TW201322924A - 伯克氏菌屬隔離菌株以及農藥代謝產物的配方和用途 - Google Patents

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Abstract

一種伯克氏菌種，已知對脊椎動物並無致病性，但具有殺蟲活性(如植物、藻類、蛛形綱動物、昆蟲、真菌、雜草和線蟲)，以及可藉由伯克氏菌種控制藻類的方法。也提供有來自此菌種的培養液和使用天然產物控制藻類和/或節肢動物的方法。

Description

伯克氏菌屬隔離菌株以及農藥代謝產物的配方和用途
本發明提供未含對脊椎動物具有致病性的伯克氏菌種，這些脊椎動物如哺乳動物、魚類和鳥類，但對植物如藻類、昆蟲、真菌及蛛形綱動物如蟎和線蟲等卻具有殺蟲活性，其配方和組合物即含有此菌種。也提供此菌種培養的天然產品、配方和組合物及控制藻類和蟎等蜘蛛綱動物的方法，即採用伯克氏菌種和/或其天然產物。
本發明所指是微生物植物和其他生物體所製成的天然產物，此微生物的天然產物提供豐富的化學多樣性來源，而天然產物用於醫藥已有很長的歷史。此類的化合物為FR901228，提取自色桿菌，並已發現可作為抗菌劑和抗腫瘤劑(如參見Ueda等人的美國專利案號7,396,665)。
但微生物生成的次級代謝物也發現可用於除草和病蟲害防治的農業應用上(如中島等1991、Duke,2000；Lydon & Duke,1999；Gerwick美國專利案號7,393,812)。微生物天然產物已可開發成農業用的殺蟲劑(如參見Salama et al.1981；Thompson et al.,2000；Krieg et al.1983)有時此類天然產品可與農藥殺蟲劑混合使用(如參見Gottlieb美國專利案號4,808,207)。
殺蟎劑
殺蟎劑是可以殺滅蟎蟲(殺蟎劑)和蜱(殺蜱劑)的化合物，此類的殺蟲劑涵蓋範圍大，可含抗生素、氨基甲酸酯類、甲脒殺蟎劑、擬除蟲菊酯類、蟎蟲生長調節劑和有機磷的殺蟎劑成份。除了化學性的殺蟲劑，矽藻土和脂肪也可用於控制蟎蟲。通常是藉由破壞角質層讓蟎乾燥而死。此外，某些精油成份如薄荷油也可用於控制蟎蟲，雖然已知有種類繁多的殺蟎劑化合物，但蟎蟲仍是一個嚴重的農業問題，因為他們對農作物造成了損害。在一季中，蟎蟲就可繁衍數代，這有助於養成對殺蟎 劑產品的抗藥性。因此，迫切需要新的防治標的和新藥效的殺蟲劑產品。
殺藻劑
藻類有許多種類，其中包括：(1)微小的單細胞藻類像是頭髮的絲狀藻類、片狀藻類和看起來像植物一樣的大型藻類；(2)在外珠(表皮內部的藻類或一些珊瑚鈣殼，海葵和其他無柄無脊椎動物中，名為蟲黃藻的藻類；(3)非常困難去除的綠色小點，有時生長在水族館箱板上，但並非是藻類而是矽藻或放射狀的棲息地(具有堅硬外殼的微小單細胞動物)有藻類混入其基質中。
在少數水量的容器中，經過一段時間，藻類的生長就非常顯著，這是非常令人討厭的事。因此，藻類會導致水過濾器的堵塞，池中出現惡臭和不雅外觀，耗盡溶解的氧氣導致魚類和貝類窒息死亡。除了出現在水中外，藻類也會出現在曝露於天候和光線的工業材料中，如礦物基板、紡織品整理劑、木材塗料和塑膠製成的材料，位於這些材質表面的有機膜劑塗層。
藻類的控制可分為4類：生物性、機械性、物理性和化學性的控制。依據某些適用於藻類控制法的一些相關事實，如Turbo和Astrea蝸牛，某些西瓜刨、褐藻和其他的食草動物。蝸牛是最廣泛使用的清道夫，這通常是最佳的選擇。本國的某些地區似乎偏好使用海膽和侏儒天使(熱帶魚)，前者容易死掉而徒增浪費，後者以昂貴的無脊椎動物為食也是個問題。其他的方法包括功能性的蛋白質分離器、帶或不帶臭氧的裝置和紫外線消毒器。這些物理性的過濾器可移除破壞曝露的藻類，水循環時促進營養素的氧化，也可使用抗生素。但對於藻類的問題只治標不治本。這些因素會導致水系統的不平衡，銅通常以硫酸銅溶液的形式來作為殺藻劑及一般動物流行病和寄生蟲預防用藥，此金屬可用於水槽和魚群的治療和檢疫，但對所有的生物具有永久毒性尤其是魚類。
伯克氏菌
伯克氏菌是屬變形桿菌的β-亞屬的菌種，有40多個品種，居住在不同的生態位階中(Compant et al.,2008)。伯克氏菌屬的細菌品種屬土壤根際中無處不在的生命體(Coenye and Vandamme,2003；Parke and Gurian-Sherman,2001)。傳統上，被稱為植物病原體，洋蔥伯克氏菌是最先被發現而鑑定為洋蔥的病原體(Burkholder,1950)。有許多的伯克氏菌種對寄主植物已形成有益的相互作用(如參見如Cabballero-Mellado et al.,2004,Chen et al.,2007)。某些伯克氏菌種也可能是人類的病原體(如參見Cheng and Currie,2005 and Nierman et al.,2004)，此外，某些伯克氏菌種可作為生物控制產品(如參見，Burkhead et al.,1994；Knudsen et al.,1987；Jansiewicz et al.,1988；Gouge et al.,美國專利申請號2003/0082147；Parke et al.，美國專利案號6,077,505；Casida et al.，美國專利案號6,689,357；Jeddeloh et al.,WO2001055398；Zhang et al.，美國專利案號7,141,407)。此菌屬的某些品種對受污染的土壤或地下水具有生物修復淨化的效果(如Leahy et al.1996)。另外，已發現某些伯克氏菌種可分泌多種的胞外酶具有蛋白水解、脂解和溶血性的作用，也含有毒素、抗生素和鐵載體的(如參見Ludovic et al.,2007；Nagamatsu,2001)。
PCT/US2011/026016中揭露伯克氏菌種特別是伯克氏菌A396及其衍生的化合物，已知對脊椎動物沒有致病性，但可防治植物、昆蟲、真菌和線蟲的危害。
噁唑、噻唑和吲哚
