CN109890210A - 用于治疗柑橘绿化病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括农业生物试剂领域，并且提供用于预防和控制柑橘黄龙病(citrus huanglongbing)的微生物组合物以及其使用方法。

Description

用于治疗柑橘绿化病的组合物和方法
技术领域
本发明提供用于抑制柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter)感染或黄龙病(Huanglongbing disease)的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及植物防御诱导剂组合物和化合物，以及其用于改善植物和作物管理的某些方面的用途，包括治疗植物疾病、改善植物抵御疾病的能力、减少疾病症状、治疗HLB疾病、最小化由植物疾病引起的作物产量降低、改善作物产率以及提高作物质量。具体地说，可以使用化合物和组合物控制和治疗植物疾病，例如黄龙病(HLB)，以及缓解植物中HLB和柑橘黄龙病菌感染的疾病症状。预期本发明适用于作物植物，例如柑橘树。
背景技术
黄龙病(HLB)，通常称为柑橘“绿化”病，是由树木和其他作物物种的部分系统性细菌感染引起的，引起叶子变色并且降低果实产量。在佛罗里达(Florida)，侵袭性HLB疾病的传播造成对柑橘产业的主要威胁，柑橘产业由于这种感染引起的损失已达到每年数百万美元。因为昆虫载体已到达德克萨斯(Texas)和加利福尼亚(California)，疾病在这些州爆发也只是时间问题。
认为HLB与由三种韧皮杆菌物种引起的感染相关：对于在亚洲的疾病，柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus；Las)，对于在非洲的疾病，柑橘黄龙病菌非洲种(Candidatus Liberibacter africanus；Laf)，并且对于在美洲的疾病，柑橘黄龙病菌美洲种(Candidatus Liberibacter americanus；Lam)。统称为柑橘黄龙病菌属。
HLB的当前管理策略是以化学方式控制木虱并且搜寻和移除受感染的树木。其功效有限并且没有常规手段可显示对疾病的持续和有效抑制。
受HLB感染的树木的果实非常苦。果实在其成熟时的颜色甚至仍然保持绿色并且其尺寸较小。患有HLB疾病的树木将落叶，并且不久便会枯萎和死亡。频繁的昆虫控制和树木移除造成的高成本将最终导致柑橘园没有盈利，其引起对园艺和农业的严重损害。并且大规模施用杀虫剂将破坏生态系统并且污染环境。
因此，需要有效治疗HLB疾病。
发明内容
提供用于改善植物(包括重要的作物植物，如柑橘)的健康和抗病性的技术和组合物。所述方法还提供对受疾病影响或对疾病敏感的植物中的植物疾病的治疗和控制。可对植物施用本文中描述的根据本发明的实施例的微生物类组合物以治疗植物疾病，如HLB；改善抗病性；改善抵御疾病的能力；减少疾病症状；最小化由植物疾病引起的作物产量降低；改善柑橘中的作物产率和作物质量；以及提高柑橘中的果汁含量和果汁质量。因此，可以使用微生物类组合物为健康植物和患病植物带来益处。所描述的方法还涉及对植物施用组合物，包括通过注射或土壤浇灌方法施用于植物周围的土壤、施用于植物表面，如喷雾到植物或植物的一部分上，如通过叶面喷雾，或注射到植物中，如通过树干注射。本发明涵盖的植物包括任何植物，尤其作物植物，但也包括观赏类植物和柑橘属植物。
在一个方面中，本发明涉及生物杀虫剂治疗柑橘绿化病领域。更具体地说，本发明涉及发现赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、绿木霉菌(Trichoderma virens)或哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的菌株，其在将发酵的完全细胞培养液、滤液、上清液或提取物施用于植物、植物部分和/或果实时可以抑制柑橘黄龙病菌属的生长。
在另一个方面中，本发明涉及发现赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)的菌株，其在将发酵的完全细胞培养液、滤液、上清液或提取物施用于植物、植物部分和/或果实时可以抑制柑橘黄龙病菌属的生长。
在一个方面中，本发明涉及用菌株的发酵产物的滤液控制柑橘绿化病的方法，所述菌株包括(但不限于)：赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)，所述滤液在低达1％的浓度下也显示对柑橘绿化病的有效抑制。
在一个方面中，可以对植物、基质、植物部分、果实或植物根部施用单一真菌或真菌混合物以控制HLB疾病。
在另一个方面中，本发明涉及第一实施例(第1号实施例)，其包括柑橘绿化病控制组合物，所述组合物包含从以下收集的完全细胞培养液、滤液或上清液：赭曲霉(ATCC18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)发酵物。
在另一个方面中，本发明涉及柑橘绿化病控制组合物，其包含从赭曲霉(ATCC18412)或绿木霉菌发酵物收集的完全细胞培养液、滤液或上清液。
在一个方面中，涵盖包含以上实施例1的组合物的种子、植物部分、根部或果实。
在另一个方面中，实施例1可存在于选自由以下组成的群组的配制物中：可乳化浓缩物、可湿性粉末、可溶性液体、气雾剂、超低体积浓缩溶液、可溶性粉末、微胶囊、水分散性颗粒、流体、微乳液和纳米乳液。
本发明还涉及用于控制植物中的柑橘绿化病的方法方面，所述方法包含向植物、来自植物的植物部分、种子和/或基质施用可以有效控制所述柑橘绿化病的量的实施例1的组合物。或者，通过引入木质部或韧皮部中来投予实施例1的组合物。
