CN1253087C - 枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药和应用，属于生物技术领域。发酵培养基为葡萄糖或蔗糖或玉米浆，温度30～37℃，转速300～1000r/min，溶氧30%，30～36h，离心收集上清液，在上清液中加入6mol/L HCl调pH至2.0～2.5，离心抽提收集上清抽提液，再用甲醇或乙醇按上述离心抽提方法抽提并将上清抽提液合并，真空干燥后获得脂肽类生物农药粉剂。离心后的发酵上清液中加入工业用NaOH调pH至7.0左右后排放于自然环境。首次提供脂肽类生物农药的经济环保型工业发酵生产方法，并在大田和保护地用于植物病虫害的无公害防治，在不同种农作物上防治效果达48%～80%，增产5.6%～20.2%。
Description
(一)技术领域
本发明枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药和应用，属于生物技术领域。专用于从枯草芽孢杆菌中制备脂肽类化合物，用于植物病虫害无公害防治，并提高作物产量。
(二)背景技术
脂肽类化合物是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生的天然的具有潜在的植物病害防治和医学应用价值的抗菌物质。它包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturins)和fengycin。其中，surfactin不仅是高活性的生物表面活性剂，同时也是具有广泛用途的生物活性物质，表现出抗病毒、抗肿瘤和抗支原体活性，在石油回收及去乳化方面也有良好的表现。而iturins能够影响细胞膜的表面张力，导致微孔的形成、K+及其它重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡，显示很强的抗菌活性，且具有很广泛的抗菌谱。而fengycin也具有强抗真菌活性，尤其对丝状真菌具有特异活性。
脂肽类化合物的结构为由α-氨基酸和β-羟基脂肪酸构成的大环内酯型脂肽类化合物。由于氨基酸组成和脂肪酸侧链长度的差异形成多种同分异构体(isoforms)，如surfactin为含有7个α-氨基酸和具有13，14或15个碳原子的β-羟基脂肪酸构成的大环内酯型脂肽类化合物。不同的surfactin isoform的生物学活性是不同的，不仅表现在其表面活性能力发生改变，而且在抗病毒活性上也存在明显差别，如脂肪酸链为15个碳原子和具一个负电荷的surfactin表现了最高的抗病毒活性。Iturins包括iturinA-E，bacillomycins D-F及mycosubtilin，在自然界中存在着8种同分异构体。Fengycin也具有2种同分异构体。由于脂肽类抗生素优良的生物学特性及其广泛的应用前景，近年来，美国、日本及欧盟等许多国家对其进行了广泛深入的研究，涉及产物纯化鉴定、生物合成酶结构与功能研究，以及生物合成酶编码基因克隆和改造等。
最近，我们与柏林理工大学生物化学与分子生物学研究所Dr.JoachimVater实验室合作，采用MALDI-MS和HPLC等技术对本实验室分离的数十个菌株和合作方实验室的一些菌株进行了鉴定。结果显示不同菌株可产生1～3种脂肽类化合物，如ATCC21332、OKB105、B2菌株仅产生surfactin一种脂肽类化合物，而B3、49菌株产生iturins和fengycin二种脂肽类化合物。而B213、A1/3、C1和43可产生surfactin、iturins和fengycin三种脂肽类化合物。
通过与德国埃尔兰根大学微生物遗传与生物化学研究所进行合作研究，我们在脂肽类化合物生物合成调控分子遗传学方面取得了一些新的研究进展。我们从具自主知识产权的枯草芽孢杆菌B3菌株中克隆到4个脂肽类化合物合成相关基因(lpaB3、srfD、aspB3和yczE)。并将编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(phosphopantetheinyl transferase，PPTases)的lpaB3转入不产生任何脂肽类抗生素的B.subtilis 168菌株中构建了用于生物生防目的的工程菌GEB3。