噁唑、噻唑和吲哚類化合物廣泛分佈於植物、藻類、海綿和微生物中。大量的天然產物包含一個或多個五元噁唑、噻唑和吲哚核/基團，這些天然產物具有廣泛的生物活性有明顯的醫療價值，如博萊黴素(Tomohisa et al.)是廣泛使用的抗癌藥物，可降解DNA的氧化並使用一個聯噻唑基團結合標靶的靶DNA序列(Vanderwall et al.,1997)，桿菌肽(Ming et al.,2002)，含噻唑啉的肽抗生素藉由混合 C55-bactoprenolpyrophosphate，可形成細菌細胞壁的新生物合成物。Thiangazole(Kunze et al.,1993)含1串列的一個噁唑和3個噻唑啉，具有抗病毒活性(Jansen et al.,1992)，其他的噁唑/噻唑含天然產物如硫鏈絲菌肽(Anderson et al.,1970)，GE2270A(Selva et al.,1997)可抑制細菌蛋白質合成中的轉換步驟。已有報告指出，超過1000種的吲哚骨架生物鹼是取自微生物，三分之一的這些化合物含超過500Da的肽，吲哚自其中衍生出色氨酸。其餘三分之二的結構變化性較高，其生物活性似乎涵蓋範圍更廣泛，包括抗菌、抗病毒、細胞毒性、殺蟲、抗血栓形成或抑制酶活性。
本發明提供為非洋蔥伯克氏菌、非植物伯克氏菌、非唐菖蒲伯克氏菌的伯克氏菌的獨立菌種，具有下列特性：(a)含一個16rRNA基因序列包括一個正向序列至少有此序列99.5%的同一性，即如SEQ ID NO：8、11和12，而反向序列對SEQ ID NO：9、10和13-15至少為99.5%的同一性；(b)具有殺蟲活性特別是除草、殺藻、殺蟎、殺蟲、殺真菌劑和殺線蟲的活性；(c)產生至少下列一種的化合物：(i)此化合物有下列特性：(a)液相色譜/質譜法(LC/MS)測定分子量為525-555；(LC/MS)；(b)1H NMR δ值6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23、1.74、1.15、1.12、1.05和1.02；(c)13C NMR δ值172.99，172.93，169.57，169.23，167.59，130.74，130.12，129.93，128.32，73.49，62.95，59.42，57.73，38.39，38.00，35.49，30.90，30.36，29.26，18.59，18.38，18.09，17.93，12.51和(d)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(ii)此化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個吲哚基團、至少一個噁唑基團、至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯 基、至少17個碳原子和至少3個氧原子、2個氮原子；(iii)此化合物具有噁唑-芐基結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子；(iv)此化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有2個亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮，及(d)對脊椎動物非致病性(無傳染性)，如哺乳動物，鳥類和魚類等；(e)對卡那黴素，氯黴素，環丙沙星，呱拉西林，亞胺培南以及磺胺和甲氧芐啶的混合物具有易感性，及(f)含脂肪酸16：0、環基17：0、16：0 3-OH、14：0、環基、19：0 ω8c，18：0。
在具體實施例中，此菌株具有伯克氏菌Are69菌種的特性(NRRL Accession No.B-50319)。
在具體實施例中，所述第一種物質是上清液。在更具體的實施例中，此上清液是無細胞的上清液。
還提供了一種組合，特別是含下列成份的組合物或配方：(a)第一種物質選自純培養物、細胞餾分物或來自上述伯克氏菌種或作為殺蟲劑使用的提取物上清液；和(b)可任選至少一種的載劑、稀釋劑、表面活性劑、輔助劑或化學性或生物性殺蟲劑(如殺藻劑、殺蟎劑、除草劑、殺菌劑、殺蟲劑和殺線蟲劑，特別是殺藻劑或殺蟎劑)。在相關方面，本發明所提供者即覆有上述組合物或成份。
在具體實施例中，此組合物或配方可包括：(a)第一種物質即選自純培養物、細胞餾分物或來自上述伯克氏菌種或作為殺蟲劑使用的提取物上清液；(b)脂肪酸16：0、環基17：0、16：0 3-OH、14：0、環基19：0 ω8c、18：0，C1-C7對羥基苯甲酸酯，C2-C17醇與洗滌劑，和 (c)任選的另一種物質，其中所述的其他物質是一種農藥(如殺真菌劑、殺蟲劑、殺藻劑、殺蟎劑、除草劑和殺線蟲劑)。
在具體實施例中，C1-C7脂族對羥基苯甲酸酯存在量約0.01-5%，C2-C17醇的存在量約0.00-10%，而洗滌劑的存在量約0.001-10%。
還提供來自上述配方的殺蟲物質，此組合物含上述殺蟲劑和其他化學或生物性的殺蟲劑和用於製造這些殺蟲劑的方法。在具體實施例中，這些殺蟲物質包括下列之一的特性：(a)具有殺蟲特性，特別是除草、殺蟲、殺線蟲和殺真菌的特性；(b)分子量約210-240，更具體地說，液相色譜/質譜(LC/MS)測定為222；(c)1H NMR δ值7.90、6.85、4.28、1.76、1.46、1.38、1.37、0.94；(d)13C NMR δ值166.84、162.12、131.34(2C)、121.04、114.83(2C)、64.32、31.25、28.43、25.45、22.18、12.93；(e)高壓液相色譜法(HPLC)於反相C-18 HPLC(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)的保留時間約15-20分鐘，更具體來說約17分鐘，甚至更具體的狀況下約17.45分鐘，以水：乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘：90-0%的水溶液CH3CN，20至24分鐘：100%乙腈，24至27分鐘：0-90%的含水乙腈，27-30分鐘：90%含水CH 3 CN)在0.5毫升/分鐘流速和210nm的UV波長下測定；(f)13C NNR譜顯示13個離散碳信號，顯示含一個甲基，5個亞甲基碳原子，4個甲烯和3個季碳；(g)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C13H18O3；(h)UV吸收帶介於210-450nm，最具體的是約248nm。
