JP2021514004A - 昆虫病原性糸状菌を用いた害虫の防除のための材料と方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、節足動物害虫の防除をするための、昆虫病原性糸状菌の製造及び使用に関する。具体的には、本発明は、Metarhizium anisopliae及びBeauveria bassianaを生成する方法、ならびにバイオ殺虫組成物としてのその使用方法を提供する。１種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、珪藻土、及び研磨物質を含む、節足動物害虫の防除をするための組成物も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０１８年２月２６日に出願された米国仮出願第６２／６３５，２４７号の優先度を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

農業業界には、コストを低く保ちながら、生産収量を最大化する妨げとなる共通の問題がある。その問題とは、これらに限られるものではないが、細菌、真菌、その他の害虫及び病原体によって引き起こされる感染及び蔓延；環境及び健康への影響を含む高コストの化学肥料及び除草剤；ならびに植物が異なるタイプの土壌から栄養及び水を効率的に吸収する難しさ等である。

特に、昆虫は、農業生産及びヒトの健康に著しい影響を及ぼし得る。昆虫は、農産物を破壊するだけでなく、疾病を伝播することがあり、その中には流行を引き起こすものもある。また、家庭や芝生、庭に虫がいると、不快でもある。

害虫防除は、典型的には、殺虫剤の使用により行われており、経口摂取、害虫表皮接触、又は燻蒸剤使用による空気を介する殺虫によって機能する。農業業界では、農業従事者が、病原体、害虫や疾病から作物を保護するために、合成化学殺虫剤の使用に大きく依存してきたが、過剰使用又は不適切に適用された場合、これらの物質は流出、浸出、及び蒸発によって大気及び水を汚染する可能性がある。適切に使用された場合でさえ、特定の化学殺虫及び肥料の過剰依存や長期使用は、土壌生態系を有害に変化させ、ストレス耐性を低下させ、害虫耐性を増加させ、植物及び動物の成長及び活力を阻害する。さらに、殺虫剤の使用は、環境又は農産物の汚染の危険があるばかりでなく、ヒトにも有害である。それに加え、殺虫剤の使用は、有益な種を意図せずに害することがある。

メッシュのような防虫バリアは、時には昆虫から作物を守るために使用され、化学物質の必要性を減らすのに役立つバリアとなる。しかしながら、防虫バリアは、昆虫からの保護が必要とされる物理的状況に常に適しているとは限らない。

化学的殺虫剤又は昆虫不透過性バリア使用の代替となる１つの方法は、昆虫忌避剤の使用である。忌避剤は、昆虫が特定の領域又は表面から追い払ったり、遮断するものである。忌避剤は、種々の昆虫害虫の繁殖、咬傷及び刺傷を防止するために使用されてきた。

農業、園芸又は他の目的のための昆虫忌避剤として使用されるために、種々の薬剤が開発されてきた。これらの薬剤には、天然に存在する抽出物から商業的に製造された化合物まである。これらの薬剤の保護の程度、保護の持続時間、及び安全性は大きく異なる。防虫剤の例としては、鉱油や植物油などの油、そしてＮ，Ｎ-ジエチル-メタトルアミド（ＤＥＥＴ）などの合成化学物質が挙げられる。ＤＥＥＴは、商業的使用における主要な化学的昆虫忌避剤である。ＤＥＥＴが忌避剤として作用するためには、約５〜２０体積パーセント（体積％）の濃度で使用しなければならない。ＤＥＥＴは、特に子供にとって、潜在的な健康リスクをもたらすことが分かっている。また、ＤＥＥＴは、限られた活性スペクトルと、著しく不快な臭気を有する。

化学物質の利用可能性と使用に対する要請や、環境への害を最小限に抑えて生産される残渣のない持続可能に生育される食品に対する消費者の要求に伴い、害虫防除業界が影響を受け、無数の課題に取り組む考え方が進化している。より安全な殺虫剤や代替の害虫防除戦略に対する需要が増加している。現時点では化学物質の卸売りの排除は実現可能ではないが、農業従事者は統合栄養管理及び統合害虫管理プログラムの実行可能な構成要素として、生物学的手段を多く取り入れるようになってきている。

例えば、生物剤は、化学殺虫の代替として現れ、生存微生物、微生物由来の生物生成物、及びそれらの組み合わせが代わりに使用されている。これらの生物学的殺虫剤は、他の従来の殺虫剤よりも重要な利点を有する。例えば、それらは、従来の化学殺虫剤より害が少なく、より効率的で特異的である。また、急速に生分解し、環境汚染が減じる。

昆虫害虫に対する生物剤として有用であることが証明された微生物の一種に、昆虫病原性糸状菌（ＥＦ）がある。ＥＦは、寄生虫様の真菌で、感染した昆虫の疾病や死を招く。ＥＦは、世界中の土壌において天然に見出され、いくつかの真菌基由来の多数の異なる分類基に属する。これらの真菌の多くは、天然防除剤と考えられ、環境的に安全であり、種々の屋外用途における昆虫及び他の節足動物害虫に対する生物学的防除剤としての使用に理想的である。

ＥＦの多くは真菌目Hypocrealesに属する。Beauveria属、Metarhizium属、Nomuraea属及びPaecilomyces属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特にMetarhizium anisopliae及びBeauveria bassianaは、ゴキブリ、バッタ、シロアリ、アリ、アブラムシ及び他の節足動物に感染する可能性がある。これらの昆虫の一部は社会的性質をもつため、ある害虫がＥＦに感染すると、直接接触することによって他の害虫に感染することがあり、特定の地域の昆虫群全体に感染することさえある。

環境意識や消費者の要求によって、害虫防除のための生成物の改良や、農作物、園芸及び芝生の処理におけるそれらの使用が促進されてきた。

このように、害虫を防除し、害虫が引き起こす損傷及び／又は疾病を防止及び／又は軽減するのに有効な改善された殺虫材料及び殺虫技術がますます必要とされている。

本発明は、殺虫組成物、及び害虫、特に、節足動物害虫の防除をするために、これらの組成物を使用する方法を提供する。具体的には、本発明は、害虫を防除し、植物及び植物の一部を有害な害虫から保護するための、真菌ベースの殺虫組成物及び方法を提供する。

本発明はまた、疾病媒介害虫の防除を介して昆虫媒介疾病の感染及び／又は拡散を、防止、減少及び／又は排除するために使用することもできる。さらに、本発明は、家庭、芝生、又は庭における有害な害虫を減少させるために使用することができる。本発明の殺虫剤組成物及び方法の利点は、環境に優しく、無毒であり、費用効果があることである。

好ましい実施形態において、本発明は、節足動物害虫を防除するための殺虫組成物であって、１種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、及び研磨物質を含む、殺虫組成物を提供する。本発明の殺虫剤組成物及び方法の利点は、例えば、農業及び／又は園芸に有益な昆虫又は他の生物に害を及ぼさないことである。

特定の実施形態において、昆虫病原性糸状菌は、Metarhizium anisopliae及びBeauveria bassianaから選択される。好ましい実施形態において、組成物は、M.anisopliaeとB.bassianaの両方を含む。

一実施形態において、組成物に使用される真菌は、固体状態又は表面発酵を用いて培養される。ハイブリッドシステムを用いることもできる。

一実施形態において、殺虫組成物は、精製された、又は本質的に純粋なキチン及び／又はカイコの結晶から選択されるキチナーゼ誘導物質を含む。カイコの結晶は、例えば、キチン及び／又は他のキチン成分を含有する、例えば、Bombyx moriなどのカイコの絹生産部分（例えば、腺、管、スピナー）から得ることができる。本発明によれば、「本質的に純粋である」とは、例えば、約８０％以上の純度を意味する。

好ましい実施形態において、研磨物質は、１マイクロメートル〜１ミリメートル、好ましくは１０〜２００マイクロメートルの粒子サイズを有する粉末である。一実施形態において、研磨物質は、軽石粉末及び／又は珪藻土を含む。珪藻土は、一種の硬殻の原生生物である珪藻の化石を含む。

一実施形態において、殺虫組成物は、抗凝固物質をさらに含む。好ましい実施形態において、抗凝固物質は、アスコルビン酸、フェニルチオ尿素及び／又はこの組み合わせから選択される血リンパ系抗凝固物質である。

ある実施形態において、殺虫組成物は、例えば、糖脂質及び／又はリポペプチドなどの１つ又は複数の界面活性剤をさらに含む。

利点を挙げると、殺虫組成物は、動物、植物、又は植物の一部を、例えば、沈降、咬傷、産卵、及び／又は昆虫による摂食から保護するために有用である。特定の実施形態において、殺虫組成物はまた、昆虫の侵入、水分喪失、微生物感染及び／又はそれらの組み合わせから農作物を保護するために有用である。

一実施形態において、本発明は、本発明による殺虫組成物を害虫と接触させて、害虫を防除する方法を提供する。好ましい実施形態において、害虫は、節足動物害虫、例えば昆虫である。

好ましい実施形態において、本方法は、１種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、及び研磨物質を含む殺虫組成物を害虫と接触させることを含む。本方法は、殺虫剤組成物と共に、１つ以上の抗凝固物質（例えば、血液リンパ凝固剤）を接触させることをさらに含む。

特定の実施形態において、表面及び／又は害虫に「塗布する」及び／又は「接触させる」ことは、表面、害虫、及び／又は表面及び／又は害虫周囲の環境に組成物を噴霧又は散布することを含む。

害虫は、例えば、動物、植物及び／又は家に害、損傷及び／又は疾病を引き起こす可能性のあるゴキブリ、シロアリ、アリ、バッタ、アブラムシ及び／又はその他である。

一実施形態において、昆虫害虫は、カンキツ緑化病（Candidatus Liberibacter spp.）を引き起こす細菌感染を有する疾病媒介生物、例えば、アジアカンキツオバコである。

一実施形態において、昆虫害虫は、同じ種の複数の生物を含む構造化コロニー又は群において、その所属であることを特徴とする社会性昆虫である。利点を挙げると、コロニー又は群の生物が本発明の組成物と接触すると、昆虫病原性糸状菌及び／又は組成物の他の成分を、相互作用するコロニーの他の生物と共に広げ、それによって、それら他の生物を防除する。

一実施形態において、本方法は、組成物を害虫に直接塗布することを含む。別の実施形態において、本方法は、害虫が横断、静止、沈降、交配、産卵、及び／又は摂食することができる表面に組成物を塗布することを含む。表面は、例えば、フェンス、壁、又は静止した農業用もしくは園芸用機器の他の部分などの人工表面であってもよい。表面は、誘引剤及び／又は餌成分、例えば、特定の害虫を殺虫組成物に向かわせる特定の害虫を誘引する特定の色、匂い又はその他の物理的又は化学的シグナルを有していてもよい。

特定の好ましい実施形態において、表面は、土壌、植物、又は植物の一部である。殺虫剤組成物は、植物の任意の部分、例えば、葉、根、種、茎、花、又は果実と接触させることができる。さらに、殺虫剤組成物は、植物全体と接触させることができる。

本方法の利点は、害虫の行動、例えば、摂食、産卵、又は疾病を引き起こす物質の伝播の結果としての損傷から植物を保護することができるということである。

一実施形態において、本方法は、例えば、病原体媒介害虫を防除することによって、例えば、植物、ヒト及び動物における害虫媒介疾病の広がり及び／又は発生を阻害、防止又は減少させるために使用することができる。