在一个方面中，所述方法进一步包含将所述植物移植到所述生长基质中。
在另一个方面中，植物是柑橘植物。
在另一个方面中，赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)可以通过化学试剂或加热来杀死或溶解。或者，其可以通过热杀灭方法来杀死。
在一个方面中，实施例1的组合物还可以包括植物肥料或一或多种具有杀线虫、杀真菌或杀昆虫活性的试剂。
具体实施方式
尽管下文详细论述本发明的各种实施例的制作和使用，但应了解，本发明提供许多可体现在广泛多种特定情形中的适用发明概念。本文中所论述的特定实施例仅说明用于制作和使用本发明的具体方式，而不限制本发明的范围。
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文中所定义的术语具有与本发明相关领域中的一般技术人员所通常理解的含义。如“一(a/an)”和“所述(the)”等术语并不意欲仅指代单数实体，而是包括具体实例可用于说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施例，但是除了权利要求中所概述的之外，它们的使用不限制本发明。
如本文中所使用的术语“施用(applying/application)”、“投予”、“投药”和所有其同源词是指任何用于使植物与本文中所论述的微生物类组合物接触的方法。投药通常可以通过在与待治疗的植物相容的媒剂(即，植物学上相容的媒剂或载剂，如水性媒剂)中将组合物施用于植物或植物周围的土壤或通过注射到植物中来实现。可以使用任何施用方法，但是一种施用方法包括如本文中所描述的树干注射和叶面喷雾。其他方法包括通过注射、浸泡或喷雾来施用于植物周围的土壤，使得所施用的化合物可以与植物根部接触并且可以被根部吸收。
如本文中所定义，“来源于”意指从具体来源直接分离或获得，或作为替代方案，具有从具体来源分离或获得的物质或有机体的鉴定特征。在所述“来源”是有机体的情况下，"来源于"意指其可以从所述有机物本身或从用于培养或生长所述有机体的培养基分离或获得。
如本文中所使用，术语“柑橘”指柑橘属，芸香科(family Rutaceae)的任何植物，并且包括柚子(Citrus maxima/Pomelo)、香橼(Citrus medica/Citron)、大翼橙(Citrusmicrantha/Papeda)、蜜柑(Citrus reticulata/Mandarin orange)、枸橘(Citrustrifolata/trifoliate orange)、金橘(Citrus japonica/kumquat)、澳洲手指青柠(Citrus australasica/Australian Finger Lime)、澳洲圆形青柠(Citrus australis/Australian Round lime)、澳洲沙漠青柠(Citrus glauca/Australian Desert Lime)、白山青柠(Citrus garrawayae/Mount White Lime)、小柑橘(Citrus gracilis)(卡卡杜青柠(Kakadu Lime)或汉姆杜青柠(Humpty Doo Lime))、拉塞尔河青柠(Citrus inodora/Russel River Lime)、新几内亚野生青柠(Citrus warburgiana/New Guinea Wild Lime)、布朗河手指青柠(Citrus wintersii/Brown River Finger Lime)、哈密橘(Citrushalimii)(沙卡橘(limau kadangsa)、凯拉橘(limau kedut kera))；印地安野生橙子(Citrus indica/Indian wild orange)、马蜂橙(Citrus macroptera)和拉迪橘(Citruslatipes)。这一定义中还包括杂交物，例如墨西哥酸橙(Citrus.times.aurantiifolia/Keylime)、苦橙(Citrus.times.aurantium/Bitter orange)、波斯橙(Citrus.times.latifolia/Persian lime)、柠檬(Citrus.times.limon/Lemon)、黎檬(Citrus.times.limonia/Rangpur)、葡萄柚(Citrus.times.paradisi/Grapefruit)、甜橙(Citrus.times.sinensis/Sweet orange)、红橘(Citrus.times.tangerina/Tangerine)、卡里佐枳橙(Poncirus trifoliata.times.C.sinensis/Carrizo citrange)和任何其它已知的柑橘属的物种或杂交物。以其常用名知晓的柑橘包括皇家柠檬(Imperial lemon)、橘柚、柚橙(orangelo)、橘柑、金诺橘(kinnow)、清见橘(kiyomi)、明尼橘柚(Minneolatangelo)、白金柚、甜橙、丑橘、佛手柑(Buddha's hand)、香橼、柠檬、橙子、香柑、苦橙、血橙、加利蒙地亚橘(calamondin)、克莱门氏小柑橘(clementine)、葡萄柚、梅尔柠檬(Meyerlemon)、黎檬、红橘和香橙，并且这些也包括在柑橘或柑橘属的定义中。
如本文中所使用，术语“有效量”或“治疗有效量”意指任何可以发挥化合物或组合物的用途的量，例如治疗植物疾病、改善植物抵御疾病的能力、减少疾病症状、治疗HLB疾病、最小化由植物疾病引起的作物产量降低、改善作物产率和提高作物质量。
如本文中所定义，“完全细胞培养液”是指含有细胞、孢子和/或培养基的液体培养物。如果细菌或真菌在盘上生长，那么可以在水或其它液体或完全培养物中收集细胞。