還提供的是含下列結構的化合物：
其中X是獨立的-O、-NR或-S基，其中R是H或C1-C10烷基，R1、R2、R3、R4、R5和R6是各自獨立的H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H基、醯基、羟基、氨基甲酸叔丁酯、磺醯基、磺醯胺或硫。
特別是此物質可能具有此類的結構：
其中X是獨立的-O，-NR或-S基，其中R是H或C1-C10烷基，R1、R2、R3、R4、R5和R6是各自獨立的H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H基、醯基、羟基、氨基甲酸叔丁酯、磺醯基、磺醯胺或硫。
在更具體的實施例中，此化合物是對羥苯甲酸丁酯而具有以下的結構：
在更具體的實施例中，此化合物是對羥苯甲酸己酯而具有以下的結構：
在更具體的實施例中，此化合物是對羥苯甲酸辛酯而具有以下的結構：
此殺蟲物質可藉由下列方法而得自上述配方：(a)提供如上所述的配方；(b)提供足夠的時間進行培養或儲存(如約1天至6個月)，在足夠溫度下(如約3到50℃間)產生殺蟲物質和配方，和(c)分離殺蟲物質。
在相關方面，即揭露一種方法用於調節有害生物的增殖和/或生長，包括但並不限於昆蟲、真菌、雜草、線蟲、節肢動物和藻類，特別是藻類和蛛形綱動物(如蟎蟲、蜱)，包括將有害生物的增殖和/或生長調節到所需的數量：(I)(a)至少一個或多個物質選自上述伯克氏菌種及其提取物的純細胞培養物，細胞餾分物和上清液，和(b)任選的另一種殺蟲劑物質，或(Ⅱ)來自所述配方的組合物或配方或殺蟲物質。可有效調節上述當地害蟲的細胞增殖和/或生長。
本發明所揭露的分離化合物，可取自或源自伯克氏菌種，或其他可製造這些混合物的生命體，可用來控制各種害蟲，特別是植物的致病害蟲，包括但不限於昆蟲、線蟲、細菌和真菌。這些化合物也可用作除草劑，殺蟎劑或殺藻劑。
特別是，此單方的殺蟲化合物包括但不限於：(A)具有下列特性的化合物：(a)液相色譜質譜(LC/MS)測 定的分子量約525-555，(ii)1 H NMR δ值6.22，5.81，5.69，5.66，5.65，4.64，4.31，3.93，3.22，3.21，3.15，3.10，2.69，2.62，2.26，2.23，1.74、1.15、1.12、1.05和1.02；(iii)13C NMR δ值172.99，172.93，169.57，169.23，167.59，130.74，130.12，129.93，128.32，73.49，62.95，59.42，57.73，38.39，38.00，35.49，30.90，30.36，29.26，18.59，18.38，18.09，17.93，12.51和(c)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(B)此化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一種吲哚基團、至少一個噁唑基團、至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子；(C)此化合物具有噁唑-芐基的結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯胺基、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子；(D)此化合物具有至少一個酯化合物、至少一個醯胺、至少3個亞甲基、至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基、至少3個羥基，至少25個碳原子、至少8個氧原子和一個氮，和(E)此化合物具有至少一個酯化合物、至少一個醯胺、至少一個環氧化合物亞甲基、至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵、至少6個甲基、至少有3個羥基、至少25個碳原子、至少8個氧原子和一個氮原子，和在具體實施例中，此單方的殺蟲化合物包括但不限於：(A)此化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子，有至少下列之一的特性：(i)分子量約275-435；(ii)1H NMR δ值8.44、8.74、8.19、7.47、7.31、3.98、2.82、2.33和1.08、(iii)13C NMR值163.7、161.2、154.8、136.1、129.4、125.4、123.5、123.3、121.8、121.5、111.8、104.7、52.2、37.3、28.1、22.7 和22.7；(iv)高壓液相色譜法(HPLC)於反相C-18 HPLC柱析的保留時間約10-20分鐘，使用水：乙腈(CH 3 CN)梯度溶劑系統和210nm的UV波長檢測；(v)UV吸收帶約226、275和327nm；(B)此化合物具有噁唑-芐基的結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團、至少一個取代烷基和至少一個醯胺基、至少15個碳原子、至少2個氧原子和2個氮原子和至少下列之一的特性：(i)液相色譜/質譜法(LC/MS)測定的分子量約240-290，(ii)1H NMR δ值約7.08、7.06、6.75、3.75、2.56、2.15、0.93、0.93；(iii)13C NMR δ值158.2、156.3、155.5、132.6、129.5、129.5、127.3、121.8、115.2、115.2、41.2、35.3、26.7、21.5、21.5；(iv)高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水上的保留時間約6-15分鐘，使用水：乙腈(CH 3 