. Foi permitido que as plantas secassem durante duas horas antes que aproximadamente 2 mL de uma suspensão de esporos de míldio pulverulento em uma concentração de 3,0x105 esporos/mL fossem pulverizados sobre cada planta. As plantas foram incubadas em uma câmara de crescimento até o desenvolvimento da doença.

[000158] Os resultados, mostrados na Figura 15, indicam que o meio com células inteiras proveniente de uma fermentação com o isolado F727 de Bacillus sp. (identificado como MBI-110 WCB na Figura) é mais eficiente contra míldio pulverulento que muitos fungicidas existentes. Os resultados para Regalia® com e sem sobrenadante de F727 são mostrados na Tabela 6. O coeficiente de sinergia de Colby indica que existe sinergia entre meio com células inteiras com F727 e Regalia® 5% a 1:2000.Tabela 6

Exemplo 13: Avaliação da eficácia de meio com células inteiras com F727, Regalia® e Double Nickel 55® contra Phytophthora infestans no tomate

[000159] Plantas de tomate (Solatium lycopersicum) var. Stupice em um estágio de duas folhas verdadeiras foram pulverizadas com 2 mL de meio com células inteiras com F727, Regalia® a 1:200 (Marrone Bio Innovations, Inc.) e Double Nickel 55® a 0,06 g/50mL (Certis USA, L.L.C.). Foi permitido que as plantas secassem antes de serem pulverizadas para cobertura com uma solução de esporos de Phytophthora infestans, em uma concentração de 104 esporos/mL, preparada partindo de folhas de tomate infectadas. As plantas foram incubadas em uma câmara de crescimento a 20°C sob luz artificial. Três dias após o tratamento, as plantas foram avaliadas em relação à gravidade da doença como descrito no Exemplo 6.

[000160] Os resultados, mostrados na Figura 16, indicam que o meio com células inteiras proveniente de uma fermentação com o isolado F727 de Bacillus sp. (identificado como MBI-110 WCB na Figura) fornece proteção robusta contra infecção causada por P. infestans de tomates.

Exemplo 14: Avaliação do controle de F727 de Sclewtium rolfsii in vitro

[000161] O isolado F727 foi fermentado em meio líquido e o sobrenadante foi removido por centrifugação. Metade do sobrenadante foi filtrada através de um filtro de 0,2 μm. Esclerócios isolados de Sclewtium rolfsii foram colocados nos centros de placas de Petri de 10 cm e quatro discos de 0,5 cm de diâmetro por placa foram colocados a uma distância de 2 cm do fungo e em distâncias iguais de cada outro. O sobrenadante de F727, o sobrenadante de F727 filtrado e Pristine® (BASF) a 0,5 mL/L foram adicionados aos discos em alíquotas de 12,5 μL, até que dois discos opostos contivessem um total de 25 μL e os outros dois contivessem 50 μL. Duas placas por tratamento foram preparadas. As placas foram incubadas a 25°C durante três dias.

[000162] A porcentagem de inibição para cada substância de teste foi determinada através da medida do crescimento do micélio partindo do esclerócio até a margem mais longe da colônia em direção a cada disco. Os resultados, mostrados na Figura 17, indicam que os sobrenadantes de F727 filtrados quando não filtrados eram eficientes na inibição do crescimento de S. rolfsii no ensaio com discos. O sobrenadante não filtrado era coerentemente mais eficiente que o filtrado e sua eficácia era comparável àquela do padrão comercial.

Exemplo 15: Avaliação do controle de F727 de Rhizoctonia solani na soja

[000163] Grãos de cevada esterilizados foram inoculados com Rhizoctonia solani e incubados durante 1-2 semanas. Os grãos foram secos, mesclados e misturados com areia em uma proporção de um para um para gerar um inóculo de R. solani. O solo foi vigorosamente misturado com este inóculo até um volume de 500 mL de solo por vaso, regado com 100 mL de água e incubado em uma câmara de crescimento durante 24 horas. O meio com células inteiras com o isolado F727 foi preparado na concentração de 100%, 50% e 25%. O solo foi então encharcado com 40 mL de cada diluição do meio e nove sementes de soja foram plantadas em cada vaso. Para cada réplica, havia três vasos e havia três réplicas por tratamento. As plantas foram incubadas em uma câmara de crescimento durante 14 dias. A germinação, a altura da planta, o peso de broto fresco e o peso da raiz fresca foram avaliados.