术语“上清液”是指当在培养液中生长或从琼脂盘在另一液体中收集的细胞通过离心、沉降或所属领域中已知的其它手段被移除时剩余的液体。
如本文中所定义，“滤液”是指来自完全培养液培养物的已经穿过膜的液体。形成滤液的非限制性方式是使一或多种微生物发酵以产生完全细胞培养液，接着使培养液穿过膜，其中滤液是无细胞的。
如本文中所定义，“提取物”是指通过溶剂(水、清洁剂、缓冲剂)从细胞移除并且通过离心、过滤或其它方法从细胞分离的液体物质。
如本文中所定义，“代谢物”是指由微生物发酵产生的化合物、物质或副产物，或从微生物获得的上清液、滤液或提取物，所述微生物可以是细菌或真菌。
如本文中所定义，“所分离的化合物”基本上不含其它化合物或物质，例如纯度是至少约20％，优选纯度是至少约40％，更优选纯度是约60％，甚至更优选纯度是约80％，最优选纯度是约90％并且甚至最优选纯度是约95％，如通过分析型方法测定，包括(但不限于)色谱方法和电泳方法。
如本文中所定义，“载剂”是惰性、有机或无机材料(例如水)，活性成分与其混合或配制以促进其施用于植物或其它待处理的目标，或促进其存储、运输和/或处理。
如本文中所定义，术语“控制”或“调节”用于指改变HLB感染量或HLB的传播速率。举例来说，抑制HLB感染或传播速率，或防止HLB感染。
如本文中所定义，“灭活”微生物是指死亡的微生物，或不处于活性生长阶段的微生物(例如孢子)。灭活的非限制性方式包括热杀死或化学杀死。在一个实施例中，微生物可以溶解。
在一个实施例中，测试来源于从赭曲霉、绿木霉菌或哈茨木霉收集的真菌组合物的发酵的培养液培养物的培养物上清液或滤液对柑橘绿色病细菌的抑制。
在另一实施例中，测试经培养的完全细胞培养液、上清液或滤液对柑橘绿色病细菌的抑制，所述经培养的完全细胞培养液、上清液或滤液是来源于从以下收集的真菌组合物的发酵的培养液培养物：赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)。
本文中所披露的真菌可以使用所属领域中已知的方法在营养物培养基中培育。有机体可以在允许细胞生长的条件下，通过振荡烧瓶培养、在合适的培养基中进行的在实验室或工业发酵器中的小规模或大规模发酵(包括(但不限于)连续、分批、分批进料或固态发酵)来培养。培养可以在包含碳和氮气来源以及无机盐的合适的营养物培养基中，使用所属领域中已知的程序进行。合适的培养基可以从商业来源获得或可以根据已公开的论文制备。
真菌组合物可以使用所属领域中已知的方法施用。具体地说，这些组合物可以施用于并且围绕植物或植物部分。在本文的上下文中，植物应理解为意指所有植物和植物群体，如所需和非所需的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可以是可以通过常规植物育种和最佳化方法，或通过生物技术和基因改造方法，或通过这些方法的组合获得的植物，包括转基因植物并且包括受植物育种者权利保护或不受其保护的植物品种。植物部分应理解为意指植物在地面上方和下方的所有部分和器官，如枝条、树叶、花和根，可能提及的实例是叶子、针叶、秆、茎、花、果实体、果实、种子、根、块茎和根茎。植物部分还包括收获的物质，以及无性和有性繁殖物质，例如插条、块茎、根茎、分枝和种子。用上文阐述的组合物处理植物和植物部分可以直接进行或通过使组合物通过例如浸没、喷雾、蒸发、雾化、分散、喷涂或注射来对植物的周围环境、生境或储存空间起作用来进行。在组合物施用于种子的情况下，使用所属领域中已知的一或多种涂层使用方法，组合物可以在种植种子之前以一或多个涂层的形式施用于种子，或在种植时以浆料或粉尘形式施用。在具体实施例中，种子可以是以基因方式修饰的晶种。
本文中所披露的组合物可以按以下模式中的任一种进行配制以用于种子处理：干燥粉末、水可浆化粉末、液体熔液、可流动浓缩物或乳剂、乳液、微胶囊、凝胶或水可分散颗粒。
在干燥粉末的情况下，活性成分与可湿润粉末类似地配制，但添加如矿物油等粘着剂而非湿润剂。举例来说，根据由莱达古玛(Nandakumar)等人(2001)所描述的方法，在无菌条件下混合一千克纯化滑石粉末(灭菌12小时)、15g碳酸钙以及10g羧甲基纤维素。以1:2.5比率(悬浮液比干燥混合物)混合一或多种活性成分，并且阴干产物以将水分含量降低到20-35％。
在一个实施例中，组合物可以包含从来自以下的菌株收集的完全细胞培养液培养物、液体培养物、滤液或悬浮液：赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)发酵物。
上文阐述的组合物可以按任何方式配制。非限制性配制物实例包括(但不限于)可乳化浓缩物(EC)、可湿性粉末(WP)、可溶性液体(SL)、气雾剂、超低体积浓缩溶液(ULV)、可溶性粉末(SP)、微胶囊、水分散性颗粒、流体(FL)、微乳液(ME)、纳米乳液(NE)等。在本文中所描述的任何配制物中，活性成分的百分比在0.01％到99.99％范围内，
组合物还可以选自多种配制物类型，包括可尘化粉末(DP)、可溶性粉末(SP)、水溶性颗粒(SG)、水分散性颗粒(WG)、可湿润粉末(WP)、颗粒(GR)(缓慢或快速释放)、可溶性浓缩物(SL)、油可混溶的液体(OL)、超低容量液体(UL)、可乳化浓缩物(EC)、可分散浓缩物(DC)、乳液(水包油(EW)和油包水(EO)两种)、微乳液(ME)、悬浮液浓缩物(SC)、基于油的悬浮液浓缩物(OD)、气雾剂、成雾/烟雾配制物、胶囊悬浮液(CS)以及种子处理剂配制物。在任何实例中所选择的配制物类型取决于所设想的具体目的以及真菌的物理、化学和生物学特性。