CN)梯度，和(v)約230，285和323nm的UV吸收帶；(C)此非環氧化物含至少一個酯化合物、至少一個醯胺、至少3個亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基、至少3個羥基、至少25個碳原子、至少8個氧原子和一個氮和至少下列之一的特性：(i)液相色譜/質譜法(LC/MS)測定分子量約530-580；(ii)1H NMR δ值為6.40、6.39、6.00、5.97、5.67、5.54、4.33、3.77、3.73、3.70、3.59、3.47、3.41、2.44、2.35、2.26、1.97、1.81、1.76、1.42、1.37、1.16、1.12和1.04；(iii)13C NMR δ值173.92、166.06、145.06、138.76、135.71、129.99、126.20、123.35、99.75、82.20、78.22、76.69、71.23、70.79、70.48、69.84、60.98、48.84、36.89、33.09、30.63、28.55，25.88，20.37、18.11、14.90、12.81、9.41，(iv)高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水上的保留時間約7-12分鐘，使用水：乙腈(CH3CN)梯度和210nm的UV波長進行檢測；(v)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C28H45NO10，(vi)UV吸收帶約210-450nm； (D)此化合物含(i)至少一個酯、至少一個醯胺、一個環氧化物亞甲基、至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基、至少3個羥基、至少25個碳原子、至少8個氧原子和至少一個氮原子，(ii)13C NMR δ值174.03、166.12、143.63、137.50、134.39、128.70、126.68、124.41、98.09、80.75、76.84、75.23、69.87、69.08、68.69、68.60、48.83、41.07、35.45、31.67、29.19、27.12、24.55、19.20、18.95、13.48、11.39、8.04，(iii)分子式為C28H43NO9和至少下列之一的特性：(a)1H NMR δ值約6.41、6.40、6.01、5.97、5.67、5.55、4.33、3.77、3.75、3.72、3.64、3.59、3.54、3.52、2.44、2.34、2.25、1.96、1.81、1.76、1.42、1.38、1.17、1.12、1.04，(b)高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水上的保留時間約6-15分鐘使用水：乙腈(CH3CN)的梯度系統檢測，(c)UV吸收帶介於210-450nm，而最具體的是約234nm。
在更具體的實施例中，所提供的化合物包括但不限於：(A)一種化合物而具有下列的結構式##STR001#
或可接受的殺蟲劑鹽類或立體異構物，其中M是1、2、3或4，n為0、1、2或3，p和q分別為1或2，X是O，NH或NR、R1、R2和R3可以是相同或各別不同的氨基酸側鏈基團或氨基酸側鏈衍生物，R是低級鏈烷基、芳基或芳基烷基的 基團；(B)一種化合物而具有下列的結構式##STR002##
其中X、Y和Z分別是-O，-NR1或-S，其中R1是-H或C1-C10烷基，R1、R2和m分別是-H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H基、醯基、羟基、氨基甲酸叔丁酯、磺醯基、磺醯胺或硫、而m可位於噁唑環上的任意位置點；(C)一種化合物而具有下列的結構式##STR002a##
其中R1是-H或C1-C10烷基，R2是烷基酯；(D)一種化合物而具有下列的結構式##STR003#
其中X，Y和Z分別是-O，-NR1或-S，其中R1是-H或C1-C10烷基，R1、R2和m為位於噁唑環上取代物，分別是-H、 烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫。
(E)一種化合物而具有下列的結構式##STR003a##
其中R1是-H或C1-C10烷基；(F)一種化合物而具有下列的結構式##STR004a##
其中X、Y和Z分別是-O，-NR或-S，其中R是H或C1-C10烷基、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13分別是H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；(G)一種化合物而具有下列的結構式##STR004b##
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13分別是-H、烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、 雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素；(H)一種化合物而具有下列的結構式##STR004c##
其中R1,R2,R3,R4,R5,R6,R7,R8，和R11分別是-H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素；(I)一種化合物而具有下列的結構式##STR005##
其中X和Y分別是-OH、-NR1或S，其中的R1和R2分別是-H、烷基(如C1-C10烷基)、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基鏈烯基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；(J)一種化合物而具有下列的結構式##STR006a##
