CN105705629B - 用作生物防治剂的粉红粘帚霉的分离株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可用作植物处理的生物防治剂的、被称为BVT Cr‑7的真菌粉红粘帚霉的分离株。所述分离株、包含所述株的制剂和/或来自所述株的孢子可以用于植物或植物材料以增加植物产量、改善植物生长，或者用于植物中的疾病或病原体的治疗或预防。

Description

用作生物防治剂的粉红粘帚霉的分离株
相关申请
本申请要求于2013年9月11日提交的、序列号为61/876,469的美国临时专利申请的优先权。该申请的全部内容以引用的方式整体结合至本文。
技术领域
本申请涉及真菌粉红粘帚霉的分离株，更具体地，涉及可用作植物处理的生物防治剂的粉红粘帚霉的分离株。
背景技术
粉红粘帚霉(Clonostachys rosea f.rosea)是一种有益微真菌，在野外的多种植物的组织和几乎所有种类的农作物中均有发现。该真菌常见于在世界各地的农场以及苗圃、果园、葡萄园、牧场和花园中收集的植物的健康根、叶片、茎、花和果实。它已经在来自于包括亚北极区、寒温带和暖温带、沙漠和湿热带的区域的植物和土壤中有报道。定殖有粉红粘帚霉的植物不显示出任何呈现该真菌存在的可视标记，直到该组织自然衰老并死亡。在那个时候，该真菌能形成孢子，并且可能在植物表面看到发白的生长，尤其是在手持透镜的帮助下。不同于与疾病相关的致病生物，Clonostachys在植物中不引起损害、病斑、萎蔫或其它症状。粉红粘帚霉同样已知是一种有益生物防治剂，用于植物的处理，并帮助保护植物抵抗疾病和环境胁迫以及促进植物生长和产率。
Stewart等(美国专利号8,101,551)描述了粉红粘帚霉株88-710，并提及了该菌株具有促进植物活力、健康、生长和产量的益处。
本领域仍然需要可用作植物处理的生物防治剂的粉红粘帚霉的新菌株。
发明内容
本申请发明人分离并表征了真菌粉红粘帚霉的新菌株。如在本文中所描述的，被指定为“BVT Cr-7”的粉红粘帚霉的该新菌株具体用作为植物处理的生物防治剂。在本发明的一个方面，粉红粘帚霉株BVT Cr-7的分离培养物已经于2013年9月4日保藏在位于加拿大R3E 3R2曼尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015号的加拿大公众健康机构国家微生物实验室的加拿大国际微生物保藏单位，编号为040913-01。
如在实施例1中所展示的，分离并表征了粉红粘帚霉的一系列不同株，以鉴定具有用作生物防治剂的特别有益性质的菌株。相对于粉红粘帚霉的其它株，BVT Cr-7展示了用作生物防治剂的许多改进性质和/或期望的性质的组合。例如，BVT Cr-7展示了与生长和孢子生产丰度相关的改进的或期望的性质、它在不同植物的内部(包括在农作物的根部中和试验植物的花和叶子中)内生性定植的能力以及它抑制或控制广谱范围的植物疾病和/或病原体的能力。在一种实施方式中，与粉红粘帚霉的对照株(如88-710和/或EV1a)相比，BVTCr-7显示出一种或多种改进的性质。
另外，如在实施例2-5中所展示的，在控制条件下将BVT Cr-7应用于田野实验中的植物以及温室中的植物证明，在不同条件下和对于多种植物而言，BVT Cr-7是一种广谱范围的生物防治剂，具有针对多种不同疾病的高性能。如在实施例4中所示的，BVT Cr-7还用于减少植物材料的腐败，例如通过降低收获的农作物中的腐烂或褪色的水平。
因此，在一个方面，本发明提供了一种如在本文中所描述的粉红粘帚霉株BVT Cr-7的分离培养物。在一种实施方式中，所述株于2013年9月4日保藏在位于加拿大R3E 3R2曼尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015号的加拿大公众健康机构国家微生物实验室的加拿大国际微生物保藏单位，编号为040913-01。
本发明还提供了产生自粉红粘帚霉株BVT Cr-7的孢子，以及粉红粘帚霉株BVTCr-7的后代，和包含BVT Cr-7的分离培养物、孢子和/或后代的制剂。本发明还提供了一种能够无性繁殖的、粉红粘帚霉株BVT Cr-7的分离的细胞。在一种实施方式中，提供了一种孢子，所述孢子通过在适于形成孢子的条件下、将BVT Cr-7的分离培养物在基质上培养而获得。在一种实施方式中，提供了一种制剂，所述制剂包含与稳定剂(如，硅酸钙)结合的BVTCr-7的孢子。
在一种实施方式中，本文描述的BVT Cr-7的分离培养物在植物中定殖成为内生菌。在一种实施方式中，用BVT Cr-7接触植物来抑制或控制侵袭植物的叶子、花、果实和/或根的疾病或病原体。在一种实施方式中，所述疾病是灰霉病、白霉病、褐腐病、根腐病和/或拟茎点霉属病(phomopsis)。在一种实施方式中，所述疾病由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起和/或由腐霉属(Pythium spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia)和/或镰刀菌属(Fusarium)的种引起。
在一种实施方式中，还提供了已经被BVT Cr-7的接种物定殖的植物或植物材料。
在一种实施方式中，粉红粘帚霉株BVT Cr-7可用作植物处理的生物防治剂。在一种实施方式中，提供了一种处理植物的方法，包括用本文描述的粉红粘帚霉株BVT Cr-7接触植物。例如，在一种实施方式中，与没有用BVT Cr-7处理的对照植物相比，BVT Cr-7用于改善植物的健康、生长和/或产量。在一种实施方式中，BVT Cr-7用于预防或治疗植物中的疾病和/或病原体。在一种实施方式中，BVT Cr-7用于促进排除其它真菌(包括病原真菌)定殖植物。在一种实施方式中，BVT Cr-7用于在植物中引发对疾病和胁迫的自然抵抗，如对病原体的感染做出反应。还提供了一种降低植物材料损耗的方法，包括用BVT Cr-7接触植物材料。
在一种实施方式中，BVT Cr-7用于处理植物，以预防或治疗可能影响植物的健康、生长和/或产量的疾病和/或病原体。在一种实施方式中，所述病原体是微生物，如真菌或细菌。可以被BVT Cr-7控制的、能影响植物健康、生长和/或产量的病原体的例子包括但不限于灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、腐霉属(Pythium spp.)、链格孢属(Alternaria)、念珠菌属(Monilia)、链核盘菌属(Monilinia)、刺盘孢属(Colletotrichum)、枝孢属(Cladosporium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、链霉菌属(Streptomyces)、亚隔孢壳属(Didymella)和/或镰刀菌属(Fusarium)。可以通过使用BVTCr-7控制的、能影响植物健康、生长和/或产量的疾病的例子包括但不限于灰霉病、白霉病、褐腐病和/或根腐病。其它例子包括在例如蓝莓或葡萄中的拟茎点霉属病以及马铃薯疮痂病。
