JP2015534457A - 抗真菌、抗細菌および成長促進活性を有するバチルス種（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）菌株 - Google Patents
抗真菌、抗細菌および成長促進活性を有するバチルス種（ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本明細書で開示するのは、殺有害生物剤活性を有する代謝産物を生成するバチルス（Bacillus）菌株、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７である。有害生物を防除することができるバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物に由来する生体活性組成物および代謝産物、ならびに有害生物を防除するための菌株およびその代謝産物の使用法も提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／６８３，１７４号、および２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８３５，６７７号の優先権を主張するものであり、それらの開示は全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本出願は、２０１２年８月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／６８３，１７４号、および２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８３５，６７７号の優先権を主張するものであり、それらの開示は全ての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本開示は、バイオ殺有害生物剤および有害生物防除、特に微生物殺有害生物剤およびそれらを生成する微生物菌株の分野にある。
天然産物は、微生物、植物、および他の生物によって生成される物質である。微生物天然産物は多量の化学的多様性の源をもたらし、医薬品目的での天然産物の利用には長い歴史がある。ヒト治療のための天然産物が強調され、５０％を超えるものが天然産物に由来するにもかかわらず、天然源に由来する殺有害生物剤はわずか１１％である。それにもかかわらず、天然産物の殺有害生物剤には、従来型と有機農場の両方で有害生物を防除する際に重要な役割を果たす可能性がある。微生物（細菌、放線菌および真菌）によって生成される二次代謝産物は新規な化学化合物となり、これらを単独または既知の化合物と組み合わせて使用し、昆虫有害生物を効率よく防除し耐性発達に関するリスクを低減することができる。農業用殺虫剤として成功している微生物天然産物の幾つかのよく知られている例がある（Thompsonら、2000年、Arenaら、1995年、Kriegら、1983年）。
微生物殺有害生物剤の開発は、純粋培養における微生物の単離で始まる。次いでそれは、温室内および野外でのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはパイロットスケール試験を使用した有効性およびスペクトルスクリーニングと共に進行する。同時に、微生物によって生成される活性化合物を単離し同定する。微生物殺有害生物剤を商品化するため、微生物は産業規模での発酵生産により経済的に生産され、承認済みの生体適合性添加剤で製剤化して有効性を増大し、利用しやすさを最大にしなければならない。
化学的殺有害生物剤に対する高い耐性の発達と共に、利用可能な殺有害生物剤のスペクトルは狭くなる。さらに、非天然殺有害生物剤は有害な環境的影響を有し得る。したがって、それに対する植物病原体の耐性が発達しておらず最小の環境的影響を有する、新たな天然殺有害生物剤が必要とされる。
本明細書で開示するのは、殺有害生物剤活性を有する微生物菌株、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７である。この菌株は、有害生物の防除および植物成長の促進において活性がある生体活性代謝産物を生成する。有害生物の防除および植物成長の促進のための、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７およびその代謝産物の使用法も開示する。特定の実施形態では、このバチルス種（Bacillus sp.）はＮＲＲＬ Ｂ−５０７６８の少なくとも１つの識別特徴（identifying characteristics）を有し得る。
さらに、このバチルス種（Bacillus sp.）は、配列番号３で示されるコンセンサス配列と少なくとも９９％の同一性、特に９９．５％の同一性を有し、配列番号１で示される配列と少なくとも９９％の同一性、特に９９．５％の同一性を有するフォワード配列、および配列番号２で示される配列と少なくとも９９％の同一性、特に９９．５％の同一性を有するリバース配列を含む１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列を有し得る。
前記菌株、または細胞分画、抽出物、前記菌株またはその抽出物に由来する上清および／または物質もしくは化合物を含む実質的に純粋な培養物または全細胞ブロスをさらに提供する。
植物における有害生物侵入を調節するための方法であって、前記有害生物侵入を調節するのに有効な量の前記バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７（および／または培養物、細胞分画、抽出物、前記菌株または抽出物に由来する上清および／または物質もしくは化合物）を、植物および／またはその種子および／または前記植物の成長に使用する基質に施用することを含む方法をさらに提供する。特定の実施形態では、有害生物は、例えばブレミア（Bremia）、ボトリチス（Botrytis）、スクレロティニア（Sclerotinia）、スフェロテカ（Sphaerotheca）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、コレトトリカム（Colletotrichum）、フザリウム（Fusarium）、ベルチシリウム（Verticillium）、フィトフトラ（Phytophthora）、またはビポラリス（Bipolaris）などの植物真菌である。他の実施形態では、有害生物は、例えばエルウィニア（Erwinia）、シュードモナス（Pseudomonas）、キサントモナス（Xanthomonas）、アシドボラックス（Acidovorax）またはクラビバクター（Clavibacter）などの細菌である。
植物の成長および／または種子の発芽を促進するための方法であって、植物の成長および／または種子の発芽を促進するのに有効な量の前記バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７（および／または培養物、細胞分画、抽出物、前記菌株または抽出物に由来する上清および／または物質もしくは化合物）を、植物および／またはその種子および／または前記植物の成長に使用する基質に施用することを含む方法も提供する。
特定の実施形態では、前記バチルス（Bacillus）は、
（ａ）（ｉ）バチルス種（Bacillus sp.）、特にバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７から入手可能であり、
（ｉｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０２０〜１０６０、より詳細には１０４４の分子量を有し、
（ｉｖ）δ７．１５、６．７２、４．８１、４．７０、４．６５、４．４０、４．３５、４．２５、４．１５、３．８５、３．６５、３．５０、３．２２、２．８５、２．８０、２．６５、２．４５、２．３５、２．３０、２．２０、１．９５、１．５５、１．３１、１．２０および０．８５の１ＨＮＭＲ値を有し、
（ｖ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）１００Ａ、１００×４．６０ｍｍ）カラムで約６〜１２分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．３１分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｖｉ）４７個の炭素原子、７２個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含有し、
（ｖｉｉ）場合によってはペプチドであり、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含み得る化合物「Ａ」、
（ｂ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０３０〜１０８０、より詳細には１０５８の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．６７分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）４８個の炭素原子、７４個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含み、
（ｖ）場合によってはペプチドであり、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含み得る化合物「Ｂ」、および
（ｃ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０５０〜１１２０、より詳細には１０７２の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約９分間、さらにより具体的には約９．１９分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）４９個の炭素原子、７６個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含有し、
（ｖ）場合によってはペプチドであり、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含み得る化合物「Ｃ」
からなる群から選択される化合物を生成する。
（ａ）（ｉ）バチルス種（Bacillus sp.）、特にバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７から入手可能であり、
（ｉｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０２０〜１０６０、より詳細には１０４４の分子量を有し、
（ｉｖ）δ７．１５、６．７２、４．８１、４．７０、４．６５、４．４０、４．３５、４．２５、４．１５、３．８５、３．６５、３．５０、３．２２、２．８５、２．８０、２．６５、２．４５、２．３５、２．３０、２．２０、１．９５、１．５５、１．３１、１．２０および０．８５の１ＨＮＭＲ値を有し、
（ｖ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）１００Ａ、１００×４．６０ｍｍ）カラムで約６〜１２分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．３１分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｖｉ）４７個の炭素原子、７２個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含有し、
（ｖｉｉ）場合によってはペプチドであり、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含み得る化合物「Ａ」、
（ｂ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０３０〜１０８０、より詳細には１０５８の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．６７分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）４８個の炭素原子、７４個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含み、
（ｖ）場合によってはペプチドであり、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含み得る化合物「Ｂ」、および
（ｃ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０５０〜１１２０、より詳細には１０７２の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約９分間、さらにより具体的には約９．１９分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）４９個の炭素原子、７６個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含有し、
（ｖ）場合によってはペプチドであり、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含み得る化合物「Ｃ」
からなる群から選択される化合物を生成する。
以下の特徴：
（ａ）（１）配列番号３で示される１６ＳｒＲＲＮＡ配列と少なくとも９９．５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（２）配列番号１０で示されるｒｅｃＡ配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、および
（３）配列番号１３で示される逆ｐｈｏＲ配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つ、
（ｂ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０２０〜１１２０の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１５分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）場合によってはペプチドである１つまたは複数の化合物を生成すること、
（ｃ）カナマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ペニシリン、セフロキシム、ピペラシリン、テトラサイクリンに耐性があること、および
（ｄ）アルカリホスファターゼ、エステラーゼ、酸性ホスファターゼ、およびナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホヒドロラーゼ活性を有すること
を有するバチルス（Bacillus）菌株も本明細書において提供する。
（ａ）（１）配列番号３で示される１６ＳｒＲＲＮＡ配列と少なくとも９９．５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（２）配列番号１０で示されるｒｅｃＡ配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、および
（３）配列番号１３で示される逆ｐｈｏＲ配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つ、
（ｂ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０２０〜１１２０の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１５分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）場合によってはペプチドである１つまたは複数の化合物を生成すること、
（ｃ）カナマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ペニシリン、セフロキシム、ピペラシリン、テトラサイクリンに耐性があること、および
（ｄ）アルカリホスファターゼ、エステラーゼ、酸性ホスファターゼ、およびナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホヒドロラーゼ活性を有すること
を有するバチルス（Bacillus）菌株も本明細書において提供する。
前記バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７、実質的に純粋な培養物、細胞分画、抽出物、前記菌株またはその抽出物に由来する上清および物質、代謝産物または化合物と、（ａ）化学的または生物学的殺有害生物剤であり得る第２の物質、および（ｂ）少なくとも１つの担体、希釈剤、表面活性物質、アジュバントの少なくとも１つを含む組合せも提供する。組合せは組成物であってよく、種子にコーティングすることができる。
植物における有害生物侵入を調節するための方法であって、前記有害生物侵入を調節するのに有効な量の組合せを、植物および／またはその種子および／または前記植物の成長に使用する基質に施用することを含む方法をさらに提供する。特定の実施形態では、有害生物は、例えばブレミア（Bremia）、ボトリチス（Botrytis）、スクレロティニア（Sclerotinia）、スフェロテカ（Sphaerotheca）、リゾクトニア（Rhizoctonia）、コレトトリカム（Colletotrichum）、フザリウム（Fusarium）、ベルチシリウム（Verticillium）、フィトフトラ（Phytophthora）、またはビポラリス（Bipolaris）などの植物真菌である。他の実施形態では、有害生物は、例えばエルウィニア（Erwinia）、シュードモナス（Pseudomonas）、キサントモナス（Xanthomonas）、アシドボラックス（Acidovorax）またはクラビバクター（Clavibacter）などの細菌である。
場合によっては１つまたは複数の第２の物質と組み合わせた殺有害生物剤組成物を製剤化するための組成物の使用であって、組成物が
（ａ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の実質的に純粋な培養物、
（ｂ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物の細胞分画、
（ｃ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物から得られる上清、
（ｄ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物から得られる濾過物、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの抽出物、
（ｆ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物によって生成する代謝産物、
（ｇ）化合物Ａ、
（ｈ）化合物Ｂ、および
（ｉ）化合物Ｃ
の１つまたは複数からなる群から選択され、
第２の物質が
（ａ）殺有害生物剤、
（ｂ）植物成長促進剤、
（ｃ）担体、
（ｄ）アジュバント、
（ｅ）表面活性物質、
（ｆ）化学肥料、および
（ｇ）抗植物病原体物質
からなる群から選択される使用をさらに提供する。
（ａ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の実質的に純粋な培養物、
（ｂ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物の細胞分画、
（ｃ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物から得られる上清、
（ｄ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物から得られる濾過物、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの抽出物、