其中X、Y和Z分別是-O，-NR或-S，其中R是H或C1-C10烷基、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12和R13分別是H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代 炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；在最具體實施例中，此化合物可包括但不限於：(i)templazole A；(ii)templazole B；(iii)templamide A；(iv)templamide B；(v)FR901228；
(x)
(xx)
(xl)FR901465；(xli)F8H17，是一種活性化合物取自F8餾分，依據正ESI模式分子離子峰為1081.75(M+H)，再由ESIMS的1079.2的基峰，顯示為活性化合物。此化合物顯示在234 nm處的UV 吸收帶。
在相關方面，即揭露一種可調節害蟲增殖和/或生長的方法(如藻類、節肢動物、線蟲、昆蟲、真菌)，包括適用於調節害蟲增殖和/或生長的位置上(如藻類、蛛形綱動物、線蟲、昆蟲和真菌)，將下列控制在所需的數量下
(I)(a)上述的單方化合物和(b)任選的另一種物質，即所謂的殺藻劑或(II)上述的成份或組合物具備有效量可用於調節害蟲的細胞增殖和/或生長。
在另一個相關方面中，所揭露的為一種用於調節藻類增殖，和/或調節受有害蟲侵染的植物，和/或調節單子葉或雙子葉雜草或莎草生長的方法，用於某個部位而調節藻類的增殖和/或生長，和/或調節節肢動物蟲蛀，和/或調節其上述雜草其出現和/或生長達所需的數量，(A)上述配方或其有效的殺蟲物質；(B)上述的組合物；(C)templamide A；(D)templamide B；(E)FR901465；(F)FR901228；可有效調節所述的藻類增殖和/或生長、和/或害蟲的侵染、和/或所述位置的單子葉或雙子葉雜草或莎草出現或生長。線蟲和/或蟲害可藉由templamide A、templamide B，FR901465和/或FR901228調節。在更具體的實施例中，可用於防治白蟻特別是Oncopeltus屬(如O.fasciatus)和/或Lygus sp和/或活線蟲和/或寄生線蟲(如M根結線蟲)控制調節。
上述的組合物和成份方便進行各種修改和改換替用方法，此節將詳細說明具體實施例。但應瞭解到，本說明內容無意將本發明的內容限制於本發明揭露的範圍以內，相反的是要 涵蓋所有的修改內容、同等方法和替用方法而無違本發明的精神和申請專利範圍內。
應瞭解的是，關於本發明的數值範圍中，除非另有清楚說明者，否則各個中間值即介於單位值1/10的下限和上限之間，本發明提及的任何中間值即等於該數值或介於此上下限的範圍內，更小的範圍也應包括在內。這些較小範圍的上下限也包括在其中，屬該範圍的任何例外限值範圍內。
除非另有定義，本發明所用的所有技術和科學術語均有相同的含義，可為本發明所屬技術領域的一般技術人員所瞭解。雖然還有其他任何類似或等同於本發明所述的方法和材料，仍可用於本發明的實務和測試中，本發明即說明優選的方法和材料。
需注意的是，本發明及其附錄所用的「單數」、「和」與「此」的字義，除非另有清楚說明者，否則也包括複數的意思。
如本發明所定義，所謂的「來自」為直接從某個特定來源，或來自某個特定來源而已辨識出的某個物質或生命體。
如本發明所定義，「單方化合物」基本上不含其它化合物或物質，如至少約20%的純度或至少約40%的純度，更好的是約60%的純度，再更好的是約80%的純度或約90%的純度，甚至最好的是約95%的純度，如分析方法所測定，包括但並不限於色譜法和電泳法。
如本發明所使用，術語「烷基」是指具有1至約12個碳原子的單價直鏈或支鏈的烴基，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正己基和類似物。
如本發明所謂的「取代烷基」是指烷基還帶有一個或多個取代基而選自羥基、烷氧基、巰基、環烷基、取代環烷基、雜環基、取代雜環基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、芳氧基、取代芳氧基、鹵素、氰基、硝基、氨基、醯氨基、-C(O)H、醯基、羟基、羧基、磺醯基、磺醯胺、硫、和類似物。
如本發明所謂的「鏈烯基」是指直鏈或支鏈的烴基，具有 一個或多個碳-碳雙鍵，並且具有約2至12個碳原子，而「取代鏈烯基」即如上所述，是指再含有一個或多個取代基取代基。
如本發明所謂的「炔基」是指至少具有一個碳-碳三鍵的直鏈或支鏈烴基，含約2至12個碳原子，而「取代炔基」是指再含有一個或多個上述的取代基。
如本發明所謂的「芳基」是指含6至14個碳原子的芳族基，而「取代芳基」是指上述的芳基再含有一個或多個如上述的取代基。
如本發明所謂的「雜芳基」是指芳環含有一個或多個雜原子(如N、O、S或類似物)，成為環狀結構的一部份，含3至14個碳原子和「取代雜芳基」，而「取代雜芳基」還帶有一個或多個上述的取代基取。
如本發明所用，所謂的「烷氧基」為-O-烷基的基團，其中烷基如上述定義，為「取代烷氧基」是指烷氧基還帶有一個或多個上述的取代基。
如本發明所用，所謂的「烷硫基」是指-S-烷基，其中是烷基如上述定義，而「取代烷硫基」是指硫代烷基再帶有一個或多個上所述的取代基。
如本發明所用，所謂的「環烷基」是指環狀結構的烷基，含3至8個碳原子，而「取代環烷基」是指環烷基還帶有一個或多個上述的取代基。
如本發明所謂的「雜環」是指環狀基，含一個或多個雜原子(如N、S、O或類似物)，成為環狀結構的一部份，含3至14個碳原子，而「取代雜環」是指雜環還帶有一個或多個上述的取代基。
本發明所謂的「海藻」是指任何生命體，主要是指水生、真核和光合的生物，大小不等範圍從單細胞生物到巨型海帶。此名詞進一步指地球上許多進行光合作用的單細胞生物而藻類族群眾多。因此，此用語指任何的單細胞生物，可為海藻而包括下列族群：囊泡蟲、chloraraachniophytes、cryptomonads、 眼蟲(euglenids)、灰藻(glaucophytes)和著鞭毛藻，如紅藻、茸鞭生物和viridaeplantae藻類的原生生物。此用語是指真核細胞、綠藻、黃綠藻、棕藻類和紅藻。此用語也指原核生物中的藍藻，此用語也指綠藻、藍藻和紅藻。