在一种实施方式中，所述植物是被粉红粘帚霉株BVT Cr-7内生性定殖的任何植物或其部分。在一种实施方式中，所述植物是开花植物、谷类植物、豆类植物或蔬菜作物。例如，在一种实施方式中，本文描述的方法和应用用于处理植物，如开花植物或农作物，如蔬菜、水果、谷物以及它们的种子或幼苗。在一种实施方式中，本文描述的方法和应用用于处理针叶树的幼苗/移植物。在一种实施方式中，所述植物是树，如松树、黑云杉或松树移植物。在一种实施方式中，所述植物是小麦、大麦、向日葵、加拿大油菜(canola)、蓝莓、草莓、木莓、葡萄、马铃薯、胡椒、黄瓜、番茄、草坪草、西兰花、菜花、桃、苹果、加拿大油菜、观赏花，如玫瑰、天竺葵、仙客来、金鱼草、藻百年属、秋海棠或百合。在一种实施方式中，所述植物在室外种植。在一种实施方式中，所述植物在温室中种植。
在一种实施方式中，本文描述的方法和应用包括用BVT Cr-7，如BVT Cr-7培养物、孢子或其制剂接触植物。在一种实施方式中，所述BVT Cr-7培养物、孢子或其制剂用作接种物。在一些实施方式中，BVT Cr-7以喷雾、薄雾、浸液、粉末或营养液形式和/或通过昆虫媒介(如，通过使用在申请号为PCT/CA2013/050179的PCT申请中所描述的蜂媒介，该申请的全部内容通过引用的方式结合至本文)而施用于植物或植物的部分。
本文还提供了生物防治剂的生产方法，所述方法包括用分离的BVT Cr-7培养物接种基质并在适于真菌生长的条件下培养所述基质，以生产粉红粘帚霉株BVT Cr-7。可选地，所述方法进一步包括在适于真菌孢子形成的条件下培养所述基质并从基质中移除孢子以生产接种体。
本发明公开内容的其它特征和有益之处将从以下的具体描述中变得显而易见。但是，应当理解，这些详细描述和表示本发明的优选实施方式的具体实施例仅以描述的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多种变化和修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。
具体实施方式
定义
如在本文中所使用的，“粉红粘帚霉株BVT Cr-7”或“BVT Cr-7”指的是于2013年9月4日保藏在位于加拿大R3E 3R2曼尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015号的加拿大公众健康机构国家微生物实验室的加拿大国际微生物保藏单位、编号为040913-01的真菌菌株。术语“粉红粘帚霉株BVT Cr-7”、“BVT Cr-7”或“粉红粘帚霉株IDAC 040913-01”同样包括所述株的分离物或从所述株产生的任何细胞、培养物、孢子和后代(如，通过无性繁殖产生)。
本领域已知的不同方法可以用于培养BVT Cr-7或制备真菌孢子，这些方法包括但不限于本文描述的方法以及在以下文献中描述的方法：Sutton等“Gliocladium roseum:aversatile adversary of Botrytis cinerea in crops.”Plant Dis 1997；81:316–28；Sutton等“Ability of Clonostachys rosea to establish and suppress sporulationpotential of Botrytis cinerea indeleafed stems of hydroponic greenhousetomatoes”Biocontrol Sci Technol 2002；12(4):413-25，以及美国专利申请2012/0021906“真菌接种物组合物”，这些文献的全部内容通过引用的方式结合至本文。
如在本文中所使用的，“植物”指能够被BVT Cr-7内生性定殖的植物界的任何成员。在优选的实施方式中，所述植物是种植植物。在一种实施方式中，“植物”也包括形成植物的块茎、种子和/或幼苗，以及可选地，包括植物材料。如在本文中所使用的，“植物材料”指收获或分离自植物、预定用作食物或其它应用(由于疾病和/或被病原体感染而容易损坏的)的任何材料。植物材料的例子包括但不限于，收获的谷物、水果或蔬菜。
如在本文中所使用的，“内生性定殖”指这样的过程：通过该过程，真菌的孢子进入植物宿主或其部分内并在其中形成真菌菌落而不引起疾病的症状或其它方面，或伤害宿主。
如在本文中所使用的，“生物防治剂”指具有以下功能的试剂：促进植物的健康、生长、活力和/或产量；提高发芽率和/或种子质量；提高对疾病、虫害和/或环境胁迫(如不利的天气或土壤条件)的抗性；控制或对抗疾病或病原体或用于疾病或病原体的治疗或预防；或促使植物从伤害和/或感染中恢复。生物防治剂的优选例子是本文描述的粉红粘帚霉BVTCr-7。
如在本文中所使用的，“病原体”指可以侵袭并定殖于植物宿主且降低所述植物的健康、生长、活力和/或产量的微生物。病原体的例子包括但不限于细菌和真菌，如灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)以及腐霉菌属(Pythium)、链格孢属(Alternaria)、念珠菌属(Monilia)、链核盘菌属(Monilinia)、刺盘孢属(Colletotrichum)、枝孢属(Cladosporium)、丝核菌属(Rhizoctonia)、链霉菌属(Streptomyces)、亚隔孢壳属(Didymella)和/或镰刀菌属(Fusarium)的种。
粉红粘帚霉与植物和植物疾病生物体的相互作用
不受理论限制，申请人相信粉红粘帚霉BVT Cr-7通过多种机制以及通过其它病原体的竞争排斥为植物提供保护，这些机制包括引发对疾病和胁迫的天然植物抵抗。
Clonostachys通过大量微观(5-7μM)的豆形孢子繁殖。当应用于植物时，这些孢子萌发以产生微管，由这些微管形成极其细小的枝并进入植物组织。进入可以发生在活的花瓣、叶片、植物创伤、根、块茎和植物的其它部分。一旦进入所述组织，每根枝形成微观真菌菌落。含有Clonostachys菌落的植物没有显示出如由致病生物体(病原体)所产生的那些症状。当被确定为植物组织内部的内生菌时，Clonostachys可以发挥出有益效果，如引发对疾病和胁迫的天然植物抗性。
当植物组织开始衰老时，如当叶子首次开始变黄或者当疾病或胁迫开始发展时，微观的Clonostachys菌落与植物组织之间的关系突然变化。在那个时候，微小的菌落开始快速生长并经常完全占据邻近的组织。Clonostachys在几乎所有在正在衰老和死亡植物上生长的其它真菌和细菌之前开始这种生长。因此，Clonostachys是衰老植物组织的先锋定殖菌。事实上，它在其它生物体(包括有害病原体，如葡萄孢属(Botrytis)、核盘菌属(Sclerotinia)和链核盘菌属(Monilinia))之前占据这些组织。一旦这些组织被占据，其它生物体，包括病原体不能取代所述占据生物体。Clonostachys能够简单地通过抢先占据所述组织而阻止病原体和其它真菌的生长。这种竞争性排除是一种主要方式，通过该方式，Clonostachys抑制植物中的疾病生物体和疾病发展。如在实施例中所示的，ClonostachysBVT Cr-7特别有效地控制广泛多种植物中的疾病和病原体。
当定殖的组织渐渐地衰老并死亡，Clonostachys产生孢子。在许多例子中，这样的孢子开启了在附近活植物中的内生性生长循环。Clonostachys能够在死的植物材料(当它们存活时，Clonostachys在此定殖)中暂时存活，但是，它在已经被其它真菌和细菌占据的死的植物材料上具有较小生长能力。在这种情况下，Clonostachys不能与如青霉属和曲霉属的微生物(这些微生物适合于植物残体和土壤的微生物世界)良好竞争。