（ｆ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物によって生成する代謝産物、
（ｇ）化合物Ａ、
（ｈ）化合物Ｂ、および
（ｉ）化合物Ｃ
の１つまたは複数からなる群から選択され、
第２の物質が
（ａ）殺有害生物剤、
（ｂ）植物成長促進剤、
（ｃ）担体、
（ｄ）アジュバント、
（ｅ）表面活性物質、
（ｆ）化学肥料、および
（ｇ）抗植物病原体物質
からなる群から選択される使用をさらに提供する。
本明細書で開示する組成物および方法は様々な変更形態および代替形が可能であるが、例示的な実施形態を本明細書中に詳細に記載する。しかしながら、開示する特定の形に本発明を限定することを意図するものではなく、これに反して、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲内にある全ての変更形態、均等物、および代替を含むことを意図するものであることを理解されたい。
一定範囲の値を与える場合、その範囲の上限と下限の間、文脈が明らかに他のことを示さない限りは下限単位の１／１０まで、それぞれの介在値および任意の他の言及またはその言及する範囲内の介在値がその中に含まれることは理解される。さらに狭い範囲も含まれる。言及する範囲内で具体的に除外される任意の限界があれば、これらのさらに狭い範囲の上限と下限もその中に含まれる。
他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または均等の任意の方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することもできるが、好ましい方法および材料をここで記載する。
文脈が明らかに他のことを示さない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は複数形の言及を含むことを記さなければならない。
本明細書で定義する「〜に由来する」は、特定供給源から直接単離もしくは入手すること、または代替的に特定供給源から単離もしくは入手した物質または生物の識別特徴を有することを意味する。「供給源」が生物である場合、「〜に由来する」は、生物自体または前記生物を培養もしくは増殖するために使用する培地から単離もしくは入手可能であることを意味する。
本明細書で定義する用語「全ブロス培養物」および「全細胞ブロス」は、細胞と培地の両方を含有する液体培養物を指す。細菌をプレート上で増殖させる場合、細胞を水または他の液体中に採取して全ブロス培養物を得ることができる。
用語「上清」は、ブロス中で増殖させた細胞または寒天プレートから別の液体中に採取した細胞を、遠心分離、濾過、沈降、または当技術分野でよく知られている他の手段により除去したとき、残存する液体を指す。
本明細書で定義する「濾過物」は、膜を通過させた全ブロス培養物由来の液体を指す。
本明細書で定義する「抽出物」は、溶媒（水、界面活性剤、バッファー）により細胞から除去し遠心分離、濾過または他の方法により細胞から分離した液体物質を指す。
本明細書で定義する「代謝産物」は、殺有害生物剤活性、特に殺細菌もしくは殺真菌活性を有する、微生物の発酵生産の化合物、物質もしくは副産物、または微生物から得た上清、濾過物、もしくは抽出物を指す。本明細書で定義する「単離化合物」は、それだけには限られないが、クロマトグラフィーおよび電気泳動法を含めた分析法により測定して、他の化合物または物質をほぼ含まない、例えば少なくとも約２０％純粋である、好ましくは少なくとも約４０％純粋である、より好ましくは約６０％純粋である、さらにより好ましくは約８０％純粋である、最も好ましくは約９０％純粋である、さらに最も好ましくは約９５％純粋である。用語「代謝産物」と「化合物」は交互に使用することができる。
本明細書で定義する「担体」は、活性成分と混合または製剤化して処置する植物もしくは他の対象へのその施用を容易にする、またはその保存、輸送および／または処理を容易にする、不活性、有機または無機材料である。
本明細書で定義する用語「調節」は、有害生物侵入の量または有害生物侵入の蔓延率を変えることを意味するために使用する。
本明細書で定義する用語「有害生物侵入」は、宿主集団における疾患もしくは感染または成長系における望ましくない雑草の出現を含めた、有害な影響を引き起こす量の有害生物の存在のことである。
本明細書で定義する「殺有害生物剤」は、植物有害生物の死亡率を高めるかまたは増殖率を抑制する、生物製剤、または化学物質に由来する物質であり、それだけには限られないが、殺線虫剤、殺虫剤、植物用殺真菌剤、植物用殺菌剤、および植物用殺ウイルス剤を含む。
バチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７の同定および特徴付け
バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７は、１６ＳｒＲＮＡ配列決定、脂肪酸分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質分析、および幾つかの生化学的アッセイを使用した特徴付けを組み合わせた多相手法を使用して、バチルス種（Bacillus）の新規な菌株として同定した。以下の実施例１〜４を参照。
バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７は、１６ＳｒＲＮＡ配列決定、脂肪酸分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質分析、および幾つかの生化学的アッセイを使用した特徴付けを組み合わせた多相手法を使用して、バチルス種（Bacillus）の新規な菌株として同定した。以下の実施例１〜４を参照。
バチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７の発酵生産によって生じた代謝産物を単離し特徴付けした。以下の実施例５、２５および２６を参照。これらの代謝産物の幾つかは、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方で真菌および細菌病原体に対して活性を示した。以下の実施例６〜１７、２０、２２、２３および２７〜２９を参照。バチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７およびその代謝産物由来の植物成長促進効果も幾つかの植物で観察している。以下の実施例１８および１９、および２１、２４を参照。
したがって、バチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７および／またはその代謝産物は、農業において真菌および細菌疾患を防除するため、ならびに植物の成長を促進するための天然産物として使用することができる。
生成の方法
前述のように、化合物または代謝産物は、バチルス（Bacillus）Ｆ７２７菌株の１つまたは複数の識別特徴を有する生物から得ることができる、入手可能である、またはそれに由来し得る。その方法は、これらの生物を培養すること、およびこれらの生物の培養物からこれらの化合物を単離することにより、本発明の化合物および／または組成物を得ることを含む。
前述のように、化合物または代謝産物は、バチルス（Bacillus）Ｆ７２７菌株の１つまたは複数の識別特徴を有する生物から得ることができる、入手可能である、またはそれに由来し得る。その方法は、これらの生物を培養すること、およびこれらの生物の培養物からこれらの化合物を単離することにより、本発明の化合物および／または組成物を得ることを含む。
特に、当技術分野で知られている方法を使用して、栄養培地中で生物を培養する。振とうフラスコ培養、適切な培地および細胞増殖を可能にする条件下で実施する、研究室もしくは工業用発酵槽における（それだけには限られないが、連続、回分、流加、または固体状発酵を含めた）小規模または大規模発酵によって、生物を培養することができる。培養は、当技術分野で知られている手順を使用して、炭素および窒素源、ならびに無機塩を含む適切な栄養培地で実施することができる。適切な培地は市販の供給源から入手可能であり、または公開済みの組成に従い調製することができる。
培養後、前記バチルス（Bacillus）菌株（例えばバチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７）の、またはそれらに由来する上清、濾過物および／または抽出物を殺有害生物剤組成物の製剤化において使用することができる。
あるいは培養後、化合物および／または代謝産物を培養ブロスから抽出、濃縮および／または精製することができる。
抽出物はクロマトグラフィーによって分画化することができる。クロマトグラフィー分画は、当技術分野で知られている方法を使用して、例えば、真菌（例えば、ボトリチス（Botrytis）、スクレロティニア（Sclerotinia）、リゾクトニア（Rhizoctonia）およびビポラリス（Bipolaris））に対する毒性活性に関してアッセイすることができる。同じまたは異なるクロマトグラフィー法を使用して、分画化を１回または複数回繰り返すことができる。
一実施形態では、菌株Ｆ７２７によって生成される組成物は、（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して１０２０〜１１２０の分子量を有し、（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで６〜１５分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、（ｉｖ）場合によってはバチルス（Bacillus）種から入手可能である１つまたは複数の化合物を含む。一実施形態では、化合物はペプチドである。
具体的実施形態では、化合物「Ａ」は、（ｉ）バチルス（Bacillus）種から入手可能であり、（ｉｉ）有害生物に対して毒性があり、（ｉｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０２０〜１０６０、より詳細には１０４４の分子量を有し、（ｉｖ）δ７．１５、６．７２、４．８１、４．７０、４．６５、４．４０、４．３５、４．２５、４．１５、３．８５、３．６５、３．５０、３．２２、２．８５、２．８０、２．６５、２．４５、２．３５、２．３０、２．２０、１．９５、１．５５、１．３１、１．２０、０．８５の１ＨＮＭＲ値を有し、（ｖ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）１００Ａ、１００×４．６０ｍｍ）カラムで約６〜１２分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．３１分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有する。さらに化合物「Ａ」は、１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲおよびＭＳ分析により測定して、４７炭素、７２水素、１２窒素、および１５酸素のシグナルを明らかにする。１ＨＮＭＲスペクトルは典型的なペプチドの特徴を示す。１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ＭＳ／ＭＳによる化合物「Ａ」の詳細な分析およびアミノ酸分析によって、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）の存在が明らかになった。
別の特定の実施形態では、菌株Ｆ７２７によって生成される化合物は、（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０３０〜１０８０、より詳細には１０５８の分子量を有し、（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．６７分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有する化合物「Ｂ」である。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルからのデータ、ならびにＭＳデータによって、４８炭素、７４水素、１２窒素、および１５酸素のシグナルが明らかである。１ＨＮＭＲスペクトルは典型的なペプチドの特徴を示す。１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ＭＳ／ＭＳによる化合物「Ｂ」の詳細な分析およびアミノ酸分析によって、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）の存在が明らかになった。
さらに別の特定の実施形態では、菌株Ｆ７２７によって生成される化合物は、（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０５０〜１１２０、より詳細には１０７２の分子量を有し、（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約９分間、さらにより具体的には約９．１９分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有する化合物「Ｃ」である。１Ｈおよび１３ＣＮＭＲスペクトルからのデータ、ならびにＭＳデータによって、４９炭素、７６水素、１２窒素、および１５酸素のシグナルが明らかである。１ＨＮＭＲスペクトルは典型的なペプチドの特徴を示す。１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ＭＳ／ＭＳによる化合物「Ｃ」の詳細な分析およびアミノ酸分析によって、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）の存在が明らかになった。
組成物
組成物は、バチルス種（Bacillus sp.）菌株、具体的にはバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の少なくとも１つの識別特徴を有するバチルス種（Bacillus sp.）菌株の、またはそれに由来する全ブロス培養物、全細胞ブロス、液体培養物、または懸濁液、ならびに前記バチルス種（Bacillus sp.）から得られる上清、濾過物または抽出物を含み得る。組成物は、特に殺細菌、殺真菌および／または植物成長促進活性を有する、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７由来の１つまたは複数の代謝産物または単離化合物も含み得る。
組成物は、バチルス種（Bacillus sp.）菌株、具体的にはバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の少なくとも１つの識別特徴を有するバチルス種（Bacillus sp.）菌株の、またはそれに由来する全ブロス培養物、全細胞ブロス、液体培養物、または懸濁液、ならびに前記バチルス種（Bacillus sp.）から得られる上清、濾過物または抽出物を含み得る。組成物は、特に殺細菌、殺真菌および／または植物成長促進活性を有する、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７由来の１つまたは複数の代謝産物または単離化合物も含み得る。
前述の組成物は任意の形式で製剤化することができる。例示的な製剤には、それだけには限られないが、乳化濃縮物（ＥＣ）、湿潤性粉末（ＷＰ）、可溶液剤（ＳＬ）、エアロゾル、超微量濃縮溶液（ＵＬＶ）、可溶性粉末（ＳＰ）、マイクロエンキャプスレート、水中分散顆粒、流動剤（ＦＬ）、マイクロエマルジョン（ＭＥ）、ナノエマルジョン（ＮＥ）などがある。本明細書に記載する任意の製剤において、活性成分の割合は０．０１％〜９９．９９％の範囲内である。
組成物は液体、ゲルまたは固体の形であってよい。固体組成物は、活性成分の溶液に固体担体を懸濁させ、室温での蒸発または６５℃以下での真空蒸発などの適切な条件下で、懸濁液を乾燥させることによって調製することができる。
組成物はゲル封入活性成分を含み得る。このようなゲル封入物質は、ゲル形成物質（例えばゼラチン、セルロース、またはリグニン）と、生存もしくは不活性化バチルス種（Bacillus sp.）菌株Ｆ７２７細胞の培養物もしくは懸濁液、またはバチルス種（Bacillus sp.）菌株Ｆ７２７の培養物もしくは懸濁液の無細胞濾過物もしくは細胞分画、またはバチルス種（Bacillus sp.）菌株Ｆ７２７の噴霧もしくは凍結乾燥培養物、細胞、もしくは細胞分画、または本発明の方法中で使用する殺有害生物剤組成物の溶液を混合すること、および作用物質のゲル形成を誘導することによって調製することができる。
組成物は、活性成分の乳化、分散、湿潤、拡散、同化、崩壊調節、安定化、流動性または錆抑制の改善の目的で使用する表面活性物質を追加的に含み得る。特定の実施形態では、表面活性物質は、好ましくはＥＰＡ Ｌｉｓｔ４Ｂに属する非植物毒性非イオン性表面活性物質である。別の特定の実施形態では、非イオン性表面活性物質はポリオキシエチレン（２０）モノラウレートである。表面活性物質の濃度は製剤全体の０．１〜３５％の間の範囲であってよく、好ましい範囲は５〜２５％である。非イオン性、アニオン性、両性およびカチオン性分散剤と乳化剤などの分散剤と乳化剤、ならびに利用する量の選択は、組成物の性質、および組成物の分散を容易にする作用物質の能力によって決まる。
前述の組成物は、別の作用物質、微生物および／または殺有害生物剤（例えば、殺線虫剤、殺菌剤、殺真菌剤、ダニ駆除剤、殺虫剤）と組み合わせることができる。微生物には、それだけには限られないが、バチルス種（Bacillus sp.）（例えば、バチルスフィルムス（Bacillus firmus）、バチルスチューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルスプミルス（Bacillus pumilus）、バチルスリケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルスアミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルスサブチリス（Bacillus subtilis））、ペシロマイセス種（Paecilomyces sp.）（ペシロマイセスリラシヌス（P.lilacinus））、パスツリア種（Pasteuria sp.）（パスツリアペネトランス（P.penetrans））、クロモバクテリウム種（Chromobacterium sp.）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）、ブレビバシラス種（Brevibacillus sp.）、レカニシリウム種（Lecanicillium sp.）、アンペロマイセス種（Ampelomyces sp.）、シュードザイマ種（Pseudozyma sp.）、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp）（ストレプトマイセスビキニエンシス（S.bikiniensis）、ストレプトマイセスコスタリカヌス（S.costaricanus）、ストレプトマイセスアベルミチリス（S.avermitilis））、バークホルデリア種（Burkholderia sp.）、トリコデルマ種（Trichoderma sp.）、グリオクラジウム種（Gliocladium sp.）、アベルメクチン（avermectin）、ミロテシウム種（Myrothecium sp.）、ペシロマイセス種（Paecilomyces spp.）、スフィンゴバクテリウム種（Sphingobacterium sp.）、アルスロボトリス種（Arthrobotrys sp.）、クロロスプロニウム（Chlorosplrnium）、ネオブルガリア（Neobulgaria）、ダルジニア（Daldinia）、アスペルギルス（Aspergillus）、ケトミウム（Chaetomium）、リゾバクター種（Lysobacter spp.）、ラチナムパピラセウム（Lachnum papyraceum）、ベルチシリウムスクラスポリウム（Verticillium suchlasporium）、アルトロボトリスオリゴスポラ（Arthrobotrys oligospora）、ベルチシリウムクラミドスポリウム（Verticillium chlamydosporium）、ヒルステラロシリエンシス（Hirsutella rhossiliensis）、ポコニアクラミドスポリア（Pochonia chlamydosporia）、プレウロタスオストレアタス（Pleurotus ostreatus）、オムファロータスオレアリウス（Omphalotus olearius）、ランプテロマイセスジャポニカ（Lampteromyces japonicas）、ブレブジモナス種（Brevudimonas sp.）、ムスコドル種（Muscodor sp.）がある。