如本發明所謂的「殺藻劑」是指一種或多種藥劑、化合物和/或成份，而具有海藻防治劑和/或殺藻劑等活性。
如本發明所謂的「殺藻」即殺藻劑。
本發明所謂的「海藻防治劑」即抑制藻類生長，在某些情況下是可逆的。
伯克氏菌株
本發明上述的伯克氏菌系為伯克氏菌種的複合菌、非植物伯克氏菌、非唐菖蒲伯克氏菌、伯克氏菌種，對脊椎動物屬非致病性，如鳥類、哺乳動物和魚類。此菌株可使用Lorch等人(1995)的步驟自土壤樣品中分離取得，伯克氏菌株分離取自許多不同種類的土壤或生長培養基中，此樣本可塗布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上，本菌為革蘭氏陰性菌呈圓形不透明的奶油色菌落，長時間下變為粉紅色和粉褐色粘糊狀。
菌落自馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上分離出而出，並篩選那些具有洋蔥伯克霍爾德菌株在下麵的實施例中所述的本發明的生物、遺傳、生物化學和/或酶學特性。特別是伯克氏菌株含16S rRNA的基因，於上述的SEQ IN NO：8、11和12中，包括1前向序列至少約99.5%，更佳則約99.9%，最好可達100%相同的序列：和一個前向序列，於上述的SEQ IN NO：9、10、13、14和15，依據CLUSTAL分析至少約99.5%相同，更佳則是約99.9%，而最好可達100%相同的序列。此外，如下所述，此伯克氏菌株具殺蟲活性，特別是殺病毒、除草、殺菌、殺真菌劑、殺線蟲劑、殺菌和殺蟲，而更具體來說，具有除草、殺藻、殺蟎、殺蟲、殺真菌和殺線蟲的活性。對脊椎動物如哺乳動物、鳥類和魚類等物致病性。
此外，伯克氏菌株可製造本發明上述一種的殺蟲化合物， 伯克氏菌株易受到卡那黴素、氯黴素、環丙沙星、呱拉西林、亞胺培南、磺胺和甲氧芐啶的組合所抑制，含脂肪酸16：0、環狀結構17：0、16：0 3-OH、14：019，環狀結構1：0和18：00。
此伯克氏菌株可藉由培養含伯克氏菌A396特性的菌種(NRRL Accession No.B-50319)，於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)或含特定的碳源如葡萄糖、麥芽糖、果糖、半乳糖和非特定的氮源如蛋白腖、胰蛋白腖、大豆腖和NZ胺的發酵培養基中取得。
溶藻和殺蟎化合物
本發明所揭露的殺藻和殺蟎化合物可能具有下列特性：(a)取自新種的伯克氏菌種的如A396；(b)特別是對最常見的農業害蟲具有毒性，(c)分子量為約525-555，更具體而言，液相色譜/質譜法(LC/MS)測定為540，(d)1H NMR δ值為6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23、1.74、1.15、1.12、1.05、1.02，(d)13C NMR δ值172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51，(e)高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100A,100 x 4.60 mm)上的保留時間約10-15分鐘，更具體而言約12分鐘，而使用水：乙腈(CH3CN)的梯度系統(0-20分鐘90-0%乙腈溶液，20-24分鐘100% CH3CN，24-27分鐘，0-90% CH3CN，而UV檢測波長是210nm，(f)依據1H,13C NMR and LC/MS的數據分析，分子式為C24H36N4O6S2，(g)23C NMR含24個碳原的所有信號，包括5-甲基、4亞甲基、9甲基和6季碳和(g)1H NMR譜顯示具有典型的縮酚酸肽特性，含3-氨基質子[4.63,4.31,3.93]和一個酯甲醇質子[5.69]。在特定實施例中，此化合物具有結構##STR001##：
或可接受的殺蟲劑鹽類或立體異構物，其中M是1，2，3或4，n為0，1，2或3，p和q分別為1或2，X是O，NH或NR，R1，R2和R3可以是相同或各別不同的氨基酸側鏈基團或氨基酸側鏈衍生物，R是低級鏈烷基，芳基或芳基烷基的基團；在特定實施例中，此化合物具有FR901228的結構：
本發明為##STR002##中的化合物：
其中X、Y和Z分別是--O、--NR1或-S，其中R1是H或C1-C10烷基，R1和R2分別是-H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環、環烷基、取代環烷基、烷氧 基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫。
甚至在另一個特定實施例中，##STR002##結構系的化合物可為上述(vi)-(xix)項的化合物。
(xii)
這些物質可取自市售或化學合成的天然材料或化合物，##STR002##結構系的化合物包括但不限於微生物、藻類和海綿。在更具體的實施例中，微生物##STR002##結構系的化合物包括但不限於或是##STR002##結構系的化合物，可衍生的物種如鏈黴菌waksmanii(化合物vi)(Umehara,et al.,1984)、鏈黴菌pimprina(化合物Ⅶ)(Naiket al.,2001)、鏈黴菌olivoreticuli(化合物VIII，IX，X)(KoyamaY.,et al.,1981)、鏈黴菌(化合物xi、xii)(Watabe et al.,1988)和丁香假單胞菌(化合物xiii、xiv)(Pettit et al.,2002)。##STR002##結構系的化合物也可取自藻類，包括但不限於紅藻(化合物xv)(N’Diaye,et al.,1996)、紅藻Martensia fragilis(化合物xvi)(Takahashi S.et al., 1998)、Diazona羊草(化合物xvii和xviii)(Lindquist N.et al.,1991)、Rhodophycota haraldiophyllum(化合物xix)(Guella et al.,1994)。