一実施形態において、本方法は、植物への、感染疾病媒介生物の沈降を防ぐことによって、植物への疾病病原体の輸送を阻害、防止又は減少させることによって、植物疾病を防止するために特に有用である。

本発明の利点は、環境中に大量の無機化合物を放出することなく使用することができることである。さらに、本発明の組成物及び方法は生分解性で、毒物学的に安全な成分を利用している。

本発明は、殺虫組成物、及び害虫、特に節足動物を防除するためにこれらの組成物を使用する方法を提供する。具体的には、本発明は、害虫を防除し、植物及び植物の一部を有害な害虫から保護するための、真菌ベースの殺虫組成物及び方法を提供する。

本発明はまた、疾病媒介害虫の防除により、昆虫媒介疾病の感染及び／又は拡散を防止、減少及び／又は排除するために使用することもできる。さらに、本発明は、家庭、芝生、又は庭における不快な害虫を減少させるために使用することができる。本発明の殺虫剤組成物及び方法の利点は、環境に優しく、無毒であり、費用効果があることである。

好ましい実施形態において、本発明は、節足動物害虫を防除するための殺虫組成物であって、１種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、及び研磨物質を含む、殺虫組成物を提供する。

特定の実施形態において、本殺虫剤組成物の昆虫病原性糸状菌は、Metarhizium anisopliae及びBeauveria bassianaから選択される。好ましい実施形態において、組成物は、M.anisopliae及びB.bassianaの両方を含む。

選択した定義
本明細書中で使用される場合、「微生物ベースの組成物」とは、微生物又は他の細胞培養物の増殖の結果として生成された成分を含む組成物を意味する。したがって、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物増殖の副生成物を含む。微生物は、栄養状態、胞子形成、菌糸形成、任意の他の形態の繁殖体、又はこれらの混合物であり得る。微生物は、プランクトン、バイオフィルム形態、又は両方の混合物であってもよい。増殖の副生成物は、例えば、代謝産物、細胞膜成分、発現タンパク質、及び／又は他の細胞成分である。微生物は、無傷であっても溶解されていてもよい。ある実施形態において、微生物は微生物ベースの組成物中に、それらが増殖された培地と共に存在する。細胞は例えば、組成物１ミリリットル当たり、１×１０⁴、１×１０⁵、１×１０⁶、１×１０⁷、１×１０⁸、１×１０⁹、１×１０¹⁰、１×１０¹¹、１×１０¹²又は１×１０^１３以上のＣＦＵの濃度で存在し得る。

本発明はさらに、所望の結果を達成するために実際に適用される生成物である「微生物ベースの生成物」を提供する。微生物ベースの生成物は単に、微生物培養プロセスから収穫された微生物ベースの組成物、又は上清などのその個々の成分であり得る。あるいは、微生物ベースの生成物は、添加されたさらなる成分を含んでいてもよい。これらの追加の成分は例えば、安定剤、緩衝剤、水、塩溶液などの適切な担体、又は任意の他の適切な担体、さらなる微生物増殖を支持するための添加された栄養素、非栄養増殖促進剤、及び／又はそれが適用される環境中の微生物及び／又は組成物の追跡を容易にする薬剤を含む。微生物ベースの生成物はまた、微生物ベースの組成物の混合物を含んでいてもよい。微生物ベースの生成物はまた、これらに限定されるものではないが、濾過、遠心分離、溶解、乾燥、精製などのような、何らかの方法で処理された微生物ベースの組成物の１つ以上の成分を含んでもよい。

本明細書中で使用される場合、発酵プロセスの文脈における「収穫された」は、増殖容器から微生物ベースの組成物の一部又は全てを除去することをいう。

本明細書中で使用される場合、「バイオフィルム」は微生物の錯体集合体であり、ここで、細胞は互いに接着する。ある実施形態において、バイオフィルムは表面に接着する。バイオフィルム中の細胞は、液体培地中で浮遊又は泳動する単一細胞で、同じ生物のプランクトン細胞とは生理学的に異なる。

本明細書中で使用される場合、「単離された」又は「精製された」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、又は有機化合物（例えば、小分子）は、それが天然に関連する細胞物質などの他の化合物を実質的に含まない。精製又は単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、天然に存在する状態で、隣接する遺伝子又は配列を含まない。精製又は単離されたポリペプチドは、天然に存在する状態で、隣接するアミノ酸又は配列を含まない。「単離された」微生物株がそれが天然に存在する環境から除去されることを意味する。従って、単離された株は例えば、生物学的に純粋な培養物として、又はキャリアに関連する胞子（又は株の他の形態）として存在し得る。

本明細書中で使用される場合、「生物学的に純粋な培養物」は、自然界に関連する材料から単離されたものである。好ましい実施形態において、培養物は、全ての他の生細胞から単離されている。さらに好ましい実施形態において、生物学的に純粋な培養物は、天然に存在するのと同じ微生物の培養物と比較して利点を有する。有利な特徴としては、例えば、１つ以上の増殖副生成物の観察が促進されることである。

特定の実施形態において、精製化合物は、目的の化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％の目的の化合物である。例えば、精製化合物は、少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、又は１００重量％（ｗ/ｗ）の所望の化合物である。純度は、任意の適切な標準的な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定される。

「代謝産物」とは、代謝によって生成される任意の物質（例えば、増殖副生成物）又は特定の代謝プロセスに関与するために必要な物質をいう。代謝物は、代謝の出発物質（例えば、グルコース）、中間体（例えば、アセチルＣｏＡ）、又は最終生成物（例えば、ｎ−ブタノール）である有機化合物であり得る。代謝産物の例としては、バイオポリマー、酵素、酸、溶剤、アルコール、タンパク質、ビタミン、ミネラル、微量元素、アミノ酸、炭水化物及びバイオサーファクタントが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「複数」という用語は、１を超える任意の数又は量を指す。

本明細書中で使用される場合、「減少」とは、負への変化をいい、「増加」とは、少なくとも（正又は負の）１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の正への変化をいう。

ここでいう「界面活性剤」とは、２つの液体間又は液体と固体間の表面張力（又は界面張力）を低下させる化合物をいう。界面活性剤は例えば、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤、及び分散剤として作用する。「バイオサーファクタント」は、生体により生成される界面活性剤である。

本明細書で示される範囲は、その範囲内の全ての値について簡略化されたものであると理解される。例えば、１〜２０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０からなる群の任意の数、数の組み合わせ、又は下位範囲、ならびに、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、及び１．９などの前述の整数の間のすべてに介在する１０進値を含むと理解される。下位範囲に関して、範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子下位範囲」が具体的に考えられる。例えば、１〜５０の例示の範囲の入れ子下位範囲は、一方向に、１〜１０、１〜２０、１〜３０、及び１〜４０、又は他方向に５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、及び５０〜１０を含む。

本明細書中で使用される場合、「農業」は、食品、繊維、バイオ燃料、医薬品、化粧品、サプリメント、装飾目的及び他の用途のための植物、藻類及び／又は真菌の栽培及び繁殖を意味する。本発明によれば、農業にはまた、園芸、造園、園芸、植物保護、果樹園及び樹木栽培が含まれる。さらに、農業には、土壌のケア、モニタリング及び保守が含まれる。

本明細書中で使用される場合、対象組成物によって生成される活性に関して使用される用語「防除」は、害虫を死滅させる、機能不全にする、固定する、もしくは個体数を減少させる、又は害虫が実質的に害を引き起こすことができないようにする行為に及ぶ。したがって、「殺虫」は、害虫を防除できることを意味し、「殺虫に有効な」量の物質は、殺虫作用が可能な量である。

本明細書中で使用される場合、植物の「周囲環境」は、根圏を含む、植物が成長している土壌及び／又は他の培地を意味する。特定の実施形態において、周囲環境は、例えば、植物から１００フィート、１０フィート、８フィート、又は６フィートの半径を越えない。

１つ又は複数の要素を参照して、「含む」、「有する」、「有する」、又は「含有する」などの用語を使用する本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書の記載は、特に断らない限り、又は文脈によって明らかに矛盾しない限り、特定の要素又は複数の要素「からなる」、「本質的にからなる」、又は「実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態をサポートすることを意図している。

本明細書で使用される用語「又は」は特に明記されない限り、又は文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される用語「１つ」、「及び」、「その」は、単数又は複数であると理解される。

本明細書で使用される場合、特に言及されない限り、又は文脈から明らかでない限り、用語「約」は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内と理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内と理解することができる。

本明細書に記載される可変のいずれかの定義における化学基の列挙の引用は、いずれかの１個の基又は列挙された基の組み合わせとしてその可変の定義を含む。本明細書における可変又は態様について実施形態の記載は、その実施形態を、任意の単一の実施形態として、又は任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせることを含む。

本明細書に参照又は引用される全ての参考文献は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、全ての図表を含め、その全体が参照により組み込まれる。

本発明による殺虫組成物
本発明は、殺虫組成物、及び害虫、特に、節足動物を防除するための組成物を使用する方法を提供する。具体的には、本発明は、害虫を防除し、植物及び植物の一部を有害な害虫から保護するための、真菌ベースの殺虫組成物及び方法を提供する。

好ましい実施形態において、本発明は、節足動物害虫を防除するための殺虫組成物であって、１種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、及び研磨物質を含む、殺虫組成物を提供する。本発明の組成物には、物理的メカニズム（体液の喪失）及び生物学的メカニズム（真菌感染）の２つの異なる防除メカニズムの使用により、害虫が組成物に対して抵抗性を持つ可能性を防ぐという利点がある。さらに、本発明の殺虫剤組成物及び方法は、例えば、農業及び／又は園芸に有益な昆虫又は他の生物には害を与えない。

本発明の昆虫病原性糸状菌は、節足動物に感染し、最終的には、節足動物を固定化及び／又は死滅させることができる種である。これらの微生物は、天然の微生物であってもよく、又は遺伝的に改変された微生物であってもよい。例えば、微生物は、特定の特徴を示すために、特定の遺伝子で形質転換することができる。微生物はまた、所望の株の突然変異体であってもよい。本明細書中で使用される場合、「変異体」は、基準微生物の株、遺伝的変異体又は下位タイプを意味し、ここで、変異体は、基準微生物と比較して、１つ以上の遺伝的変異（例えば、点変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、欠失、重複、フレームシフト変異又は反復拡大）を有する。変異体を作製するための手順は、微生物学技術分野において周知されている。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンは、この目的のために広く使用されている。

病原性真菌にはBeauveria spp、Metarhizium spp、Paecilomyces spp、Lecanicillium spp、Nomuraea spp.及びEntomophthora spp.が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態において、１つ以上の病原性真菌は分生子の形態である。分生子は無性真菌胞子で、高温に耐性があり、様々な環境条件下で比較的安定で、定量化することができ、真菌生存率及び致死量（ＬＤ₅₀）などのパラメータを評価するための計測単位として使用することができる。

「ＬＤ₅₀」という用語は、その用量を受けた昆虫の５０％を死滅させ、分生子の数で測定される、昆虫病原性糸状菌の致死量の平均を意味する。ＬＤ₅₀は、実験室バイオアッセイにおいて昆虫群に関して求めることができる。バイオアッセイは、真菌の連続希釈を行い、昆虫群に個々に既知の量を数回適用し、毎日の死亡率をモニターすることによって行うことができる。