作用物質は、殺線虫剤、殺真菌剤、殺菌剤および／または殺虫剤活性を有する天然油または油産物であってよい（例えば、パラフィン油、茶木油、レモングラス油、丁子油、シナモン油、柑橘油、ローズマリー油、除虫菊油、柑橘油（それだけには限られないが、ビターオレンジ油、オレンジ油、およびレモン油を含む）、ローズマリー油、オールスパイス、ベルガモット、ブルーガム、カモミール、シトロネラ、コモンジャスミン、セイヨウネズ、コモンラベンダー、コモンミルラ、野生ミント、フリージア、グレーサントリナ、ハーブヒソップ、ホーリーバジル、オニヒバ、ジャスミン、ラベンダー、マリーゴールド、ミント、ペパーミント、キンセンカ、スペアミント、イランイラン香油、サポニン）。
さらに、殺有害生物剤は、それだけには限られないが、ベンズイミダゾール、脱メチル化阻害剤（ＤＭＩ）（例えば、イミダゾール、ピペラジン、ピリミジン、トリアゾール）、モルホリン、ヒドロキシピリミジン、アニリノピリミジン、ホスホロチオレート、キノンアウトサイドインヒビター、キノリン、ジカルボキシイミド、カルボキシイミド、フェニルアミド、アニリノピリミジン、フェニルピロール、芳香族炭化水素、桂皮酸、ヒドロキシアニリド、抗生物質、ポリオキシン、アシルアミン、フタルイミド、ベンゼノイド（キシリルアラニン）、イミダゾール、ピペラジン、ピリミジンおよびトリアゾール（例えば、ビテルタノール、マイクロブタニル、ペンコナゾール、プロピコナゾール、トリアジメホン、ブロムコナゾール、シプロコナゾール、ジニコナゾール、フェンブコナゾール、ヘキサコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール）からなる群から選択される脱メチル化阻害剤、マイクロブタニル、およびキノンアウトサイドインヒビター（例えばストロビルリン）を含み得る一部位作用抗真菌剤であってよい。ストロビルリンは、それだけには限られないが、アゾキシストロビン、クレゾキシム−メトイルまたはトリフロキシストロビンを含み得る。さらに別の特定の実施形態では、抗真菌剤はキノン、例えばキノキシフェン（５，７−ジクロロ−４−キノリル４−フルオロフェニルエーテル）である。抗真菌剤はレイノウトリア（Reynoutria）抽出物由来であってもよい。
殺真菌剤は、クロロニトリル、キノキサリン、スルファミド、ホスホネート、ホスファイト、ジチオカルバメート、クロラルキチオス（chloralkythios）、フェニルピリジン−アミンおよびシアノ−アセトアミドオキシムからなる群から選択される多部位作用非無機化学物質殺真菌剤であってもよい。
前述のように、組成物は殺線虫剤をさらに含み得る。殺線虫剤は、それだけには限られないが、オルガノホスフェート、カルバメート、および燻煙剤などの化学物質、およびアベルメクチン（avermectin）、ミロテシウム種（Myrothecium sp.）、バイオーム（Biome）（バチルスフィルムス（Bacillus firmus））、パスツリア種（Pasteuria spp.）、ペシロマイセス（Paecilomyces）などの微生物産物、ならびにサポニンおよび植物油などの有機産物を含み得る。
当技術分野で知られている方法を使用して、組成物を施用することができる。具体的には、これらの組成物を植物または植物の一部分周辺に施用する。植物は、本発明の文脈で意味する所望および望ましくない野生植物または（天然穀類植物を含めた）穀類植物などの植物全体および植物集団として理解される。穀類植物は、植物品種改良者の権利によって保護されるかまたは保護されないトランスジェニック植物および植物栽培品種を含めた、従来の植物品種改良法および最適化法、またはバイオテクノロジーおよび遺伝子操作法、またはこれらの方法の組合せによって入手可能である植物であってよい。植物の一部分は、苗条、葉、花および根などの、地上と地下の植物の全ての部分および器官を意味すると理解され、言及することができる例は葉、針状葉、柄、茎、花、子実体、子実、種子、根、塊茎、根茎である。植物の一部分は、採取した物質、ならびに植物性および生殖繁殖物質、例えば断片、塊茎、根茎、側枝および種子も含む。
前述の組成物を用いた植物および植物の一部分の処理は直接、または例えば浸漬、スプレー、蒸発、噴霧、散乱、塗布、もしくは注入によって、植物の周辺、生息もしくは保存空間において組成物を作用させることにより実施することができる。
本明細書で開示する組成物は、当技術分野で知られている方法を使用して土壌に施用することもできる。これらは、それだけには限られないが、（ａ）点滴灌漑または化学溶液灌漑、（ｂ）土壌への取り込み、（ｃ）土壌浸透、（ｄ）種子の処理と手入れ、および（ｅ）裸根の浸漬を含む。
種子の処理
種子の処理は、場合によっては他の生体活性、アンタゴニストまたは共生物質と組み合わせた、種まき前の種子表面への、本明細書で開示する組成物の施用を含む。本明細書で開示する殺有害生物剤毒素、タンパク質、および／または化合物は、乾燥粉末、スラリー粉末として種子に施用することができ、または植え付け前に種子に噴霧することができる。
種子の処理は、場合によっては他の生体活性、アンタゴニストまたは共生物質と組み合わせた、種まき前の種子表面への、本明細書で開示する組成物の施用を含む。本明細書で開示する殺有害生物剤毒素、タンパク質、および／または化合物は、乾燥粉末、スラリー粉末として種子に施用することができ、または植え付け前に種子に噴霧することができる。
本明細書で開示する組成物は、以下のいずれかの形式で種子の処理用に製剤化することができる。乾燥粉末、水溶性スラリー粉末、可溶液剤、流動性濃縮物またはエマルジョン、エマルジョン、マイクロカプセル、ゲルまたは水中分散顆粒。
乾燥粉末の場合、湿潤性粉末と同様に、ただし湿潤剤の代わりに、鉱油などの粘着物質の添加によって活性成分を製剤化する。例えば、（１２時間滅菌した）１ｋｇの精製タルク粉末、１５ｇの炭酸カルシウム、および１０ｇのカルボキシメチルセルロースを、Nandakumarら(2001)により記載された方法に従い無菌条件下で混合する。活性成分は１：２．５の比で混合し（懸濁液から乾燥混合物へ）、生成物は陰干しして２０〜３５％まで含水率を低下させる。
本明細書で開示する組成物を種子に施用する実施形態では、それだけには限られないが、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、キトサン、カルボキシメチルキトサン、ピートモス、樹脂およびワックスを含めた１つまたは複数の種子コーティング剤を使用して、種子の植え付け前に１つまたは複数のコーティングとして組成物を施用することができる。当技術分野で知られている方法を使用して、一部位作用、多部位作用または未知の作用形式で、例えば化学的殺真菌剤または殺菌剤と組み合わせて、種子に組成物を施用することもできる。
別の実施形態では、種子吸水膨潤により、または粉末状接種物として、開示する組成物を種子に施用することができる。
種子は従来型種子であってよく、またはＬｉｂｅｒｔｙ Ｌｉｎｋ（Ｂａｙｅｒ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ）、Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙの種子（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）などの遺伝子改変型種子、または他の除草剤耐性種子、および／または昆虫耐性があるように操作した種子、または除草剤および昆虫耐性遺伝子で「ピリメイドされた（pyrimaded）」種子であってよい。
植物の成長促進
根圏における植物−細菌の相互作用は、土壌肥沃度と植物の健康状態の重要な決定要因である。植物の成長に有益である遊離生存細菌は、植物成長促進リゾバクテリア（ＰＧＰＲ）として知られる。一般に、植物成長促進剤は、３つの形式、植物成長制御剤の合成、土壌栄養分の取り込みを容易にすること、および／または植物疾患の予防の１つで機能する。したがって、ＰＧＰＲの影響は直接的と間接的の両方であり得る。間接的な植物成長促進は、植物病原体に対するアンタゴニスト効果を含み得る。これは例えば、シデロフォアの生成、抗生物質の合成、ＨＣＮおよび／または細胞壁分解酵素の生成によって実施され得る。直接的な植物成長促進効果は、（植物体および根の発達ならびにストレスに対する防御において役立つ）植物ホルモンの制御、ならびに無機リン酸および他の栄養物質の可溶化によって得られる。
根圏における植物−細菌の相互作用は、土壌肥沃度と植物の健康状態の重要な決定要因である。植物の成長に有益である遊離生存細菌は、植物成長促進リゾバクテリア（ＰＧＰＲ）として知られる。一般に、植物成長促進剤は、３つの形式、植物成長制御剤の合成、土壌栄養分の取り込みを容易にすること、および／または植物疾患の予防の１つで機能する。したがって、ＰＧＰＲの影響は直接的と間接的の両方であり得る。間接的な植物成長促進は、植物病原体に対するアンタゴニスト効果を含み得る。これは例えば、シデロフォアの生成、抗生物質の合成、ＨＣＮおよび／または細胞壁分解酵素の生成によって実施され得る。直接的な植物成長促進効果は、（植物体および根の発達ならびにストレスに対する防御において役立つ）植物ホルモンの制御、ならびに無機リン酸および他の栄養物質の可溶化によって得られる。
本明細書で開示する組成物、特にバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７、および／またはバチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７の培養物から得られる上清、濾過物、抽出物、化合物、代謝産物または細胞分画を使用して、植物、例えば果物（例えばイチゴ）、野菜（例えばトマト、カボチャ、コショウ、ナス）などの穀物、マメ科植物または穀類穀物（例えばダイズ、コムギ、コメ、コーン）、樹木、花、観賞植物、低木（例えばワタ、バラ）、芝草（例えば一年生ライグラス、バミューダグラス、バッファローグラス、コロニアルベントグラス、クリーピングベントグラス、ダイコンドラ、コウライウシノケグサ、ケンタッキーブルーグラス、キクユグラス、ペレニアルライグラス、オオウシノケグサ、ラフブルーグラス、シーショアパスパラム、セントオーガスチングラス、トールフェスク、ノシバなど）、球根植物（例えばタマネギ、ニンニク）またはつる植物（例えばブドウつる木）の成長を調節、またはより詳細には促進することができる。組成物を使用して植物における種子の発芽を調節することもできる。
本明細書で開示する組成物、または製剤製品は、成長期中所定の順序および施用間隔で、混合タンクまたはプログラム（ローテーションと呼ばれる連続施用）において、単独で、または成長促進剤および／または抗植物病原体物質などの以下に記載する１つまたは複数の他の成分と組み合わせて使用することができる。製品ラベルで推奨されるより低い濃度で前述の製品と組み合わせて使用するとき、（その１つが本明細書で開示する前記組成物である）２つ以上の製品の組合せ効果は、特定の実施形態において、各個別成分の効果の合計より大きい。したがって、これら２つ（以上の）製品の間の相乗作用により効果が高まり、植物病原体菌株間の殺有害生物剤耐性の発達に関するリスクは低減する。
組成物は、移植時の根の浸漬によって、具体的には土壌に果実または野菜を移植する前に、前記組成物の懸濁液中に果実または野菜の根を（約０．２５〜約１．５体積％、より詳細には約０．５〜約１．０体積％）浸すことによる、組成物を用いた果実または野菜の処理によって施用することができる。
あるいは組成物は、点滴または他の灌漑システムによって施用することができる。具体的には組成物は、点滴灌漑システムに注入することができる。特定の実施形態では、エーカー当たり約１１〜約４クォートの体積において、１×１０８のコロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの濃度で組成物を施用する。
さらに別の実施形態では、溝内施用物として組成物を添加することができる。具体的には、エーカー当たり２〜６ガロンの合計アウトプットを送達するための目盛り付きノズルを使用して、植え付け時に溝内スプレーで、組成物を添加することができる。溝への殺有害生物剤施用と種子滴下が同時であるように、ノズルはプランターの溝あき部分に配置する。
開示する組成物と、例えば固体または液体アジュバントの混合物は、知られている形式で調製する。例えば混合物は、均質に混合すること、および／または溶剤などのエクステンダー、固体担体、および適切な場合、表面活性化合物（表面活性物質）で活性成分を粉砕することにより調製することができる。組成物は、安定剤、粘度調整剤、結合剤、アジュバント、および化学肥料、または特殊効果を得るための他の活性成分などの別の成分も含有し得る。
植物成長促進剤を含む組合せ
本明細書で開示する組成物は、合成もしくは有機化学肥料（例えばリン酸二アンモニウム、顆粒もしくは液体形のいずれか）、堆肥茶葉、海藻抽出物、単独またはＩＢＡ（インドール酪酸）およびＮＡＡ（ナフタレン酢酸）などの植物成長制御剤と組み合わせた移植に関する根ホルモン処理において使用するＩＡＡ（インドール酢酸）などの植物成長ホルモン、ならびに成長促進微生物、例えばＰＰＦＭ（桃色色素沈着通性メチロトローフ）、バチルス種（Bacillus spp.）、シュードモナス（Pseudomonads）、リゾビア（Rhizobia）、およびトリコデルマ（Trichoderma）などの、他の成長促進剤と組み合わせて使用することができる。
本明細書で開示する組成物は、合成もしくは有機化学肥料（例えばリン酸二アンモニウム、顆粒もしくは液体形のいずれか）、堆肥茶葉、海藻抽出物、単独またはＩＢＡ（インドール酪酸）およびＮＡＡ（ナフタレン酢酸）などの植物成長制御剤と組み合わせた移植に関する根ホルモン処理において使用するＩＡＡ（インドール酢酸）などの植物成長ホルモン、ならびに成長促進微生物、例えばＰＰＦＭ（桃色色素沈着通性メチロトローフ）、バチルス種（Bacillus spp.）、シュードモナス（Pseudomonads）、リゾビア（Rhizobia）、およびトリコデルマ（Trichoderma）などの、他の成長促進剤と組み合わせて使用することができる。
抗植物病原体物質
本明細書で開示する組成物は、植物抽出物、バイオ殺有害生物剤、無機穀類保護物質（銅など）、表面活性物質（ラムノリピドなど、Gandhiら、2007年）、または殺有害生物剤の性質を有するパラフィン油もしくは茶木油などの天然油、または一部位作用、多部位作用もしくは未知の作用形式のいずれかの化学的殺真菌剤もしくは殺菌剤などの他の抗植物病原体物質と組み合わせて使用することもできる。本明細書で定義する「抗植物病原体物質」は、植物病原体、特に植物における土壌媒介性疾患を引き起こす病原体の増殖を調節する、または代替的に植物病原体による植物の感染を予防する作用物質である。植物病原体には、それだけには限られないが、真菌、細菌、放線菌またはウイルスがある。
本明細書で開示する組成物は、植物抽出物、バイオ殺有害生物剤、無機穀類保護物質（銅など）、表面活性物質（ラムノリピドなど、Gandhiら、2007年）、または殺有害生物剤の性質を有するパラフィン油もしくは茶木油などの天然油、または一部位作用、多部位作用もしくは未知の作用形式のいずれかの化学的殺真菌剤もしくは殺菌剤などの他の抗植物病原体物質と組み合わせて使用することもできる。本明細書で定義する「抗植物病原体物質」は、植物病原体、特に植物における土壌媒介性疾患を引き起こす病原体の増殖を調節する、または代替的に植物病原体による植物の感染を予防する作用物質である。植物病原体には、それだけには限られないが、真菌、細菌、放線菌またはウイルスがある。
前述のように、抗植物病原体物質は、それだけには限られないが、ベンズイミダゾール、脱メチル化阻害剤（ＤＭＩ）（例えば、イミダゾール、ピペラジン、ピリミジン、トリアゾール）、モルホリン、ヒドロキシピリミジン、アニリノピリミジン、ホスホロチオレート、キノンアウトサイドインヒビター、キノリン、ジカルボキシイミド、カルボキシイミド、フェニルアミド、アニリノピリミジン、フェニルピロール、芳香族炭化水素、桂皮酸、ヒドロキシアニリド、抗生物質、ポリオキシン、アシルアミン、フタルイミド、ベンゼノイド（キシリルアラニン）を含み得る一部位作用抗真菌剤であってよい。さらに特定の実施形態では、抗真菌剤は、イミダゾール、ピペラジン、ピリミジンおよびトリアゾール（例えば、ビテルタノール、マイクロブタニル、ペンコナゾール、プロピコナゾール、トリアジメホン、ブロムコナゾール、シプロコナゾール、ジニコナゾール、フェンブコナゾール、ヘキサコナゾール、テブコナゾール、テトラコナゾール）からなる群から選択される脱メチル化阻害剤である。最も特定の実施形態では、抗真菌剤はマイクロブタニルである。さらに別の特定の実施形態では、抗真菌剤はキノンアウトサイドインヒビター（例えばストロビルリン）である。ストロビルリンは、それだけには限られないが、アゾキシストロビン、クレソキシム−メチルまたはトリフロキシストロビンを含み得る。さらに別の特定の実施形態では、抗真菌剤はキノン、例えばキノキシフェン（５，７−ジクロロ−４−キノリル４−フルオロフェニルエーテル）である。
他のさらなる実施形態では、殺真菌剤は、クロロニトリル、キノキサリン、スルファミド、ホスホネート、ホスファイト、ジチオカルバメート、クロラルキチオス、フェニルピリジン−アミンおよびシアノ−アセトアミドオキシムからなる群から選択される多部位作用非無機化学物質殺真菌剤である。
他のさらなる実施形態では、抗植物病原体物質は、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、銅、またはカスガマイシンであってよい。
［実施例］
［実施例］
１６ＳｒＲＮＡ、ｒｅｃＡおよびｐｈｏＲ配列によるバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の単離および特徴付け
バチルス種（Bacillus sp.）菌株Ｆ７２７を、従来のプレート希釈法を使用して、Ｊｏｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＣＡで回収した土壌サンプルから単離した。この分離株を、共通の細菌用プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅ならびに１６ＳｒＲＮＡ、ｒｅｃＡおよびｐｈｏＲ遺伝子の配列決定によりバチルス種（Bacillus sp.）として同定した。Cerritosら(2008) Int.J.Sys.Evol.Microbiol、第58巻:919〜923頁;Guoら(2012) Can.J.Microbiol.第58巻:1295〜1305頁。
バチルス種（Bacillus sp.）菌株Ｆ７２７を、従来のプレート希釈法を使用して、Ｊｏｎｅｓｖｉｌｌｅ、ＣＡで回収した土壌サンプルから単離した。この分離株を、共通の細菌用プライマーを使用して、ＰＣＲ増幅ならびに１６ＳｒＲＮＡ、ｒｅｃＡおよびｐｈｏＲ遺伝子の配列決定によりバチルス種（Bacillus sp.）として同定した。Cerritosら(2008) Int.J.Sys.Evol.Microbiol、第58巻:919〜923頁;Guoら(2012) Can.J.Microbiol.第58巻:1295〜1305頁。
２４時間ジャガイモデキストロースプレート由来の増殖物を滅菌ループでかき取り、ＤＮＡ抽出バッファーに再懸濁した。ＤＮＡはＭｏＢｉｏ Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ抽出キットを使用して抽出した。１％アガロースゲルにおける５ｕＬアリコートの電気泳動によって、ＤＮＡ抽出物を質／量に関して調べた。