迄今为止，脂肽类化合物的研究目标主要集中在医学应用上，但由于脂肽类化合物存在破坏血红细胞的作用而使其在医学上的应用受到限制，对脂肽类化合物酶基因进行分子修饰来创造出可用于医学的新活性化合物仍是目前世界上生物化学和分子生物学研究的一个热点。迄今，脂肽类化合物的研究工作还只限于实验室内进行分子生物学方面的研究，没有文献和专利报道利用工业发酵方法生产枯草芽孢杆菌脂肽类化合物，并用该脂肽类化合物进行植物病虫害防治的报道。
(三)发明内容
技术问题 本发明的目的是提供枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药及其应用方法，属于经济环保型工业发酵生产方法，可以作为新型环保型生物农药在大田和保护地应用，用于防治植物病虫害和提高作物产量。
技术方案 枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药，是通过以下方法生产的，包括：
在发酵罐中配制发酵培养基：按照每升培养液中含10～20g葡萄糖或10～20g蔗糖或25～35g玉米浆，0.5～1g酵母提取物(yeast extract)，0.5g谷氨酸钠，0.5gMgSO4，0.5gKCl,1gKH2PO4，0.15mgFe2SO4·6H2O，5.0mgMnSO4·H2O，0.16mgCuSO4·5H2O，调pH范围为6.8～7.0，加水至1L；
按发酵培养基体积的2％加入种子菌，温度30～37℃，转速300～1000r/min，溶氧30％，发酵30～36h，发酵结束后离心收集上清液，在上清液中加入6mol/LHCl调pH至2.0～2.5，离心收集沉淀，按其质量的1倍量加入甲醇或乙醇后，用1mol/L NaOH调pH范围为6.8～7.2，离心抽提收集上清抽提液，再用甲醇或乙醇按上述离心抽提方法抽提并将上清抽提液合并，真空干燥后获得脂肽类生物农药粉剂。离心后的发酵上清液中加入工业用NaOH调pH至7.0左右后排放于自然环境。
上述脂肽类生物农药的使用方法：将脂肽类生物农药粉剂先溶于少量甲醇或乙醇后加水配制成浓度为10～500μg/mL的溶液蘸根或喷施植物表面1～4次，用于防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦白粉病、小麦赤霉病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、番茄早疫病、番茄青枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病等植物病害，以及蚜虫等虫害。
有益效果 本发明所提供的枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：
1.首次提供了可工业化生产脂肽类生物农药的经济环保型的生产方法
利用枯草芽孢杆菌活菌进行植物病害生物防治已有报道，由于枯草芽孢杆菌栖息的植物和土壤环境中微生物群落复杂，防治效果差且很不稳定，而且直接使用枯草芽孢杆菌菌体发酵液，体积大，在贮藏和运输上有很大困难。枯草芽孢杆菌抗菌的主要成份是脂肽类化合物，本发明首次提供了一套经济环保型可工业化生产脂肽类生物农药的方法，可以进行大规模工业化生产。生产中使用廉价的玉米浆培养基或蔗糖培养基代替葡萄糖，可以获得理想的脂肽类生物农药产量，提供了廉价的生产方法。同时，对脂肽类生物农药生产过程中产生的发酵废液通过加入工业用NaOH调节pH至7.0左右后，再排放于自然环境中，不会对环境造成任何污染，所以本发明提供了符合环保要求的可工业化生产脂肽类生物农药的新方法。
2.首次提出脂肽类化合物作为新型环保型生物农药使用
由于枯草芽孢杆菌活菌及其代谢产物是目前仅有的几种可用于绿色蔬菜A级和AA级生产的微生物农药之一，所以本发明提供的枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药是枯草芽孢杆菌的自然代谢产物，属新型环保型生物农药。同时，脂肽类生物农药也是一种创新产品，因为脂肽类化合物是由多种同分异构体组成，与化学农药相比不易产生抗药性。与枯草芽孢杆菌活菌比，本发明脂肽类生物农药是活菌的主要活性成份，将其直接用于大田和保护地用于植物病虫害的无公害防治，效果更好和更易使用。生产的脂肽类生物农药还提供了与其它化学农药混用的可能性，从而减轻化学农药对环境的污染。