ほとんどの昆虫病原性糸状菌は、宿主昆虫の上皮に付着して侵入する胞子（分生子）を発芽させることによって感染を開始する。胞子形成には通常高湿度が必要である。この菌が昆虫害虫の上皮に侵入すると、侵入した菌糸は宿主組織に侵入し、体腔（血瘤）を通して広がる。菌糸の体節は血瘤全体に分布しており、死滅しつつある昆虫を菌糸体で満たす。菌糸は昆虫の外皮を通して現れ、宿主の外表面に胞子をつくる。典型的には、昆虫は最終的に死滅し（時には真菌によって分泌される毒素によって）、新たな胞子が昆虫の中又は上に形成される（湿度及び温度が理想的である場合）。

特定の実施形態において、本殺虫剤組成物の昆虫病原性糸状菌は、Metarhizium anisopliae及びBeauveria bassianaから選択される。好ましい実施形態において、組成物は、M.anisopliae及びB.bassianaの両方を含む。組成物はまた、これらの種の突然変異体及び／又は株を含むこともできる。

好ましい実施形態において、本発明の殺虫組成物は、１×１０^７及び１×１０^１０分生子／ｍＬの１つ以上の昆虫病原性糸状菌を含む。

病原性真菌は、酵素複合体を用いて宿主の外皮を攻撃することができる。キチナーゼは、節足動物の外骨格の主要成分であることが多いため、この複合体に見出される重要な成分である。したがって、一実施形態において、殺虫組成物は、精製された、又は本質的に純粋なキチン及び／又はカイコの結晶から選択されるキチナーゼ誘導物質を含むことができる。カイコの結晶は、例えば、キチン及び／又は他のキチン成分を含有する、例えば、Bombyx moriなどのカイコの絹生成部分（例えば、腺、管、スピナー）から得ることができる。キチナーゼ誘導剤を含めると、キチナーゼの生成が増加し、真菌ベースの殺虫組成物の潜在的な毒性が増加する。

一実施形態において、研磨物質が殺虫剤組成物に含まれる。好ましい実施形態において、研磨物質は、１マイクロメートル〜１ミリメートル、好ましくは、１０〜２００マイクロメートルの粒子サイズを有する粉末の形態である。一実施形態において、研磨物質は軽石粉末及び珪藻土から選択される。

好ましくは、研磨物質は、珪藻土である。珪藻土は、珪藻として知られる一種の硬い殻のある化石を含む。微視的には、粒子は非常に鋭く、昆虫に付着し、その外骨格関節の間に留まる。昆虫が動くにつれて、その身体は鋭利な粒子により切断裂傷される。さらに、研磨粒子は、昆虫のワックス状外骨格層で擦り取られ、これにより、内部水分が昆虫の身体から失われる。昆虫の湿った表面と、切断による循環系からの「滲出」液体とによって、真菌胞子の発芽が可能となり、真菌の伝搬を増加させ、昆虫の死を早める。

一実施形態において、殺虫組成物は、抗凝固物質をさらに含むことができる。好ましい実施形態において、抗凝固物質は、アスコルビン酸、フェニルチオ尿素及び／又はそれらの組み合わせから選択される血リンパ系抗凝固物質である。抗凝固剤の添加は、害虫の血液リンパの凝固を防止する。好ましくは、アスコルビン酸及びフェニルチオ尿素の一方又は両方を０．１％まで使用することができる。

本組成物は、１つ以上の微生物の増殖副生成物をさらに含むことができる。一実施形態において、増殖副生成物は、例えば、酵素、生体高分子、溶媒、酸、ガス、又はキラー毒素を含む微生物代謝産物から選択される。一実施形態において、増殖副生成物は、精製された形態又は精製されていない形態のバイオサーファクタントである。

バイオサーファクタントは、多くの微生物に存在する重要な部類の二次代謝物を形成する。バイオサーファクタントは生分解性であり、再生可能な基質上の選択された生物を用いて、効率的に生産することができる。ほとんどのバイオサーファクタント生成生物は、増殖培地中の炭化水素源（例えば、油、糖、グリセロールなど）の存在に応答してバイオサーファクタントを生成する。他の培地成分もまた、バイオサーファクタント生成に有意に影響を及ぼし得る。

微生物バイオサーファクタントは、細菌、真菌、及び酵母などの様々な微生物によって生成される。例示のバイオサーファクタント生成微生物としては、Starmerella spp.（例えば、Sbombicola）、Pseudomonas spp.（例えば、Paeruginosa、Pputida、Pflorescens、Psyringae）、Flavobacterium spp.（例えば、Bsubtilis、Bamyloliquefaciens、Bcereus、Blicheniformis）、Wickerhamomyces spp.（例えば、Wanomalus）、Candida spp.（例えば、Calbicans、Crugosa、Ctropicalis、Clipolytica、Ctorulopsis）、Saccharomyces（例えば、Scerevisiae）、Pseudozyma spp.（例えば、P.Rhodococcus spp.（例えば、Rhodococcus spp.）、Arthrobacter spp.、Cornybacterium spp.、Pichia spp.（例えば、Pguilliermondii、Poccidentalis）その他が挙げられる。

バイオサーファクタントには、低分子量糖脂質（ＧＬ）、リポペプチド（ＬＰ）、フラボリピド（ＦＬ）、リン脂質（例えば、カルジオリピン）、セロビオース脂質、ならびにリポタンパク質、リポ多糖-タンパク質複合体及び多糖-タンパク質-脂肪酸複合体などの高分子量ポリマーが含まれる。バイオサーファクタント分子の共通の親油性部分は、脂肪酸の炭化水素鎖であり、一方、親水性部分は、中性脂質のエステル又はアルコール基、脂肪酸又はアミノ酸（又はペプチド）のカルボキシレート基、フラボリピドの場合には有機酸、又は糖脂質の場合には炭水化物によって形成される。

本発明の実施形態によれば、バイオサーファクタントは、害虫の組織に十分に浸透することができ、アジュバントを使用することなく、より少ない量で有効である。臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える濃度では、バイオサーファクタントは、より効果的に浸透できることが分かっている。

一実施形態において、バイオサーファクタントは、例えば、ラムノリピド（ＲＬＰ）、ソホロリピド（ＳＬＰ）、トレハロース脂質又はマンノシルエリトリトール脂質（ＭＥＬ）などの糖脂質を含む。一実施形態において、バイオサーファクタントは、リポペプチド、例えば、サーファクチン、イチュリン、フェンギシン、ビスコシン、アトロファクチン、及び／又はリケニシンを含む。一実施形態において、バイオサーファクタントは、例えば、エマルサン、リポマナン、アラサン、及び／又はリポサンなどのポリマーバイオサーファクタントを含む。

好ましくは、バイオ殺虫組成物中のバイオサーファクタントの合計濃度は、約０．００１〜１０．０％、好ましくは、約０．０１〜５％、より好ましくは約０．０１〜１％である。

殺虫組成物は、好ましくは、土壌、種、植物全体、又は植物の一部（これに限定されるものではないが、根、塊茎、茎、花及び葉を含む）への適用のために処方される。特定の実施形態において、組成物は、例えば、粉塵、顆粒、微小顆粒、ペレット、湿潤性粉末、流動性粉末、エマルジョン、マイクロカプセル、油、又はエアロゾルとして処方される。

組成物の効果を改善又は安定化するために、組成物を適切なアジュバントとブレンドし、そのまま、又は必要に応じて希釈後に使用することができる。好ましい実施形態において、組成物は、乾燥粉末又は乾燥顆粒として処方され、これを水及び他の成分と混合して、液体生成物を形成することができる。

一実施形態において、殺虫組成物は、許容可能な担体と混合することができる。本発明の目的にとって許容される担体は、意図する機能を果たす能力に影響を及ぼすことなく活性成分を分散できる物質又は物質の混合物（例えば、油、エマルジョン及び懸濁液）と定義することができる。組成物は、油、エマルジョン又は懸濁型の形態であってもよい。「油」という用語は、常温で粘性の油性液体である物質を含むことが意図される。油は、石油又は植物であってもよい。軽油には、パラフィン系油、ならびに他の石油系油及び植物油、例えば、トウモロコシ、ココナッツ、キャノーラ、綿実、大豆、ヒマワリ種子及びパーム核に由来するものが含まれる。

ある実施形態において、殺虫組成物は、餌又は誘引成分をさらに含む。例えば、天然又は合成の香気成分、化学誘引物質、染料及び／又は他の感覚誘引剤を組成物中に含めて、害虫を組成物に引き寄せ、それらを効果的に防除することができる。特定の実施形態において、誘引物質及び／又は餌は、有益な昆虫を誘因したり、害を及ぼすことを回避するために、防除が望まれる特定の昆虫害虫に特異的なものである。

利点を上げると、殺虫組成物は、動物、植物、又は植物の一部を、例えば、沈降、咬傷、産卵、及び／又は昆虫による摂食から保護するのに有用である。特定の実施形態において、殺虫組成物はまた、昆虫の侵入、水分喪失、微生物感染及び／又はそれらの組み合わせから農作物を保護するのにも有用である。

昆虫害虫を防除する方法
一実施形態において、本発明は、本発明による殺虫組成物を害虫と接触させる、害虫の防除方法を提供する。好ましい実施形態において、害虫は、節足動物害虫、例えば昆虫である。

好ましい実施形態において、本方法は、１種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、及び研磨物質を含む殺虫組成物を害虫と接触させることを含む。本方法は、１つ以上の抗凝固物質、例えば、血液リンパ凝固剤、を害虫と接触させる工程をさらに包む。

特定の実施形態において、害虫及び／又は害虫が接触する表面に組成物を直接塗布することによって、害虫は、組成物と接触する。組成物に「塗布する」には、表面、害虫、表面及び／又は害虫を取り囲む環境に組成物を噴霧、散布、広げる、浸漬、又は他の方法で撒くことが含まれる。

一実施形態において、本方法は、組成物を害虫に直接塗布することを含む。別の実施形態において、本方法は、害虫が横断、静止、沈降、交配、産卵、及び／又は摂食する表面に組成物を塗布することを含む。表面は、例えば、フェンス、壁、又は据置型農業用もしくは園芸用機器のその他一部などの人工表面であってもよい。

一実施形態において、害虫は、カンキツ緑化病（Candidatus Liberibacter spp.）を引き起こす細菌感染をもたらす疾病媒介生物、例えば、アジア型ミカンキジラミである。

一実施形態において、害虫は、同じ種の複数の生物を含む構造化コロニー又は群において、その所属であることを特徴とする社会性昆虫である。利点を挙げると、コロニー又は群の生物が本発明の組成物と接触すると、昆虫病原性糸状菌、及び／又は組成物の他の成分を、相互作用するコロニーの他の生物と共に広げ、それによって、それら他の生物を防除する。

一実施形態において、殺虫組成物は、殺虫組成物を有する昆虫トラップの内側に塗布される。害虫は、例えば、誘引化学物質、フェロモン、香気成分又は視覚的誘引によってトラップに誘引され得る。一実施形態において、誘引物は、有益な昆虫は誘因しない。トラップ内部で害虫を殺虫組成物に接触させることができる。本発明に従って使用することができるトラップとしては、光トラップ、接着剤トラップ、パントラップ、バケット式トラップ、ボトルトラップ、フライトインターセプトトラップ、マレーズトラップ、落とし穴トラップ、粒子プローブ、スパイク、地下餌システム、及び陸上羽化トラップが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態において、殺虫組成物は、植物の任意の部分、例えば、葉、根、種、茎、花、又は果実と接触させることができる。殺虫剤組成物は、植物全体と接触させることができる。さらに、殺虫剤組成物はまた、植物が生育する土壌及び／又は植物を取り囲む空気に適用することもできる。