Clonostachys还能够在其它真菌的菌丝和菌丝体上生长(即，是一种真菌上寄生物)。Clonostachys通常仅在与其它真菌的菌丝、菌核或其它部分非常紧密接触(即，完全接触或有大约1-5μM的距离)后袭击其它真菌。在做这些事情中，Clonostachys菌丝有时候盘绕寄生的真菌，而所述“宿主真菌”实质上死亡。
不受理论限制，申请人认为Clonostachys抑制植物中的病原体和疾病的主要方式是通过：A、快速占据正在衰老或已损坏的组织以阻止所述组织中的病原体的生长；和B、刺激植物对疾病生物体的天然抗性机制。此外，Clonostachys能够通过寄生(即，在它们上生长，将它们作为食物来源)灭活或杀死存活的真菌结构(如，土壤中或土壤表面上的菌核和多种孢子)。BVT Cr-7是Clonostachys的分离株，展示出多种使它可用作处理植物的生物防治剂而特别有效的性质。
菌株BVT Cr-7的特征和性质
在一种实施方式中，提供了一种被称为BVT Cr-7的Clonostachys的分离株。在一种实施方式中，该菌株于2013年9月4日保藏在位于加拿大R3E 3R2曼尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015号的加拿大公众健康机构国家微生物实验室的加拿大国际微生物保藏单位，编号为040913-01。在一种实施方式中，“粉红粘帚霉株BVT Cr-7”或“BVT Cr-7”包括例如通过无性繁殖从所述菌株生产的任何培养物、孢子、细胞和后代。如在本文中所描述的，BVT Cr-7比Clonostachys的其它株表现出多种有利的特征。
例如，在一种实施方式中，BVT Cr-7能够在标准琼脂培养基和植物种子(如，灭菌的谷物种子)上生产孢子。在一种实施方式中，与粉红粘帚霉的其它株(如，88-710，同样已知为AFr-710、PG-710)相比，BVT Cr-7具有改善的在标准琼脂培养基和植物种子(如，灭菌的谷物种子)上生产孢子的能力。菌株88-710在Sutton等,Evaluation of the FungalEndophyte Clonostachys rosea as an Inoculant to Enhance Growth,Fitness andProductivity of Crop Plants.Proc.IVth IS on Seed,Transplant and StandEstablishmentof Hort.Crops Ed.:D.I.Leskovar,Acta Hort.782,ISHS 2008,279-286页(通过引用的方式全文并入本文)中描述。在一种实施方式中，所述谷物种子是小麦或大麦种子。在一种实施方式中，BVT Cr-7用于生产用在植物处理中的接种物。
在一个方面，BVT Cr-7能够在植物中建立内生。在一种实施方式中，BVT Cr-7能够在植物的根(例如，农作物植物的根)中建立内生。在一种实施方式中，与粉红粘帚霉的其它株(如，88-710)相比，BVT Cr-7具有改善的在植物根中建立内生的能力。例如，在一种实施方式中，BVT Cr-7具有改善的在农作物植物和/或如小粒谷物、草坪草、豌豆、加拿大油菜、大豆、胡椒、番茄和黄瓜的植物中建立内生的能力。
在一种实施方式中，BVT Cr-7能够在植物的叶子和/或花中建立内生。在一种实施方式中，与粉红粘帚霉的其它株(如，88-710)相比，BVT Cr-7具有改善的在植物的叶子和花中建立内生的能力。例如，在一种实施方式中，BVT Cr-7具有改善的在迷你玫瑰、草莓、向日葵和加拿大油菜的叶子和/或花中建立内生的能力。
在另一方面，BVT Cr-7能够抑制和/或控制植物中的疾病。在一种实施方式中，BVTCr-7能够抑制和/或控制植物中由病原体(如，其它真菌或微生物)引起的疾病。在一种实施方式中，与粉红粘帚霉的其它株(如，88-710)相比，BVT Cr-7具有改善的抑制或控制植物中的疾病的能力。例如，在一种实施方式中，BVT Cr-7具有改善的抑制或控制侵袭植物的叶子、花、果实和/或根的疾病的能力。在一种实施方式中，所述疾病由灰葡萄孢菌(灰霉病)、核盘菌(白霉病)引起的和/或由腐霉菌、丝核菌属(Rhizoctonia)和/或镰刀菌属的种引起的(根腐病和其它疾病)。
在一种实施方式中，BVT Cr-7能够降低植物材料的腐败。例如，在一种实施方式中，相对于未处理的植物材料，用BVT Cr-7通过例如喷雾处理来接触收获的植物材料降低了腐烂的发生率。
将BVT Cr-7应用于植物和/或其部分
在一种实施方式中，本文描述的方法和应用包括用BVT Cr-7接触植物或植物材料。在一种实施方式中，使BVT Cr-7暴露于植物或植物材料，使得促进植物或植物材料的内生定殖。根据应用，可以通过任何已知方法，包括通过喷雾、薄雾，通过浸渍，通过营养液和/或通过昆虫媒介，将BVT Cr-7应用于植物的任何部分，包括植物叶子、花、根、块茎和/或种子。
例如，用于移植的幼苗植物可以通过在移植时湿透土壤培养基或浸渍植物而处理。
在另一种实施例中，由感染花病原体引起的疾病通常可以有效地通过将粉红粘帚霉BVT Cr-7施用于花而控制，所述施用例如通过喷雾处理或昆虫媒介，如在PCT公开号为WO2012/135940和PCT申请号为PCT/CA2013/050179的申请中所描述的蜜蜂媒介技术，这些文献的内容通过引用的方式全文结合至本文。在一种实施方式中，蜜蜂媒介能够用于处理开花农作物，因为蜜蜂每天(与例如每周喷雾相比)将Clonostachys递送至新开的花。
其它示例性的应用包括：通过超低容量薄雾或常规喷雾将Clonostachys施用在温室作物的叶子上来控制叶子和茎创伤中的如葡萄孢属的病原体，所述创伤是在脱叶或其它修剪实践中形成的；用Clonostachys对高尔夫球场上的草进行喷雾处理以控制硬币元状斑病(核盘菌属)、雪霉病(Typhula,Microdochium)以及其它树叶病；对新鲜创伤(48小时内)施用Clonostachys通常提供了针对许多例如在嫁接、切割或损伤的植物中的创伤感染疾病生物体的长期保护；以及可以用Clonostachys处理种子(然后真菌在根系统中生长)以增强农作物(如紫花豌豆)的能力，从而当受到干旱胁迫或生产实践(包括使用一些杀虫剂)时维持生长。
在一种实施方式中，如在本文中描述的BVT Cr-7可以用于控制多种农作物中的病原体，所述农作物包括加拿大油菜、向日葵、树莓、蓝莓、草莓、苹果、梨、奇异果、西瓜、咖啡、芒果、鳄梨、樱桃、李子、杏仁、桃子、腰果、番石榴、紫花苜蓿、荞麦、苜蓿、豆子、豌豆、洋葱、大豆、棉花、芥末、黑莓、鹅莓、胡椒、茄子和醋栗，所述病原体如核盘菌、moniliniavaccinii-corymbosi和/或灰葡萄孢菌。
在一些实施方式中，BVT Cr-7以单剂量暴露或在不同时间以多剂量或暴露来施用于植物。例如，在一种实施方式中，通过如喷雾或以装备有合适的接种物分配器的蜂房的昆虫媒介在至少2天、4天、1周、2周、1个月或大于1个月的间隙对植物施用或暴露于BVT Cr-7。
在一种实施方式中，在目标植物的年生长循环期间，使植物与BVT Cr-7接触一次或多次。例如，在一种实施方式中，在春天在生长季的开始和/或在秋天在生长季的末尾对植物施用BVT Cr-7。在一种实施方式中，在收获植物材料之前，例如在收获植物材料的1周、2周、3周或4周之前将BVT Cr-7应用于植物。
用于接种植物的制剂