3.首次提出了脂肽类化合物作为新型环保型生物农药的高效应用
本发明突破了脂肽类化合物还没有在植物病虫害防治方面应用的现状。在大田和保护地应用脂肽类生物农药的试验表明，脂肽类生物农药以10～500μg/mL喷施植物表面或蘸根，用于防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦白粉病、小麦赤霉病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、番茄早疫病、番茄青枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病等植物病害，以及蚜虫等虫害，在不同种农作物上防治效果达48％～80％，增产5.6％～20.2％。
四、附图说明
图1：MALDI-MS检测的枯草芽孢杆菌B3菌株产生的fengycin
图2：MALDI-MS检测的枯草芽孢杆菌B3菌株产生的伊枯草菌素
图3：MALDI-MS检测的枯草芽孢杆菌B2菌株产生的表面活性素
图4：枯草芽孢杆菌B3菌株产生的脂肽类化合物HPLC定量分析色谱图
五、具体实施方式
实施例1
1、枯草芽孢杆菌B3菌株脂肽类生物农药的生产方法，包括
在瑞士比欧30L发酵罐(NLF，Bioengineering AG)中配制发酵培养基20L：按照每升培养液中含20g蔗糖，1g yeast extract，0.5g谷氨酸钠，0.5gMgSO4，0.5gKCl，1gKH2PO4，0.15mgFe2SO4·6H2O，5.0mgMnSO4·H2O，0.16mgCuSO4·5H2O，调pH范围为7.0，加水至1L；
种子菌在摇瓶中振荡培养12小时，按发酵培养基体积的2％加种子菌400mL至发酵罐，温度35℃，转速500r/min，溶氧30％，发酵30h，发酵结束后离心收集上清液，在上清液中加入6mol/L HCl调pH至2.0，离心收集沉淀，湿重约142g，按其质量的1倍量加入甲醇后，用1mol/L NaOH调pH为7.0，离心抽提收集上清抽提液，再用甲醇或乙醇按上述离心抽提方法抽提1次并将上清抽提液合并，真空干燥获得脂肽类生物农药约15.2g粉剂。
2、脂肽类生物农药的质量检测：
脂肽类生物农药的主要活性成份是脂肽类化合物。其质量的定性检测可用质谱的方法。具体的是将脂肽类生物农药过葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)层析柱进行初步纯化，获得的粗纯化物经MALDI-TOF-MS检测，结果表明枯草芽孢杆B3菌菌株产生的脂肽类化合物有伊枯草菌素和fengycin。
利用HPLC技术(高学文，姚仕义，Huong Pham，Joachim Vater，王金生.Bacillus subtilis B2菌株产生的表面活性变异体的纯化和鉴定.微生物学报，2003，43(5)：647～652)定量检测脂肽类生物农药的含量。具体的是利用HPLCSMART SYSTEM过μRPC C2/C18层析柱来分离脂肽类生物农药，梯度洗脱。洗脱液A为含0.1％甲酸的水溶液，B为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，55min内B液梯度变化从0至100％。检测波长为210、260和280nm。以脂肽类化合物表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和fengycin纯品作标准曲线，通过样品测定且与标准曲线比较来确定样品浓度。检测结果表明B3菌株发酵后产生的纯脂肽类化合物重量为12.1g。
采用上述方法生产的脂肽类生物农药，在田间的使用方法见表1，用于植物病虫害无公害防治并提高作物产量。试验表明，脂肽类生物农药以10～500μg/mL喷施植物表面或蘸根，能够防治植物病虫害，在不同种农作物上防治效果达48％～80％，增产5.6％～20.2％。