组合物还可以呈液体、凝胶或固体形式。可以通过使固体载剂悬浮于一或多种活性成分的溶液中，并且在温和条件下干燥所述悬浮液(如在室温下蒸发或在65℃或更低的温度下真空蒸发)来制备固体组合物。组合物可以包含用凝胶囊封的活性成分。这类凝胶囊封的物质可以通过以下方式制备：混合胶凝形成剂(例如明胶、纤维素或木质素)与活的或灭活的真菌的培养物或悬浮液或真菌培养物或悬浮液的无细胞滤液或细胞溶离份，或喷雾或冷冻干燥的培养物、细胞或细胞溶离份或在本发明的方法中使用的抗菌化合物的溶液中；并且诱导试剂的凝胶形成。
组合物可以另外包含用于以下目的的表面活性剂：乳化、分散、湿润、扩散、整合、控制崩解、稳活性成分以及改善流动性或抑制衰退。在具体实施例中，表面活性剂是无植物毒性的非离子型表面活性剂，其优选属于EPA清单4B(以引用的方式并入本文中)。在另一个具体实施例中，非离子型表面活性剂是聚氧乙烯(20)单月桂酸酯。表面活性剂的浓度可以在全部配制物的0.1％-35％之间的范围内，优选范围是5-25％。通过组合物的性质和试剂促进本发明的组合物分散的能力来确定分散剂和乳化剂的选择，如非离子型、阴离子型、两性和阳离子型分散剂和乳化剂，以及所使用的量。
组合物还可以包括(但不限于)氨基糖苷抗生素，其包括许多对植物、真菌和动物细胞具有毒性的分子(例如卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、健大霉素(gentamycin)、衍生物G418和巴龙霉素(paromycin))(奈普(Nap)等人1992)，以及细菌性新霉素磷酸转移酶II和艾洛西丁(aerocyanidin)、艾洛卡文(aerocavin)、3,6-二羟基-吲哚噁嗪和单酰胺菌素SB-26.180。
如上所述，上述组合物和物质可以用于调节植物、其种子、根部、果实、叶子、茎干、块茎中的柑橘黄龙病菌属感染量，并且具体地说，抑制和/或防止所述柑橘黄龙病菌属感染，具体地说，降低所述植物中所述柑橘黄龙病菌属感染的传播率和/或传播程度。并且，植物包括(但不限于)果实(例如草莓、蓝莓、黑莓、桃子和其它核果类果实)、植物(例如番茄、笋瓜、胡椒、茄子、马铃薯、胡萝卜)或谷物作物(例如大豆、小麦、大米、玉米、高粱)、树木、花、观赏类植物、灌木(例如棉花、玫瑰)、鳞基植物(例如洋葱、大蒜)或藤本植物(例如葡萄藤)、草皮、块茎(例如马铃薯、胡萝卜、甜菜)。或者，所述组合物可以用于调节植物中柑橘黄龙病菌属感染量并且具体地说，防止或抑制所述柑橘黄龙病菌属感染和/或降低所述植物中所述疾病感染的传播率和/或传播程度。并且，植物包括(但不限于)果实(例如草莓)、植物(例如番茄、笋瓜、胡椒、茄子)或谷物作物(例如大豆、小麦、大米、玉米)、树木、花、观赏类植物、灌木(例如棉花、玫瑰)、鳞基植物(例如洋葱、大蒜)或藤本植物(例如葡萄藤)。
在另一实施例中，可以通过不同途径将组合物递送到植物中。组合物可以适当地以气雾剂形式投予，例如通过喷雾到叶子或其它植物物质上。也可以通过注射来投予颗粒，例如直接注射到植物中，如注射到茎干中。在某些实施例中，将组合物投予到根部。这可以通过用组合物对植物根部进行喷雾或浇水来实现。在其它实施例中，将颗粒引入木质部或韧皮部，例如通过注射或包括于供应到木质部或韧皮部中的供水系统中。
本文中所披露的组合物还可以与种衣剂组合使用。这类种衣剂包括(但不限于)乙二醇、聚乙二醇、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、泥煤苔、树脂和蜡或具有单一位点、多位点或未知作用模式的化学杀真菌剂或杀细菌剂。
在另一实施例中，本发明的组合物可以通过切割植物根部的顶端并且将其浸泡于以下的不同浓度的发酵的完全细胞培养液、滤液、上清液或提取物中来施用：赭曲霉(ATCC18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)发酵物。
本文中阐述的组合物可以与另一种微生物和/或杀虫剂(例如杀线虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂)组合。微生物可以包括(但不限于)来源于以下的试剂：芽孢杆菌属(Bacillussp.)(例如坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、苏力菌(Bacillus thuringiensis)、短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、淀粉消化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草杆菌(Bacillus subtilis))、拟青霉菌属(Paecilomyces sp.)(淡紫拟青霉菌(P.lilacinus))、巴斯德氏芽菌属(Pasteuria sp.)(穿透巴斯德菌(P.penetrans))、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽孢短杆菌属(Brevabacillus sp.)、轮枝菌属(Lecanicillium sp.)、白粉寄生孢属(Ampelomycessp.)、南极假丝酵母属(Pseudozyma sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)(比基尼链霉菌(S.bikiniensis)、哥斯达黎加链霉菌(S.costaricanus)、阿维链霉菌(S.avermitilis))、伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、胶霉属(Gliocladiumsp.)、阿佛菌素(avermectin)、漆斑菌属(Myrothecium sp.)、拟青霉菌属(Paecilomycesspp.)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)、线虫捕捉菌属(Arthrobotrys sp.)