植物及び／又はそれらの環境は、植物を栽培するプロセス中の任意の時点で処理することができる。例えば、殺虫組成物は、種子が植え付けられる前、同時、又は後に、植物及び／又はその環境に適用することができる。また、植物の開花、結実時を含む、植物の発育及び成長の間、及び落葉中及び／又は後の任意の時点で塗布することもできる。

特定の実施形態において、処理をした植物は健康である。他の実施形態において、植物は、植物疾病又は植物疾病症状によって影響を受ける。

本方法は、適用中の昆虫病原性糸状菌の増殖を増進するために材料を添加することをさらに含む。一実施形態において、増殖促進剤は、例えば、窒素、カリウム、リン、マグネシウム、タンパク質、ビタミン及び／又は炭素の供給源などの栄養源を含む。

一実施形態において、本方法は、例えば、病原体媒介害虫を防除することによって、例えば、植物、ヒト及び動物における害虫媒介疾病の広がり及び／又は発生を阻害、防止又は減少させるために使用することができる。

一実施形態において、本方法は、植物への感染した疾病媒介生物の沈降を防止し、それによって、植物への疾病病原体の輸送を阻害、防止又は減少させることによって、植物疾病を防止するのに特に有用である。

一実施形態において、本方法は、家庭、庭及び／又は芝生において迷惑と考えられる害虫を防除するために使用することができる。例えば、殺虫剤組成物は、例えば、ハンドヘルド噴霧器を使用して、芝生、庭、及び家の周囲の造園に塗布され、例えば、そのような領域に侵入し得る、及び／又は家庭に望ましくなく侵入する害虫の集団を減少させる。

本発明の方法はまた、他の農業又は園芸植物管理システムと組み合わせて使用することもできる。一実施形態において、組成物は、任意で、天然及び／又は化学肥料及び／又は植物栄養源を含む、又は共に適用することができる。

一実施形態において、本方法は、大規模な農業環境で使用することができる。本方法は、水、肥料又はその他液体組成物を、作物、果樹又は野菜に供給するために使用される潅漑システムに接続されたタンクに殺虫剤組成物を投与することを含む。したがって、植物及び／又は植物を取り囲む土壌は、例えば、土壌注入、土壌浸漬、又はセンターピボット潅漑システムを使用することによって、又はシード溝にスプレーを用いて、又はスプリンクラーもしくは点滴潅漑設備を用いて、殺虫剤組成物で処理することができる。利点を上げると、本方法は、一度に何百エーカーもの作物、果樹又は野菜を処理するのに適している。

一実施形態において、本方法は、家庭の庭、芝生、又は温室などのより小規模な環境で使用することができる。本方法は、水、任意で他の殺虫剤、及び栄養源が中に入ったハンドヘルド芝生及び庭用噴霧器のタンクに殺虫剤組成物を注ぎ、植物及び／又はその周囲環境に混合物を噴霧することを含む。

特定の実施形態において、本発明による方法及び組成物は、未処理の環境で生育する植物と比較して、害虫によって引き起こされる植物への損傷を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上低減する。

特定の実施形態において、本発明による方法及び組成物は、未処理の作物と比較して、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上の作物収量の増加をもたらす。

一実施形態において、本発明の方法は、未処理の環境で生育する植物と比較して、植物又は植物の周囲環境における害虫の数を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上減少させる。

一実施形態において、本発明の方法は、未処理の環境で生育する植物と比較して、植物の質量を約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上増加させる。

対象害虫
本方法は、作物、庭、芝生、家庭、温室などに寄生する節足動物害虫を防除するために使用することができる。特定の実施形態において、害虫は昆虫である。

本明細書中で使用される場合、「害虫」は、ヒト又はヒトの関心事（例えば、農業）に対して破壊的、有毒及び／又は有害な、ヒト以外の生物である。害虫は、感染、寄生及び／又は疾病を引き起こしたり、その病原体を運搬することがある。害虫は、例えば、植物の一部を食べることによって、直接的な害を引き起こし得る。害虫は、これらに限定されるものではないが、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、原虫、節足動物及び／又は線虫を含む単細胞又は多細胞生物である。

ある実施形態において、害虫は節足動物であり、昆虫を含む。本明細書中で使用される用語「昆虫」は、身体が頭部、胸部、及び腹部に分割され、３対の脚、（必ずではないが）２対の膜様羽のある成体状態で特徴付けられる、無脊椎動物群の種を指す。したがって、この定義には、様々な咬傷／刺傷昆虫（例えば、アリ、ミツバチ、ブユ、ツツガムシ、ノミ、アオバエ、蚊、サシバエ、マダニ、及びハチ）、木喰虫（例えば、シロアリ）、有害昆虫（例えば、イエバエ、ゴキブリ、シラミ、ローチ、及びワラジムシ）、及び家庭害虫（例えば、小麦粉及びマメ甲虫、イエダニ、ガ、セイヨウシミ、トコジラミ、カツオブシムシ、ファニチャービートル、ヒラタチャタテ、衣蛾、クモ及びゾウムシ）が含まれるが、これらに限定されない。他の例としては、イナゴ、毛虫、青虫、カメムシ、バッタ及びアブラムシが挙げられる。この定義はまた、幼虫及びさなぎを含む非成虫状態を含む。

本発明が有用である害虫の例としては、これらに限られるものではないが、ゴキブリ、バッタ、シロアリ、アリ、ダニ、アザミウマ、アブラムシ、コナカイガラムシ、キジラミ、カタカイガラムシ、コナジラミ、ヨコバイ、ゾウムシ、南京虫、マツマダラメイガ、甲虫、Delphacidae、（例えば、Laodelphax striatellus、Nilaparvata lugens、又はSogatella furcifera）、Deltocephalidae（例えば、Nephotettix cincticeps）、Aphididae（例えば、Aphis gossypii、Myzus persicae、Brevicoryne brassicae、Macrosiphum euphorbiae、Aulacorthum solani、Rhopalosiphum padi）、Pentatomidae（例えば、Nezara antennata、Riptortus clavetus）、Leptocorisa chinensis、Eysarcoris parvus、Halyomorpha mista、Pyralidae（例えば、Trialeurodes vaporariorum、Bemisia tabaci）、Pyralidae（例えば、Chilo suppressoryza incertulas、Cnaphalocrocis medinalis、Notarcha derogata、Ostrinia furnacalis又はHellula undalis）、Noctuidae（例えば、Spodoptera litura、Spodoptera exigua、Mythimna separata、Mamestra brassicae、Agrotis ipsilon、Plusia nigrisigna、Trichoplusia、Heliothis spp.又はHelicoverpa spp.、Tortricidae（例えば、Leguminivora glycinivorella、Matsumuraes azukivora）及びYponomeutidae（例えば、Plutella rylostella）、Frankliniella occidentalis、Thrips dorsalis、Thrips tabaci、Frankliniella intonsa、Anthomyiidae（例えば、Delia platura又はDelia antiqua）、Agromyzidae（例えば、Agromyza oryzae、Hydrellia griseola、Liriomyza sativae、Liriomyza trifoli）、又はChromatomyia horticola、Chloropidae（例えば、Chlorops oryzae）、Drosophilidae（例えば、Diabrotica virgifera、又はDiabrotica undecimpunctata howardi）、Scarabaeidae（例えば、Anomala cuprea、Anomala rufocuprea、又はPopillia japonica）、Curculionidae（例えば、Sitophilus zeamais、Lissorhoptrus oryzophilus、Echinocnemus squameus、又はAnthonomus grandis）、Chrysomelidae（例えば、Oulema oryzae、Aulacophora femoralis、Phyllotreta striolata、又はLeptinotarsa decemlineata）、Elateridae（Agriotes spp.）、Paederus fuscipes、ならびに植物や家庭に損傷や疾病を引き起こす可能性のあるその他のものが挙げられる。

節足動物及び／又は昆虫のさらなる例としては、アジアミカンキジラミ（Diaphorina citri）、アフリカミカンキジラミ（Trioza erytreae）、ナシキジラミ（Cacopsylla （Psylla） pyri）、ニンジンキジラミ（Trioza apicalis）、ジャガイモキジラミ、（Bactericera （Paratrioza） cockerelli）及びPsyllidae系列のキジラミ、ヨーロピアングレープバインガ等のガ（Lobesia botrana又はEGVM）、フォースコドリングガ（Thaumatotibia leucotreta又はFCM）、ヨーロピアンジプシーモス（Lymantria dispar 又はEGM）、インディアンミールガ（Plodiainterpunctella）、バクガガ（Sitotroga cerealella）、ライスガ（Corcyra cephalonica）及びライトブラウンアップルガ（Epiphyas postvittana又はLBAM）のようなガ、アジアンカミキリムシ（Anoplophora glabripennis又はALB）、ココナツカブトムシ（Oryctes rhinoceros）、エメラルドアッシュボーラービートル（Agrilus planipennis又はEAB）、アカサビコムギビートル（Tribolium spp.）、ノコギリグレインビートル（Oryzaephilussurinamensis）、フラットグレインビートル（Cryptolestes spp.）及びヒメアカカツオブシムシ（Trogoderma granarium）のようなビートル、チチュウカイミバエ（Ceratitis capitata又はMedfly）、メキシカンミバエ（Anastrepha ludens）及びオリエンタルミバエ（Bactrocera dorsalis）のようなハエ、サシチョウバエ、ウシアブ、ツェツェバエ、メクラアブのようなハエ、Hippelatesのようなメマトイ、ヒアリ（Solenopsis invicta）のような蟻、ならびにAnopheles属、Trypanosoma属、Aedes属（Aedes aegyptiなど）、Culex属、Mansonia属、Anopheles属などの蚊が挙げられる。

ある実施形態において、害虫は、疾病媒介生物、すなわち、細菌、真菌、寄生虫、又はウイルスなどの病原体の担体である。植物の病原細菌によって引き起こされるいくつかの植物の疾病（特に、斑点、病斑、枯れ、虫えい、軟腐病を引き起こす疾病）では、細菌は宿主植物の表面に飛沫や粘着性滲出物の塊として漏出する。細菌の滲出液は、感染部位のひび割れや傷、又は植物の感染部位の自然開口部を通して放出される。そうすると、そのような菌は、植物に着地して、物質に接触するハエ、アブラムシ、蟻、甲虫、コナジラミなどのような虫の脚や体に張り付く可能性が高い。

昆虫が、植物の他の部分や他の感染し易い宿主植物に移動すると、体内に多数の細菌が運ばれる。もし、昆虫が新しい傷や植物の自然開口部に着地し、植物表面に十分な水分があると、細菌は増殖して植物に移動し、新たな感染が始まる。したがって、本方法は、これらの担体害虫を防除する、すなわち死滅させることによって、植物病原体の拡散を防止することができる。

一実施形態において、本方法は、病原性細菌の伝播を防止するために使用される。例えば、節足動物は、Pseudomonas（例えば、P. savastanoi、P. syringae pathovars）、Ralstonia solanacearum、Agrobacterium（例えば、A. tumefaciens）、Xanthomonas（例えば、X. oryzae pv. Oryzae、X. campestris pathovars、X. axonopodis pathovars）、Erwinia（例えば、E. amylovora）、Xylella（例えば、X. fastidiosa）、Dickeya（例えば、D. dadantii及びD. solani）、Pectobacterium（例えば、P. carotovorum及びP. atrosepticum）、 Clavibacter（例えば、C. michiganensis及びC. sepedonicus）、Candidatus Liberibacter asiaticus、Pantoea、Burkholderia、Acidovorax、Streptomyces、Spiroplasma及び／又はPhytoplasma、ならびに黄龍病（ＨＬＢ、カンキツグリーニング病）、かんきつ類細菌斑病、かんきつ類多様性クロロシス、褐色腐敗病、かんきつ類及び黒斑病の病原性菌株を伝播する。