[000164] As medidas de sustentação dos brotos (Tabela 7), emergência (Tabela 8), peso médio do broto (Tabela 9) e altura média do broto (Tabela 10) foram determinadas. Os resultados indicam que o meio com células inteiras com F727 aumentava a emergência, o peso dos brotos e a altura dos brotos nas plantas de soja infectadas com R. solani.Tabela 7

Tabela 8

Tabela 9

Tabela 10

Exemplo 16: Avaliação do controle de F727 de agentes patogênicos de plantas bacterianos in vitro

[000165] Um mL de água esterilizada foi inoculado com uma alça de cada um dos agentes patogênicos de plantas bacterianos, Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae, Bacillus cereus, Erwinia carotovora, Xanthomonas campestris, Xanthomonas arboricola ou Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, provenientes de placas com ágar de dextrose de batata (PDA) cultivadas. As bactérias foram ressuspensas e 100 μL da ressuspensão do agente patogênico foram estriados sobre uma placa com ágar PDA e deixados que fossem absorvidos dentro da placa durante 10-15 minutos. Discos de filtro esterilizados foram aplicados no ágar e foram carregados com 20 μL de frações de VLC de F727 (10 mg/mL em metanol) ou combinações das frações de VLC. As frações foram obtidas partindo de uma fermentação do isolado F727 de Bacillus sp. em meio V8 como descrito no Exemplo 5, acima.

[000166] As placas foram incubadas 24-48 horas e então inspecionadas em relação ao aparecimento de uma zona de inibição ao redor do disco de filtro, indicando suscetibilidade do agente patogênico à fração de F727. Os resultados são mostrados na Tabela 11.Tabela 11: Suscetibilidade de agentes fitopatogênicos bacterianos às frações de F727

Identificação: +++ muito suscetível, ++ suscetível, - resistente

[000167] A inibição do maior número de espécies de bactérias foi observada com a Fração 3. Consequentemente, esta fração foi submetida ao fracionamento adicional, como descrito no Exemplo 5, acima. Adicionalmente, a Fração 5 exibia atividade antibacteriana contra Bacillus cereus, Erwinia carotovora e Clavibacter.

Exemplo 17: Avaliação de sobrenadante e extrato bruto de F727, preparados em meios diferentes, para o controle da germinação de agentes patogênicos fúngicos in vitro

[000168] O isolado F727 foi fermentado em 12 meios líquidos diferentes. Amostras de sobrenadante e de extrato bruto foram testadas em um ensaio de germinação de esporos de resposta à dose. Em uma placa de 48 poços, 100 μL de amostra de sobrenadante ou de extrato bruto foram combinados com 200 μL de ágar com dextrose de batata (PDA) 1,5x e permitidos que solidificassem. As suspensões de esporos provenientes de agentes patogênicos de plantas fúngicos foram preparadas nas concentrações mostradas na Tabela 12 e 50 μL de suspensão de esporos foram dispensados na superfície da mistura de PDA/tratamento. As placas foram incubadas a 25°C durante 3-5 dias e uma avaliação visual da germinação de esporos fúngicos foi conduzida.

[000169] Os resultados são mostrados na Tabela 13. Todos os sobrenadantes testados inibiam a germinação de todos os agentes patogênicos na concentração mais baixa testada (3,13%). A atividade dos extratos brutos variava dependendo do meio utilizado para crescer as células F727 (uma diluição de 0,4% de extrato bruto era a concentração mais baixa testada). Isto indicava que a atividade de extratos de F727 pode depender do meio no qual as células são crescidas e, assim, a atividade ótima contra um agente patogênico particular pode ser ajustada com base no meio no qual as células são crescidas. Por exemplo, o meio M24 pode ser utilizado para crescer células cujos extratos se direcionarão para Fusarium. Tabela 12