、绿盘菌属(Chlorosplrnium)、螺菌属(Neobulgaria)、轮层炭菌属(Daldinia)、曲霉属(Aspergillus)、毛壳菌属(Chaetomium)、溶杆菌属(Lysobacter spp)、巴氏粒毛盘菌(Lachnum papyraceum)、亚厚孢轮枝孢(Verticillium suchlasporium)、少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)、厚垣轮孢枝霉(Verticillium chlamydosporium)、罗氏被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)、厚垣普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、发光类脐菇(Omphalotus olearius)、日本亮耳菌(Lampteromyces japonicas)、单胞菌属(Brevudimonas sp.)或麝香霉属(Muscodor sp.)。
或者，组合物可以与具有杀线虫、杀真菌和/或杀虫活性的天然油或油产品(例如石蜡油、茶树油、柠檬草油、丁香油、肉桂油、柑桔油(包括(但不限于)苦橙、橙、柠檬)、迷迭香油、除虫菊、多香果、香柑、蓝桉、洋甘菊、香茅、常见茉莉花、欧洲刺柏、常见熏衣草、常见没药、薄荷、小苍兰、灰神圣亚麻、神香草、圣罗勒、土沉香树、茉莉花、熏衣草、万寿菊、薄荷、胡椒薄荷、金盏花、留兰香、依兰树、皂苷)组合。此外，组合物可以与单一位点抗真菌剂一起添加，所述抗真菌剂可以包括(但不限于)苯并咪唑、去甲基化抑制剂(DMI)(例如咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯氨基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外部抑制剂、喹啉、二甲酰亚胺、甲酰亚胺、苯基酰胺、苯氨基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烃、肉桂酸、羟基苯胺、抗生素、多氧菌素、酰胺、邻苯二甲酰亚胺、苯型(xylylalanine)；选自由以下组成的群组的去甲基化抑制剂：咪唑、哌嗪、嘧啶和三唑(例如联苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、三唑酮、糠菌唑、环丙唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑)、腈菌唑以及醌外部抑制剂(例如嗜球果伞素)。嗜球果伞素可以包括(但不限于)亚托敏(azoxystrobin)、醚菌酯(kresoxim-methoyl)或三氟敏(trifloxystrobin)。在另一具体实施例中，抗真菌剂是醌，例如喹氧灵(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。抗真菌剂也可以来源于虎杖(Reynoutria)提取物。
投药方法
所属领域的技术人员了解向植物施用基于微生物的组合物以用于表面施用或吸收的各种方法，并且本发明中涵盖使用这些方法中的任一种。作为非限制性实例，对植物进行投药的方法包括施用于植物的任何部分，通过包含于灌溉水中、通过注射到植物中或注射到植物周围的土壤中、通过使根系统暴露于含有化合物的水性溶液、通过用于水耕或气培系统中、通过在含有诱导剂的培养基中培养个别植物细胞或植物细胞群、通过种子处理剂、通过使用于接枝的柑橘植物的插条暴露于含有化合物的水性溶液、通过施用于根部、茎干或叶子或通过施用于植物内部或所处理的植物的任何部分。涵盖所属领域的技术人员已知的任何手段。一种投药模式包括在植物根部处、植物根部上或植物根部附近施用组合物，或树干注射。
基于微生物的组合物的施用可以在苗圃环境、温室、水耕设备中，或在田野中，或在任何需要处理植物以防止可能的疾病或治疗疾病和其影响的环境中进行，例如在已暴露于或可能变成暴露于HLB或柑橘黄龙病菌感染的植物中。本发明的方法和化合物可以用于治疗由任何柑橘黄龙病菌物种或类型引起的感染并且可以用于改善未受感染的植物中的植物抵抗力。因此，在本发明的情形下，任何有需要的植物包括任何和所有需要改良健康和活力、生长和产率或抵抗疾病的能力的植物。本发明涵盖柑橘或其它对疾病(如HLB或由柑橘黄龙病菌物种引起的感染)敏感的植物，无论目前受到感染或具有潜在感染危险。
对种子的施用可以如下实现，但也可以使用所属领域中已知的任何方法。可在种植之前，通过使种子在含有某一活性成分剂量的化合物的溶液中浸泡数分钟或数小时，或通过用含有某一活性成分剂量的化合物的载剂涂布种子，对种子进行处理或拌种。浓度、体积和持续时间可以视植物而变化。
对土壤的施用可以通过土壤注射或土壤浇灌来进行，但也可以使用所属领域中已知的任何方法。这些投药方法可以如下实现。土壤浇灌可以通过将含有某一活性成分剂量的化合物的溶液或媒剂以0.5到1加仑/树木倒入距离底座顶面上的树干10到100cm内的新月形的土壤表面以最小化径流来进行，和/或通过使用灌溉系统进行。土壤注射可以通过使用土壤注射器将含有某一活性成分剂量的化合物的溶液或媒剂直接注射到距离树干10到100cm内的土壤中来进行。浓度、体积和持续时间可以视植物而变化。
对水耕或培养基的施用可以如下进行，但也可以使用所属领域中已知的任何方法。可以将含有某一活性成分剂量的化合物的溶液或媒剂以适用于植物生长和发育的最终浓度添加到水耕或培养基中。浓度和体积可以视植物而变化。
对根部的施用可以通过在实验室、苗圃或水耕环境中将根部结构浸泡于溶液或媒剂中，或通过如上文所描述对根部周围的土壤进行土壤注射或土壤浇灌来进行。根部结构的浸泡可以如下进行，但也可以使用所属领域中已知的任何方法。可以通过使用根部给料器以0.5到1加仑/树木将含有某一活性成分剂量的化合物的溶液或媒剂施用于根部。浓度、体积和持续时间可以视植物而变化。