在一个方面，提供了一种包含BVT Cr-7的制剂，所述制剂适于接种植物或植物材料。可选地，所述制剂可以是固体(如粉末制剂)或溶液(如水溶液)。在一种实施方式中，所述制剂包含BVT Cr-7的冻干孢子。在一种实施方式中，本文描述的制剂用作用于植物处理的接种物。
在一种实施方式中，所述制剂可以包括多种添加剂，所述添加剂与粉红粘帚霉株BVT Cr-7的分离培养物或真菌孢子结合。
本领域技术人员将意识到，所述制剂中的细胞或孢子的浓度可以根据制剂所使用的条件(如，将所述制剂应用于所述植物或植物材料的气候、目标植物、方法等)变化。
在一些实施方式中，所述制剂是固体制剂并且每克制剂可包含约1×108至4×108个孢子，可选地约2×108至4×108个孢子。
在一些实施方式中，所述添加剂包括稳定剂、吸湿剂、引诱剂、稀释剂和/或抗结剂中的一种或多种。在一些实施方式中，所述添加剂可以包括稳定剂、吸湿剂、引诱剂、稀释剂和/或抗结剂中的两种或更多种。在一种实施方式中，所述制剂适用于昆虫媒介，如在PCT/CA2013/050179中所描述的那样，该文件内容通过引用的方式结合至本文。
在一种实施方式中，所述制剂包括稳定剂。所述稳定剂用于防止或最小化腐烂、分解或在递送至植物目标前活化真菌孢子。稳定剂的例子包括粒状硅酸钙。例如，在一些实施方式中，所述制剂可以包含真菌孢子，所述真菌孢子可以与至少一些硅酸钙结合。所述制剂可以具有的孢子密度是：孢子所结合的每克硅酸钙约1×109至4×109个孢子。在一种实施方式中，所述制剂可以具有的孢子密度是：孢子所结合的每克硅酸钙约2×109个孢子。
在一种实施方式中，所述制剂包括吸湿剂。所述吸湿剂用以从所述制剂中吸收湿气以保持所述制剂相对干燥并预防制剂结块或成块。吸湿剂的例子包括干燥剂(如硅胶微粒或硅胶珠)以及超吸收聚合物(如聚丙烯酸钠)。吸湿剂的更多例子包括木刨花和粘土球。
在一种实施方式中，所述制剂包括引诱剂。引诱剂可以帮助将制剂吸引至植物和/或媒介昆虫。例如，所述引诱剂可以具有净正静电电荷，使得它能够被静电吸引至具有净负静电电荷的植物和/或媒介昆虫。在一些实施例中，所述引诱剂可以包括矿物或矿物混合物。在一种具体实施例中，所述引诱剂可以包括由Agri-Dynamics(Martins Creek,PA)出售的名字为DYNA-MINTM的矿物混合物，其包括以下矿物：二氧化硅、氧化铝、钙、铁、镁、钾、钠、磷、钛、锰、锶、锆、锂、铷、硼、锌、钒、铬、铜、钇、镍、钴、镓、铯、钪、锡、钼和其它痕量元素。在另一种实施例中，所述引诱剂可以包括钙石灰石。
在一种实施方式中，所述制剂包括稀释剂。所述稀释剂可以是合适的淀粉或面粉。在通过昆虫媒介递送所述制剂的实施例中，可以选择所述稀释剂使得它不会刺激昆虫或伤害昆虫，并且不会被昆虫吃掉。可以进一步选择所述稀释剂使得它不会吸收大量的湿气，使得所述稀释剂不会成块。适于昆虫媒介的稀释剂的例子包括玉米粉和谷物粉，如黑麦粉、小麦粉、米粉和斯佩尔特小麦面粉。在可选择的实施例中，所述稀释剂可以是高岭土。在其它实施例中，所述稀释剂可以包括奶粉或滑石粉。这些可能在不是通过昆虫媒介的方式(如通过喷雾)递送制剂的实施例中特别有用。
在一种实施方式中，所述制剂包括合适的抗结剂。抗结剂的一种具体例子是氧化镁。本领域技术人员已知的其它抗结剂也可以用在本文描述的制剂中。
在一种实施方式中，所述制剂是液体制剂，如水悬液。在一种实施方式中，所述制剂包括约1～6×105孢子/mL，可选地约2～5×105孢子/mL。在一种实施方式中，所述制剂是液体制剂并包括一种或多种农学上适用的载体或稀释剂。在一种实施方式中，所述液体制剂包括一种或多种稳定剂。
本发明还提供了用于生产如本文描述的生物防治剂的方法，所述生物防治剂如包含有效量的BVT Cr-7的接种物。例如，在一种实施方式中，提供了一种方法，包括提供BVTCr-7的分离培养物，用BVT Cr-7的分离培养物接种基质，以及在适于真菌生长的条件下培养所述基质。在一种实施方式中，在相对湿度大于90％或大于95％、温度范围为20-24℃的条件下培养接种的基质。
在一种实施方式中，所述基质是灭菌基质。在一种实施方式中，所述方法进一步包括在适于真菌形成孢子的条件下培养所述基质。适于粉红粘帚霉的真菌孢子形成的条件是本领域公知的。例如，在一种实施方式中，适于真菌形成孢子的条件包括：使BVT Cr-7在大约20-24℃、在高湿度水平(大于约95％)下在基质(如灭菌的种子)上生长几天使得真菌生长，然后将相对湿度降低至低于约50％、可选约20-50％、35-45％或约20-25％、持续至少10天、至少2周或大于2周以促进大量孢子产生。本申请发明人已经测定，将相对湿度水平降低至约35-45％、持续约2周对于BVT Cr-7的真菌孢子的生产特别有效。在一种实施方式中，所述灭菌的种子是大麦种子。在一种实施方式中，在孢子生产过程中所述基质是暴露于空气中的。优选地，在灭菌条件下培养基质以避免被其它微生物污染。
在一种实施方式中，所述方法进一步包括将孢子从基质中移除，可选地，通过在水溶液中悬浮。在一种实施方式中，从所述基质移除所述孢子以生产接种物。可选地，所述孢子可以从基质中移除，然后冻干或以本领域已知的方式加工，从而生产生物防治剂。在一种实施方式中，所述方法包括将接种物与一种或多种其它成分混合，以生产本文描述的制剂，所述其它成分如稳定剂、吸湿剂、引诱剂、稀释剂和/或抗结剂。在一种实施方式中，所述方法包括通过用灭菌水混合基质从所述基质移除孢子。在一种实施方式中，所述方法包括摇动混合物，过滤掉成块的或过程材料(course material)，轻柔离心滤出液并重悬成球的材料以生产水溶液。
其它实施方式
在一种实施方式中，提供了一种控制植物病原体的方法，包括将本文描述的BVTCr-7应用于植物或植物材料。例如，本文公开的BVT Cr-7分离物、孢子和制剂可以用作预防剂以减少在植物或植物材料中发生的感染，特别是病原体真菌如葡萄孢属(Botrytis)或核盘菌属(Sclerotinia)感染的机会。
本发明还提供了控制植物中的病原体的方法，所述方法包括用本文公开的培养物或制剂处理一批种子，然后将处理过的种子培养成植物。
本发明还提供了一种制剂，包含本文描述的BVT Cr-7和载体或稀释剂，以及可选地进一步包括其它生物防治剂，如抗真菌剂或杀虫剂。所述制剂可以是种子处理制剂、植物处理制剂或土壤处理制剂。在一种实施方式中，所述载体或稀释剂是帮助满足制剂的稳定性和性能的农业上可接受的载体或稀释剂。在一种实施方式中，所述载体或稀释剂与生物防治剂相容，农业上可接受并具有良好的吸收能力和合适的堆密度，使得能够容易地进行粒子分散和附加。
本文描述的包含BVT Cr-7的制剂可以例如应用于植物的种子或繁殖体、生长培养基(如土壤或水)、植物的根和/或植物的叶子、植物的花或雌蕊、或它们的任意组合。可以用本发明的制剂处理的示例性植物包括但不限于农作物，如种子作物、谷物作物、纤维作物、豆类作物、园艺作物、森林作物和草坪草。
根据本领域确定的实践，包含本文描述的BVT Cr-7的制剂可以以水喷雾、颗粒和灰尘/粉末制剂的形式施用于植物。水喷雾通常通过以下方式制备：将BVT Cr-7的分离培养物或孢子的可湿润的粉末或可乳化的浓缩制剂与相对大量的水混合以形成分散液。
上述公开内容一般性地描述了本申请，参考以下具体实施例可以获得更完整的理解。描述这些实施例仅是为了例示的目的，并不意味着限制本发明的范围。由于环境可能暗示或者提供便利，可以考虑形式上的变化和等价替换。尽管本文使用了具体术语，这样的术语是描述意义，并不是限制目的。