Tabela 13: Concentração inibitória mínima do extrato bruto de F727 proveniente de meios diferentes necessários para prevenir a germinação de esporos fúngicos

Exemplo 18: Avaliação das características de crescimento de plantas de F727 in vitro

[000170] O isolado F727 foi avaliado em relação às características de crescimento de plantas in vitro, incluindo a capacidade de solubilizar fosfato, a produção de ACC-desaminase, a produção de ácido indol-3-acético (IAA), a produção de sideróforos (CAS ágar) e a capacidade de crescer com metanol como a única fonte de carbono (AMS ágar). A solubilização de fosfato foi avaliada em azul de bromofenol-fosfato ágar, a atividade de ACC-desaminase foi avaliada sobre placas com ágar com ACC como a única fonte de carbono e nitrogênio, a produção de sideróforos foi avaliada sobre CAS ágar e metilotrofia foi avaliada sobre um ágar com sais minerais corrigido com metanol como a única fonte de carbono. Como mostrado na Tabela 14, o Isolado F727 foi positivo no teste para todas estas características de promoção de crescimento de plantas. Tabela 14

Identificação: +++: resposta positiva muito forte, ++: resposta positiva, +: resposta positiva fraca

Exemplo 19: Análise do vigor de sementes tratadas com F727

[000171] Sementes de milho, soja, trigo, arroz, sorgo e tomate tiveram suas superfícies esterilizadas durante seis minutos com alvejante a 1% e lavadas com água esterilizada cinco vezes. As sementes foram submersas durante 24 horas na suspensão de F727 preparada em sulfato de magnésio a 10 mM. As sementes foram secas durante 30 minutos para o Experimento #1 e durante toda a noite para o Experimento #2. Foi permitido que as sementes germinassem em toalhas de papel umedecidas durante vários dias e o peso fresco total das sementes foi medido.

[000172] Os resultados são mostrados na Tabela 15 e indicam que as células do isolado F727 de Bacillus sp. promoveram o crescimento de milho, soja, sorgo e tomate.Tabela 1

# var. Kandy Korn* var. Trucker's Favorite Yellow, Boone County White and Silver King.

Exemplo 20: Atividade antifúngica contra Aspergillus niger

[000173] O meio com células inteiras (WCB) proveniente de uma fermentação do isolado F727 de Bacillus sp. foi avaliado em relação ao seu efeito inibidor sobre o agente patogênico Aspergillus niger pós- colheita, em um ensaio de imersão de fruto. O WCB foi utilizado não diluído e diluído em água esterilizada até concentrações de 5%, 20% e 50%.

[000174] Uvas verdes esterilizadas foram imersas durante cinco segundos em cada uma das concentrações de WCB, então colocadas sobre uma prateleira dentro de um recipiente. Uma vez que o fruto estava seco, cada recipiente recebeu 24 sprays de inóculo de A. niger ajustado para 3 x 103 esporo/mL. 100 mL de água deionizada foram adicionados em cada caixa debaixo da prateleira para aumentar a umidade e as caixas foram seladas e incubadas à temperatura ambiente. Dois recipientes, cada um contendo 5 uvas por tratamento, foram incluídos no experimento. Um tratamento com água foi utilizado como um controle negativo e o produto comercial Switch foi utilizado como o controle positivo.

[000175] A porcentagem de doença de cada fruto foi determinada através da observação da cobertura de micélios sobre cada uva. Os resultados são mostrados na Tabela 16 e indicam que o F727 WCB exibe atividade anti-Aspergillus significativa.Tabela 16. Porcentagem de doença de A. niger nas uvas após um tratamento de imersão com F727 WCB após 12 dias de crescimento.

Exemplo 21: Promoção do crescimento no milho

[000176] Sementes de milho foram plantadas na mistura de solo para plantação em vasos, em vasos com um diâmetro de 4 polegadas, em uma densidade de 10 semente por vaso. Os vasos semeados foram encharcados no momento do plantio e uma semana depois com meio com células inteiras com F727. Os vasos foram incubados em uma estufa. Um total de 10 plantas por vaso e 9 vasos por tratamento foi avaliado.