一実施形態において、本方法は、病原性ウイルスの伝播を防止するために使用される。例えば、節足動物の害虫は、ウイルス、例えば、Carlavirus、Abutilon、Hordeivirus、Badnavirus、Reoviridae、Fijivirus、Phytoreovirus、Mycoreovirus、Rymovirus、Tritimovirus、Bymovirus、Cucumovirus、Begomovirus、Rhabdoviridae、Tospovirus、Sobemovirus、Nepovirus、Benyvirus、Furovirus、Pecluvirus、Pomovirus、アルファルファモザイクウイルス、ビートモザイクウイルス、カウモザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、パニックモザイクサテライトウイルス、プラムポックスウイルス、タバコモザイクウイルス、チューリップブレーキングウイルス、及びズッキーニ黄斑モザイクウイルスを伝播する。

対象植物
本明細書中で使用される用語「植物」は、木、オーナメント又は装飾、作物又は穀類、果実植物又は野菜植物、花又は樹木、巨大藻類又は微細藻類、植物プランクトン及び光合成藻類（例えば、緑藻類Chlamydomonas reinhardtii）の任意の種類を含むが、これらに限定されない。「植物」はまた、単細胞植物（例えば、微細藻類）及びコロニー（例えば、ボルボックス）又は植物の発育の任意の段階に存在する構造に大きく分化される複数の植物細胞を含む。そのような構造には、果実、種、シュート、茎、葉、根、花弁などが含まれるが、これらに限定されない。植物は、例えば、１本の庭木であっても、又は、例えば、果樹園、作物又は牧草地の一部にある多くの植物のうちの１つであってもよい。

本発明が有用である植物の例としては、穀類及び草類（例えば、コムギ、オオムギ、ライ、オーツ、コメ、モロコシ、トウモロコシ）、ビーツ（例えば、砂糖、飼料ビーツ）、果実（例えば、グレープ、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、仁果類、核果、ソフトフルーツ、リンゴ、梨、プラム、桃、アーモンド、チェリーやベリー）、マメ科作物（例えば、ビーンズ、レンズマメ、豆、大豆）、油料作物（例えば、アブラナ、マスタード、ポピー、オリーブ、ヒマワリ、ココナッツ、ヒマシ、ココア、ピーナツ）、ウリ科（例えば、カボチャ、キュウリ、南瓜、メロン）、繊維植物（例えば、綿、亜麻、麻、ジュート）、柑橘類（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、タンジェリン）、野菜（例えば、ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ、ピーマン）、クスノキ科（例えば、アボカド、シナモン、樟脳）、ならびにタバコ、ナッツ、ハーブ、スパイス、薬用植物、コーヒー、ナス、サトウキビ、紅茶、コショウ、ブドウの木、ホップ、オオバコ科、ラテックス植物、切花及び装飾品が挙げられるがこれらに限られるものではない。

本発明の生成物及び方法の適用から利益を得ることができる植物の種類としては、これらに限られるものではないが、列作物（例えば、トウモロコシ、ダイズ、モロコシ、ピーナッツなど）、畑作物（例えば、アルファルファ、コムギ、穀物など）、樹木作物（例えば、クルミ、アーモンド、ヘーゼルナッツ、ペカン、ピスタチオなど）、柑橘類作物（例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツなど）、果樹作物（例えば、リンゴ、ナシ、イチゴ、ブラックベリーなど）、芝作物（例えば、芝生）、装飾作物（例えば、花、つるなど）、野菜（例えば、トマト、ニンジンなど）、つる作物（例えば、ブドウなど）、林業（例えば、マツ、トウヒ、ユーカリ、ポプラ等）、管理された牧草（放牧動物の飼育に使いられる様々な植物）が挙げられる。

本発明の生成物及び方法から利益を得ることができるさらなる植物としては、上科、緑色植物亜界に属するすべての植物、特に、中でもAcer spp、Abelmoschus spp、Agelmoschus sisalana、Agropyron spp、Agrostis stolonifera、Allium spp、Amaranthus arenaria、Annona comosus、Annona spp、Apium graveolens、Arachis spp、Asparagus officinalis、Avena spp.（例えば、Asativa、Abyzantina、Afatua varsativa）、Bambusa sp、Benincasa carambola spida、Benincasa excelsea、Beta vulgaris、Brassica spp.（例えば、Bnapus、Brapa ssp.［キャノーラ、アブラナ、セイヨウアブラナ］）、Cadaba farinosa、Camellia sinensis、Canna indica、Cannabis sativa、Capsicum spp、Carex elata、Carica paya、Carissa macrocarpa、Carya tinctorius、Castanea spp、Cinnamomum spp、Citrus lanatus spp、Cocos spp、Coffea esculenta、Cora spp、Corchorus spp、Coriandrum sativum、Corylus spp、Crataegus sativus、Cucurbita spp、Cucumis spp、Cynara spp、Daucus carota、Dimocarpus longan、Dioscorea spp、Diospyros spp、Echinochloa spp、Elaeis（例えば、Eguineensis、E. oleifera）、Eleusine coracana、Eragrostis tef、Erianthus sp.、Eriobotrya japonica、Eucalyptus sp.、Erianthus sp.、Eriobotrya japonica、Eucalyptus sp.、Eugenia uniflora、Fagopyrum spp.、Fagus spp.、Festuca arundinacea、Ficus carica、Fortunella spp.、Fragaria spp.、Ginkgo biloba、Glycine spp.（例えば、G. max、Soja hispida又はSoja max）、Gossypium hirsutum、Helianthus spp.（例えば、H. annuus）、Hemerocallis fulva、Hibiscus spp.、Hordeum spp.（例えば、H. vulgare）、Ipomoea batatas、Juglans spp.、Lactuca sativa、Lathyrus spp.、Lens culinaris、Linum usitatissimum、Litchi chinensis、Lotus spp.、Luffa acutangula、Lupinus spp.、Luzula sylvatica、Lycopersicon spp.（例えば、L. esculentum、L. lycopersicum、L. pyriforme）、Macrotyloma spp.、Malus spp.、Malpighia emarginata、Mammea americana、Mangifera indica、Manihot spp.、Manilkara zapota、Medicago sativa、Melilotus spp.、Mentha spp.、Miscanthus sinensis、Momordica spp.、Morus nigra、Musa spp.、Nicotiana spp.、Olea spp.、Opuntia spp.、Ornithopus spp.、Oryza spp.（例えば、O. sativa、O. latifolia）、Panicum miliaceum、Panicum virgatum、Passiflora edulis、Pastinaca sativa、Pennisetum sp.、Persea spp.、Petroselinum crispum、Phalaris arundinacea、Phaseolus spp.、Phleum pratense、Phoenix spp.、Phragmites australis、Physalis spp.、Pinus spp.、Pistacia vera、Pisum spp.、Poa spp.、Populus spp.、Prosopis spp.、Prunus spp.、Psidium spp.、Punica granatum、Pyrus communis、Quercus spp.、Raphanus sativus、Rheum rhabarbarum、Ribes spp.、Ricinus communis、Rubus spp.、Saccharum spp.、Salix sp.、Sambucus spp.、Secale cereale、Sesamum spp.、Sinapis sp.、Solanum spp.（例えば、S. tuberosum、S. integrifolium又はS. lycopersicum）、Sorghum bicolor、Spinacia spp.、Syzygium spp.、Tagetes spp.、Tamarindus indica、Theobroma cacao、Trifolium spp.、Tripsacum dactyloides、Triticosecale rimpaui、Triticum spp.（例えば、T. aestivum、T. durum、T. turgidum、T. hybernum、T. macha、T. sativum、T. monococcum又はT. vulgare）、Tropaeolum minus、Tropaeolum majus、Vaccinium spp.、Vicia spp.、Vigna spp.、Viola odorata、Vitis spp.、Zea mays、Zizania palustris、Ziziphus spp.から選択される、飼料又はマメ科植物、装飾植物、食用作物、樹木又は低木をはじめとする単子葉及び双子葉植物が挙げられる。

対象植物のさらなる例としては、これらに限定されるものではないが、トウモロコシ（Zea mays）、Brassica sp.（例えば、B.napus、B.rapa、B.juncea）、特に、種子油の供給源として有用なBrassica種、アルファルファ（Medicago sativa）、イネ（Oryza sativa）、ライ（Secale cereale）、モロコシ（Sorghum bicolor、Sorghum vulgare）、キビ（例えば、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、モチキビ（Panicum miliaceum）、アワ（Setaria italica）、シコクビエ（Eleusine coracana）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、サフラワー（Carthamus tinctorius）、コムギ（Triticum aestivum）、ダイズ（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、落花生（Arachis hypogaea）、綿（Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum）、サツマイモ（Ipomoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Coffea spp.）、ココナッツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、柑橘樹（Citrus spp.）、ココア（Theobroma cacao）、茶（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイア（Carica paya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharumspp.）、エンバク、大麦、野菜、装飾品、及び針葉樹が挙げられるが、これらに限定されない。

野菜には、トマト（Lycopersicon esculentum）、レタス（例えば、Lactuca sativa）、緑豆（Phaseolus vulgaris）、リマ豆（Phaseolus limensis）、エンドウ（Lathyrus spp.）、及びキュウリ（Csativus）、カンタロープ（Ccantalupensis）やマスクメロン（C.melo）などのCucumis属の構成が含まれる。装飾品には、アザレア（Rhododendron spp.）、アジサイ（Macrophylla hydrangea）、ハイビスカス（Hibiscus rosasanensis）、バラ（Rosa spp.）、チューリップ（Tulipa spp.）、水仙（Narcissus spp.）、ペチュニア（Petunia hybrida）、カーネーション（Dianthus caryophyllus）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）及び菊が含まれる。実施形態を実施する際に使用することができる針葉樹には、例えば、マツ、例えば、ロリーマツ（Pinus taeda）、スラッシュマツ（Pinus elliotii）、ポンデロサマツ（Pinus ponderosa）、ロッジポールマツ（Pinus contorta）、及びモンテリーマツ（Pinus radiata）、ベイマツ（Pseudotsuga menziesii）、ウェスタンヘムロック（Tsuga canadensis）、シトカ・スプルース（Picea glauca）、レッドウッド（Sequoia sempervirens）、シルバーモミ（Abies amabilis）及びバルサムモミ（Abies balsamea）などのモミ、ならびに西洋レッドスギ（Thuja plicata）及びアラスカ・イエロー-スギダル（Chamaecyparis nootkatensis）などのスギが含まれる。実施形態の植物には、トウモロコシ及びダイズ植物などの作物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、ダイズ、綿、ベニバナ、ピーナッツ、モロコシ、コムギ、キビ、タバコなど）が含まれる。