還提供的##STR003##的結構物：
其中X和Y分別是-OH、-NR1或-S，其中R1是-H或C1-C10烷基，R1、R2和m噁唑環上的取代基，分別是-H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫。
還提供##STR005##：
其中X和Y分別是-OH、-NR1或S，其中的R1、R2分別是-H、烷基(如C1-C10烷基)、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基鏈烯基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；在特定實施例中，##STR005##結構系的化合物如來自上述xx-xxiii的化合物，可取自天然或市售或化學合成的來源。
(xx)
##STR005##結構系化合物的天然來源包括但不限於植物、珊瑚、微生物和海綿。此微生物包括但不限於灰色鏈黴菌(化合物xx)(Hirota et al.,1978)和白色鏈黴菌(化合物xxi)(Werner et al.,1980)。STR004的結構系化合物也可取自藻類，包括但不限於Haraldiophyllum sp(化合物xxii(Guella et al.,2006)和紅藻(化合物xv)(N’Diaye,et al.,1994)。
在某個實施例中，此化合物可來自或取自一種微生物，尤其是取自伯克氏菌種，其結構特性含至少一個酯、至少一個醯胺、至少3亞甲基基團、至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基基團、至少3個羥基基團，至少25 個碳原子和至少8個氧原子和一個氮原子。此化合物再含有下列之一的特性：(a)具殺蟲特性，特別是殺線蟲、殺真菌、殺蟲、殺蟎、殺藻和除草的特性；(b)分子量約530-580，更具體地說，液相色譜/質譜(LC/MS)測定為555；(c)1H NMR δ值6.40、6.39、6.00、5.97、5.67、5.54、4.33、3.77、3.73、3.70、3.59、3.47、3.41、2.44、2.35、2.26、1.97，1.81，1.76、1.42、1.37、1.16，1.12、1.04；(d)13C NMR δ值173.92、166.06、145.06、138.76、135.71、129.99、126.20、123.35、99.75、82.20，78.22、76.69、71.23、70.79、70.48、69.84、60.98、48.84、36.89、33.09、30.63、28.55，25.88，20.37、18.11、14.90、12.81、9.41；(e)高壓液相色譜法(HPLC)於反相C-18 HPLC(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)的保留時間約7-12分鐘，更具體來說約10.98分鐘，以水：乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘：90-0%的水溶液CH3CN，20至24分鐘：100%乙腈，24至27分鐘：0-90%的含水乙腈，27-30分鐘：90%含水CH3CN)在0.5毫升/分鐘流速和210nm的UV波長下測定；(f)13C NMR譜顯示28個離散碳信號，顯示含6個甲基、4個甲基碳原子、13個次甲基其中包括sp2和4個季碳；(g)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C28H45NO10；(h)UV吸收帶介於210-450nm，最具體的是約234nm。
也提供含##STR004a##結構的化合物。
其中X、Y和Z分別是-O，-NR或-S，其中R是H或C1-C10 烷基、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、和R13分別是H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；在特定實施例中，此化合物具有結構##STR0004b##：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、和R13的定義同前##STR004a##。
在更具體的實施例中，此化合物是Templamide A所含結構如下：
在另一個實施例中，提供含##STR004c##配方的化合物：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R11的定義同前##STR004a##。
在另一個具體實施例中，所提供的化合物可取自伯克氏菌種，其特性含至少一個酯化合物、至少一個醯胺、一個環氧亞甲基、至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵、至少6個甲基、至少有3個羥基、至少25個碳原子、至少8個氧原 子和一個氮原子和殺蟲活性。此化合物再含有下列之一的特性：(a)具殺蟲特性，特別是殺蟲、殺菌、殺線蟲劑、殺蟎劑、殺藻及除草的特性；(b)分子量約520-560，特別是液相色譜/質譜(LC/MS)測定為537；(c)1H NMR δ值約6.41、6.40、6.01、5.97、5.67、5.55、4.33、3.77、3.75、3.72、3.64、3.59、3.54、3.52、2.44、2.34、2.25、1.96、1.81、1.76、1.42、1.38，1.17，1.12、1.04；(d)13C NMR δ值174.03、166.12、143.63、137.50、134.39、128.70、126.68、124.41、98.09、80.75，76.84、75.23、69.87、69.08、68.69、68.60、48.83、41.07、35.45、31.67、29.19、27.12、24.55、19.20、18.95、13.48、11.39、8.04；(e)高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100A,100 x 4.60 mm)上的保留時間約6-15分鐘，更具體而言約8分鐘，而使用水：乙腈(CH3CN)的梯度系統，高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100A,100 x 4.60 mm)上的保留時間約8-15分鐘，更具體而言約11.73分鐘，而使用水：乙腈(CH3CN)的梯度系統(0-20分鐘90-0%乙腈溶液，20-24分鐘100% CH3CN，24-27分鐘，0-90% CH3CN，流速為0.5 mL/min，而UV檢測波長是210nm；(f)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C28H43NO9；(g)UV吸收帶介於210-450nm，最具體的是約234nm。