ｒＲＮＡ配列
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応を、２μＬの滅菌ＤＮＡ抽出物と、２５μＬのＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１．５μＬのフォワードプライマー（ＦＤ１プライマー、５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号４）、および１．５μＬのリバースプライマー（ＲＤ１プライマー、５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号５））を組み合わせることにより設定した。滅菌無ヌクレアーゼ水で、反応体積を５０μＬに調節した。増幅反応は、以下の条件：９５℃で１０分間（初期変性）、９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で２分間の３０サイクル、次に７２℃で５分間（最終延長）、および１０℃の最終保持温度の下において、サーモサイクラーマシーンを使用して実施した。
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応を、２μＬの滅菌ＤＮＡ抽出物と、２５μＬのＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１．５μＬのフォワードプライマー（ＦＤ１プライマー、５’−ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号４）、および１．５μＬのリバースプライマー（ＲＤ１プライマー、５’−ＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号５））を組み合わせることにより設定した。滅菌無ヌクレアーゼ水で、反応体積を５０μＬに調節した。増幅反応は、以下の条件：９５℃で１０分間（初期変性）、９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間および７２℃で２分間の３０サイクル、次に７２℃で５分間（最終延長）、および１０℃の最終保持温度の下において、サーモサイクラーマシーンを使用して実施した。
増幅産物のサイズ、質および量は、１％アガロースゲルにおける５ｕＬアリコートの電気泳動、および分子量ラダーを用いた産物バンドの比較によって評価した。
過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素および鋳型は、ＭｏＢｉｏ ＰＣＲクリーンアップキットを使用してＰＣＲ産物から除去した。クリーンアップしたＰＣＲ産物は、前に記載したプライマーを使用して直接配列決定した。
ＢｉｏＥｄｉｔソフトウエアを使用してフォワード配列とリバース配列を一直線に並べ、１４５９ｂｐのコンセンサス配列を作製した。
Ｆ７２７ＦＤ１１６Ｓ配列：
Ｆ７２７ＲＤ１１６Ｓ配列：
Ｆ７２７コンセンサス１６Ｓ配列：
菌株Ｆ７２７の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子コンセンサス配列を、ＢＬＡＳＴを使用して細菌ドメインを表す入手可能な配列と比較した。最も近い種の合致は、９９％の類似性でバチルス種（Bacillus sp.）（受託番号ＧＵ２５０４４９．１）であった。公に利用可能なデータベースにおいて如何なる１６Ｓ配列も、菌株Ｆ７２７と１００％の類似性を示さなかった。
さらにコンセンサス配列を、１６ＳｒＲＮＡ配列データに基づきＥｚＴａｘｏｎ−ｅサーバー（eztaxon-e.ezbiocloud.net/;Kimら、2012年）を使用して分析した。（表１中に示した）最も近い合致は、１６ＳｒＲＮＡ配列のみに基づいては区別できない数種のバチルス（Bacillus）属に関する菌株型を含んでいた。
ｒｅｃＡ配列
ｒｅｃＡ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応を、２μＬの滅菌ＤＮＡ抽出物と、２５μＬのＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１．５μＬのフォワードプライマー（ｒｅｃＡｆ、５’−ＧＡＴＣＧＴＣＡＲＧＣＡＧＳＣＹＴＷＧＡＴ−３’、配列番号６）、および１．５μＬのリバースプライマー（ｒｅｃＡｒ、５’−ＴＴＷＣＣＲＡＣＣＡＴＡＡＣＳＣＣＲＡＣ−３’、配列番号７）を組み合わせることによって構築した。滅菌無ヌクレアーゼ水を使用して、反応体積を５０μＬに調節した。増幅反応は、以下の条件：９５℃で５分間（初期変性）、９５℃で３０秒間、４５℃で３０秒間および７２℃で１分間の３０サイクル、次に７２℃で５分間（最終延長）、および４℃の最終保持温度の下において、サーモサイクラーマシーンで実施した。
ｒｅｃＡ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応を、２μＬの滅菌ＤＮＡ抽出物と、２５μＬのＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１．５μＬのフォワードプライマー（ｒｅｃＡｆ、５’−ＧＡＴＣＧＴＣＡＲＧＣＡＧＳＣＹＴＷＧＡＴ−３’、配列番号６）、および１．５μＬのリバースプライマー（ｒｅｃＡｒ、５’−ＴＴＷＣＣＲＡＣＣＡＴＡＡＣＳＣＣＲＡＣ−３’、配列番号７）を組み合わせることによって構築した。滅菌無ヌクレアーゼ水を使用して、反応体積を５０μＬに調節した。増幅反応は、以下の条件：９５℃で５分間（初期変性）、９５℃で３０秒間、４５℃で３０秒間および７２℃で１分間の３０サイクル、次に７２℃で５分間（最終延長）、および４℃の最終保持温度の下において、サーモサイクラーマシーンで実施した。
ＰＣＲ産物のサイズ、質および量は、１％アガロースゲルにおける５ｕＬアリコートの電気泳動、および分子量ラダーを用いた産物バンドの比較によって評価した。
過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素および鋳型は、ＭｏＢｉｏ ＰＣＲクリーンアップキットを使用してＰＣＲ産物から除去した。クリーンアップしたＰＣＲ産物は、前に記載したプライマーを使用して直接配列決定した。
ＢｉｏＥｄｉｔソフトウエアを使用してフォワード配列とリバース配列を一直線に並べ、５０５ｂｐのコンセンサス配列を作製した。
Ｆ７２７フォワードｒｅｃＡ配列：
Ｆ７２７リバースｒｅｃＡ配列：
Ｆ７２７コンセンサスｒｅｃＡ配列：
菌株Ｆ７２７のｒｅｃＡ遺伝子コンセンサス配列（配列番号１０）を、ＢＬＡＳＴを使用して代表的な細菌配列と比較した。最も近い種の合致は、９２％の類似性でバチルスアミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）（受託番号ＣＰ００２９２７．１）の完全ゲノムであった。
ｐｈｏＲ配列
ｐｈｏＲ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応を、２μＬの滅菌ＤＮＡ抽出物と、２５μＬのＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１．５μＬのフォワードプライマー（ｐｈｏＲ−ｆ：５’−ＴＴＹＡＲＹＴＣＡＴＧＲＧＡＶＡＣＡＴＴ−３’、配列番号１１）、および１．５μＬのリバースプライマー（ｐｈｏＲ−ｒ：５’−ＧＧＮＴＡＹＡＡＡＮＡＲＧＡＧＧＡＧＣＣ−３’、配列番号１２）を組み合わせることによって構築した。滅菌無ヌクレアーゼ水を使用して、反応体積を５０μＬに調節した。増幅反応は、以下の条件：９５℃で５分間（初期変性）、９５℃で４５秒間、４８℃で４５秒間および７２℃で１分間の３５サイクル、次に７２℃で１０分間（最終延長）、および４℃の最終保持温度の下において、サーモサイクラーマシーンで実施した。
ｐｈｏＲ遺伝子を増幅するためのＰＣＲ反応を、２μＬの滅菌ＤＮＡ抽出物と、２５μＬのＧｏＴａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ、１．５μＬのフォワードプライマー（ｐｈｏＲ−ｆ：５’−ＴＴＹＡＲＹＴＣＡＴＧＲＧＡＶＡＣＡＴＴ−３’、配列番号１１）、および１．５μＬのリバースプライマー（ｐｈｏＲ−ｒ：５’−ＧＧＮＴＡＹＡＡＡＮＡＲＧＡＧＧＡＧＣＣ−３’、配列番号１２）を組み合わせることによって構築した。滅菌無ヌクレアーゼ水を使用して、反応体積を５０μＬに調節した。増幅反応は、以下の条件：９５℃で５分間（初期変性）、９５℃で４５秒間、４８℃で４５秒間および７２℃で１分間の３５サイクル、次に７２℃で１０分間（最終延長）、および４℃の最終保持温度の下において、サーモサイクラーマシーンで実施した。
ＰＣＲ産物のサイズ、質および量は、１％アガロースゲルにおける５ｕＬアリコートの電気泳動、および分子量ラダーを用いた産物バンドの比較によって評価した。
過剰なプライマー、ヌクレオチド、酵素および鋳型は、ＭｏＢｉｏ ＰＣＲクリーンアップキットを使用してＰＣＲ産物から除去した。クリーンアップしたＰＣＲ産物は、前に記載したプライマーを使用して直接配列決定した。
９９８ヌクレオチドのｐｈｏＲ配列は、前に記載したリバースプライマーを使用して得た。
Ｆ７２７リバースｐｈｏＲ配列：
ｐｈｏＲリバース配列を、ＢＬＡＳＴを使用して代表的な細菌配列と比較した。最も近い種の合致は、８３％の類似性のみで数種のバチルスアミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）菌株の完全ゲノムであった。
分離株Ｆ７２７の脂肪酸組成
分離株Ｆ７２７の脂肪酸プロファイルは、市販の標準に従いＭＩＤＩ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）で実施された。結果は表２中に示す。その脂肪酸プロファイルとＲＴＳＢＡ６６．１０脂肪酸データベースの比較によって、分離株Ｆ７２７はバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）と０．８８５の類似性指数があったことを示した。
分離株Ｆ７２７の脂肪酸プロファイルは、市販の標準に従いＭＩＤＩ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）で実施された。結果は表２中に示す。その脂肪酸プロファイルとＲＴＳＢＡ６６．１０脂肪酸データベースの比較によって、分離株Ｆ７２７はバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）と０．８８５の類似性指数があったことを示した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質プロファイルによる分離株Ｆ７２７の特徴付け
分離株Ｆ７２７のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光タンパク質フィンガープリントは、ＭＩＤＩ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）で実施された。分離株Ｆ７２７は、質量スペクトルのデータベース中に存在した任意の他の微生物のそれとは異なるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質プロファイルを示した。バチルスバリスモルチス（Bacillus vallismortis）、バチルスモジャベンシス（Bacillus mojavensis）およびバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）のタンパク質プロファイルとある程度の類似性を観察したが、しかしながら、いずれの類似性スコアも単なる属の合致を示すほど充分高いわけではなかった。
分離株Ｆ７２７のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光タンパク質フィンガープリントは、ＭＩＤＩ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）で実施された。分離株Ｆ７２７は、質量スペクトルのデータベース中に存在した任意の他の微生物のそれとは異なるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質プロファイルを示した。バチルスバリスモルチス（Bacillus vallismortis）、バチルスモジャベンシス（Bacillus mojavensis）およびバチルスサブチリス（Bacillus subtilis）のタンパク質プロファイルとある程度の類似性を観察したが、しかしながら、いずれの類似性スコアも単なる属の合致を示すほど充分高いわけではなかった。
バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の生化学的特徴付け
グラム染色
グラム染色は、細胞壁の物理的性質、主にペプチドグリカンの組成に基づいて細菌を区別する方法である。グラム陽性菌分離株は、紫色／青色に染色される厚いペプチドグリカン層を有し、一方グラム陰性菌分離株は、赤色／桃色に染色される薄いペプチドグリカン層を細胞壁内に有する。グラム染色後の分離株Ｆ７２７の鏡検によって紫色の細胞が明らかになり、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７がグラム陽性菌であることを示した。
グラム染色
グラム染色は、細胞壁の物理的性質、主にペプチドグリカンの組成に基づいて細菌を区別する方法である。グラム陽性菌分離株は、紫色／青色に染色される厚いペプチドグリカン層を有し、一方グラム陰性菌分離株は、赤色／桃色に染色される薄いペプチドグリカン層を細胞壁内に有する。グラム染色後の分離株Ｆ７２７の鏡検によって紫色の細胞が明らかになり、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７がグラム陽性菌であることを示した。
ウレアーゼ活性
ウレアーゼ試験を使用して、尿素のアンモニアと重炭酸塩への変換を触媒する酵素ウレアーゼの活性を検出する。尿素ブロスは、尿素とｐＨ指示薬フェノールレッドを含有する。この指示薬は酸性環境では黄色になり、アルカリ性環境では桃色になる。ウレアーゼの酵素活性が存在する場合、ブロス中の尿素は分解してアンモニアを生成し、培地は桃色になり、陽性試験の結果を示す。
ウレアーゼ試験を使用して、尿素のアンモニアと重炭酸塩への変換を触媒する酵素ウレアーゼの活性を検出する。尿素ブロスは、尿素とｐＨ指示薬フェノールレッドを含有する。この指示薬は酸性環境では黄色になり、アルカリ性環境では桃色になる。ウレアーゼの酵素活性が存在する場合、ブロス中の尿素は分解してアンモニアを生成し、培地は桃色になり、陽性試験の結果を示す。
分離株Ｆ７２７を接種した後、尿素ブロスは赤色から黄色に色が変わり、ウレアーゼ活性に関して陰性試験の結果を示した。したがってバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７は酸性環境をもたらし、ウレアーゼ活性の不在を示した。
カタラーゼ活性
カタラーゼ試験を使用して、酵素カタラーゼの活性を検出する。カタラーゼは過酸化水素を酸素と水に分解する。カタラーゼ活性を有する生物は、過酸化水素で処理すると気泡を生成する。バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物に試薬を施用すると数秒以内に気泡が形成され、この生物がカタラーゼ活性を有することが示された。
カタラーゼ試験を使用して、酵素カタラーゼの活性を検出する。カタラーゼは過酸化水素を酸素と水に分解する。カタラーゼ活性を有する生物は、過酸化水素で処理すると気泡を生成する。バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の培養物に試薬を施用すると数秒以内に気泡が形成され、この生物がカタラーゼ活性を有することが示された。
オキシダーゼ活性
オキシダーゼ試験を使用して、シトクロムｃオキシダーゼ活性の存在を検出する。それらの呼吸鎖の一部としてシトクロムｃを含有する細菌はオキシダーゼ陽性であり、試薬は紫色になる。逆に、オキシダーゼ陰性である細菌は試薬を酸化せず、それは無色になる。バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７によって試薬は紫色になり、それがオキシダーゼ活性を有することが実証された。
オキシダーゼ試験を使用して、シトクロムｃオキシダーゼ活性の存在を検出する。それらの呼吸鎖の一部としてシトクロムｃを含有する細菌はオキシダーゼ陽性であり、試薬は紫色になる。逆に、オキシダーゼ陰性である細菌は試薬を酸化せず、それは無色になる。バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７によって試薬は紫色になり、それがオキシダーゼ活性を有することが実証された。
ＴＳＩ寒天培地
三糖鉄（ＴＳＩ）寒天培地を使用して、グルコース、ラクトースおよび／またはスクロースを発酵する微生物の能力、および硫化水素を生成する腸内細菌の能力を測定する。この培地はｐＨ指示薬フェノールレッド、および硫化水素と反応して黒色沈殿をもたらす硫酸第一鉄を含有する。分離株Ｆ７２７を試験すると、斜面は赤色状態であり、一方基部は赤色から黄色に変わり、黒色は観察されなかった。これらの結果は、分離株Ｆ７２７が、ラクトースまたはスクロースではなくグルコースのみで硫化水素および発酵物を生成しないことを示す。
三糖鉄（ＴＳＩ）寒天培地を使用して、グルコース、ラクトースおよび／またはスクロースを発酵する微生物の能力、および硫化水素を生成する腸内細菌の能力を測定する。この培地はｐＨ指示薬フェノールレッド、および硫化水素と反応して黒色沈殿をもたらす硫酸第一鉄を含有する。分離株Ｆ７２７を試験すると、斜面は赤色状態であり、一方基部は赤色から黄色に変わり、黒色は観察されなかった。これらの結果は、分離株Ｆ７２７が、ラクトースまたはスクロースではなくグルコースのみで硫化水素および発酵物を生成しないことを示す。
抗生物質に対する感受性
バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の抗生物質に対する感受性を、ミュラーヒルトン培地で抗生物質ディスクを使用して試験した。ループ状Ｆ７２７を１ｍＬの滅菌脱イオン水に再懸濁し、１００μＬのこの懸濁液をミュラーヒルトン寒天プレートに画線培養した。寒天プレートに画線培養物を吸収させた後、予め充填した抗生物質ディスクをプレートに置き、プレートは２５℃で４８時間インキュベートした。結果は表３中に表す。
バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の抗生物質に対する感受性を、ミュラーヒルトン培地で抗生物質ディスクを使用して試験した。ループ状Ｆ７２７を１ｍＬの滅菌脱イオン水に再懸濁し、１００μＬのこの懸濁液をミュラーヒルトン寒天プレートに画線培養した。寒天プレートに画線培養物を吸収させた後、予め充填した抗生物質ディスクをプレートに置き、プレートは２５℃で４８時間インキュベートした。結果は表３中に表す。
ＡＰＩＺＹＭストリップ
ＡＰＩＺＹＭストリップ（ＢｉｏＭｅｒｒｉｅｕｘ）は、微生物の様々な酵素活性を試験するための方法となる。このアッセイは製造業者の説明書に従い実施し、結果の概要は表４中に示す。
ＡＰＩＺＹＭストリップ（ＢｉｏＭｅｒｒｉｅｕｘ）は、微生物の様々な酵素活性を試験するための方法となる。このアッセイは製造業者の説明書に従い実施し、結果の概要は表４中に示す。
ＡＰＩ２０ＮＥストリップ
ＡＰＩ２０ＮＥストリップは、脱水基質を含有する２０のマイクロチューブからなる。従来の試験品を、培地を再構築するバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の懸濁液に接種した。代謝によってマイクロチューブの変色が生じた。同化試験品は最小培地に接種し、細菌が基質を利用可能である場合、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７は増殖する。反応は製造業者の読み取り表に従い分析し、結果は表５中に要約する。