ターフグラス牧草には、スズメノカタビラ（Poa annua）、一年生ライグラス（Lolium multiflorum）、カナダブルーグラス（Poa compressa）、チューニングフェスク（Festuca rubra）、コロニアルベントグラス（Agrostis palustris）、クレステッドウイートグラス（Agropyron desertorum）、フェアウェイウイートグラス（Agropyron cristatum）、ハードフェスク（Festuca longifolia）、ケンタッキーブルーグラス（Poa pratensis）、オーチャードグラス（Dactylis glomerate）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne）、レッドフェスク（Festuca rubra）、レッドトップ（Agrostis alba）ラフブルーグラス（Poa trivialis）、シープフェスク（Festuca ovine）、スムースブロメグラス（Bromus inermis）、トールフェスク（Festuca arundinacea）、ティモシー（Phleum pretense）、ベルベットベントグラス（Agrostis canine）、ウィーピングアルカリグラス（Puccinellia distans）、ウエスタンウィートグラス（Agropyron smithii）、バミューダグラス（Cynodon spp.）、セントオーガスチングラス（Stenotaphrum secundatum）、ゾイシアグラス（Zoysia spp.）、バヒアグラス（Paspalum notatum）、カーペットグラス（Axonopus affinis）、センチペドグラス（Eremochloa ophiuroides）、キクユグラス（Pennisetum clandesinum）、サワスズメノヒエ（Paspalum vaginatum）、ブルーグラマ（Bouteloua gracilis）、バッファローグラス（Buchloe dactyloids）、シデオートグラマ（Bouteloua curtipendula）が含まれるがこれらに限られるものではない。

目的の植物には、目的の種子を提供する穀物植物、油料種子植物、及びマメ科植物が含まれる。目的の種子には、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、ライムギ、キビなどの穀物種子が含まれる。油料種子植物としては、綿、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナッツ、亜麻、ヒマシ、オリーブなどが挙げられる。マメ科植物には、豆及びエンドウ豆が含まれる。豆には、グアー、ローカストビーン、フェヌグリーク、大豆、インゲン豆、ササゲ、リョクトウ、ライ豆、空豆、レンズ豆、ヒヨコマメなどが含まれる。

目的の植物には、さらに、アサ（例えば、サティバ、インディカ、及びルデラリス）及び工業用麻が含まれる。

全ての植物及び植物の一部を、本発明に従って処理することができる。この文脈において、植物は、例えば、所望及び所望されない野生植物又は作物（天然に存在する作物植物を含む）等の全ての植物及び植物集団を意味すると理解される。作物植物は、典型的な繁殖及び最適化方法によって、又はバイオテクノロジー及び組換え方法によって、又はトランスジェニック植物及び植物品種を含むこれらの方法の組み合わせによって得ることができる植物であり得る。

植物の一部とは、シュート、葉、花及び根のような植物の全ての空中及び地下の部分及び器官を意味すると理解され、例としては、葉、針葉、柄、茎、花、果実体、果実、種子、根、塊茎及び根茎が挙げられる。植物の一部はまた、作物材料、生長及び生殖繁殖材料、例えば、挿し木、塊茎、根茎、スリップ及び種子も含む。

本発明による昆虫病原性糸状菌の増殖
本発明は、微生物の培養及び微生物代謝産物及び／又は微生物増殖のその他副生成物の製造のための方法を利用する。本発明はさらに、所望の規模での微生物の培養及び微生物代謝産物の生成に適した培養プロセスを利用する。これらの培養プロセスには、これらに限られるものではないが、浸漬培養／発酵、固相発酵（ＳＳＦ）、及び変性、ハイブリッド、及び／又はそれらの組み合わせが含まれる。

本明細書中で使用される場合、「発酵」とは、制御された条件下での細胞の培養又は増殖をいう。増殖は、好気性又は嫌気性であり得る。好ましい実施形態において、微生物は、ＳＳＦ及び／又はその変性したものを使用して増殖される。

一実施形態において、本発明は、バイオマス（例えば、生存細胞材料）、細胞外代謝産物（例えば、小分子及び排泄タンパク質）、残留栄養素及び／又は細胞内成分（例えば、酵素及び他のタンパク質）を生成するための材料及び方法を提供する。

本発明に従って使用される微生物増殖容器は、工業的使用のための任意の発酵槽又は培養反応器とすることができる。一実施形態において、容器は、機能制御／センサを有してもよく、あるいは、ｐＨ、酸素、圧力、温度、湿度、微生物密度及び／又は代謝産物濃度などの培養プロセスにおける重要な因子を測定するために機能制御／センサに接続されてもよい。

さらなる実施形態において、容器は、容器内の微生物の増殖（例えば、細胞数及び増殖相の測定）をモニターすることもできる。あるいは、毎日のサンプルを容器から採取し、希釈プレーティング技術などの当技術分野で公知の技術により列挙してもよい。希釈プレーティングは、サンプル中の生物の数を推定するために使用される単純な技術である。この技術はまた、異なる環境又は治療を比較することができる指標を提供することもできる。

一実施形態において、本方法は、窒素源を用いて培養を補うことを含む。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素、及び／又は塩化アンモニウムである。これらの窒素源は、単独で、又は２種以上の組み合わせで使用することができる。

本方法は、増殖培養物に酸素化を行うことができる。一実施形態は、低酸素含有空気を除去し、酸素化空気を導入するために、空気の緩やかな動きを利用する。浸漬発酵の場合、酸素化空気は、液体の機械的撹拌のためのインペラー、及び液体中への酸素の溶解のために液体に気泡を供給するための空気スパージャーを含む機構を介して毎日補充される周囲空気であってもよい。

本方法は、培養物に炭素源を補充することをさらに含むことができる。炭素源は、典型的には、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、及び／又はマルトースなどの炭水化物、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、及び／又はピルビン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール、及び／又はグリセロールなどのアルコール、大豆油、キャノーラ油、米ぬか油、オリーブ油、トウモロコシ油、ゴマ油、及び／又はアマニ油などの油脂である。これらの炭素源は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

一実施形態において、微生物の成長因子及び微量栄養素が培地に含まれる。これは、それらが必要とするビタミンの全てを生成することができない微生物を増殖させる場合に特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及び／又はコバルトのような微量元素を含む無機栄養素もまた、培地に含めてよい。さらに、ビタミン、必須アミノ酸、及び微量元素の供給源は、例えば、トウモロコシ粉などの粉又はミールの形態で、又は酵母エキス、ジャガイモエキス、ビーフエキス、大豆エキス、バナナ皮エキスなどのエキスの形態で、あるいは精製された形態で含まれる。アミノ酸、例えば、タンパク質の生合成に有用なアミノ酸もまた含まれ得る。

一実施形態において、無機塩も含まれ得る。使用可能な無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、及び／又は炭酸ナトリウムであり得る。これらの無機塩は単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

ある実施形態において、培養のための方法は、培養プロセスの前及び／又は間に、培地中に追加の酸及び／又は抗菌剤を付加することをさらに含んでもよい。抗菌剤又は抗生物質は、培養物を汚染から保護するために使用される。さらに、消泡剤を添加して、浸漬培養の間にガスが生成されるときに泡の形成及び／又は蓄積を防止することもできる。

混合物のｐＨは、目的の微生物に適したものとする。緩衝液、及び炭酸塩及びリン酸塩などのｐＨ調節剤を用いて、ｐＨを好ましい値付近に安定化させることができる。金属イオンが高濃度で存在する場合、媒体中にキレート化剤を使用することが必要である。

微生物は、プランクトンの形態で、又はバイオフィルムとして増殖させることができる。バイオフィルムの場合、容器は、その中に、微生物をバイオフィルム状態で増殖させることができる基質を有する。システムはまた、例えば、バイオフィルム増殖特性を促進及び／又は改善する刺激（せん断応力など）を印加する能力を有していてもよい。

一実施形態において、微生物の培養方法は、約５℃〜約１００℃、好ましくは１５〜６０℃、より好ましくは２５〜５０℃で実施される。さらなる実施形態において、培養は一定温度で連続的に実施されてもよい。別の実施形態において、培養は、変化する温度で行ってもよい。

一実施形態において、方法及び培養プロセスで使用される装置は無菌である。反応器／容器のような培養装置は、殺菌ユニット、例えば、オートクレーブから離れているが、接続されている。培養装置はまた、接種を開始する前にインサイチュで殺菌する殺菌ユニットを有していてもよい。空気は、当技術分野で公知の方法によって殺菌することができる。例えば、周囲空気を容器内に導入する前に、少なくとも１つのフィルタに通すことができる。他の実施形態において、培地は、低温殺菌されてもよく、又は任意で、熱を全く加えなくてもよく、低水分活性及び低ｐＨを用い、望ましくない細菌増殖を防除してもよい。

一実施形態において、本発明はさらに、増殖及び代謝産物生成に適切な条件下で、本発明の微生物株を培養することによって、例えば、バイオサーファクタント、酵素、タンパク質、エタノール、乳酸、β−グルカン、ペプチド、代謝中間体、多価不飽和脂肪酸、及び脂質などの微生物代謝産物を生成し、任意で、代謝産物を精製する方法を提供する。本方法によって生成される代謝産物含量は、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。

発酵培地（例えば、ブロス）のバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌ以上、又は１０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌである。乾燥生成物の細胞濃度は、例えば、１グラム当たり１×１０⁹、１×１０¹⁰、１×１０¹¹、１×１０¹²又は１×１０¹³の細胞又は胞子である。

目的の微生物によって生成される微生物増殖副生成物は、微生物中に保持されるか、又は増殖培地中に分泌される。培地は、微生物増殖副生成物の活性を安定化する化合物を含有していてもよい。

微生物の培養及び微生物副生成物の製造のための方法及び装置は、バッチ、準連続処理、又は連続処理で実施することができる。

一実施形態において、微生物培養組成物の全ては、培養の完了時に（例えば、所望の細胞密度、又は特定の代謝産物の密度を達成した時に）除去される。このバッチ手順では、全く新しいバッチが、第１のバッチの採取時に開始される。

他の実施形態において、発酵産物の一部のみが、任意の時点で除去される。この実施形態において、生存細胞、胞子、分生子、菌糸及び／又は菌糸体を有するバイオマスは新しい培養バッチのための接種物として容器内に残る。除去される組成物は、無細胞培地であるか、又は細胞、胞子、もしくは他の生殖繁殖体、及び／又はそれらの組み合わせを含む。このようにして、準連続システムが生成される。

固相発酵の方法
好ましい実施形態において、本発明は、新規形態の固体発酵又はマトリックス発酵を用いて、微生物及び／又は微生物増殖副生成物を培養する方法を提供する。利点を上げると、培養方法を、スケールアップしたり、サイズダウンできることである。特筆すべき点は、本方法は、商業的用途、例えば、農業に適した量で微生物ベースの生成物を供給することができるスケールを意味する工業的スケールにスケール変更することができる。

本発明は、ＤＯ、ｐＨ及び他の発酵パラメーターを測定及び／又は安定化するための高性能の通気システム、ミキサー、又はプローブを有する発酵システムを必要としない。

好ましい実施形態において、微生物を培養し、及び／又は微生物増殖副生成物を生成する方法は、ａ）微生物増殖を増進するために栄養素と任意で混合された固体基質を容器に入れてマトリックスを形成し、ｂ）微生物の接種剤をマトリックスに適用し、ｃ）接種されたマトリックスを有する容器をインキュベーション空間に入れ、ｄ）微生物がマトリックスを通って増殖するのに十分な時間、２５〜４０℃の温度で容器をインキュベートすることを含む。

特定の実施形態において、固体基質は、複数の個々の固形物、例えば、小片、細片、穀物又は粒子を含む。好ましい実施形態において、固形物は食品である。食品は、例えば、米、米殻、米ぬか、豆、レンズマメ、マメ科植物、オーツ及びオートミール、トウモロコシ及び他の穀物、パスタ、小麦ふすま、小麦粉又はミール（例えば、トウモロコシ粉、トウモロコシ浸漬粉末、消石灰処理トウモロコシ粉、部分加水分解トウモロコシ粉）、及び／又は微生物培養物が増殖及び／又は摂食するための表面積を与える他の同様の食品のうちの１つ以上を含むことができる。