发明人的测试结果表明脂肽类生物农药对数十种植物病原真菌和植物病原细菌都有很好的抑制效果，植物病原真菌中以稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum nigrum)等效果最好，而植物病原细菌中对番茄青枯病病菌(Pseudomonas solanacearum)的抑制效果最好。以抑制稻瘟病菌、番茄早疫病菌和辣椒炭疽病菌分生孢子萌发为指标，结果表明脂肽类化合物中fengycin和iturin的抑菌效果很好，EC50分别为0.12～2.2μg/mL和1.66～14.55μg/mL。MIC为50～80μg/mL。选取辣椒炭疽病菌进行抗药性分析，结果表明辣椒炭疽病菌对脂肽类化合物不产生抗药性。
实施例2
1、枯草芽孢杆菌B213菌株脂肽类生物农药的生产方法，包括
在瑞士比欧30L发酵罐(NLF，Bioengineering AG)中配制发酵培养基20L：按照每升培养液中含15g葡萄糖，0.5g yeast extract，0.5g谷氨酸钠，0.5gMgSO4，0.5gKCl，1gKH2PO4，0.15mgFe2SO4·6H2O，5.0mgMnSO4·H2O，0.16mgCuSO4·5H2O，调pH范围为7.0，加水至1L；
种子菌在摇瓶中振荡培养12h，按发酵培养基体积的2％加种子菌400mL进入发酵罐，温度35～37℃，转速500r/min，溶氧30％，发酵30h，发酵结束后离心收集上清液，在上清液中加入6mol/L HCl调pH至2.0，离心收集沉淀，湿重约160g，按其质量的1倍量加入甲醇后，用1NaOH调pH为7.0，离心抽提收集上清抽提液，再用甲醇或乙醇按上述离心抽提方法抽提1次并将上清抽提液合并，干燥后获得脂肽类生物农药粉剂18.8g。
2、脂肽类生物农药的质量检测：
脂肽类生物农药的主要活性成份是脂肽类化合物。其质量的定性检测可用质谱的方法。具体的是将脂肽类生物农药过葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)层析柱进行初步纯化，获得的粗纯化物经MALDI-TOF-MS检测表明枯草芽孢杆菌B213菌株产生的脂肽类化合物有表面活性素、伊枯草菌素和fengycin。
利用HPLC技术定量检测脂肽类生物农药的含量。具体的是利用HPLC SMARTSYSTEM过μRPC C2/C18层析柱来分离脂肽类生物农药，梯度洗脱。洗脱液A为含0.1％甲酸的水溶液，B为含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液，55min内B液梯度变化从0至100％。检测波长为210、260和280nm。以脂肽类化合物表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素类(iturins)和fengycin纯品作标准曲线，通过样品测定且与标准曲线比较来确定样品浓度。检测结果表明B213菌株发酵后产生的纯脂肽类化合物15.3g。
实施例3
不同枯草芽孢杆菌菌株，使用培养基不同成份，采用实施例1的方法和条件，通过发酵生产和质量检测同样可以得到脂肽类生物农药，每20L培养基可得到脂肽类生物农药产量10～35g(见表2)，其田间应用方法和效果同实施例1，是本领域技术人员可以做到的。
上述实施例所用菌株B3、B213、43、49、ATCC6633、OKB105和C1及农药MALDI-TOF-MS检测方法见J.Vater，X.W.Gao，G.Hitzeroth，C.Wilde and P.Franke.“Whole cell”-Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization-Time of Flight-Mass Spectrometry，an Emerging Technique forEfficient Screening of Biocombinatorial Libraries of NaturalCompounds-Present State of Tesearch.Combinatorial Chenistry & HighThroughput Screening，2003，6，557-567。
表1脂肽类生物农药对作物病虫防治作用及增产作用
| 作物 | 使用方法 | 防治对象 | 防治效果(％) | 增产效果(％) |
| 水稻 | 喷雾3次，使用浓度为120μg/L喷雾3次，使用浓度为120μg/L | 稻瘟病纹枯病 | 7265 | 11.08.0 |