ＡＰＩ２０ＮＥストリップは、脱水基質を含有する２０のマイクロチューブからなる。従来の試験品を、培地を再構築するバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の懸濁液に接種した。代謝によってマイクロチューブの変色が生じた。同化試験品は最小培地に接種し、細菌が基質を利用可能である場合、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７は増殖する。反応は製造業者の読み取り表に従い分析し、結果は表５中に要約する。
化合物Ａ、ＢおよびＣの単離および特徴付け
精製手順
（図１中に概略した）以下の手順を、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の細胞培養物から抽出した化合物の精製に使用した。
精製手順
（図１中に概略した）以下の手順を、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の細胞培養物から抽出した化合物の精製に使用した。
室温において２時間１５５ｒｐｍで細胞懸濁液と樹脂を振とうすることにより、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７樹脂（Asolkar ら、2006年）を用いて、増殖培地中のバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の１Ｌ発酵液から培養ブロスを抽出した。樹脂と細胞塊はチーズクロスを介した濾過により回収し、脱イオン水で洗浄して塩を除去した。次いで樹脂、細胞塊、およびチーズクロスをアセトン中に２時間浸し、その後アセトンは濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で乾燥させ、粗製抽出物を得た。
粗製抽出物を逆相Ｃ１８真空液体クロマトグラフィー（ＶＬＣ、Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ、勾配８０：２０〜０：１００％）にかけて６分画を得た。これらの分画はロータリーエバポレーターを使用して乾燥状態まで濃縮し、生成した乾燥残渣は寒天−ディスクアッセイを使用し生物活性に関してスクリーニングした。以下の実施例１６を参照。このアッセイで、Ｃ−１８ＶＬＣ分画３が真菌活性を有することを特定した。
活性分画３を逆相ＨＰＬＣ（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍ Ｐ４０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にかけて純化合物を得、次いでそれらを前述のバイオアッセイでスクリーニングし活性化合物を位置付け／特定した。
活性分画３は、８ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（０．０１％ＴＦＡ含有）勾配溶媒系（０〜１０分；７０％水性ＣＨ３ＣＮ、１０〜２０分；７０〜４５％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜４０分；４５〜３０％水性ＣＨ３ＣＮ、４０〜６０分；３０〜０％ＣＨ３ＣＮ、６０〜６５分；１００％ＣＨ３ＣＮ、６５〜７０分；０〜３０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用して、ＨＰＬＣＣ−１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ１０ｕＣ１８（２）１００Ａ、２５０×３０）でさらに精製した。３つの精製化合物を得た：
３５．９５分の保持時間を有する化合物Ａ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１１）、
３７．２６分の保持時間を有する化合物Ｂ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１４）、および
３８．１１分の保持時間を有する化合物Ｃ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１７）。
３５．９５分の保持時間を有する化合物Ａ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１１）、
３７．２６分の保持時間を有する化合物Ｂ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１４）、および
３８．１１分の保持時間を有する化合物Ｃ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１７）。
質量分光分析
化合物Ａ、ＢおよびＣの質量分光分析を、ＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰｐｌｕｓ質量分光分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｒｏｐ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）においてフルスキャンモード（ｍ／ｚ１００〜１５００ダルトン）で、ポジティブとネガティブイオン化モードの両方を使用してＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ｄｅｃａ ＸＰ Ｐｌｕｓエレクトロスプレー（ＥＳＩ）装置で実施した。Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＰＤＡおよび検出器、オートサンプラーおよび、ＭＳポンプおよび４．６ｍｍ×１００ｍｍのＬｕｎａＣ１８ ５μｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備える、Ｔｈｅｒｍｏ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を使用した。溶媒系は水（溶媒Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）からなっていた。移動相は１０％溶媒Ｂで始まり、２０分間で１００％溶媒Ｂまで直線的に増大し、次いで４分間１００％溶媒Ｂを維持し、最後に３分間で１０％溶媒Ｂまで戻し、３分間１０％溶媒Ｂを維持する。流速は０．５ｍＬ／分であった。注入体積は１０μＬであり、サンプルはオートサンプラー内に室温で保った。
化合物Ａ、ＢおよびＣの質量分光分析を、ＬＣＱ ＤＥＣＡ ＸＰｐｌｕｓ質量分光分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｒｏｐ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）においてフルスキャンモード（ｍ／ｚ１００〜１５００ダルトン）で、ポジティブとネガティブイオン化モードの両方を使用してＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ Ｄｅｃａ ＸＰ Ｐｌｕｓエレクトロスプレー（ＥＳＩ）装置で実施した。Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＰＤＡおよび検出器、オートサンプラーおよび、ＭＳポンプおよび４．６ｍｍ×１００ｍｍのＬｕｎａＣ１８ ５μｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を備える、Ｔｈｅｒｍｏ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置を使用した。溶媒系は水（溶媒Ａ）とアセトニトリル（溶媒Ｂ）からなっていた。移動相は１０％溶媒Ｂで始まり、２０分間で１００％溶媒Ｂまで直線的に増大し、次いで４分間１００％溶媒Ｂを維持し、最後に３分間で１０％溶媒Ｂまで戻し、３分間１０％溶媒Ｂを維持する。流速は０．５ｍＬ／分であった。注入体積は１０μＬであり、サンプルはオートサンプラー内に室温で保った。
ＬＣおよび逆相クロマトグラフィーを利用して、ＬＣ−ＭＳにより化合物を分析した。存在した化合物の質量分光分析を以下の条件下で実施した。窒素ガスの流速は、それぞれシースおよび補助／スイープガス流速に関して３０と１５ａｒｂに固定した。エレクトロスプレーイオン化は、５０００Ｖに設定したスプレー電圧と３５．０Ｖのキャピラリー電圧で実施した。キャピラリー温度は４００℃に設定した。データはＸｃａｌｉｂｕｒソフトウエアで分析した。
化合物Ａ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１１）の分子量は、ネガティブイオン化モードにおける１０４３．８４（Ｍ−Ｈ）での分子量イオンピークに基づき１０４４であると決定した（図２）。この決定はポジティブモードＥＳＩＭＳにおけるイオン化パターンにより支持され、１０４５．４８（Ｍ＋Ｈ）でピークおよび１０６７．５５（Ｍ＋Ｎａ）でみかけの分子量イオンピークを示した（図３）。
化合物Ｂ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１４）の分子量は、ネガティブイオン化モードにおける１０５７．８３（Ｍ−Ｈ）での分子量イオンピークに基づき１０５８であると決定した（図４）。この決定はポジティブモードＥＳＩＭＳにおけるイオン化パターンにより支持され、１０５９．５６（Ｍ＋Ｈ）でピークおよび１０８１．６３（Ｍ＋Ｎａ）でみかけの分子量イオンピークを示した（図５）。
化合物Ｃ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１７）の分子量は、ネガティブイオン化モードにおける１０７１．８５（Ｍ−Ｈ）での分子量イオンピークに基づき１０７２であると決定した（図６）。この決定はポジティブモードＥＳＩＭＳにおけるイオン化パターンにより支持され、１０７３．５７（Ｍ＋Ｈ）でピークおよび１０９５．６２（Ｍ＋Ｎａ）でみかけの分子量イオンピークを示した（図７）。
分画および純化合物の抗真菌性試験のためのプラグアッセイ法
分画および精製化合物を、以下のように抗真菌活性に関して試験した。フィルターディスクを、中程度の大きさのペトリ皿の各四分円に置いた（合計４ディスク）。各ディスクは皿の中心から２ｃｍに置いた。１５μＬのカラム分画または精製化合物（２０ｍｇ／ｍＬ）は、２ディスク各々の表面上に互いに対向させて分配した。エタノールは対照として他の２ディスクに分配した。フィルターディスクを充填した後、真菌の小さなプラグ（約１×１ｃｍ）をペトリ皿の中心に置いた。使用した真菌病原体は、ビポラリスメイディス（Bipolaris maydis）、ボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）、スクレロティニアホメオカルパ（Sclerotinia homeocarpa）およびリゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）であった。プレートは２５℃でインキュベートし、４８時間後、各フィルターディスク周辺の阻害領域を測定した。ＶＬＣ分画３、ならびに化合物Ａ、ＢおよびＣに関する結果は図８中に示し、３つの化合物全てが有意な殺真菌活性を有することを示す。
分画および精製化合物を、以下のように抗真菌活性に関して試験した。フィルターディスクを、中程度の大きさのペトリ皿の各四分円に置いた（合計４ディスク）。各ディスクは皿の中心から２ｃｍに置いた。１５μＬのカラム分画または精製化合物（２０ｍｇ／ｍＬ）は、２ディスク各々の表面上に互いに対向させて分配した。エタノールは対照として他の２ディスクに分配した。フィルターディスクを充填した後、真菌の小さなプラグ（約１×１ｃｍ）をペトリ皿の中心に置いた。使用した真菌病原体は、ビポラリスメイディス（Bipolaris maydis）、ボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）、スクレロティニアホメオカルパ（Sclerotinia homeocarpa）およびリゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）であった。プレートは２５℃でインキュベートし、４８時間後、各フィルターディスク周辺の阻害領域を測定した。ＶＬＣ分画３、ならびに化合物Ａ、ＢおよびＣに関する結果は図８中に示し、３つの化合物全てが有意な殺真菌活性を有することを示す。
化合物Ａ、ＢおよびＣのアミノ酸分析
化合物Ａ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１１、０．０５ｍｇ）を、液相加水分解（６ＮＨＣＬ、１％フェノール、１１０℃、２４時間、真空中）によって加水分解した。冷却後、反応混合物を乾燥させ、加水分解産物は１．０ｍＬ体積までＮｏｒｌｅｕ希釈バッファーに溶かした。このサンプルの５０μｌアリコートを、分析用にイオン交換カラムに充填した。
化合物Ａ（Ｆ７２７Ｆ３Ｈ１１、０．０５ｍｇ）を、液相加水分解（６ＮＨＣＬ、１％フェノール、１１０℃、２４時間、真空中）によって加水分解した。冷却後、反応混合物を乾燥させ、加水分解産物は１．０ｍＬ体積までＮｏｒｌｅｕ希釈バッファーに溶かした。このサンプルの５０μｌアリコートを、分析用にイオン交換カラムに充填した。
標準および較正用に、Ｎａ−ｂａｓｅｄ Ｈｉｔａｃｈｉ８８００（Ｓｉｇｍａ、Ａ−９９０６）のタンパク質加水分解産物用のアミノ酸標準溶液を使用して応答因子を決定し、したがって全アミノ酸に関してＨｉｔａｃｈｉ８８００アナライザーを較正した。それぞれの注入液は内部標準としてノルロイシンを含有し、サンプル体積の変化およびクロマトグラフィー変数に関する結果の補正を可能にした。システムは、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ Ｎａバッファー、Ｐｉｅｒｃｅ ＳｅｑｕａｎａｌグレードＨＣｌ（加水分解）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃイオン交換カラム、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＭＳＦ）、ＵＣ Ｄａｖｉｓにより開発された最適化法を利用した。各サンプル中に存在した個々のアミノ酸を報告した。化合物Ａにおいて存在したアミノ酸は、グルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）であることが分かった。
化合物ＢとＣのアミノ酸組成を同様の形式で分析した。化合物ＢとＣは、化合物Ａと同じ割合で同じアミノ酸を有することが分かった。
トマト植物でのボトリチス（Botrytis）に対するバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の影響
トマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種ロマ（Roma）をＦ７２７発酵由来の上清で処理した。それぞれの植物に約３ｍｌの無細胞発酵上清を噴霧した。植物を乾燥させ、次いで６．６７×１０７個胞子／ｍｌの濃度でボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）胞子の２ｍｌ懸濁液を接種した。対照植物には脱イオン水を噴霧し、２つの陰性対照植物には（１×１０７個胞子／ｍｌおよび６．６７×１０７個胞子／ｍｌの濃度で）胞子のみを噴霧し、陽性対照植物にはSWITCH（登録商標）６５．２ＷＧ（シプロニジルおよびフルジオキソニル、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．によって商品化）を１４ｏｚ／１００ｇａｌ／エーカーの割合で噴霧した。処理は三連で実施した。光を与え一定温度に制御して、成長ルーム内の透明プラスチックビン中に植物を置いた。疾患評定は処理後８日で実施した。疾患の兆候がある葉領域の目視評価により疾患重度に関して植物を評価し、疾患評定を得た。例えば、ＷＣ Ｊａｍｅｓ（１９７１）「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｋｅｙｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．ＩＳＢＮ９７８−０−８９０５４−０８１−７を参照。図９中に示す結果は、疾患重度が６５％（感染、未処理対照）から、Ｆ７２７上清で処理した感染植物では４０％に低減したことを示す。
トマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種ロマ（Roma）をＦ７２７発酵由来の上清で処理した。それぞれの植物に約３ｍｌの無細胞発酵上清を噴霧した。植物を乾燥させ、次いで６．６７×１０７個胞子／ｍｌの濃度でボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）胞子の２ｍｌ懸濁液を接種した。対照植物には脱イオン水を噴霧し、２つの陰性対照植物には（１×１０７個胞子／ｍｌおよび６．６７×１０７個胞子／ｍｌの濃度で）胞子のみを噴霧し、陽性対照植物にはSWITCH（登録商標）６５．２ＷＧ（シプロニジルおよびフルジオキソニル、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．によって商品化）を１４ｏｚ／１００ｇａｌ／エーカーの割合で噴霧した。処理は三連で実施した。光を与え一定温度に制御して、成長ルーム内の透明プラスチックビン中に植物を置いた。疾患評定は処理後８日で実施した。疾患の兆候がある葉領域の目視評価により疾患重度に関して植物を評価し、疾患評定を得た。例えば、ＷＣ Ｊａｍｅｓ（１９７１）「Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｋｅｙｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅ」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．ＩＳＢＮ９７８−０−８９０５４−０８１−７を参照。図９中に示す結果は、疾患重度が６５％（感染、未処理対照）から、Ｆ７２７上清で処理した感染植物では４０％に低減したことを示す。
別の実験では、２倍、４倍および１０倍希釈のＦ７２７ＷＣＢを試験した。２つの別個の発酵由来のＷＣＢを使用すると、疾患重度の低減を３つの希釈全てで観察した。
レタスにおけるべと病菌（Downy Mildew）に対するバチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７の影響
レタス植物（ラクツカサティバ（Lactuca sativa））変種セルタス（Celtuce）をポット当たり４苗木の密度で植え付けた。それぞれのポットには２ｍｌのＦ７２７発酵上清を噴霧した。
レタス植物（ラクツカサティバ（Lactuca sativa））変種セルタス（Celtuce）をポット当たり４苗木の密度で植え付けた。それぞれのポットには２ｍｌのＦ７２７発酵上清を噴霧した。
植物は乾燥させ、次いで２ｍｌのブレミアラクツカ（Bremia lactuca）（べと病菌）胞子懸濁液（１×１０５個胞子／ｍｌ）を接種した。処理は５反復で実施した。処理した植物は、成長チャンバーにおいて１２時間の光周期１５℃で、プラスチックカバーで密閉したトレー内でインキュベートした。処理後第１０日で、実施例６中に記載したように疾患重度を評価した。
結果は図１０中に示す。未処理対照における平均疾患重度は５４．４７％であり、一方Ｆ７２７で処理した植物はわずか１４．６４％の疾患重度を示した。Ｆ７２７処理植物における疾患重度は、化学物質対照ＲＩＤＯＭＩＬ（登録商標）ＧＯＬＤ ＥＣ（４％ｗ／ｗメタラキシル−Ｍおよび６４％ｗ／ｗマンコゼブ）（１５０ｐｐｍ ａ．ｉ．）（Ｓｙｎｇｅｎｔａ）で植物を処理した後に得たものと同等であり、それは１１．６７％の重度をもたらした。
別の実験では、２倍、４倍および１０倍希釈のＦ７２７ＷＣＢを試験した。２つの別個の発酵由来のＷＣＢを使用すると、疾患重度の低減を３つの希釈全てで観察した。
バチルス種（Bacillus sp.）Ｆ７２７とＥＬＥＶＡＴＥ（登録商標）の影響の比較
トマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種ロマ（Roma）を３ｍｌのＦ７２７発酵上清で処理し乾燥させた。次いで植物に約２ｍｌのボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）胞子懸濁液（２．８×１０７個胞子／ｍｌ）を接種した。感染植物の一部分には２時間後にＦ７２７を２回目噴霧し、または最初の処理後に乾燥させた。接種植物は水（陰性対照）、および陽性対照としてＥＬＥＶＡＴＥ（登録商標）５０ＷＤＧ（フェンヘキサミド、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）でも処理した。
トマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種ロマ（Roma）を３ｍｌのＦ７２７発酵上清で処理し乾燥させた。次いで植物に約２ｍｌのボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）胞子懸濁液（２．８×１０７個胞子／ｍｌ）を接種した。感染植物の一部分には２時間後にＦ７２７を２回目噴霧し、または最初の処理後に乾燥させた。接種植物は水（陰性対照）、および陽性対照としてＥＬＥＶＡＴＥ（登録商標）５０ＷＤＧ（フェンヘキサミド、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）でも処理した。
処理は４回の反復で実施した。処理後第９日で、実施例６中に記載したように疾患重度を評価した。結果は図１１中に示す。水対照に関する疾患重度は３８．３％であり、一方陽性対照（ＥＬＥＶＡＴＥ（登録商標）５０ＷＤＧ、フェンヘキサミド、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）は疾患重度を１３．３３％に低減した。１×および２×Ｆ７２７上清で処理した植物はそれぞれ８．３％と５％の疾患重度を有していた。
コショウにおけるボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）感染に対するＦ７２７上清の影響
コショウ植物（カプシカムアンナム（Capscicum annuum））変種セラーノ（Serrano）に約２ｍｌのＦ７２７上清を噴霧し乾燥させた。次いで植物に２ｍｌのボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）の胞子懸濁液（２．７×１０７個胞子／ｍｌ）を接種した。植物は三連で処理した。処理後第１３日で疾患重度を評価し、（水を噴霧した）未処理対照、およびラベル規格で施用した（Ｅｌｅｖａｔｅ（登録商標）５０ＷＤＧ（フェンヘキサミド、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）を噴霧した）陽性対照と比較した。
コショウ植物（カプシカムアンナム（Capscicum annuum））変種セラーノ（Serrano）に約２ｍｌのＦ７２７上清を噴霧し乾燥させた。次いで植物に２ｍｌのボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）の胞子懸濁液（２．７×１０７個胞子／ｍｌ）を接種した。植物は三連で処理した。処理後第１３日で疾患重度を評価し、（水を噴霧した）未処理対照、およびラベル規格で施用した（Ｅｌｅｖａｔｅ（登録商標）５０ＷＤＧ（フェンヘキサミド、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ．）を噴霧した）陽性対照と比較した。
図１２中に示す結果は、Ｆ７２７で処理したボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）感染植物における疾患防除は、Ｅｌｅｖａｔｅ（登録商標）を用いた植物の処理によって得たものと同等であったことを示す。
キュウリにおけるウドンコ病菌に対する３培地中の発酵により生じたＦ７２７全細胞ブロス、上清および細胞の評価。
Ｆ７２７細胞に３つの異なる増殖培地（ＳＰＹ、ＳＭＰおよびＴＳＢ）で発酵生産させた。２週齢のキュウリ植物（ククミスサティブス（Cucumis sativus））変種ＳＭＲ５８に、これら３つの発酵それぞれから得た約３ｍＬのＦ７２７全細胞ブロス、Ｆ７２７上清またはＦ７２７細胞を噴霧した。細胞はペレット状にし、次いで噴霧用に１０ｍＭの硫酸マグネシウムに再懸濁した。処理当たり４回の反復を実施した。感染植物から調製した約２ｍＬのウドンコ病菌胞子懸濁液を３．０×１０５個胞子／ｍＬの濃度で噴霧する前に、植物を２時間乾燥させた。次いで疾患発症まで植物を成長ルームでインキュベートし、実施例６中に記載したように疾患重度を評価した。
Ｆ７２７細胞に３つの異なる増殖培地（ＳＰＹ、ＳＭＰおよびＴＳＢ）で発酵生産させた。２週齢のキュウリ植物（ククミスサティブス（Cucumis sativus））変種ＳＭＲ５８に、これら３つの発酵それぞれから得た約３ｍＬのＦ７２７全細胞ブロス、Ｆ７２７上清またはＦ７２７細胞を噴霧した。細胞はペレット状にし、次いで噴霧用に１０ｍＭの硫酸マグネシウムに再懸濁した。処理当たり４回の反復を実施した。感染植物から調製した約２ｍＬのウドンコ病菌胞子懸濁液を３．０×１０５個胞子／ｍＬの濃度で噴霧する前に、植物を２時間乾燥させた。次いで疾患発症まで植物を成長ルームでインキュベートし、実施例６中に記載したように疾患重度を評価した。
疾患防除率として表した結果は図１３中に示す。キュウリにおける抗真菌活性は、３つ全ての培地から得た全細胞、全細胞ブロス、および細胞上清で観察した。
トマトにおけるボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）に対する３培地中の発酵により生じたＦ７２７全細胞ブロス、上清および細胞の有効性の評価。
２週齢のトマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種スタピース（Stupice）に、異なる増殖培地（ＳＰＹ、ＳＭＰおよびＴＳＢ）における３つの別個の発酵からそれぞれ調製した、約２ｍＬのＦ７２７全細胞ブロス、Ｆ７２７上清およびＦ７２７細胞を噴霧した。細胞はペレット状にし、噴霧用に１０ｍＭの硫酸マグネシウムに再懸濁した。処理当たり３回の反復を実施した。植物は１時間乾燥させ、次いで湿気条件下に置いて気孔を開いた。２％Ｓａｂｏｕｒａｕｄマルトースブロスにおいて１．０×１０７個胞子／ｍＬでの１０日齢培養寒天プレートから調製した約１ｍＬのボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）胞子懸濁液を、それぞれの植物に噴霧した。疾患発症まで１２時間光周期で植物を成長チャンバーでインキュベートし、実施例６中に記載したように疾患重度を評価した。
２週齢のトマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種スタピース（Stupice）に、異なる増殖培地（ＳＰＹ、ＳＭＰおよびＴＳＢ）における３つの別個の発酵からそれぞれ調製した、約２ｍＬのＦ７２７全細胞ブロス、Ｆ７２７上清およびＦ７２７細胞を噴霧した。細胞はペレット状にし、噴霧用に１０ｍＭの硫酸マグネシウムに再懸濁した。処理当たり３回の反復を実施した。植物は１時間乾燥させ、次いで湿気条件下に置いて気孔を開いた。２％Ｓａｂｏｕｒａｕｄマルトースブロスにおいて１．０×１０７個胞子／ｍＬでの１０日齢培養寒天プレートから調製した約１ｍＬのボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）胞子懸濁液を、それぞれの植物に噴霧した。疾患発症まで１２時間光周期で植物を成長チャンバーでインキュベートし、実施例６中に記載したように疾患重度を評価した。
疾患防除率として表した結果は図１４中に示す。トマトにおける抗真菌活性は、３つ全ての培地から得た全細胞、全細胞ブロス、および細胞上清で観察した。
キュウリにおけるウドンコ病菌に対する、Ｆ７２７全細胞ブロス、市販のバチルス（Bacillus）ベース製品、およびＲｅｇａｌｉａ（登録商標）と混合したＦ７２７全細胞ブロスの有効性の評価。
２週齢のキュウリ植物（ククミスサティブス（Cucumis sativus））変種ＳＭＲ５８に、最初に真性葉に、約３ｍＬのＲｅｇａｌｉａ（登録商標）５％（レイノウトリアサカリネンシス（Reynoutria sachalinensis）、Ｍａｒｒｏｎｅ Ｂｉｏ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）、１：２０００、Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）５％、１：２００、Ｆ７２７全細胞ブロス、Ｆ７２７全細胞ブロス＋Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）５％、１：２０００、Ｓｅｒｅｎａｄｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ）、１：２００、Ｓｏｎａｔａ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ）、１：２００、Ｖａｃｃｉｐｌａｎｔ（登録商標）（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｇｏｅｍａｒ Ｓ．Ａ．）、４０μＬ／５０ｍＬ、Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（登録商標）（Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌｔｄ．）、１：２００、およびＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（登録商標）（Ｃｅｒｔｉｓ ＵＳＡ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）、０．０６ｇ／５０ｍＬを噴霧した。処理当たり４反復を調製した。それぞれの植物に約２ｍＬのウドンコ病菌胞子懸濁液を３．０×１０５個胞子／ｍＬの濃度で噴霧する前に、植物を２時間乾燥させた。植物は疾患発症まで成長ルームでインキュベートした。
２週齢のキュウリ植物（ククミスサティブス（Cucumis sativus））変種ＳＭＲ５８に、最初に真性葉に、約３ｍＬのＲｅｇａｌｉａ（登録商標）５％（レイノウトリアサカリネンシス（Reynoutria sachalinensis）、Ｍａｒｒｏｎｅ Ｂｉｏ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）、１：２０００、Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）５％、１：２００、Ｆ７２７全細胞ブロス、Ｆ７２７全細胞ブロス＋Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）５％、１：２０００、Ｓｅｒｅｎａｄｅ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ）、１：２００、Ｓｏｎａｔａ（登録商標）（Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｃ）、１：２００、Ｖａｃｃｉｐｌａｎｔ（登録商標）（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ Ｇｏｅｍａｒ Ｓ．Ａ．）、４０μＬ／５０ｍＬ、Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ（登録商標）（Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｌｔｄ．）、１：２００、およびＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（登録商標）（Ｃｅｒｔｉｓ ＵＳＡ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）、０．０６ｇ／５０ｍＬを噴霧した。処理当たり４反復を調製した。それぞれの植物に約２ｍＬのウドンコ病菌胞子懸濁液を３．０×１０５個胞子／ｍＬの濃度で噴霧する前に、植物を２時間乾燥させた。植物は疾患発症まで成長ルームでインキュベートした。
図１５中に示す結果は、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７発酵由来の全細胞ブロス（図中ではＭＢＩ−１１０ＷＣＢとして特定）は、多くの既存の殺真菌剤よりウドンコ病菌に対して有効であることを示す。Ｆ７２７上清有りおよび無しでのＲｅｇａｌｉａ（登録商標）に関する結果は表６中に示す。コルビーの相乗作用係数は、Ｆ７２７全細胞ブロスとＲｅｇａｌｉａ（登録商標）５％、１：２０００の間に相乗作用が存在することを示す。
トマトにおけるフィトフトラインフェスタンス（Phytophthora infestans）に対するＦ７２７全細胞ブロス、Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）およびＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（登録商標）の有効性の評価
トマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種スタピース（Stupice）に、二真性葉段階で、２ｍＬのＦ７２７全細胞ブロス、Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）、１：２００（Ｍａｒｒｏｎｅ Ｂｉｏ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．）およびＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（登録商標）、０．０６ｇ／５０ｍＬ（Ｃｅｒｔｉｓ ＵＳＡ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）を噴霧した。感染したトマトの葉から調製したフィトフトラインフェスタンス（Phytophthora infestans）胞子の溶液を１０４個胞子／ｍＬの濃度で噴霧して含ませる前に、植物を乾燥させた。植物は人工光の下で成長チャンバーにおいて、２０℃でインキュベートした。処理後第３日で、実施例６中に記載したように疾患重度に関して植物を評価した。
トマト植物（ソラナムリコペルシカム（Solanum lycopersicum））変種スタピース（Stupice）に、二真性葉段階で、２ｍＬのＦ７２７全細胞ブロス、Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）、１：２００（Ｍａｒｒｏｎｅ Ｂｉｏ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．）およびＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（登録商標）、０．０６ｇ／５０ｍＬ（Ｃｅｒｔｉｓ ＵＳＡ、Ｌ．Ｌ．Ｃ．）を噴霧した。感染したトマトの葉から調製したフィトフトラインフェスタンス（Phytophthora infestans）胞子の溶液を１０４個胞子／ｍＬの濃度で噴霧して含ませる前に、植物を乾燥させた。植物は人工光の下で成長チャンバーにおいて、２０℃でインキュベートした。処理後第３日で、実施例６中に記載したように疾患重度に関して植物を評価した。
図１６中に示す結果は、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７発酵由来の全細胞ブロス（図中ではＭＢＩ−１１０ＷＣＢとして特定）は、トマトのフィトフトラインフェスタンス（Phytophthora infestans）感染に対して確固たる防御をもたらすことを示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのスクレロチウムロルフシ（Sclerotium rolfsii）のＦ７２７防除の評価
分離株Ｆ７２７に液体培地で発酵生産させ、上清を遠心分離によって除去した。上清の半分は０．２μｍのフィルターを介して濾過した。キツネノワンタケ属の一種スクレロチウムロルフシ（Sclerotium rolfsii）を１０ｃｍペトリプレートの中心に置き、プレート当たり４個の０．５ｃｍ径ディスクを真菌から２ｃｍの距離、および互いから等しい距離に置いた。２つの対向ディスクが合計２５μｌになり他の２つが５０μｌになるまで、０．５ｍＬ／ＬのＦ７２７上清、濾過Ｆ７２７上清およびＰｒｉｓｔｉｎｅ（登録商標）（ＢＡＳＦ）を１２．５μｌアリコートでディスクに添加した。処理当たり２プレートを調製した。プレートは２５℃で３日間インキュベートした。
分離株Ｆ７２７に液体培地で発酵生産させ、上清を遠心分離によって除去した。上清の半分は０．２μｍのフィルターを介して濾過した。キツネノワンタケ属の一種スクレロチウムロルフシ（Sclerotium rolfsii）を１０ｃｍペトリプレートの中心に置き、プレート当たり４個の０．５ｃｍ径ディスクを真菌から２ｃｍの距離、および互いから等しい距離に置いた。２つの対向ディスクが合計２５μｌになり他の２つが５０μｌになるまで、０．５ｍＬ／ＬのＦ７２７上清、濾過Ｆ７２７上清およびＰｒｉｓｔｉｎｅ（登録商標）（ＢＡＳＦ）を１２．５μｌアリコートでディスクに添加した。処理当たり２プレートを調製した。プレートは２５℃で３日間インキュベートした。
各試験基質に関する阻害率は、スクレロチウム（sclerotium）から各ディスクに向かうコロニーの最遠端までの菌糸体増殖を測定することにより決定した。図１７中に示す結果は、ディスクアッセイにおいて、Ｆ７２７の濾過と無濾過上清の両方がエスロルフシ（S.rolfsii）の増殖を阻害する際に有効であったことを示す。無濾過上清は濾過上清より常に有効であり、その有効性は市販の標準品のものと同等であった。
ダイズにおけるリゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）のＦ７２７防除の評価
滅菌した大麦穀物にリゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）を接種し、１〜２週間インキュベートした。穀物は乾燥させ、配合し、砂と１：１の割合で混合し、リゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）接種物を作製した。土壌とこの接種物を完全に混合し、ポット当たりの土壌を５００ｍＬの体積にし、１００ｍＬの水をまき、２４時間成長ルーム内でインキュベートした。分離株Ｆ７２７の全細胞ブロスは１００％、５０％および２５％強度で調製した。次いで土壌に４０ｍＬの各ブロス希釈液を浸し、９個のダイズ種子をそれぞれのポットに植え付けた。各反復に関して、３ポットが存在し、処理当たり３回反復した。植物は成長ルームで１４日間インキュベートした。発芽、植物の高さ、新苗条重量および新根重量を評価した。
滅菌した大麦穀物にリゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）を接種し、１〜２週間インキュベートした。穀物は乾燥させ、配合し、砂と１：１の割合で混合し、リゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）接種物を作製した。土壌とこの接種物を完全に混合し、ポット当たりの土壌を５００ｍＬの体積にし、１００ｍＬの水をまき、２４時間成長ルーム内でインキュベートした。分離株Ｆ７２７の全細胞ブロスは１００％、５０％および２５％強度で調製した。次いで土壌に４０ｍＬの各ブロス希釈液を浸し、９個のダイズ種子をそれぞれのポットに植え付けた。各反復に関して、３ポットが存在し、処理当たり３回反復した。植物は成長ルームで１４日間インキュベートした。発芽、植物の高さ、新苗条重量および新根重量を評価した。
苗条立本数（表７）、出現率（表８）、平均苗条重量（表９）および平均苗条高さ（表１０）の測定値を決定した。結果は、Ｆ７２７全細胞ブロスは、リゾクトニアソラニ（Rhizoctonia solani）感染ダイズ植物において出現率、苗条重量および苗条高さが増大したことを示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細菌植物病原体のＦ７２７防除の評価