对植物的茎干或叶子的施用可以通过对植物的所需区域的喷雾或其它直接施用方法来进行，但也可以使用所属领域中已知的任何方法。对含有某一活性成分剂量的化合物的溶液或媒剂可以用喷雾器施用于茎干或叶子直到径流以确保完全覆盖，并且在生长季节中重复三次或四次。浓度、体积和重复处理可以视植物而变化。
在本发明中，以下表面活性剂可以与上文所提及的微生物发酵物一起使用以促进乳化、分散、溶解和渗透。
非离子型表面活性剂的非限制性实例包括脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧亚烷基脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧亚烷基脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧亚烷基甘油脂肪酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚氧亚烷基聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、树脂酸酯、聚氧亚烷基树脂酸酯、聚氧亚烷基烷基醚、聚氧亚烷基烷基苯基醚、烷基(聚)糖苷和聚氧亚烷基烷基(聚)糖苷。优选地，可以使用不具有氮原子的含有醚基的非离子型表面活性剂和含有酯基的非离子型表面活性剂。
阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括羧酸、磺酸、含有硫酸酯基的表面活性剂和含有磷酸酯基的表面活性剂，以及含有羧酸和磷酸酯基的表面活性剂。
羧酸表面活性剂的非限制性实例包括具有6-30个碳原子的脂肪酸或其盐、多羟基羧酸盐、聚氧化烯烷基醚羧酸盐、聚氧亚烷基烷基酰胺醚羧酸盐、洛定酸(rhodinic acid)盐、二聚酸盐、聚合物酸盐和松油脂肪酸盐。
磺酸表面活性剂的非限制性实例包括烷基苯磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基萘磺酸盐、萘磺酸盐、二苯基醚磺酸盐、烷基萘磺酸的缩合物和萘磺酸的缩合物。
含有硫酸酯基的表面活性剂的非限制性实例包括烷基硫酸酯盐(烷基硫酸盐)、聚氧亚烷基烷基硫酸酯盐(聚氧亚烷基烷基硫酸盐)、聚氧亚烷基烷基苯基醚硫酸盐、三苯乙烯化酚硫酸酯盐、聚氧亚烷基二苯乙烯化酚硫酸酯盐和烷基多糖苷硫酸盐。
含有磷酸酯基的表面活性剂的非限制性实例包括烷基磷酸酯盐、烷基苯基磷酸酯盐、聚氧亚烷基烷基磷酸酯盐和聚氧亚烷基烷基苯基磷酸酯盐。
盐的非限制性实例包括金属盐(如Na、K、Ca、Mg和Zn的盐)、铵盐、烷醇胺盐和脂肪族胺盐。
两性表面活性剂的非限制性实例包括含有氨基酸基团、含有甜菜碱基团、含有咪唑啉基团和含有氧化胺基团的表面活性剂。
含有氨基酸基团的表面活性剂的非限制性实例包括酰基氨基酸盐、酰基肌氨酸盐、丙烯酰基甲基氨基丙酸盐、烷基氨基丙酸盐和酰胺乙基羟基乙基甲基羧酸盐。
含有甜菜碱基团的表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基甜菜碱、烷基羟基乙基甜菜碱、酰基酰胺丙基羟基丙基氨磺基甜菜碱、酰基酰胺丙基羟基丙基氨磺基甜菜碱和蓖麻醇酸酰胺丙基二甲基羧基甲基氨甜菜碱。
含有咪唑啉基团的表面活性剂的非限制性实例包括烷基羧基甲基羟基乙基咪唑啉甜菜碱和烷基乙氧基羧基甲基咪唑啉甜菜碱。
含有氧化胺基团的表面活性剂的非限制性实例包括氧化烷基二甲基胺、氧化烷基二乙醇胺和氧化烷基酰胺丙基胺。
可以使用一种类型的上文所提及的表面活性剂，并且可以使用两种或更多种类型的上文所提及的表面活性剂的混合物。在这些表面活性剂中的一种包含聚氧亚烷基的情况下，所述聚氧亚烷基可以是聚氧乙烯基并且所添加的聚氧乙烯基的平均摩尔数可以是1到50。
作为表面活性剂，可以使用至少一种选自含有酯基的非离子型表面活性剂、不具有氮原子的含有醚基的非离子型表面活性剂、两性表面活性剂、羧酸阴离子型表面活性剂和磷酸阴离子型表面活性剂的化合物。
以下肥料组分可以与上文所提及的微生物发酵物一起使用。其具体实例可以是无机或有机化合物，其可以提供如N、P、K、Ca、Mg、S、B、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、Si和Na等元素，尤其N、P、X、Ca和Mg。这类无机化合物的实例包括硝酸铵、硝酸钾、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、硝酸钠、脲、碳酸铵、磷酸钾、过磷酸钙、稠合磷酸盐肥料(3MgO.CaO.P2O5.3CaSiO2)、硫酸钾、氯化钾、石灰的硝酸盐、熟石灰、石灰的碳酸盐、硫酸镁、氢氧化镁和碳酸镁。有机化合物的实例包括飞禽粪便、牛粪、树皮堆肥、氨基酸、蛋白胨、氨基酸溶液、发酵提取物、有机酸(如柠檬酸、葡萄糖酸和丁二酸)的钙盐以及脂肪酸(如甲酸、乙酸、丙酸、辛酸、癸酸和己酸)的钙盐。这些肥料组分可以与表面活性剂一起使用。在肥料组分作为基础肥料充分施用于土壤的情况下(如在稻谷植物或蔬菜的室外培养中所见)，无需混合肥料组分。
实例
实例1
因为柑橘黄龙病菌属不在受感染植物的外部活体外生长，使用新月裂杆菌(Liberibacter crescens)作为所属领域中已知的活体外模型，作为HLB抑制的指示。
在这种分析法中，通过使柑橘黄龙病菌在候选微生物滤液(无细胞)存在下，在不同浓度下生长2天以观察哪些抗菌剂和哪些浓度可以抑制生长来测试每种抗微生物化合物。通过将细菌/抗微生物混合物与PrestoBlue Cell Viability试剂(一种在活细胞存在下从蓝色和无荧光变成红色和显著荧光的荧光团)一起培育来定量生长量。使用荧光微板读数仪检测这种荧光变化并且显示于表1中。