マトリックスが予め製造されたパスタを含む一実施形態において、パスタは、例えば、トウモロコシ粉、小麦粉、セモリナ粉、米粉、キヌア粉、ジャガイモ粉、大豆粉、ヒヨコマメ粉及び／又はこれらの組み合わせから製造することができる。利点を上げると、微生物は、パスタの内側及び／又はパスタの外側表面上で増殖することである。

一実施形態において、培養方法は、容器を用意することを含み、容器は、例えば、標準的なプルーフィングオーブンに取り付けられるトレイ、金属シートパン、又はスチームパンである。用意には、容器の内側を、例えば、箔で覆うことを含む。用意にはまた、例えば、容器をオートクレーブすることによって容器を殺菌することを含む。所望であれば、容器を密封するために、蓋とシリコンバンドを設けることができる。

次に、食品と、追加の塩及び／又は栄養素を含む液体培地とを混合して、微生物の増殖をサポートして、マトリックスを形成する。次いで、混合物を容器に広げ、層状にして、約１〜１２インチ、好ましくは１〜６インチの厚さを有するマトリックスを形成する。

好ましい実施形態において、マトリックス基質が、微生物が増殖するのに十分な表面積を与える三次元足場として作用する。ある実施形態において、マトリックス中の食品はまた、微生物の栄養源としても作用する。さらに、マトリックスは、微生物が好気性条件下での培養を必要とする場合、酸素供給を増やすことができる。

一実施形態において、微生物が増殖する表面積を増やすために、溝、リッジ、チャネル、及び／又は穴をマトリックスに形成することができる。これはまた、基質内の微生物増殖の深さを増し、好気性培養中の培養全体にわたる酸素浸透を増強する。

容器及びマトリックスの殺菌は、マトリックスが容器に配置された後に行うことができる。殺菌は、目的の分野で公知のオートクレーブ又は任意の他の手段によって実施できる。ある実施形態において、例えば、パスタが固体基質として使用される場合、このプロセスはまた、基質を効果的に調理することができる。完全に殺菌されたシステムを作り出すために、蓋及びバンドを殺菌することもできる。

一実施形態において、小麦粉又はミールを固体基材として使用される場合、本方法はマトリックスを切片又は塊に細断することを含む。粉及びミールは、特に殺菌された後に、より大きな個々の断片を有する食品よりも密度の高いマトリックスを作り出すことができる。従って、微生物を播種する前に高密度基質を分解すると、微生物増殖のための表面積が増加する。

準備後、容器内のマトリックスに、任意で、無菌栄養培地と予め混合された所望の微生物を接種することができる。任意で、培養される微生物の通気の必要性に応じて、容器は次いで、例えば、蓋及びバンドで密封される。例えば、嫌気性微生物が生成されている場合、通気は必要ではなく、容器は密閉する。

接種材料は、好ましくは、所望の微生物の栄養細胞、胞子、分生子、又は他の繁殖体を含み、これらは、任意の公知の発酵方法を使用して予め培養しておくことができる。一実施形態において、接種は、マトリックスの表面上に接種材料を均一に適用することによって行われる。接種材料は、例えば、噴霧、散布、注ぎ込み、注入、ピペッティング又は塗り広げにより、塗布することができる。

次に、接種されたマトリックスの入った容器をインキュベーション空間内に配置する。一実施形態において、インキュベーション空間は発酵反応器である。一実施形態において、発酵反応器は、例えば、商業的ベーキングで使用される標準プルーフィングオーブンなどのプルーフィングオーブンである。一実施形態において、インキュベーション空間は、壁、床、及び天井を備える耐熱性の部屋又はエンクロージャである。

任意で、インキュベーション空間は、コンベヤーシステムを備えており、接種された容器は、例えば、コンベヤーベルト又はプーリーシステムを使用して、培養物を増殖させることのできる速度で、その空間を連続的に移動する。

インキュベーション空間内の発酵パラメーターは、生成される所望の産物（例えば、所望の微生物増殖副生成物）及び培養される微生物に基づいて調節することができる。利点を上げると、一実施形態において、培養物のｐＨを監視又は安定化する必要がないことである。

一実施形態において、インキュベーション空間は、任意で、ゆっくりと動く空気供給を提供するための通気システムを含むことができる。通気システムの使用は、培養される微生物の必要性による。

一実施形態において、周囲空気の受動的交換で、必要な酸素化を好気性培養物に供給し、インキュベーション空間内の空気の濃度を標準化するのに十分である。一実施形態において、この受動的空気交換システムは、任意で、周囲空気がインキュベーション空間内に移動する空気フィルタを有する入口と、空気が空間から出る出口とを備える。

ある実施形態において、真空及び／又はポンプシステムが、インキュベーション空間への空気交換及びインキュベーション空間からの空気交換を行う。

ある実施形態において、個々の容器は、空気交換のための入口及び出口を含む。例えば、一実施形態において、蓋で密封された容器は、蓋に固定された入口及び出口を備え、空気ポンプは、入口に取り付けられた管を通して密閉容器にゆっくりと動く空気を供給し、空気は、出口に取り付けられた管を通して容器から出る。

インキュベーション空間内の温度は、好ましくは約２５〜４０℃に保たれる。一実施形態において、温度は約２５〜３５℃に保たれる。一実施形態において、温度は約３２〜３７℃に保たれる。正確な温度範囲は、培養される微生物に応じて変わる。

培養物は、微生物が増殖し、所望の濃度に達することを可能にする時間インキュベートすることができる。一実施形態において、培養物が胞子形成微生物である場合、インキュベーション時間は、培養物が５０％〜１００％胞子形成に達するのに十分な長さであることが好ましい。

好ましい実施形態において、インキュベーション時間の量は１日〜１４日、より好ましくは２日〜１０日である。

容器は、微生物濃度を増加させるために、殺菌栄養培地を用いて、発酵の間、規則的に（例えば、１日に１回、１日おきに１回、週に１回）噴霧される。ある実施形態において、微生物は、発酵の間、マトリックス基質の一部又は全体のいずれかを消費する。

培養物及び残りの基質を容器から採取し、次いで一緒にブレンドして、微生物スラリーを生成する。微生物スラリーは、微生物、その増殖副生成物、ならびに任意の残りの栄養素及び基質を含むことができる。微生物スラリーを処理して、さらなる成分、例えば、追加の栄養素を、微生物ベースの生成物の用途に必要と判断された場合に、添加することができる。本発明の方法に従って生成される微生物の濃度は、１グラムあたり少なくとも１×１０⁸の細胞、好ましくは、１×１０^１０〜１×１０¹²の細胞、胞子又は他の増殖体となる。

一実施形態において、微生物スラリーは、均質化され、乾燥されて、乾燥微生物ベースの生成物が生成される。乾燥は、例えば、噴霧乾燥又は凍結乾燥を含む、目的の分野で標準的な方法を用いて行うことができる。

一実施形態において、微生物スラリーは、乾燥又は加工することなく、直接利用することができる。他の実施形態において、微生物スラリーを水と混合して、液体微生物ベースの生成物を形成することができる。

ある実施形態において、本方法に従って製造された微生物ベースの生成物の各種処方を、使用前に貯蔵することができる。

利点を挙げると、本方法は、複雑な設備や高いエネルギー消費を必要としないことである。目的の微生物は、現場で小規模又は大規模に培養され、培地と混合されたままの城代でも利用することができる。同様に、微生物代謝産物はまた、必要な部位で大量に生成することもできる。

利点を挙げると、微生物ベースの生成物は、遠隔地で製造することができる。微生物増殖施設は、例えば、太陽光、風力及び／又は水力を利用することによって、オフグリッドで稼働される。

耐熱性エンクロージャシステム
一実施形態において、本方法で利用される発酵反応器は、４つの垂直な壁、床、及び天井を有する、大きく、湿気密封され、熱安定性の密閉空間を含む。壁は、任意で、１つ又は複数の窓及び／又はドアを備える。この耐熱性エンクロージャは、例えば、プルーフィングオーブン発酵反応器内に存在するであろう環境を、大規模に再現することができる。

一実施形態において、耐熱性エンクロージャは、車輪付きトレーラーのようなポータブルプラットフォームに固定される。

一実施形態において、耐熱性エンクロージャの内部は、複数の水平面を含み、そこに、接種されたマトリックス基質を有する容器を配置することができる。

一実施形態において、表面は棚の形態である。棚は、エンクロージャの壁に固定することができる。棚ユニットは、天井から吊り下げたり、床に固定することもできる。

一実施形態において、耐熱性エンクロージャは、複数の金属シートパンラックを含む。シートパンラックは、好ましくは、接種されたマトリックス基質を有するトレイを保持するための複数のスライド形態の水平面を含む。一実施形態において、ラックは、例えば、車輪が取り付けられて携帯可能である。

一実施形態において、パンラックは、１０〜５０個のトレイを保持することができる。好ましくは、好気性微生物の増殖時、各トレイ間の空気循環を最適にするために、スライドは、互いに少なくとも３インチ離す。

一実施形態において、エンクロージャの天井は、任意で、例えば、天井通気口及び／又は空気フィルタを用いて、エアフロ―を可能にするような構成とすることができる。さらに、天井及び壁に、紫外線ライトを据え付け、システム内の空気及び他の表面の殺菌を助けることができる。利点を挙げると、金属トレイ及び金属パンラックの使用によって、ＵＶ殺菌を増加させるために紫外線反射を増強することができる。

一実施形態において、耐熱性エンクロージャは、標準温度防除装置を備えることができる。

耐熱性エンクロージャの寸法は、例えば、エンクロージャの位置及びエンクロージャ内に配置される容器の数などの様々な要因に基づいてカスタマイズすることができる。一実施形態において、天井の高さは少なくとも８フィートであり、床の面積は少なくとも８０平方フィートである。

一実施形態において、微生物を培養し、及び／又は微生物増殖副生成物を生成する方法は、ａ）微生物増殖を増強するために栄養素と任意で混合された固体基質を容器に入れてマトリックスを形成し、ｂ）微生物の接種剤をマトリックスに適用し、ｃ）表面が熱安定性エンクロージャの内側にあるようにして、接種されたマトリックスを有する容器を水平表面上に配置し、ｄ）微生物がマトリックスを通って増殖するのに十分な時間、２５〜４０℃の温度で容器をインキュベートすることを含む。

特定の実施形態において、容器は、シートパン又はトレイであり、水平面はシートパンラック内のスライドである。トレイは、複数の他の接種されたトレイと共に、パンラックのスライド上に配置することができる。一実施形態において、トレイが充填された複数のシートパンラックは、熱安定性エンクロージャ内部で使用される。

微生物ベースの生成物の調製
本発明の１つの微生物ベースの生成物は単に、微生物及び／又は微生物によって生成される微生物代謝産物及び／又は任意の残留栄養素を含有する基質である。固体基質、微生物、及び／又は副生成物を採取すると、生成物をホモジナイズし、任意で、例えば、貯蔵タンク内で水に溶解することができる。ある実施形態において、水に溶解する前に、生成物は、例えば、噴霧乾燥又は凍結乾燥を用いて乾燥することができる。乾燥した生成物は、貯蔵することもできる。