１ｍｌの滅菌水に、培養ジャガイモデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）プレート由来の一群の各細菌植物病原体、エルウィニアアミロボラ（Erwinia amylovora）、シュードモナスシリンゲ（Pseudomonas syringae）、バチルスセレウス（Bacillus cereus）、エルウィニアカロトボラ（Erwinia carotovora）、キサントモナスカンペストリス（Xanthomonas campestris）、キサントモナスアルボリコラ（Xanthomonas arboricola）またはクラビバクターミシガネンシス亜種ミシガネンシス（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）を接種した。細菌を再懸濁し、１００μＬの病原体再懸濁をＰＤＡ寒天プレートに画線培養し、１０〜１５分間プレートに吸収させた。滅菌フィルターディスクを寒天プレートに施用し、２０μＬのＦ７２７ＶＬＣ分画（１０ｍｇ／ｍＬ、メタノール中）またはＶＬＣ分画の組合せを充填した。前述の実施例５中に記載したように、Ｖ８培地でのバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の発酵から分画を得た。
１ｍｌの滅菌水に、培養ジャガイモデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）プレート由来の一群の各細菌植物病原体、エルウィニアアミロボラ（Erwinia amylovora）、シュードモナスシリンゲ（Pseudomonas syringae）、バチルスセレウス（Bacillus cereus）、エルウィニアカロトボラ（Erwinia carotovora）、キサントモナスカンペストリス（Xanthomonas campestris）、キサントモナスアルボリコラ（Xanthomonas arboricola）またはクラビバクターミシガネンシス亜種ミシガネンシス（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）を接種した。細菌を再懸濁し、１００μＬの病原体再懸濁をＰＤＡ寒天プレートに画線培養し、１０〜１５分間プレートに吸収させた。滅菌フィルターディスクを寒天プレートに施用し、２０μＬのＦ７２７ＶＬＣ分画（１０ｍｇ／ｍＬ、メタノール中）またはＶＬＣ分画の組合せを充填した。前述の実施例５中に記載したように、Ｖ８培地でのバチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の発酵から分画を得た。
プレートは２４〜４８時間インキュベートし、次いでＦ７２７分画に対する病原体の感受性を示す、フィルターディスク周辺の阻害領域の出現に関して調べた。結果は表１１中に示す。
最多数の細菌種の阻害は分画３で観察した。したがって、前の実施例５中に記載したように、この分画をさらなる分画化に供した。さらに分画５は、バチルスセレウス（Bacillus cereus）、エルウィニアカロトボラ（Erwinia carotovora）およびクラビバクター（Clavibacter）に対して抗細菌活性を示した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの真菌病原体発芽の防除に関する、異なる培地で調製したＦ７２７上清および粗製抽出物の評価
分離株Ｆ７２７に１２の異なる液体培地で発酵生産させた。上清および粗製抽出物サンプルは、用量応答胞子発芽アッセイで試験した。４８ウエルプレートにおいて、１００μＬの上清または粗製抽出物サンプルを１．５×ジャガイモデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）２００μＬと組み合わせ凝固させた。真菌植物病原体から表１２中に示す濃度で胞子懸濁液を調製し、５０μＬの胞子懸濁液をＰＤＡ／処理混合物の上部に分配した。プレートは３〜５日間２５℃でインキュベートし、真菌胞子発芽の目視評価を実施した。
分離株Ｆ７２７に１２の異なる液体培地で発酵生産させた。上清および粗製抽出物サンプルは、用量応答胞子発芽アッセイで試験した。４８ウエルプレートにおいて、１００μＬの上清または粗製抽出物サンプルを１．５×ジャガイモデキストロース寒天培地（ＰＤＡ）２００μＬと組み合わせ凝固させた。真菌植物病原体から表１２中に示す濃度で胞子懸濁液を調製し、５０μＬの胞子懸濁液をＰＤＡ／処理混合物の上部に分配した。プレートは３〜５日間２５℃でインキュベートし、真菌胞子発芽の目視評価を実施した。
結果は表１３中に示す。試験した全ての上清は、試験した最も低い濃度（３．１３％）で全病原体の発芽を阻害した。粗製抽出物の活性はＦ７２７細胞増殖のために使用した培地に応じて変化した（粗製抽出物の０．４％希釈が試験した最も低い濃度であった）。これは、Ｆ７２７抽出物の活性は細胞が増殖する培地に依存している可能性があり、したがって、特定病原体に対する最適活性は細胞が増殖する培地に基づき調整可能であることを示した。例えば、Ｍ２４培地を使用して、その抽出物がフサリウム（Fusarium）を標的化する細胞を増殖させることができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦ７２７の植物成長特性の評価
分離株Ｆ７２７を、リン酸塩を可溶化する能力、ＡＣＣ−デアミナーゼの生成、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）の生成、シデロフォアの生成（ＣＡＳ寒天培地）、および唯一の炭素源としてメタノールを用いて増殖する能力（ＡＭＳ寒天培地）を含め、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの植物成長特性に関して評価した。リン酸塩の可溶化はブロモフェノールブルーリン酸塩寒天培地で評価し、ＡＣＣ−デアミナーゼ活性は唯一の炭素源としてＡＣＣおよび窒素源を含む寒天培地プレートで評価し、シデロフォア生成はＣＡＳ寒天培地で評価し、メチル栄養性は唯一の炭素源としてメタノールを追加した無機塩寒天培地で評価した。表１４中に示すように、分離株Ｆ７２７は、これらの植物成長促進形質全てに関して陽性の結果を示した。
分離株Ｆ７２７を、リン酸塩を可溶化する能力、ＡＣＣ−デアミナーゼの生成、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）の生成、シデロフォアの生成（ＣＡＳ寒天培地）、および唯一の炭素源としてメタノールを用いて増殖する能力（ＡＭＳ寒天培地）を含め、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの植物成長特性に関して評価した。リン酸塩の可溶化はブロモフェノールブルーリン酸塩寒天培地で評価し、ＡＣＣ−デアミナーゼ活性は唯一の炭素源としてＡＣＣおよび窒素源を含む寒天培地プレートで評価し、シデロフォア生成はＣＡＳ寒天培地で評価し、メチル栄養性は唯一の炭素源としてメタノールを追加した無機塩寒天培地で評価した。表１４中に示すように、分離株Ｆ７２７は、これらの植物成長促進形質全てに関して陽性の結果を示した。
Ｆ７２７で処理した種子の活力分析
コーン、ダイズ、コムギ、コメ、ソルガムおよびトマト種子を１％漂白剤で６分間表面滅菌し、滅菌水で５回すすいだ。１０ｍＭ硫酸マグネシウムで調製したＦ７２７懸濁液中に２４時間種子を沈めた。種子は実験番号１に関して３０分間、および実験番号２に関して一晩乾燥させた。種子は湿らせたペーパータオル内で数日間発芽させ、種子の合計新鮮重量を測定した。
コーン、ダイズ、コムギ、コメ、ソルガムおよびトマト種子を１％漂白剤で６分間表面滅菌し、滅菌水で５回すすいだ。１０ｍＭ硫酸マグネシウムで調製したＦ７２７懸濁液中に２４時間種子を沈めた。種子は実験番号１に関して３０分間、および実験番号２に関して一晩乾燥させた。種子は湿らせたペーパータオル内で数日間発芽させ、種子の合計新鮮重量を測定した。
結果は表１５中に示し、バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７細胞がコーン、ダイズ、ソルガムおよびトマトの成長を促進したことを示す。
アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）に対する抗真菌活性
バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の発酵由来の全細胞ブロス（ＷＣＢ）を、果実浸漬アッセイにおいて、採取後病原体アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）に対するその阻害効果に関して評価した。ＷＣＢは非希釈、ならびに５％、２０％、および５０％の濃度まで滅菌水に希釈して使用した。
バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７の発酵由来の全細胞ブロス（ＷＣＢ）を、果実浸漬アッセイにおいて、採取後病原体アスペルギルスニガー（Aspergillus niger）に対するその阻害効果に関して評価した。ＷＣＢは非希釈、ならびに５％、２０％、および５０％の濃度まで滅菌水に希釈して使用した。
滅菌した青ブドウを各濃度のＷＣＢに５秒間浸し、次いでクリスパーボックス内のラックに置いた。果実を乾燥させた後、各ボックスに３×１０３個胞子／ｍｌに調節したアスペルギルスニガー（Aspergillus niger）の接種物を２４回噴霧した。１００ｍｌの脱イオン水をラック下の各ボックスに添加して湿度を増大させ、ボックスは密閉し室温でインキュベートした。処理当たり５ブドウをそれぞれ含有する、２つのクリスパーボックスを実験中に含めた。水処理を陰性対照として使用し、市販品Ｓｗｉｔｃｈを陽性対照として使用した。
各果実の疾患率を、各ブドウにおける菌糸体範囲を観察することにより測定した。結果は表１６中に示し、Ｆ７２７ＷＣＢが有意な抗アスペルギルス（Aspergillus）活性を表すことを示す。
コーンにおける成長促進
コーン種子を、ポット当たり１０種子の密度で、ポット土壌混合物、４インチ径を有するポットに植え付けた。植え付け時およびその後１週間で、種子ポットにＦ７２７全細胞ブロスを浸した。ポットは温室内でインキュベートした。ポット当たり合計１０植物と処理当たり９ポットを評価した。
コーン種子を、ポット当たり１０種子の密度で、ポット土壌混合物、４インチ径を有するポットに植え付けた。植え付け時およびその後１週間で、種子ポットにＦ７２７全細胞ブロスを浸した。ポットは温室内でインキュベートした。ポット当たり合計１０植物と処理当たり９ポットを評価した。
合計新鮮重量を２週間の成長後に記録した。（水を浸した）対照植物は２１．４８±４．０２ｇの平均新鮮重量を有しており、一方Ｆ７２７ＷＣＢを浸した植物は２６．５±３．５５ｇの平均新鮮重量を有していた。Ｍｉｎｉｔａｂ ＡＮＯＶＡ Ｔｕｋｅｙにより測定して、これらの差は統計学的に有意である。これらの結果は、Ｆ７２７ＷＣＢの成長促進活性に関するさらなる証拠を与える。
Ｆ７２７全細胞ブロスを用いた土壌浸漬によるレタスにおけるブレミアラクツカ（Bremia lactucae）べと病菌（Downy Mildew）の防除
べと病菌（Downy Mildew）ブレミアラクツカ（Bremia lactucae）の胞子を、培養ボックス中で成長させた感染植物由来の胞子含有葉を切断し、５０ｍｌ脱イオン水中で葉を振とうすることによって得た。次いで液体を１００μｍのナイロンメッシュを介して濾過した。濾過液中の胞子の数は血球計算器で数え、液体が５×１０４個胞子／ｍｌを含有するように脱イオン水で調節した。
べと病菌（Downy Mildew）ブレミアラクツカ（Bremia lactucae）の胞子を、培養ボックス中で成長させた感染植物由来の胞子含有葉を切断し、５０ｍｌ脱イオン水中で葉を振とうすることによって得た。次いで液体を１００μｍのナイロンメッシュを介して濾過した。濾過液中の胞子の数は血球計算器で数え、液体が５×１０４個胞子／ｍｌを含有するように脱イオン水で調節した。
全細胞ブロス（ＷＣＢ）を調製するため、バチルス（Bacillus）菌株Ｆ７２７を２５℃で２４〜７２時間ＳＰＹ培地で増殖させた。
レタス（栽培品種セルタス（Celtuce））をポット当たり６植物の密度で２．５インチポットに植え付けた。植物は１２時間の光周期で１６℃の成長チャンバー内で育てた。成長１０日後に、土壌に２０ｍｌのＦ７２７ＷＣＢを浸した。
浸漬後１時間で、約１ｍｌの前に記載したべと病菌（Downy Mildew）胞子懸濁液を、レタス植物のそれぞれのポットに噴霧した。接種後最初の４８時間は、カバーをかけたプラスチックトレイ内でポットをインキュベートした。その後それらは、１２時間の光周期で１６℃において８日間インキュベートした。
それぞれの子葉に関して、疾患状態であった葉表面の割合として疾患重度を評定し、植物のそれぞれのポットに関して平均重度を測定した。処理（土壌浸漬）植物と未処理対照（ＵＴＣ）植物に関する結果はｔ検定を使用して比較し、表１７および図１８中に示す。結果は、Ｆ７２７全細胞ブロスを土壌浸漬させたレタス植物における、べと病菌（Downy Mildew）疾患重度の統計学的に有意な低下を示す（ｐ＝０．００３６）。
キュウリにおけるスフェロテカフリジネア（Sphaerotheca fuliginea）べと病菌（Downy Mildew）の防除での、Ｆ７２７全細胞ブロスとバチルスアミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）の間の相乗作用
スフェロテカフリジネア（Sphaerotheca fuliginea）の接種物を、感染したキュウリの葉を脱イオン水ですすぎ、チーズクロスの２層を介してリンス液を濾過することにより調製した。
スフェロテカフリジネア（Sphaerotheca fuliginea）の接種物を、感染したキュウリの葉を脱イオン水ですすぎ、チーズクロスの２層を介してリンス液を濾過することにより調製した。
二真性葉段階で、キュウリ植物に２ｍｌの処理液を噴霧し（以下参照）、３時間乾燥させ、その後２．５×１０５個分生子／ｍｌの濃度でスフェロテカフリジネア（Sphaerotheca fuliginea）の接種物２ｍｌを葉にこすり付けることにより植物に接種した。
処理は以下の通りであった（処理当たり３反復）：
１．水（陰性対照）
２．Ｆ７２７全細胞ブロス（完全強度）
３．Ｆ７２７全細胞ブロス（５０％強度）
４．Ｆ７２７全細胞ブロス（完全強度）＋Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）（３ｌｂｓ．／エーカー）
５．Ｆ７２７全細胞ブロス（５０％強度）＋Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）（３ｌｂｓ．／エーカー）
６．Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）（３ｌｂｓ．／エーカー）
１．水（陰性対照）
２．Ｆ７２７全細胞ブロス（完全強度）
３．Ｆ７２７全細胞ブロス（５０％強度）
４．Ｆ７２７全細胞ブロス（完全強度）＋Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）（３ｌｂｓ．／エーカー）
５．Ｆ７２７全細胞ブロス（５０％強度）＋Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）（３ｌｂｓ．／エーカー）
６．Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）（３ｌｂｓ．／エーカー）
全細胞ブロスを調製するため、Ｆ７２７を５日間ＳＰＹ培地で増殖させた。Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）は、べと病菌（Downy Mildew）に対する活性を含めた広範囲の殺真菌活性を有する、市販のバチルスアミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）調製物（Ｃｅｒｔｉｓ ＵＳＡ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）である。
接種後、１０日間約２５℃の温度において成長ルーム内で植物をインキュベートし、このとき植物を疾患重度に関して目視評価し、それは疾患状態だった葉表面の割合として評価した。表１８中に示す結果はＭｉｎｉｔａｂ１６統計解析ソフトウエア（Ｍｉｎｉｔａｂ、Ｓｔａｇｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）を使用して解析し、コルビーの相乗作用係数の計算によって考えられる相乗作用を評価した。Colby(1967)「Calculating synergistic and antagonistic responses of herbicide combinations」Weeds15:20-22。
表１８中の結果は、Ｆ７２７全細胞ブロスは、完全強度と半強度の全細胞ブロスの両方に関して、それぞれ５．６と１．８のコルビーの相乗作用係数で、べと病菌（Downy Mildew）の防除においてＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌと強く相乗作用することを示す。
Ｆ７２７全細胞ブロスのタルク製剤を使用した植物の成長促進
タルク（１ｋｇ）、カルボキシメチルセルロース（１０ｇ）、炭酸カルシウム（１５ｇ）で構成される乾燥担体とＦ７２７全細胞ブロスを、１：１（ｗ／ｖ）乾燥担体混合物：ＷＣＢの割合で混合することによりタルク製剤を調製した。混合物は一晩混合させ、次いで微粉化処理に供した。この製剤は２形式で施用した。第１の方法では、溝内施用として種子（野生コーン）の下に、植え付け時に製剤を土壌に施用した。第２の方法では、タルク製剤を水に溶かし、これを使用して植え付け前に種子を一晩プライミングした。水は対照として使用した。植物は温室内で２週間成長させ、重量を測定した。
タルク（１ｋｇ）、カルボキシメチルセルロース（１０ｇ）、炭酸カルシウム（１５ｇ）で構成される乾燥担体とＦ７２７全細胞ブロスを、１：１（ｗ／ｖ）乾燥担体混合物：ＷＣＢの割合で混合することによりタルク製剤を調製した。混合物は一晩混合させ、次いで微粉化処理に供した。この製剤は２形式で施用した。第１の方法では、溝内施用として種子（野生コーン）の下に、植え付け時に製剤を土壌に施用した。第２の方法では、タルク製剤を水に溶かし、これを使用して植え付け前に種子を一晩プライミングした。水は対照として使用した。植物は温室内で２週間成長させ、重量を測定した。
これらの分析の結果は表１９および２０中に示す。溝内施用は平均新鮮重量の１６％の増加をもたらし（表１９）、一方でプライミングは平均新鮮重量の１５％の増加をもたらした（表２０）。したがってＦ７２７ＷＣＢは成長促進活性を有する。
Ｆ７２７全細胞ブロスの分画化
菌株Ｆ７２７を１リットルの適切な発酵培地（例えばＳＰＭ、ＳＰＹ、ＴＳＢ、Ｖ８）中で４８〜７２時間２５℃において増殖させた。室温において２時間１５５ｒｐｍで細胞懸濁液と樹脂を振とうすることにより、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７樹脂を用いて１リットルの全細胞ブロスを抽出した。樹脂と細胞塊はチーズクロスを介した濾過により回収し、脱イオン水で洗浄して塩を除去した。次いで樹脂、細胞塊、およびチーズクロスをアセトン中に２時間浸し、その後アセトンは濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で乾燥させ、粗製抽出物を得た。