表1
尽管一些样品含有相同物种属名称，但其是相同物种的不同菌株。
此外，还测试高达25％的更高浓度(未图示)并且呈现平均>95％抑制。
实例2
温室分析法
将使用接枝后五到八个月并且未用系统性杀虫剂处理的年龄为一年的单茎干柑橘树进行分析法。在足够大的盆中提供树木，由此在本分析法持续期间不会变成根部缠绕。将树木保持在无木虱温室中并且在开始主动冲洗时输送。将树木与被柑橘黄龙病菌亚洲种感染的柑橘木虱(Diaphorina citri)一起置放于生长室中直到树木被均匀感染。在植物接种之后收集木虱的子样品以确认昆虫的柑橘黄龙病菌亚洲种感染率。接着，以物理方式移除木虱并且向树木施用杀虫皂，接着移送到无木虱温室中。
在处理之前，从每棵树移出四片叶子以使用qPCR检测初始效价(T0)，两片来自树木顶端的每一侧并且两片来自树冠底部的每一侧。接着，通过叶面气雾剂、土壤浸液或根部输注，用发酵的赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL67415)完全细胞培养液或滤液处理树木。通过根部输注来分析先前已证实未通过叶面施用进入韧皮部的抗微生物物质。
对于根部输注，从每棵植物分离一条侧根，但保持连接到主根部系统。在温和清洁培养基的侧根之后使用这一完整根部，在无菌蒸馏水下切割根部顶端并且将切割的顶端放入塑料管中。将物质注射到管中并且使其注入树木中。在处理后第三十天，从与T0样品类似的位置移出四片叶子并且用于监测抗微生物物质的移动。分析法由十份感染/处理和十份健康/处理样品组成，还存在十份健康的未处理和十份被感染的未处理样品。在健康/处理树木中评估植物毒性，并且通过与健康/未处理对照物比较落叶、叶焦病和变色来测定。进行qPCR并且显示对植物中柑橘黄龙病菌感染的抑制。
生物材料的寄存
以下生物材料已由农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research CultureCollection，NRRL)(美国伊利诺伊州61604皮奥里亚市北方大学街1815号(1815N.University Street,Peoria,Illinois 61604,USA))根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)寄存，并且所述生物材料具有以下编号：
所述菌株已经在以下条件下进行寄存：确保在本专利申请案等待审查期间，由专利商标委员会根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122所授权的人可以获得培养物。寄存物表示寄存菌株的基本上纯的培养物。视需要可以在已申请本申请书的同族专利或其成果的国家根据外国专利法获得寄存物。但是，应理解，寄存物的可获得性不构成以废除政府活动所授予的专利权的形式实践本发明的许可。
使用词语“一”在结合术语“包括”用在权利要求书和/或说明书中时可以指“一个”，而且其还符合“一或多个”、“至少一个”以及“一个或超过一个”的含义。尽管本发明支持提及单独替代物和“和/或”的定义，但是除非明确指示提及单独替代物或替代物相互排斥，否则权利要求书中使用的术语“或(or)”用于指“和/或(and/or)”。在整个本申请案中，术语“约”用于指示一个值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变化，或在研究受试者间存在的变化。
如本说明书和权利要求书中所用，词语“包含”(和包含(comprising)的任何形式，如“comprise”和“comprises”)、“具有”(和具有(having)的任何形式，如“have”和“has”)、“包括”(和包括(including)的任何形式，如“includes”和“include”)或“含有”(和含有(containing)的任何形式，例如“contains”和“contain”)是包含性或开放性的，并且不排除其它未列出的要素或方法步骤。
如本文所用，术语“或其组合”是指在所述术语前面的所列项目的所有排列和组合。举例来说，“A、B、C或其组合”意图包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在具体情况下次序是重要的，那么还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续本实例，明确包括含有一或多个项目或术语的重复的组合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。所属领域的技术人员将了解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语的数量的限制。
本文中所披露和要求的所有组合物和/或方法都可以根据本发明在无不当实验的情况下制造和执行。虽然已根据优选实施例描述本发明的组合物和方法，但是所属领域的技术人员将显而易见，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下改变组合物和/或方法以及本文中所述方法的步骤或步骤的顺序。对所属领域的技术人员显而易见的所有这类类似取代和修改视为在由所附权利要求书所定义的本发明的精神、范畴和概念内。

Claims (12)

1.一种柑橘绿化病控制真菌组合物，其包含(i)从赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、绿木霉菌(Trichoderma virens)或哈茨木霉(Trichoderma harzianum)发酵物收集的完全细胞培养液或滤液；和(ii)载剂、稀释剂、佐剂或表面活性剂。