[000177] O peso fresco total foi registrado após crescimento de 2 semanas. As plantas de controle (encharcadas com água) tinham um peso fresco médio de 21,48 + 4,02 g, enquanto que as plantas que foram encharcadas com F727 WCB tinham um peso fresco médio de 26,5 + 3,55 g. Estas diferenças são estatisticamente significativas, que são determinadas por Minitab ANOVA Tukey's. Estes resultados fornecem evidência adicional para a atividade de promover o crescimento de F727 WCB.

Exemplo 22: Controle do Míldio Felpudo Bremia lactucae na alface encharcando o solo com meio de células inteiras com F727

[000178] Esporos de Míldio Felpudo (Bremia lactucae) foram obtidos através do corte de folhas que contêm esporos de plantas infectadas crescidas em caixas de cultura e da agitação das folhas em 50 mL de água deionizada. O liquid foi então filtrado através de uma tela de nylon de 100 μm. O número de esporos no líquido filtrado foi contado em um hemocitômetro e o líquido foi ajustado com água deionizada para conter 5x104 esporos/mL.

[000179] Para a preparação de meio com células inteiras (WCB), a cepa F727 de Bacillus foi crescida em meio SPY durante 24-72 horas a 25°C.

[000180] A alface (c.v. Celtuce) foi plantada em vasos de 2,5 polegadas em uma densidade de seis plantas por vaso. As plantas foram crescidas em uma câmara de crescimento a 16°C com um fotoperíodo de 12 horas. Após 10 dias de crescimento, o solo foi encharcado com 20 mL de F727 WCB.

[000181] Uma hora após encharcar, aproximadamente 1 mL da suspensão de esporos de Míldio Felpudo descrita anteriormente foi pulverizado sobre cada vaso de plantas de alface. Durante as primeiras 48 horas após a inoculação, os vasos foram incubados em bandejas de plástico cobertas. Depois disso, estes foram incubados durante 8 dias a 16°C com um fotoperíodo de 12 horas.

[000182] Para cada cotilédone, a gravidade da doença foi classificada como a porcentagem da superfície da folha que estava doente e a gravidade média foi determinada para cada vaso de plantas. Os resultados para plantas tratadas (solo encharcado) e de controle não tratadas (UTC) foram comparados utilizando um teste-t e são mostrados na Tabela 17 e na Figura 18. Os resultados mostram uma redução estatisticamente significativa (p=0,0036) da gravidade da doença causada pelo Míldio Felpudo nas plantas de alface que receberam um solo encharcado com meio de células inteiras com F727.Tabela 17: Efeito do solo encharcado com F727 WCB sobre a infecção de alface causada por míldio felpudo (Teste-t de duas amostras assumindo variâncias equivalentes)

Exemplo 23: Sinergia entre o meie > de células inteiras com F727 e Bacillus amyloliquefaciens no controle de Sphaerotheca fuliginea Míldio Pulverulento no pepino

[000183] Um inóculo de Sphaerotheca fuliginea foi preparado através da lavagem de folhas de pepino infectadas com água deionizada e da filtração do que foi lavado através de duas camadas de gaze de algodão.

[000184] Plantas de pepino no estágio de duas folhas verdadeiras foram pulverizadas com 2 mL de tratamento (ver a seguir) e foi permitido que secassem durante três horas, após as quais as plantas foram inoculadas pincelando as folhas com 2 mL de inóculo de S. fuliginea em uma concentração de 2,5x105 conídios/mL.

[000185] Os tratamentos eram como a seguir (com três réplicas por tratamento): 1. Água (controle negativo) 2. Meio com células inteiras com F727 (concentração total) 3. Meio com células inteiras com F727 (concentração de 50%) 4. Meio com células inteiras com F727 (concentração total) + Double Nickel 55 (3 lbs. /acre) 5. Meio com células inteiras com F727 (concentração de 50%) + Double Nickel 55 (3 lbs. /acre) 6. Double Nickel 55 (3 lbs./acre)

[000186] Para a preparação de meio com células inteiras, o F727 foi crescido em meio SPY durante 5 dias. Double Nickel 55 é uma preparação de B. amyloliquefaciens comercial (Certis USA, Columbia, MD), que possui atividade fungicida de espectro amplo, incluindo atividade contra Míldio Pulverulento.