菌株Ｆ７２７を１リットルの適切な発酵培地（例えばＳＰＭ、ＳＰＹ、ＴＳＢ、Ｖ８）中で４８〜７２時間２５℃において増殖させた。室温において２時間１５５ｒｐｍで細胞懸濁液と樹脂を振とうすることにより、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７樹脂を用いて１リットルの全細胞ブロスを抽出した。樹脂と細胞塊はチーズクロスを介した濾過により回収し、脱イオン水で洗浄して塩を除去した。次いで樹脂、細胞塊、およびチーズクロスをアセトン中に２時間浸し、その後アセトンは濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して真空下で乾燥させ、粗製抽出物を得た。
逆相Ｃ−１８真空液体クロマトグラフィーにより粗製抽出物を分画化した。前の分画化スキーム（実施例５および図１）では、殺有害生物活性は分画３（４０〜６０％メタノール留分）および４（６０〜８０％メタノール留分）で見られた。一分画中の活性量を最大にするため、逆相Ｃ−１８ＶＬＣ手順を表２１中に示すように変更し、５０〜８０％メタノール留分（分画４）を得た。次いで化合物Ａ、ＢおよびＣを、実施例５中に記載したようにＣ−１８HPLCにより分画４から精製した。
ＭＳ／ＭＳ分析により決定した化合物Ａの構造
分画４由来の分子量１０４４の化合物（化合物Ａ）をエレクトロスプレーイオン化質量分析／質量分析（ＥＳＩＭＳ／ＭＳ）により分析し、その構成アミノ酸の配列を得た。結果は図１９中に示す。これらの結果に基づき、化合物Ａは図２０中に示す環状ペプチド構造を有すると決定した。
分画４由来の分子量１０４４の化合物（化合物Ａ）をエレクトロスプレーイオン化質量分析／質量分析（ＥＳＩＭＳ／ＭＳ）により分析し、その構成アミノ酸の配列を得た。結果は図１９中に示す。これらの結果に基づき、化合物Ａは図２０中に示す環状ペプチド構造を有すると決定した。
化合物およびＶＬＣ分画の殺細菌活性
エルウィニアカロトボラ（Erwinia carotovora）、シュードモナスシリンジ（Pseudomonas syringae）、キサントモナスアルボリコラ（Xanthomonas arboricola）、アシドボラックスアベナエ亜種シトルリ（Acidovorax avenae subsp.citrulli）およびクラビバクターミシガネンシス亜種ミシガネンシス（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）をジャガイモデキストロース寒天培地に平板培養した。充分なバイオマスの蓄積後、一群の各病原体をそのプレートから除去し、滅菌水に懸濁した。１００ｕＬの各懸濁液をジャガイモデキストロース寒天プレートに画線培養し、１０〜１５分間プレートに吸収させた。
エルウィニアカロトボラ（Erwinia carotovora）、シュードモナスシリンジ（Pseudomonas syringae）、キサントモナスアルボリコラ（Xanthomonas arboricola）、アシドボラックスアベナエ亜種シトルリ（Acidovorax avenae subsp.citrulli）およびクラビバクターミシガネンシス亜種ミシガネンシス（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis）をジャガイモデキストロース寒天培地に平板培養した。充分なバイオマスの蓄積後、一群の各病原体をそのプレートから除去し、滅菌水に懸濁した。１００ｕＬの各懸濁液をジャガイモデキストロース寒天プレートに画線培養し、１０〜１５分間プレートに吸収させた。
実施例２５中に記載したＶＬＣ分画４および５、ならびに実施例２５中に記載したＶＬＣ分画４由来の化合物Ａ（分子量＝１０４４）、Ｂ（分子量＝１０５８）、およびＣ（分子量＝１０７２）のサンプルをメタノール中に５ｍｇ／ｍＬで調製し、各サンプルの２倍連続希釈液５セットを水で作製した（すなわち、０．１５６２５ｍｇ／ｍＬと５ｍｇ／ｍＬの間の濃度を２倍濃度増分で試験した）。滅菌フィルターディスクを寒天プレートに施用し、ディスクには２０ｕＬの各サンプルを充填した。プレートは２５℃で３日間インキュベートし、サンプルに対する病原体の感受性を示すフィルターディスク周辺の増殖阻害領域に関して次いで観察した。阻害を検出した場合、阻害活性を示すサンプルの最小濃度を決定した。結果は表２１中に示す。分画４および５はエルウィニアカロトボラ（Erwinia carotovora）およびクラビバクターミシガネンシス（Clavibacter michiganensis）に対する阻害活性を有し、一方化合物ＡおよびＢはアシドボラックスアベナエ（Acidovorax avenae）の増殖を阻害する。
化合物およびＶＬＣ分画の殺真菌活性
実施例２５中に記載したＶＬＣ分画４および５、ならびに実施例２５中に記載したＶＬＣ分画４由来の化合物Ａ（分子量＝１０４４）、Ｂ（分子量＝１０５８）、およびＣ（分子量＝１０７２）のサンプルをメタノール中に５ｍｇ／ｍＬで調製した。各サンプルの連続希釈液を４８ウエルプレートに調製した。試験した各サンプルの最高濃度は５００μｇ／ｍＬ（元の濃度の１０％）であり、その後サンプルは、３．９０６２μｇ／ｍＬの濃度まで水に２倍増分で連続希釈した。１００μＬのサンプル希釈液、次に２００μＬの１．５×ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）を各ウエルに添加し、次いで混合物を１０〜１５分間凝固させた。
実施例２５中に記載したＶＬＣ分画４および５、ならびに実施例２５中に記載したＶＬＣ分画４由来の化合物Ａ（分子量＝１０４４）、Ｂ（分子量＝１０５８）、およびＣ（分子量＝１０７２）のサンプルをメタノール中に５ｍｇ／ｍＬで調製した。各サンプルの連続希釈液を４８ウエルプレートに調製した。試験した各サンプルの最高濃度は５００μｇ／ｍＬ（元の濃度の１０％）であり、その後サンプルは、３．９０６２μｇ／ｍＬの濃度まで水に２倍増分で連続希釈した。１００μＬのサンプル希釈液、次に２００μＬの１．５×ジャガイモデキストロース寒天（ＰＤＡ）を各ウエルに添加し、次いで混合物を１０〜１５分間凝固させた。
コレトトリカムセレアレ（Colletotrichum cereale）、フサリウムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）、ボトリチスシネレア（Botrytis cinerea）、およびバーティシリウムダーリエ（Verticillium dahliae）をＰＤＡに平板培養し、菌糸体増殖がプレート全体を覆うまで、室温においてインキュベートした。滅菌水を各プレートに添加し、滅菌スプレッダーを使用して菌糸体と胞子を取り除いた。スラリーをフィルターに通し菌糸体と胞子を分離した。胞子は血球計算器で計数し、水で希釈することにより１０３〜１０４個胞子／ｍｌの濃度に調節した。
フィトフトラカプシシ（Phytophthora capsici）をＰＡＲＰ寒天培地で平板培養し、充分な菌糸体増殖を観察するまで室温において増殖させた。滅菌水をプレートに添加し、スプレッダーを使用して胞子を取り除いた。胞子嚢が遊走子を放出するまで、プレートは１〜２時間１６℃においてＣｏｎｖｉｒｏｎチャンバー内でインキュベートした。次いで胞子は試験管内に回収し、血球計算器で計数し、胞子懸濁液は水で１０３〜１０４個胞子／ｍｌの濃度に調節した。
各病原体由来の胞子溶液５０μＬをサンプルの各ウエルに接種した。プレートは２５℃で４〜５日間インキュベートし、サンプルに対する病原体の感受性を示すウエル中の胞子発芽の阻害に関して次いで観察した。阻害を検出した場合、阻害活性を示すサンプルの最小濃度を決定した。結果は表２２中に示す。
化合物Ａ、Ｂ、およびＣおよび分画４は、ピーカプシシ（P.capsici）以外、試験した全ての真菌病原体の胞子発芽を阻害した。化合物Ｃと分画４が最も高い阻害活性を示した。
生物材料の寄託
以下の生物材料が、ブダペスト条約、およびアグリカルチャーリサーチカルチャーコレクション（ＮＲＲＬ）、１８１５Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１６０４ＵＳＡの条件の下で寄託され、以下の番号が与えられた：
以下の生物材料が、ブダペスト条約、およびアグリカルチャーリサーチカルチャーコレクション（ＮＲＲＬ）、１８１５Ｎ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｐｅｏｒｉａ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ６１６０４ＵＳＡの条件の下で寄託され、以下の番号が与えられた：
この菌株は、本特許出願の訴訟係属中、この培養物へのアクセスが、特許商標庁長官により決定される寄託物および３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．１４および３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２２の下、そこに付与された商標に利用可能であることを確実にする条件下で寄託された。この寄託物は、寄託菌株の実質的に純粋な培養物を表す。本出願の相当物、またはその子孫が出願される諸外国の特許法により必要とされるとき、この寄託物は利用可能である。しかしながら、寄託物の利用が、行政措置により認可された特許権を侵害して、本発明を実践する権利をなすものではないことは理解されたい。
本明細書で記載し特許請求する本発明は、本明細書で開示する具体的態様に範囲が限定されるわけではない。これらの態様は、本発明の幾つかの態様の例証として考えられるからである。任意の均等な態様が本発明の範囲内にあると考えられる。実際、本明細書に示し記載する形態以外の本発明の様々な変更形態が、前述の記載から当業者には明らかとなる。このような変更形態も添付の特許請求の範囲内にあると考えられる。係争の場合、定義を含めた本開示を調整する。
様々な参照文献を本明細書に引用し、その開示はその全体が参照により組み込まれている。
Claims (22)
- バチルス（Bacillus）菌株の実質的に純粋な培養物であって、以下の特徴：
（Ａ）（１）配列番号３で示される１６ＳｒＲＲＮＡ配列と少なくとも９９．５％の同一性を有するヌクレオチド配列、
（２）配列番号１０で示されるｒｅｃＡ配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列、および
（３）配列番号１３で示される逆ｐｈｏＲ配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列
の少なくとも１つ、
（Ｂ）殺有害生物剤活性、
（Ｃ）カナマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、ペニシリン、セフロキシム、ピペラシリン、テトラサイクリンに耐性があること、
（Ｄ）アルカリホスファターゼ、エステラーゼ、酸性ホスファターゼ、ナフトール−ＡＳ−ＢＩ−ホスホヒドロラーゼ活性を有すること、および
（Ｅ）脊椎動物に対して非病原性であること
を有する培養物。 - 前記菌株がバチルス（bacillus）菌株Ｆ７２７（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−５０７６８）の少なくとも１つの識別特徴を有する、請求項１に記載の培養物。
- 請求項１に記載の培養物から得られる濾過物、上清、抽出物、細胞分画または全細胞ブロス。
- （ａ）（ｉ）バチルス種（Bacillus sp.）分離株Ｆ７２７から得られ、
（ｉｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０２０〜１０６０、より詳細には１０４４の分子量を有し、
（ｉｖ）δ７．１５、６．７２、４．８１、４．７０、４．６５、４．４０、４．３５、４．２５、４．１５、３．８５、３．６５、３．５０、３．２２、２．８５、２．８０、２．６５、２．４５、２．３５、２．３０、２．２０、１．９５、１．５５、１．３１、１．２０および０．８５の１ＨＮＭＲ値を有し、
（ｖ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｌｕｎａ５μＣ１８（２）１００Ａ、１００×４．６０ｍｍ）カラムで約６〜１２分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．３１分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｖｉ）４７個の炭素原子、７２個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含有し、
（ｖｉｉ）場合によってはグルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含むペプチドである化合物Ａ、
（ｂ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０３０〜１０８０、より詳細には１０５８の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約８分間、さらにより具体的には約８．６７分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）４８個の炭素原子、７４個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含み、
（ｖ）場合によってはグルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含むペプチドである化合物Ｂ、および
（ｃ）（ｉ）殺有害生物剤活性を有し、
（ｉｉ）液体クロマトグラフィー／質量分光分析（ＬＣ／ＭＳ）により測定して約１０５０〜１１２０、より詳細には１０７２の分子量を有し、
（ｉｉｉ）０．５ｍＬ／分の流速および２１０ｎｍでのＵＶ検出において、水：アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）勾配溶媒系（０〜２０分；９０〜０％水性ＣＨ３ＣＮ、２０〜２４分；１００％ＣＨ３ＣＮ、２４〜２７分；０〜９０％水性ＣＨ３ＣＮ、２７〜３０分；９０％水性ＣＨ３ＣＮ）を使用した逆相Ｃ−１８ＨＰＬＣカラムで約６〜１４分間、より具体的には約９分間、さらにより具体的には約９．１９分間の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）保持時間を有し、
（ｉｖ）４９個の炭素原子、７６個の水素原子、１２個の窒素原子、および１５個の酸素原子を場合によっては含み、
（ｖ）場合によってはグルタミン（１単位）、プロリン（１単位）、セリン（１単位）、チロシン（１単位）およびアスパラギン（３単位）を含むペプチドである化合物「Ｃ」
からなる群から選択される化合物。 - （ａ）（ｉ）請求項１に記載の培養物、
（ｉｉ）請求項１に記載の培養物の細胞分画、
（ｉｉｉ）請求項１に記載の培養物から得られる上清、
（ｉｖ）請求項１に記載の培養物から得られる濾過物、
（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）のいずれかの抽出物、
（ｖｉ）請求項１に記載の培養物によって生成する代謝産物、
（ｖｉｉ）化合物Ａ、
（ｖｉｉｉ）化合物Ｂ、
（ｉｘ）化合物Ｃ
からなる群から選択される第１の物質を、
（ｂ）場合によっては
（ｉ）１つまたは複数の化学的または生物学的殺有害生物剤、植物成長促進剤、抗植物病原体物質および化学肥料である第２の物質、および
（ｉｉ）少なくとも１つの担体、希釈剤、表面活性物質、またはアジュバントの少なくとも１つと組み合わせて含む組成物。 - 前記第２の物質が化学的または生物学的殺有害生物剤である、請求項５に記載の組合せ。
- 組合せが組成物である、請求項５に記載の組合せ。
- 植物における有害生物侵入を調節するための方法であって、
前記有害生物侵入を調節するのに有効な量の
（ａ）請求項１に記載の培養物、
（ｂ）請求項１に記載の培養物の細胞分画、
（ｃ）請求項１に記載の培養物から得られる上清、
（ｄ）請求項１に記載の培養物から得られる濾過物、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの抽出物、
（ｆ）請求項１に記載の培養物によって生成する代謝産物、
（ｇ）化合物Ａ、
（ｈ）化合物Ｂ、および
（ｉ）化合物Ｃ
からなる群から選択される組成物を、植物および／またはその種子および／または前記植物の成長に使用する基質に施用することを含む方法。 - 有害生物が真菌または細菌である、請求項８に記載の方法。
- 真菌がアスペルギルス（Aspergillus）、アルテルナリア（Alternaria）、ブレミア（Bremia）、スフェロテカ（Sphaerotheca）、コレトトリカム（Colletotrichum）、フザリウム（Fusarium）、ベルチシリウム（Verticillium）、ボトリチス（Botrytis）、スクレロティニア（Sclerotinia）、スクレロチウム（Sclerotium）、リゾクトニア（Rhizoctonia）およびビポラリス（Bipolaris）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 組成物が胞子発芽を阻害する、請求項１０に記載の方法。
- 細菌がバチルス（Bacillus）、エルウィニア（Erwinia）、アシドボラックス（Acidovorax）およびクラビバクター（Clavibacter）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 有害生物がフィトフトラ（Phytophthora）である、請求項８に記載の方法。
- 組成物が殺有害生物剤をさらに含む、請求項９に記載の方法。
- 有害生物が真菌であり、殺有害生物剤がレイノウトリアサカリネンシス（Reynoutria sachalinensis）（タデ）抽出物、Ｒｅｇａｌｉａ（登録商標）およびＤｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｅｌ５５（商標）からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
- 植物の成長および／または種子の発芽を調節するための方法であって、
前記植物、その成長基質、および／または前記植物の種子と
（ａ）請求項１に記載の培養物、
（ｂ）請求項１に記載の培養物の細胞分画、
（ｃ）請求項１に記載の培養物から得られる上清、
（ｄ）請求項１に記載の培養物から得られる濾過物、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの抽出物、
（ｆ）請求項１に記載の培養物によって生成する代謝産物、
（ｇ）化合物Ａ、
（ｈ）化合物Ｂ、および
（ｉ）化合物Ｃ
からなる群から選択される一定量の組成物を接触させることを含み、
前記量が前記植物の成長および／または前記種子の発芽を調節するのに有効である方法。 - 組成物が植物成長促進剤、表面活性物質、担体、アジュバント、および／または化学肥料をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
- 組成物がタルク製剤である、請求項１６に記載の方法。
- 殺有害生物剤および／または植物成長促進組成物を製剤化するための組成物の使用であって、組成物が
（ａ）請求項１に記載の培養物、
（ｂ）請求項１に記載の培養物の細胞分画、
（ｃ）請求項１に記載の培養物から得られる上清、
（ｄ）請求項１に記載の培養物から得られる濾過物、
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの抽出物、
（ｆ）請求項１に記載の培養物によって生成する代謝産物、
（ｇ）化合物Ａ、
（ｈ）化合物Ｂ、および
（ｉ）化合物Ｃ
からなる群の１つまたは複数から選択される使用。 - 殺有害生物剤または植物成長促進組成物が、
（ａ）殺有害生物剤、
（ｂ）植物成長促進剤、
（ｃ）担体、
（ｄ）アジュバント、
（ｅ）表面活性物質、
（ｆ）化学肥料、および
（ｇ）抗植物病原体物質
からなる群の１つまたは複数から選択される第２の物質をさらに含む、請求項１９に記載の使用。 - 殺有害生物剤が殺菌剤、殺真菌剤および殺線虫剤からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用。
- 殺有害生物剤がタデ抽出物およびＲｅｇａｌｉａ（登録商標）からなる群から選択される、請求項２１に記載の使用。
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