2.一种柑橘绿化病控制真菌组合物，其包含(i)从赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL 67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL 67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)发酵物收集的完全细胞培养液或滤液；和(ii)载剂、稀释剂、佐剂或表面活性剂。
3.一种植物或植物部分，其包含根据权利要求1所述的组合物。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述真菌菌株存在于选自由以下组成的群组的配制物中：可乳化浓缩物、可湿性粉末、可溶性液体、气雾剂、超低体积浓缩溶液、可溶性粉末、微胶囊、水分散性颗粒、可流动剂、微乳液和纳米乳液。
5.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含植物肥料或一或多种具有杀线虫、杀真菌或杀昆虫活性的试剂。
6.一种控制植物中的柑橘绿化病的方法，其包含
向所述植物、来自所述植物的植物部分、种子和/或基质施用能够有效控制所述柑橘绿化病的量的根据权利要求1所述的组合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包含将所述植物移植到所述生长基质中。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述植物是柑橘植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述柑橘是选自由以下组成的群组：柚子(Citrusmaxima/Pomelo)；香橼(Citrus medica/Citron)；大翼橙(Citrus micrantha/Papeda)；蜜柑(Citrus reticulata/Mandarin orange)；枸橘(Citrus trifolata/trifoliateorange)；金橘(Citrus japonica/kumquat)；澳洲手指青柠(Citrus australasica/Australian Finger Lime)；澳洲圆形青柠(Citrus australis/Australian Round lime)；澳洲沙漠青柠(Citrus glauca/Australian Desert Lime)；白山青柠(Citrusgarrawayae/Mount White Lime)；小柑橘(Citrus gracilis)(卡卡杜青柠(Kakadu Lime)或汉姆杜青柠(Humpty Doo Lime))；拉塞尔河青柠(Citrus inodora/Russel RiverLime)；新几内亚野生青柠(Citrus warburgiana/New Guinea Wild Lime)；布朗河手指青柠(Citrus wintersii/Brown River Finger Lime)；哈密橘(Citrus halimii)(沙卡橘(limau kadangsa)、凯拉橘(limau kedut kera))；印地安野生橙子(Citrus indica/Indian wild orange)；马蜂橙(Citrus macroptera)；和拉迪橘(Citrus latipes)；墨西哥酸橙(Citrus.times.aurantiifolia/Key lime)；苦橙(Citrus.times.aurantium/Bitterorange)；波斯橙(Citrus.times.latifolia/Persian lime)；柠檬(Citrus.times.limon/Lemon)；黎檬(Citrus.times.limonia/Rangpur)；葡萄柚(Citrus.times.paradisi/Grapefruit)、甜橙(Citrus.times.sinensis/Sweet orange)、红橘(Citrus.times.tangerina/Tangerine)、卡里佐枳橙(Poncirustrifoliata.times.C.sinensis/Carrizo citrange)、施文格枳柚(C.paradisi"Duncan"grapefruit.times.Pondirus trifoliate/Swingle citrumelo)、皇家柠檬(Imperiallemon)、橘柚、柚橙(orangelo)、橘柑、金诺橘(kinnow)、清见橘(kiyomi)、明尼橘柚(Minneola tangelo)、白金柚、甜橙、丑橘、佛手柑(Buddha's hand)、香橼、柠檬、橙子、香柑、苦橙、血橙、加利蒙地亚橘(calamondin)、克莱门氏小柑橘(clementine)、葡萄柚、梅尔柠檬(Meyer lemon)；黎檬；红橘；和香橙。
10.一种控制植物中的柑橘绿化病的方法，其包含
向所述植物、来自所述植物的植物部分、种子和/或基质施用能够有效控制所述柑橘绿化病的量的根据权利要求5所述的组合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其进一步包含将所述植物移植到所述生长基质中。
12.一种基本上纯的微生物，其包含赭曲霉(ATCC 18412)、绿木霉菌S101(NRRL67411)、绿木霉菌S102(NRRL 67412)、绿木霉菌S103(NRRL 67413)、绿木霉菌S090(NRRL67414)或哈茨木霉S117(NRRL 67415)。
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