[000187] Após a inoculação, as plantas foram incubadas em uma câmara de crescimento a uma temperatura de aproximadamente 25°C durante dez dias, em cujo período de tempo estas foram avaliadas visualmente em relação à gravidade da doença, que foi analisada como a porcentagem de superfície da folha que estava doente. Os resultados, mostrados na Tabela 18, foram analisados utilizando o software estatístico Minitab 16 (Minitab, State College, PA) e a sinergia possível foi avaliada através do cálculo do coeficiente de sinergia de Colby. Colby (1967) "Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide combinations." Weeds 15:20-22.Tabela 18: Efeito do meio de células inteiras com F727 e misturas com Double Nickel 55, no controle do míldio pulverulento no pepino.

* Os dados para gravidade da doença são apresentados na forma de médias e desvios padrões. As medias que não possuem a mesma letra são significativamente diferentes (p<0,05) utilizando o teste LSD de Fisher.# Ee é a Eficácia esperada partindo da fórmula de Colby (Colby, 1967): Ee=A+B-AB/100, em que A e B são as eficácias dos produtos individuais; Existe uma sinergia se a eficácia da combinação (% de controle, E) for maior que Ee (E/Ee>1,0).

[000188] Os resultados na Tabela 18 indicam que o meio de células inteiras com F727 tem efeito fortemente sinérgico com Double Nickel no controle do Míldio Pulverulento, com coeficientes de sinergia de Colby de 5,6 e 1,8, respectivamente, para meio com células inteiras na concentração total e metade da concentração.

Exemplo 24: Promoção do crescimento de plantas utilizando formulações de talco de meio de células inteiras com F727

[000189] Uma formulação de talco foi preparada através da mistura de um carreador seco feito de talco (1 kg), carboximetil celulose (10 g), carbonato de cálcio (15 g) e meio com células inteiras com F727 a uma proporção de 1:1 (p/v) de mistura de carreador seco:WCB. A mistura foi seca durante toda a noite e então submetida à trituração fina. Esta formulação foi aplicada de duas maneiras. No primeiro método, esta foi aplicada no solo no plantio, sob a semente (milho de campo) na forma de uma aplicação no arado. No segundo método, a formulação de talco foi dissolvida em água e utilizada para ativar as sementes durante toda a noite antes do plantio. A água foi utilizada como um controle. As plantas foram crescidas durante duas semanas em uma estufa e pesadas.

[000190] Os resultados destas análises são mostrados nas Tabelas 19 e 20. A aplicação no arado resultou em um aumento de 16% no peso fresco médio (Tabela 19), enquanto que a ativação resultou em um aumento de 15% no peso fresco médio (Tabela 20). Assim, o F727 WCB possui atividade de promover o crescimento. Tabela 19: Aplicação no arado da formulação de talco de F727 WCB

Tabela 20: Ativação da semente com a formulação de talco de F727 WCB

Exemplo 25: Fracionamento do meio de células inteiras com F727

[000191] A cepa F727 foi crescida em um litro de um meio de fermentação adequado (por exemplo, SPM, SPY, TSB, V8) durante 4872 horas a 25°C. Um litro de meio com células inteiras foi extraído com resina Amberlite XAD-7 através da agitação da suspensão de células com a resina a 155 rpm durante duas horas à temperatura ambiente. A resina e a massa de células foram coletadas por filtração através de gaze de algodão e lavadas com água deionizada para remover os sais. A resina, a massa de células e gaze de algodão foram então imersas durante 2 horas em acetona, após as quais a acetona foi filtrada e seca a vácuo, utilizando um evaporador giratório, para fornecer um extrato bruto.