発酵産物は、抽出又は精製することなく直接使用することができる。所望であれば、抽出及び精製は、当業者に公知の標準的な抽出方法又は技術を使用して行うことができる。

微生物ベースの生成物中の微生物は、活性又は不活性形態であってよい。ある実施形態において、微生物は、胞子形成されているか、又は胞子形態である。微生物ベースの生成物は、さらなる安定化、保存、及び貯蔵することなく、使用することができる。利点を挙げると、これらの微生物ベースの生成物の直接使用によって、微生物の高い生存率が保たれ、異物や望ましくない微生物からの汚染の可能性が低減され、微生物増殖の副生成物の活性が維持されることである。

一実施形態において、微生物ベースの生成物は、１グラム当たり少なくとも１×１０^８〜１×１０^１２の細胞、胞子又は他の繁殖体を含むことができる。好ましい実施形態において、生成物は、１グラム当たり少なくとも１×１０^１０の細胞、胞子又は他の繁殖体を含む。

溶解された培養物を含有する乾燥生成物及び／又は液体生成物は、例えば、直ちに使用するためのタンカーを介して、適用部位に移すことができる。追加の栄養素及び添加剤も同様に含めることができる。

他の実施形態において、組成物（乾燥生成物の形態又は溶解した液体形態）は、例えば、意図される用途、意図される適用方法、発酵容器のサイズ、及び微生物増殖施設から使用場所への任意の輸送様式を考慮して、適切なサイズの容器に入れることができる。このように、微生物ベースの組成物が配置される容器は、例えば、１ガロン〜１，０００ガロン以上であってもよい。特定の実施形態において、容器は、２ガロン、５ガロン、２５ガロン、又はそれ以上である。

反応器から微生物ベースの組成物を収穫したら、収穫された生成物が処理される際、及び／又は貯蔵や輸送のために容器に入れられる際に、さらなる成分を添加することができる。添加剤は、例えば、緩衝剤、担体、同じ又は異なる施設で製造される他の微生物ベースの組成物、粘度調整剤、防腐剤、微生物増殖のための栄養素、追跡剤、殺虫剤、及び意図される用途に特定の他の成分とすることができる。

利点を挙げると、本発明によれば、微生物ベースの生成物は、微生物が増殖した基質を含むことである。生成物中のバイオマスの量は、重量基準で、例えば、全てのパーセンテージを含めて０％〜１００％のいずれかである。

任意で、生成物は、使用前に貯蔵することができる。貯蔵時間は短いのが好ましく、６０日未満、４５日未満、３０日未満、２０日未満、１５日未満、１０日未満、７日未満、５日未満、３日未満、２日未満、１日未満、又は１２時間未満である。好ましい実施形態において、生細胞が生成物中に存在する場合、生成物は、例えば、２０℃、１５℃、１０℃、又は５℃未満などの低温で貯蔵される。一方、バイオ界面活性剤組成物は、典型的には周囲温度で貯蔵することができる。

微生物ベースの生成物の現地生産
本発明の特定の実施形態において、微生物増殖施設は、所望のスケールで、新鮮な高密度の微生物及び／又は目的の微生物増殖副生成物を生成する。微生物増殖施設は、適用部位又はその近くに位置してもよい。この施設は、バッチ培養、準連続培養、又は連続培養で、高密度の微生物ベースの組成物を生産する。

本発明の微生物増殖施設は、微生物ベースの生成物が使用される場所（例えば、柑橘園）に配置することができる。例えば、微生物増殖施設は、使用場所から３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、１５、１０、５、３、又は１マイル未満である。

微生物ベースの生成物は、従来の微生物生成の微生物安定化、保存、貯蔵及び輸送プロセスに頼ることなく、現地で生成することができるので、非常に高密度の微生物を生成することができ、それによって、現場適用で使用するために必要とされる微生物ベースの生成物の量は少なくて構わない。また、所望の効力を達成するために必要な場合には、非常に高い密度の微生物を適用することもできる。これにより、スケールダウンしたバイオリアクター（例えば、小さい発酵容器、少ない供給量の出発物質、栄養素及びｐＨ防除剤）が可能となり、システムを効率的にし、細胞を安定化させる、又は培養培地からそれらを分離する必要性を排除することができる。微生物ベースの生成物の現地生成によればまた、生成物に増殖培地を容易に含めることができる。培地は、発酵中に生成された、現地使用に特に適した薬剤を含有することができる。

現地生産の高密度で頑強な微生物の培養は、サプライチェーンにしばらくの間残っていたものよりも、この分野においては有効である。本発明の微生物ベースの生成物は、発酵増殖培地中に存在する代謝産物及び栄養素から細胞が分離されている従来の生成物と比較して特に有利である。輸送時間の短縮によって、微生物及び／又はそれらの代謝産物の新鮮なバッチの製造及び配送が、現地の要求に応じた時間及び体積で可能になる。

本発明の微生物増殖設備は、微生物自体、微生物代謝産物、及び／又は微生物が増殖する記録媒体の他の成分を含む、新鮮な微生物ベースの組成物を生成する。所望であれば、組成物は、高密度の栄養細胞もしくは増殖体、又は栄養細胞と増殖体との混合物を含む。

一実施形態において、微生物増殖施設は、微生物ベースの生成物が使用される場所（例えば、柑橘園）、例えば、３００マイル、２００マイル、又はさらには１００マイル以内又はその近くに位置する。利点を挙げると、組成物を、指定場所での使用のために調整できることである。微生物ベースの組成物の処方及び効力は、例えば、どの土壌タイプ、植物及び／又は作物が処理されているか、組成物が適用されている時期がどの季節、気候及び／又は年間であるか、適用のどの様式及び／又は割合が利用されているかのような、適用時の特定の現地の条件に合わせてカスタマイズすることができる。

利点を挙げると、分散型微生物増殖設備は、上流側での処理遅延、サプライチェーンのボトルネック、不適切な貯蔵、及び、例えば、細胞が最初に増殖される生存可能な高細胞計数生成物及び関連する培地及び代謝産物のタイムリーな配送及び適用を妨げる他の不測事態に起因して、その生成物の品質が損なわれる、遠方に散在している工業規模の生産者に依存するという現在の問題に対する解決策を提供することである。

さらに、組成物を現地製造することによって、処方や効能を、特定の場所及び適用時に存在する条件にリアルタイムで調整することができる。これは、中央の場所で予め作製され、例えば、ある場所には最適ではない設定割合や処方を有する組成物に勝る利点を与える。

微生物増殖施設は、目的地の地理との相乗効果を改善するために微生物ベースの生成物を調整する能力があるため、製造の汎用性が提供される。好ましい実施形態において、本発明のシステムには、天然に存在する現地微生物及びそれらの代謝副生成物の力を利用するという利点がある。

個々の容器の培養時間は例えば、１〜７日以上であってもよい。培養物は、数多くの異なる方法のいずれかで収穫することができる。

例えば、発酵の２４時間以内の現地製造及び配送により、純粋な、高い細胞密度の組成物を実質的に低輸送コストで得られる。より効果的で強力な微生物接種材料の開発における急速な進歩の見通しを考えると、消費者は、微生物ベースの生成物を早急に配達できる恩恵を受けられるであろう。

実施例
本発明及びさらなる理解と多くの利点は、例示として与えられる以下の実施例から得られる。以下の実施例は、本発明の方法、用途、実施形態及び変形のいくつかを例示するものであ。それらは、本発明を限定するものと見なされるべきではない。本発明に関して、多くの変更及び修正を行うことができる。

実施例１-固相発酵を用いたメタリジウムアニソプリアの増殖
Metarhizium anisopliaeを、初期含水量が約５０％に固定された米ふすまと米殻との混合物を含む培地を用いた固相発酵によって増殖させた。培地を、基準プルーフィングオーブン（すなわち、市販のベーカーに用いられる）に適合した金属トレイに広げた。次いで、発酵を、２７±１℃の温度でプルーフィングオーブン中で行った。発酵時間は１２〜１４日であった。

実施例２−固相発酵を用いたBEAUVERIA BASSIANAの増殖
１×１０^７の分生子／ｇの濃度のBeauveria bassianaの播種培養物を、３％トウモロコシ粉、２％米ぬか、及び２％トウモロコシ浸漬粉末培地中で２日間増殖させた。

播種培養物を湿った米培地（精白米、４０％水分含量）に添加した。接種材料の量は培地の総量の１０％であった。培養物をポリエチレンバッグ中で増殖させた。

これらの最適条件を用いて、２５℃で１４日間培養した後、４．０５グラムの分生子／１００グラムの乾燥米を得た。

Claims (24)

1. １種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、及び研磨物質を含む、殺虫組成物。
2. 前記１種以上の昆虫病原性糸状菌は、Metarhizium anisopliae及びBeauveria bassianaから選択される、請求項１に記載の殺虫組成物。
3. M.anisopliaeとB.bassianaの両方を含む、請求項２に記載の殺虫組成物。
4. 前記キチナーゼ誘導物質は、キチン及びはカイコの結晶から選択される、請求項１に記載の殺虫組成物。
5. 前記研磨物質は、珪藻土である、請求項１に記載の殺虫組成物。
6. 抗凝固物質をさらに含む、請求項１に記載の殺虫組成物。
7. 前記抗凝固物質は、血リンパ系抗凝固物質を含む、請求項６に記載の殺虫組成物。
8. 前記血リンパ系抗凝固物質は、アスコルビン酸及びフェニルチオ尿素から選択される、請求項７に記載の殺虫組成物。
9. ０．１％までの血リンパ系抗凝固物質を含む、請求項７に記載の殺虫組成物。
10. １種以上の昆虫病原性糸状菌、キチナーゼ誘導物質、及び研磨物質を、、節足動物害虫と接触させることを含む、節足動物害虫を防除する方法。
11. 前記節足動物害虫は、昆虫害虫である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記節足動物害虫は、疾病媒介生物である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記１種以上の昆虫病原性糸状菌は、Metarhizium anisopliae及びBeauveria bassianaから選択される、請求項１０に記載の方法。
14. 前記キチナーゼ誘導物質は、キチン及びカイコの結晶から選択される、請求項１０に記載の方法。
15. 前記研磨物質は、珪藻土である、請求項１０に記載の方法。
16. 抗凝固物質を前記害虫と接触させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
17. 前記抗凝固物質は、血リンパ系抗凝固物質を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 前記血リンパ系抗凝固物質は、アスコルビン酸、フェニルチオ尿素、及びこの組み合わせから選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記殺虫組成物を、前記害虫と接触させることは、前記害虫が横断、静止、沈降、交配、産卵、及び／又は摂食する表面に、前記殺虫組成物を塗布することを含む、請求項１０に記載の方法。
20. 前記表面は、植物又は植物の一部である、請求項１９に記載の方法。
21. 前記殺虫組成物を、前記害虫と接触させることは、前記組成物を、噴霧又は散布により、前記害虫に直接塗布することを含む、請求項１０に記載の方法。
22. 植物、動物及び／又はヒトにおける害虫媒介疾病の広がり又は発生を、阻害、防止及び／又は減少させるために使用する、請求項１０に記載の方法。
23. 害虫によって引き起こされる植物への損傷及び疾病を、阻害、防止及び／又は減少させるために使用する、請求項１０に記載の方法。
24. 前記殺虫組成物を、前記害虫と接触させることは、前記組成物を、誘引化学物質、フェロモン、及び／又は視覚的誘引を有する昆虫トラップに塗布することを含む、請求項１０に記載の方法。