以下非限定的实施例描述了本发明内容。
实施例
实施例1：粉红粘帚霉株BVT Cr-7的分离
在临近安大略省圭尔夫的田野里收集几种农作物(小麦、大豆、玉米、紫花苜蓿、草)作为粉红粘帚霉新菌株的可能来源。从临近安大略省阿克尔的田野获得健康小麦幼苗(分蘖早期)的根部分离出本文描述的真菌菌株BVT Cr-7。同样分离了一批粉红粘帚霉的其它菌株(BVT Cr-1到BVT Cr-14)，并在下面列出。
用于从小麦和其它农作物的根分离Clonostachys菌株的方法如下所示。全程使用无菌技术。在自来水中清洗几种植物的根，除掉土壤，在纸巾上吸干水，然后切成1-2cm长的段。将段用棉纸吸干，并在20-22℃下、在细菌培养皿中的百草枯-氯霉素琼脂培养基上培养。所述百草枯加速根衰老，使得Clonostachys在它之前已经定殖的根的表面上相对快速地(如，6-8天内)形成孢子。孢子形成结构(它们含有的分生孢子梗和分生孢子)是真菌被识别和鉴定的基础。所述分生孢子(即，孢子)可以被移除并在培养中生长。
为分离真菌，用灭菌针将孢子从根上的分生孢子梗转移至细菌培养皿中的补充有链霉素(以抑制细菌)的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。在孢子在琼脂培养基上已经生长并产生出菌落后，将真菌在细菌培养皿中的PDA-链霉素上传代培养。在灭菌的蒸馏水中悬浮传代培养的孢子，连续稀释悬浮液并散布在PDA上。将从单一孢子生长的菌落转移至细菌培养皿中的新鲜琼脂培养基上，并在4℃下维持培养以作为一系列分离物，用于进一步表征为可能的生物防治剂。
然后检测所述系列分离株并互相比较以及与粉红粘帚霉的已确定株(包括88-710和EV-1a)进行比较。菌株88-710在Sutton等,Evaluation of the Fungal EndophyteClonostachys rosea as an Inoculant to Enhance Growth,Fitness and Productivityof Crop Plants.Proc.IVth IS on Seed,Transplant and Stand Establishment ofHort.Crops Ed.:D.I.Leskovar,Acta Hort.782,ISHS 2008 279-286页中描述(全文内容通过引用的方式结合至本文)。
通过在实施例2和3中列出的实验鉴定出分离株BVT Cr-7(蜜蜂媒介技术粉红粘帚霉#7)为优势分离株。然后培养BVT Cr-7的分离培养物并于2013年9月4日保藏在位于加拿大R3E 3R2曼尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015号的加拿大公众健康机构国家微生物实验室的加拿大国际微生物保藏单位，编号为040913-01。
实施例2：检测和表征BVT Cr-7相对于粉红粘帚霉的其它株的性质
在一系列实验中比较新分离的菌株BVT Cr-7和粉红粘帚霉的其它两株菌株(88-710和EV-1a)，这些实验被设计为评估它们作为用于植物处理的生物防治剂的性质。根据以下每项标准，观察到BVT Cr-7与88-710和/或EV-1a相比是相当的或有优势的：
·在可以用于商业接种物生产的标准琼脂培养基和如灭菌谷物种子(小麦和大麦)的基质上的生长和孢子生产的丰度。
·在多种不同农作物植物(包括小粒谷物、草坪草、豌豆、加拿大油菜、大豆、胡椒、番茄和黄瓜)的根内大量定植(即，内生性地)的能力。
·在几种检测植物(迷你玫瑰、草莓、向日葵、加拿大油菜)的叶子和花中内生性定植的能力。
·抑制或控制广谱范围的侵袭叶子、花、果实和根的破坏性疾病的能力，特别是由灰葡萄孢菌(灰霉病)、核盘菌(白霉病)引起以及由腐霉属(Pythium spp.)、丝核菌属(Rhizoctonia)和镰刀菌属(Fusarium)的种引起的疾病(根腐病和其它疾病)。
因此，BVT Cr-7展示出了抗多种植物中的不同疾病的期望的性质，并且普遍展示出了相对于88-710和/或EV-1a的更好地作为生物防治剂的活性。
实施例3：BVT Cr-7控制植物中的疾病的性质
将BVT Cr-7应用于一系列植物和农作物中以评估它们在田野试验中的活性。具体地，将BVT Cr-7施用于下列植物的花(例如，通过蜜蜂媒介或喷雾处理)，以控制由具体病原体引起的疾病：
向日葵：核盘菌属(Sclerotinia)、葡萄孢属(Botrytis)和镰刀菌属(Fusarium)
加拿大油菜：核盘菌属(Sclerotinia)
蓝莓：链核盘菌属(Monilinia)、核盘菌属(Sclerotinia)、葡萄孢属(Botrytis)和拟茎点霉属(Phomopsis)
草莓：葡萄孢属(Botrytis)、拟茎点霉属(Phomopsis)和根霉属(Rhizopus)
树莓：葡萄孢属(Botrytis)
葡萄：葡萄孢属(Botrytis)、拟茎点霉属(Phomopsis)
BVT Cr-7还可以(通过营养液)应用于温室水培植物的根，并观察到在胡椒、黄瓜和番茄中控制由腐霉属(Pythium)和镰刀菌属(Fusarium)引起的疾病。
将BVT Cr-7(作为喷雾)应用于草坪草、温室胡椒和温室番茄的叶子。观察到BVTCr-7能够控制草坪草中由核盘菌属(Sclerotinia)、Typhula和Microdochium引起的疾病、温室胡椒中由镰刀菌属(Fusarium)引起的疾病以及温室番茄中由葡萄孢属(Botrytis)引起的疾病。
BVT Cr-7用于处理草莓的田间试验
在安大略省进行了一项试验，其中将四群大黄蜂放置在四英亩有机草莓田的中央。每个蜜蜂群箱(“蜂房”)装备有分配器，以在蜜蜂离开蜂房时将BVT Cr-7的粉末制剂撒在蜜蜂上。从田间多于80％的草莓花中重新获得BVT Cr-7。相对于临近的未经处理的有机草莓田，BVT Cr-7蜜蜂媒介的田中果实腐病的水平格外的低。在这个试验中，BVT Cr-7抑制了>90％的葡萄孢霉(Botrytis)果腐病，100％的拟茎点霉(Phomopsis)果腐病以及93％的根霉(Rhizopus)腐烂病(“漏出”)。
BVT Cr-7用于处理向日葵的田间试验
在临近安大略省里普利的向日葵中通过大黄蜂进行了BVT Cr-7的田间媒介实验。在实验室分析中比较了来自处理田的收获种子以及来自该区域中对照田(没有大黄蜂或BVT Cr-7)的收获种子。来自蜜蜂媒介处理的种子的发芽率比对照种子的发芽率高27％(即，89.7％比70.7％)。BVT Cr-7处理同样降低了种子上几种不期望的霉(镰刀菌属(Fusarium)、葡萄孢属(Botrytis)和青霉属(Penicillium))的水平。
从蜂房到花，大黄蜂有力地媒介了BVT Cr-7至少360m。在大比例的向日葵头部的小花和种子中，BVT Cr-7有效地作为内生菌定植。在BVT Cr-7定殖的向日葵头上没有发现破坏性病原体核盘菌属(Sclerotinia)，而在蜜蜂媒介BVT Cr-7的范围以外的头部有20-25％存在该病原体。种植者报告，种子产量增加了多于20％(授粉加BVT Cr-7的影响)以及更好的品质，尤其是更大的种子尺寸(因此更多油)以及收获的种子上霉的减少。
BVT Cr-7用于处理蓝莓的田间试验