| 小麦 | 喷雾3次，使用浓度为100μg/L喷雾3次，使用浓度为100μg/L | 白粉病赤霉病 | 6853 | 5.67.1 |
| 番茄 | 喷雾3次，使用浓度为80μg/L蘸根及后期喷雾2次，使用浓度为80μg/L | 早疫病青枯病 | 8056 | 20.28.8 |
| 辣椒 | 喷雾3次，使用浓度为80μg/L喷雾3次，使用浓度为80μg/L | 炭疽病病毒病 | 6548 | 7.28.2 |
| 黄瓜 | 喷雾3次，使用浓度为80μg/L喷雾3次，使用浓度为80μg/L | 灰霉病霜霉病 | 7666 | 12.311.2 |
| 青菜 | 喷雾3次，使用浓度为80μg/L喷雾3次，使用浓度为80μg/L | 霜霉病蚜虫 | 6255 | 7.69.7 |
表2脂肽类生物农药的产量和质量测定结果
| 枯草芽孢杆菌菌株 | 发酵条件 | 脂肽类生物农药产量(g) | 产生的脂肽类化合物种类 | 纯脂肽类化合物含量(g) |
| B3 | 培养基20g/L蔗糖，1g/L Yeastextract，其它同实施例1 | 15.2 | Iturin，fengycin | 12.1 |
| B213 | 培养基15g/L葡萄糖，0.5g/L Yeastextract，其它同实施例1 | 18.8 | Iturin，Fengycin，surfactin | 15.3 |
| 43 | 培养基15g/L葡萄糖，1g/L Yeastextract，其它同实施例1 | 10.3 | Iturin，Fengycin，surfactin | 7.7 |
| 49 | 培养基15g/L葡萄糖，0.5g/L Yeastextract，其它同实施例1 | 12.4 | Iturin，fengycin | 8.9 |
| ATCC6633 | 培养基20g/L蔗糖，1g/L Yeastextract，其它同实施例1 | 23.6 | Iturin，Fengycin，surfactin | 17.6 |
| OKB105 | 培养基20g/L蔗糖，0.5g/L Yeastextract，其它同实施例1 | 34.5 | surfacin | 28.8 |
| C1 | 培养基35g/L玉米浆，1g/L Yeastextract，其它同实施例1 | 25.2 | Iturin，Fengycin，surfactin | 18.3 |
Claims (2)
1.枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药，其特征在于，该农药是通过以下方法生产的，包括：
在发酵罐中配制发酵培养基：按照每升培养液中含10～20g葡萄糖或10～20g蔗糖或25～35g玉米浆，0.5～1g酵母提取物，0.5g谷氨酸钠，0.5gMgSO4，0.5gKCl，1gKH2PO4，0.15mgFe2SO4·6H2O，5.0mgMnSO4·H2O，0.16mgCuSO4·5H2O，调pH范围为6.8～7.0，加水至1L；
按发酵培养基体积的2％加入种子菌，温度30～37℃，转速300～1000r/min，溶氧30％，发酵30～36h，发酵结束后离心收集上清液，在上清液中加入6mol/LHCl调pH至2.0～2.5，离心收集沉淀，按其质量的1倍量加入甲醇或乙醇后，用1mol/L NaOH调pH范围为6.8～7.2，离心抽提收集上清抽提液，再用甲醇或乙醇按上述离心抽提方法抽提并将上清抽提液合并，之后将上清抽提液真空干燥获得脂肽类生物农药粉剂。
2.权利要求1所述的脂肽类生物农药的使用方法：将浓度为10～500μg/mL的脂肽类生物农药蘸根或喷施植物表面1～4次，用于防治防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦白粉病、小麦赤霉病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、番茄早疫病、番茄青枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病，以及蚜虫。
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