[000192] O extrato bruto foi fracionado por cromatografia líquida a vácuo com C-18 em fase inversa. Em um esquema de fracionamento anterior (Exemplo 5 e Figura 1), a atividade pesticida foi observada nas Frações 3 (corte de 40-60% de metanol) e 4 (corte de 60-80% de metanol). Para maximizar a quantidade de atividade em uma única fração, o procedimento de VLC com C-18 em fase inversa foi alterado, como mostrado na Tabela 21, para fornecer um corte de 50-80% de metanol (Fração 4). Os compostos A, B e C foram então purificados partindo da Fração 4 por HPLC com C-18 como descrito no Exemplo 5.Tabela 21: Frações de VLC de extrato de F727 com Amberlite

Exemplo 26: Estrutura do Composto A determinada pela análise de MS/MS

[000193] O composto de PM 1044 da Fração 4 (Composto A) foi analisado por espectroscopia de massa por ionização com eletrospray/espectroscopia de massa (ESEVIS/MS) para a obtenção da sequência de seus aminoácidos constituintes. Os resultados são mostrados na Figura 19. Com base nestes resultados, o Composto A foi determinado como possuindo estrutura peptídica cíclica mostrada na Figura 20.

Exemplo 27: Atividade bactericida de compostos e frações de VLC

[000194] Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae, Xanthomonas arboricola, Acidovorax avenae subsp. citrulli e Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis foram plaqueadas sobre ágar com dextrose de batata. Após o acúmulo de biomassa suficiente, uma alça cheia de cada agente patogênico foi removida de sua placa e suspensa em água esterilizada. 100 μL de cada suspensão foram estriados sobre uma placa de ágar com dextrose de batata e deixados absorver dentro da placa durante 10-15 minutos.

[000195] Amostras de frações de VLC 4 e 5, como descrito no Exemplo 25 e de compostos A (PM=1044), B (PM=1058) e C (PM=1072) partindo da Fração de VLC 4 descrita no Exemplo 25 foram preparadas a 5 mg/mL em metanol e 5 conjuntos de diluições em série de duas vezes de cada amostra foram feitos em água (isto é, concentrações entre 0,15625 mg/mL e 5 mg/mL, em incrementos de concentração de duas vezes, foram testadas). Discos de filtro esterilizados foram aplicados nas placas com ágar e os discos foram carregados com 20 μL de cada amostra. As placas foram incubadas a 25°C durante 3 dias e então observadas em relação às zonas de inibição de crescimento ao redor dos discos de filtro, indicativas da suscetibilidade do agente patogênico à amostra. Se uma inibição fosse detectada, a concentração mínima de amostra exibindo atividade inibidora era determinada. Os resultados são mostrados na Tabela 21. As Frações 4 e 5 possuem atividade inibidora contra Erwinia caratovora e Clavibacter michagensis, enquanto que os Compostos A e B inibem o crescimento de Acidovorax avenae.Tabela 21: Concentração mínima da amostra que inibe o crescimento do agente patogênico

Tabela 21: -continuação-

Exemplo 28: Atividade fungicida de compostos e frações de VLC

[000196] Amostras de frações de VLC 4 e 5, como descrito no Exemplo 25 e dos compostos A (PM=1044), B (PM=1058) e C (PM=1072) provenientes da Fração de VLC 4 descrita no Exemplo 25 foram preparadas a 5 mg/mL em metanol. Diluições em série de cada amostra foram preparadas em uma placa de 48 poços. A concentração mais alta de cada amostra testada era 500 μg/mL (10% da concentração original) e as amostras foram depois disso diluídas em série em água em incrementos de duas vezes até uma concentração de 3,9062 μg/mL. 100 μL de amostra diluição foram adicionados em cada poço, seguidos por 200 μL de ágar com dextrose de batata (PDA) 1,5X e foi então permitido que a mistura se solidificasse durante 10-15 minutos.

[000197] Colletotrichum cereale, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea e Verticillium dahliae foram plaqueadas em PDA e incubadas à temperatura ambiente até que o crescimento de micélio cobrisse a placa inteira. Água esterilizada foi adicionada em cada placa e uma espátula esterilizada foi utilizada para desalojar os micélios e os esporos. A suspensão foi passada através de um filtro para separar os micélios e os esporos. Os esporos foram contados com um hemocitômetro e ajustados, através de diluição com água, a uma concentração de 103104 esporos/mL.