在爱德华王子岛中的试验证明，以粉末制剂或孢子水悬浮液的喷雾通过大黄蜂来使用BVT Cr-7能够在矮丛蓝莓的花、莓果和叶子中内生性地定植。该处理将健康莓果的比例增加了70-100％。BVT Cr-7有力地减少了僵果的发生率，僵果是一种当天气条件格外有利于该疾病时由真菌Monilinia vaccinii-corymbosi引起的主要蓝莓病。BVT Cr-7同样显著地减少了莓果变褐和早熟落果；我们发现莓果变褐和早熟落果是由于一种由核盘菌引起的、之前尚未被描述的疾病。在试验的一年中，在未处理的蓝莓中核盘菌病与僵果至少有相同的损害。适当定时地喷雾施用BVT Cr-7有效地抵抗了安大略省的低丛蓝莓和高丛蓝莓试验中的拟茎点霉属溃疡病。因此，BVT Cr-7是抵抗侵袭田间蓝莓的大部分疾病的广谱生物防治工具。
因此，粉红粘帚霉株BVT Cr-7能够控制多种农作物中的有主要经济重要性的广谱疾病。
实施例4：BVT Cr-7在控制条件中的性能
在一些具体农作物上检测BVT Cr-7以评估其作为生物防治剂的应用：
A.加拿大油菜幼苗：用BVT Cr-7处理的种子对灭菌土壤中的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)高侵犯株和田间土壤中的腐霉(Pythium)根腐病高侵犯株有非常强的抑制性。
B.收获的胡萝卜(根)：当与模拟储藏中的胡萝卜上的病原体共接种时，BVT Cr-7显著地抑制核盘菌(Sclerotinia)腐病。
C.西兰花头：用BVT Cr-7喷雾处理控制了储藏的西兰花头的链格孢属(Alternaria)、枝孢属(Cladosporium)和过早变色。
D.桃子：将BVT Cr-7以薄雾方式应用于新鲜的桃子上显著抑制了水果中褐腐病(念珠菌属(Monilia))的发生率和发展速度。
E.芒草(Miscanthus)：在储藏之前将芒草的根茎浸在BVT Cr-7的孢子悬浮液中，在冷藏期的几个月中提供了抵抗由根腐属(Pythium)、镰刀菌属(Fusarium)和丝核菌属(Rhizoctonia)引起的腐烂的保护性。
基于这些结果，BVT Cr-7已经论证了在多种不同条件下、在多种农作物中比粉红粘帚霉的其它株具有更宽的已证明的高性能的疾病抗性。
实施例5：使用BVT Cr-7处理温室番茄
评估用粉红粘帚霉BVT Cr-7处理的温室番茄的花和未处理的对照花上的粉红粘帚霉、灰葡萄孢菌和常规霉。
使用蜜蜂媒介、通过在群体箱(大黄蜂蜂房)装配接种物分配器以将接种物递送至番茄的花，从而将粉红粘帚霉BVT Cr-7递送至植物，所述番茄在位于加拿大新斯科舍的测试位置的相对小(小于四分之一英亩)的商业温室中。
实验室方法：
从测试位置、在良好的条件下获得番茄花的样品。每份样品包括四朵花，放在一个小塑料袋中。2014年6月20日，将每份样品的四朵花放在细菌培养皿中的百草枯-氯霉素琼脂(PCA)培养基上，并在干净的塑料箱中、在21-25℃下、在柔和的光照条件下培养7天。然后用显微镜评估每朵花的粉红粘帚霉、灰葡萄孢菌和常规霉。百草枯加速了植物组织的天然衰老，从而使得粉红粘帚霉生产孢子并因此鉴定。当这些组织衰老并死亡时，其它真菌同样可以在组织上生长并形成孢子。
结果
如在表1中所示的，在87.5％的处理花和0％的未处理花上观察到生物防治剂粉红粘帚霉BVT Cr-7形成孢子。粉红粘帚霉在处理花的雄蕊加雌蕊串上的孢子形成在几乎所有的情况中是密集且广泛的，使得圆锥体样的这些串显示出几乎全白色。在大部分处理花的花瓣上的孢子形成是中度到重度。
在12％的未处理花(在所有的情况下都是轻度)和0％的用粉红粘帚霉处理的花上发现病原体灰葡萄孢菌形成孢子。
观察到样品上有不同程度的常规温室霉。主要地，包括枝孢属(Cladosporium)(不是Fulvia fulvum)、曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的种、链格孢菌和类似于支顶孢属(Acremonium)的真菌。为提供粉红粘帚霉对这些霉的作用的定量信息，按表1中的1-5的比例评估了每朵花上的“霉”(即，非粉红粘帚霉或葡萄孢属(Botrytis)的任何真菌)，其中，1表示零痕迹的霉，5表示非常重的霉。在粉红粘帚霉已经定植并形成孢子的花中，这些霉形成孢子的花的范围非常小(平均比例1.80/5.00)，而在没有粉红粘帚霉的花(包括对照的所有花)中非常高(4.55/5.00)。因此观察到，除了葡萄孢属(Botrytis)以外，生物防治剂BVT Cr-7显著地抑制这些霉。实质上，相对于未处理的花，粉红粘帚霉处理的被覆盖的花显得非常“干净”。
Figure BDA0000986210940000161
表1：在温室中使用蜜蜂媒介传播BVT Cr-7的试验结果。*被一种或多种这些霉所覆盖的花的面积比例：1＝零痕迹；2＝轻度；3＝中等轻度；4＝中等重度；5＝非常重。
值得注意的，如通过已经在PCA上培养所述花一周之后所观察到的显著的孢子形成水平所判断的，使用蜜蜂媒介递送BVT Cr-7接种物使得生物防治剂在花中快速并彻底地内生性定植。
观察到粉红粘帚霉在“雄蕊加雌蕊”串中的出色定植，并且考虑到这些是病原体的主要入口，这是特别重要的。
观察到被粉红粘帚霉定殖的花中灰葡萄孢菌的可见的完全抑制以及多种温室霉的大部分抑制，表明BVT Cr-7针对其它真菌的广谱能力和活性(例如，通过竞争性排除)。
尽管已经参考目前被认为是优选的实施例来描述了本发明，应当理解，本申请不限于公开的实施例。相反，本发明计划涵盖包括在所附的权利要求书的精神和范围内的多种修饰和等价设置。
所有文献、专利、专利申请和生物保藏均通过引用的方式全文结合于此，达到如同每份单独的文献、专利、专利申请或生物保藏具体并单独地指明通过引用的方式全文结合于此一样的程度。
Figure BDA0000986210940000181
Figure BDA0000986210940000191

Claims (47)

1.一种粉红粘帚霉的分离培养物，其中，所述分离培养物是粉红粘帚霉株IDAC040913-01。
2.根据权利要求1所述的分离培养物，其中，所述分离培养物定殖植物成为内生菌。
3.根据权利要求1所述的分离培养物，其中，用所述分离培养物接触植物抑制或控制侵袭所述植物的叶子、花、果实和/或根的疾病或病原体。
4.根据权利要求3所述的分离培养物，其中，所述疾病是灰霉病、白霉病、褐腐病、根腐病和/或拟茎点霉属病。
5.根据权利要求3所述的分离培养物，其中，所述疾病是由灰葡萄孢菌、核盘菌引起和/或由腐霉属、丝核菌属和/或镰刀菌属的种引起。
6.从权利要求1-5任一项所述的粉红粘帚霉的分离培养物所获得的真菌孢子。
7.根据权利要求6所述的真菌孢子，其中，所述孢子通过在适于孢子形成的条件下、在基质上培养所述分离培养物而获得。
8.一种制剂，包含权利要求1-5任一项所述的分离培养物或根据权利要求6或7所述的真菌孢子。
9.根据权利要求8所述的制剂，进一步包含一种载体或稀释剂。
10.根据权利要求8或9所述的制剂，其中，所述制剂是液体形式或固体形式。
11.根据权利要求10所述的制剂，其中，所述制剂是固体形式且进一步包含稳定剂、吸湿剂、引诱剂、稀释剂和/或抗结剂中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的制剂，其中，所述稳定剂是粒状硅酸钙。
13.根据权利要求11所述的制剂，其中，所述吸湿剂包括干燥剂、硅胶微粒或硅胶珠、超吸收聚合物、聚丙烯酸钠、木刨花和/或粘土球。
14.根据权利要求11所述的制剂，其中，所述引诱剂包括矿物。
15.根据权利要求14所述的制剂，其中，所述矿物包括二氧化硅、氧化铝、钙、铁、镁、钾、钠、磷、钛、锰、锶、锆、锂、铷、硼、锌、钒、铬、铜、钇、镍、钴、镓、铯、钪、锡、钼和/或钙石灰石中的一种或多种。
16.根据权利要求11所述的制剂，其中，所述引诱剂包括DYNA-MINTM。
17.根据权利要求8或9所述的制剂，其中，每克制剂包含1×108至4×108个孢子。
18.一种用生物防治剂处理植物的方法，包括用权利要求1-16任一项所述的分离培养物、真菌孢子或制剂接触所述植物。
19.根据权利要求18所述的方法，用于改善植物的健康、生长和/或产量。
20.根据权利要求18所述的方法，用于预防或治疗植物中的疾病和/或病原体。
21.根据权利要求18所述的方法，用于控制植物上的霉的生长。
22.根据权利要求18所述的方法，用于改善植物种子的发芽。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述病原体是灰葡萄孢菌、核盘菌、腐霉属、链格孢属、念珠菌属、链核盘菌属、枝孢属、丝核菌属和/或镰刀菌属。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，所述疾病是灰霉病、白霉病、褐腐病、根腐病和/或拟茎点霉属病。
25.根据权利要求18-24任意一项所述的方法，其中，所述植物选自向日葵、加拿大油菜、蓝莓、草莓、葡萄、胡椒、黄瓜、番茄、草坪草、西兰花、桃子和/或芒草。
26.根据权利要求18-24任意一项所述的方法，其中，所述植物生长在温室中。
27.根据权利要求18-24任意一项所述的方法，其中，用分离培养物、真菌孢子或制剂接触植物包括将喷雾、薄雾、浸液或营养液施用于植物。
28.根据权利要求18-24任意一项所述的方法，其中，用分离培养物、真菌孢子或制剂接触植物包括昆虫媒介。
29.权利要求1-16任意一项所述的分离培养物、真菌孢子或制剂作为生物防治剂的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，用于改善植物的健康、生长和/或产量。
31.根据权利要求29所述的应用，用于治疗或预防植物中的疾病或病原体。
32.根据权利要求31所述的应用，其中所述病原体是灰葡萄孢菌、核盘菌、腐霉属、链格孢属、念珠菌属、链核盘菌属、枝孢属、丝核菌属和/或镰刀菌属。
33.根据权利要求31所述的应用，其中，所述疾病是灰霉病、白霉病、褐腐病、根腐病和/或拟茎点霉属病。
34.一种减少植物材料损耗的方法，所述方法包括用权利要求1-16任意一项所述的分离培养物、真菌孢子或制剂接触所述植物材料。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述植物材料是水果、蔬菜或谷物。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中，接触所述植物材料包括使用权利要求10所述的液体制剂的喷雾、薄雾或将所述植物材料浸渍在权利要求10所述的液体制剂中。
37.根据权利要求34或35所述的方法，其中，接触所述植物材料包括使用权利要求10或11所述的固体形式的制剂或使用权利要求10或11所述的固体形式的制剂的液体悬浮液。
38.根据权利要求34或35所述的方法，其中，所述植物材料已经收获。
39.一种生产生物防治剂的方法，所述方法包括：
用权利要求1的分离培养物接种基质；以及
在适于真菌生长的条件下培养所述基质以生产粉红粘帚霉株BVT Cr-7。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述适于真菌生长的条件包括大于95％的相对湿度和20-24℃范围的温度。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中，所述基质是灭菌基质。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述灭菌基质包含灭菌大麦种子。
43.根据权利要求39或40所述的方法，进一步包括在适于真菌形成孢子的条件下培养所述基质。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述适于真菌形成孢子的条件包括将相对湿度降低至低于50％。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述适于真菌形成孢子的条件包括将相对湿度降低至低于45％。
46.根据权利要求43所述的方法，进一步包括从基质转移孢子以生产接种物。
47.根据权利要求46所述的方法，包括将所述孢子与载体或稀释剂混合。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3044307B1 (en) 2013-09-11 2018-12-19 Bee Vectoring Technology Inc. Isolated strain of clonostachys rosea for use as a biological control agent
WO2017109802A1 (en) * 2015-12-24 2017-06-29 Bioagritest Srl Strains of clonostachys roseae (anam. gliocladium roseum) and their use in the limitation of the growth of pathogenic fungi and as plants growth promoters
EP3351106A1 (en) * 2017-01-19 2018-07-25 Danstar Ferment AG Post-harvest treatment method using clonostachys rosea
RU2644338C1 (ru) * 2017-05-18 2018-02-08 Общество с ограниченной ответственостью "ЭКОГЕН" Штамм микроорганизма Clonostachys rosea f. catenulata в качестве биофунгицида, стимулятора роста растений и продуцента метаболитов для сельскохозяйственного применения
CN111373027A (zh) 2017-09-20 2020-07-03 拜耳作物科学生物制品有限责任公司 改善真菌孢子的储存稳定性和适应性的方法
CA3087804A1 (en) * 2017-12-19 2019-06-27 Danstar Ferment Ag Bca control of stb
US20210127686A1 (en) 2018-06-15 2021-05-06 Bayer Aktiengesellschaft Liquid and storage-stable formulations for fungal spores
US20210176992A1 (en) 2018-07-03 2021-06-17 Bayer Aktiengesellschaft Fungicidally active combination of a clonostachys strain and an azole