[000198] Phytophthora capsici foi plaqueada sobre PARP ágar e crescida à temperatura ambiente até que um crescimento de micélios suficiente fosse observado. Água esterilizada foi adicionada na placa e uma espátula foi utilizada para desalojar os esporos. A placa foi incubada em uma câmara Conviron a 16°C durante 1-2 horas até que os esporângios liberassem os zoósporos. Os esporos foram então coletados em um tubo, contados com um hemocitômetro e a suspensão de esporos foi ajustada, com água, a uma concentração de 103-104 esporos/mL.

[000199] 50 μL da solução de esporos provenientes de cada agente patogênico foram inoculados dentro de cada poço de amostra. As placas foram incubadas a 25°C durante 4-5 dias e então observadas em relação à inibição da germinação de esporo nos poços, indicativa da suscetibilidade do agente patogênico à amostra. Se uma inibição fosse detectada, a concentração mínima da amostra exibindo atividade inibidora era determinada. Os resultados são mostrados na Tabela 22. Tabela 22: Concentrações mínimas de amostras que inibem a germinação de esporos

[000200] Os Compostos A, B e C e a Fração 4 inibiam a germinação de esporos de todos os agentes patogênicos fúngicos testados exceto P. capsici. O Composto C e a Fração 4 exibiam as atividades inibidoras mais altas.

DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO

[000201] O material biológico a seguir foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste na Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604 USA e recebeu o número a seguir:

[000202] A cepa foi depositada sob condições que garantem que o acesso à cultura será disponível durante a pendência deste pedido de patente a um determinado pelo Commissioner of Patents and Trademarks como sendo intitulado sob 37 C.F.R. §1,14 e 35 U.S.C. §122. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito está disponível quando requerido por leis de patentes estrangeiras em países em que correspondentes do presente pedido de patente ou sua progênie estão depositados. Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção abolindo os direitos de patente concedidos pela ação do Governo.

[000203] A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ter seu âmbito limitado pelos aspectos específicos divulgados aqui, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. É pretendido que quaisquer aspectos equivalents estejam dentro do âmbito desta invenção. Na verdade, várias modificações da invenção em adição àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes para os peritos na arte partindo da descrição anterior. É também pretendido que tais modificações se encaixem dentro do âmbito das reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente divulgação incluindo as definições controlará. São citadas aqui várias referências, cujas divulgações são incorporadas como referência em suas totalidades.

Claims

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um meio de células inteiras coletado de fermentação de cepa de um Bacillus F727 (No. de Acesso de NRRL B-50768), em que a cepa de Bacillus F727 possui atividade pesticida ou atividade promotora de crescimento de planta; (b) pelo menos um de um carreador, um diluente, um tensoativo ou um adjuvante; e (c) um pesticida químico ou biológico.

2. Método para a modulação da infestação por fungos em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende a aplicação na planta e/ou nas sementes da mesma e/ou no substrato utilizado para o crescimento da dita planta de uma quantidade da composição compreendendo um meio de células inteiras coletado de fermentação de cepa de um Bacillus F727 (No. de Acesso de NRRL B-50768) e compreendendo opcionalmente um pesticida.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fungo é selecionado do grupo que consiste de Botrytis, Sclerotinia, Rhizoctonia e Bipolaris.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pesticida adicional consiste de extrato de Reynoutria sachalinensis (sanguinária).

5. Método para a modulação do crescimento de uma planta e/ou da germinação de uma semente caracterizado pelo fato de que compreende o contato da dita planta, seu substrato de crescimento e/ou uma semente da dita planta com uma quantidade da composição compreendendo um meio de células inteiras coletado de fermentação de cepa de um Bacillus F727 (No. de Acesso de NRRL B-50768), e opcionalmente, uma ou mais substâncias efetivas para modular o crescimento de dita planta e/ou germinação de dita semente.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que uma ou mais substâncias compreende um agente que promove o crescimento, um tensoativo, um carreador, um adjuvante e/ou um fertilizante.

7. Semente revestida com uma composição, caracterizada pelo fato da dita composição compreender um meio de células inteiras coletado de fermentação de cepa de um Bacillus F727 (No. de Acesso de NRRL B-50768).