AR117608A1 (es) 2018-07-10 2021-08-18 Bayer Cropscience Ag Vehículos fluidos para formulaciones líquidas de esporas fúngicas
MX2021000702A (es) 2018-07-20 2021-03-25 Bayer Ag Nuevos fluidos portadores para formulaciones liquidas de esporas fungicas.
AU2019343727A1 (en) 2018-09-19 2021-04-08 Danstar Ferment Ag Method for increasing storage stability of fungal spores
CN113163766A (zh) 2018-11-02 2021-07-23 日本农药株式会社 有害生物防除剂组合物及其使用方法
MX2021012479A (es) 2019-04-12 2021-11-12 Danstar Ferment Ag Metodos para aumentar la tasa de germinacion de esporas de hongos.
WO2020245154A1 (en) 2019-06-07 2020-12-10 Bayer Cropscience Biologics Gmbh Methods of increasing the germination rate of fungal spores
CN110558336A (zh) * 2019-07-19 2019-12-13 湖南科技学院 一种防治莴苣菌核病的生防制剂及其制备和使用方法
US20230212502A1 (en) 2020-05-28 2023-07-06 Danstar Ferment Ag Novel fermentation substrate for solid-state fermentation
BR112022024480A2 (pt) 2020-06-08 2022-12-27 Danstar Ferment Ag Preparação, composição, semente, método de produção de uma preparação, métodos para aumentar a taxa de germinação de esporos e para controlar fungos fitopatogênicos e usos de pelo menos um glicerofosfolipídio
CN112760230B (zh) * 2020-12-31 2022-11-11 天津开发区坤禾生物技术有限公司 粉红粘帚霉、粉红粘帚霉菌液及在防治向日葵菌核病害中的应用
CN115486309A (zh) * 2022-09-02 2022-12-20 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 利用丛枝菌根真菌促进玫瑰生长的方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI95598C (fi) * 1994-01-31 1996-02-26 Kemira Agro Oy Mikro-organismi kasvitautien biologiseen torjuntaan
WO2000018241A1 (en) * 1998-09-30 2000-04-06 Her Majesty The Queen In Right Of Agriculture Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Canada Gliocladium roseum strains useful for the control of fungal pathogens in plants
JP2005073586A (ja) 2003-09-01 2005-03-24 Shizuoka Prefecture 柑橘病害に対する防除能を有する新規なグリオクラディウム属菌及びそれを用いた生物防除方法
GB0407329D0 (en) * 2004-03-31 2004-05-05 Danisco Process
CN1281609C (zh) * 2005-03-16 2006-10-25 云南大学 一类具有毒杀松材线虫活性的化合物及其应用
US8101551B2 (en) 2006-03-22 2012-01-24 Adjuvants Plus Inc. Production and use of endophytes as novel inoculants for promoting enhanced plant vigor, health, growth, yield reducing environmental stress and for reducing dependency on chemical pesticides for pest control
WO2010108267A1 (en) * 2009-03-23 2010-09-30 Origro Inc. Fungal inoculant compositions
CN101643705B (zh) * 2009-09-11 2011-12-21 东北农业大学 一种抑制番茄灰霉病的粘帚霉菌菌株
GB201100427D0 (en) 2011-01-11 2011-02-23 Stichting Dienst Landbouwkundi Agents for biological control of bacterial plant pathogens
UA116760C2 (uk) 2011-04-07 2018-05-10 Біі Векторінг Течнолоґи Інк. Пристрій для обробки рослин
JP2015511590A (ja) 2012-03-12 2015-04-20 ビー ヴェクトリング テクノロジー インコーポレイテッドＢｅｅ Ｖｅｃｔｏｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． 植物の処理のための、粒子状ケイ酸カルシウムおよびクロノスタキス・ロセア（ｃｌｏｎｏｓｔａｃｈｙｓｒｏｓｅａ）を含む配合物
US9526233B2 (en) 2013-02-01 2016-12-27 Bee Vectoring Technology Inc. Apparatus for treatment of plants
EP3044307B1 (en) 2013-09-11 2018-12-19 Bee Vectoring Technology Inc. Isolated strain of clonostachys rosea for use as a biological control agent

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