在特定實施例中，此化合物具有結構##STR006a##：
其中X、Y和Z分別是-O，-NR或-S，其中R是H或C1-C10烷基、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12和R13分別是H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；在特定實施例中，此化合物具有的結構為：
在另一個實施例中，提供含##STR006b##配方的化合物：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R11的定義同前##STR006a##。
在更具體的實施例中，此化合物是Templamide B所含結構如下：
在另一個具體實施例中，所提供的化合物可取自伯克氏菌種，其特性含至少一個酯化合物、至少一個醯胺、一個環氧亞甲基、至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵、至少6個甲基、至少有3個羥基、至少25個碳原子、至少8個氧原 子和至少一個氮原子，此化合物再含有下列之一的特性：(a)具殺蟲特性，特別是殺線蟲、殺真菌、殺蟲、殺蟎、殺藻和除草的特性；(b)分子量約510-550，特別是液相色譜/質譜(LC/MS)測定約為523；(c)1H NMR δ值約6.41，6.40，6.01，5.98，5.68，5.56，4.33，3.77，3.75，3.72，3.65，3.59，3.55，3.50，2.44，2.26，2.04，1.96，1.81，1.75，1.37，1.17，1.04；(d)13C NMR δ值約172.22，167.55，144.98，138.94，135.84，130.14，125.85，123.37，99.54，82.19，78.28，76.69，71.31，70.13，69.68，48.83，42.52，36.89，33.11，30.63，25.99，21.20，20.38，18.14，14.93，12.84；(e)高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100A,100 x 4.60 mm)上的保留時間約6-15分鐘，更具體而言約8分鐘，而使用水：乙腈(CH3CN)的梯度系統，高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱析採用水(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100A,100 x 4.60 mm)上的保留時間約8-15分鐘，更具體而言約11.73分鐘，而使用水：乙腈(CH3CN)的梯度系統(0-20分鐘90-0%乙腈溶液，20-24分鐘100% CH3CN，24-27分鐘，0-90% CH3CN，流速為0.5 mL/min，而UV檢測波長是210nm；(f)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C27H41NO9；(g)UV吸收帶介於210-450nm，最具體的是約234nm。
在更具體的實施例中，此化合物是已知的化合物FR901465，取自上述假單胞菌屬No.2663(Nakajima et al.1996)細菌培養液中，並據報含抗癌活性具有下列結構：
甚至在另一個特定實施例中，##STR006a##的家族化合物可為上述(xxiv)-(xxxix)項的化合物。這些物質可取自市售或化學合成的天然材料或化合物，##STR006a##結構系的化合物包括但不限於微生物、藻類和海綿。在更具體實施例，此微生物包括##STR006a##的化合物，來自如假單胞菌屬的微生物No.2663(化合物xxiv-xxvi)(Nakajima et al.,1996)，此FR901464(xxvii-xxxix)的類似物已被合成具有專利的抗癌化合物(見Koide等人美國專利申請號2008/0096879 A1)。
還提供上述配方所製造的殺蟲化合物，包括以下至少一種的特性：(a)具有殺蟲特性，特別是除草、殺蟲、殺線蟲和殺真菌的特性；(b)分子量約210-240，更具體地說，液相色譜/質譜(LC/MS)測定為222；(c)1H NMR δ值7.90、6.85、4.28、1.76、1.46、1.38、1.37、0.94；(d)13C NMR δ值166.84、162.12、131.34(2C)、121.04、114.83(2C)、64.32、31.25、28.43、25.45、22.18、12.93；(e)高壓液相色譜法(HPLC)於反相C-18 HPLC(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100 A,100 x 4.60 mm)的保留時間約7-12分鐘，更具體來說約10.98分鐘，以水：乙腈(CH3CN)梯度溶劑系統(0-20分鐘：90-0%的水溶液CH3CN，20至24分鐘：100%乙腈，24至27分鐘：0-90%的含水乙腈，27-30分鐘：90%含水CH3CN)在0.5毫升/分鐘流速和210nm的UV波長下測定；(f)13C NMR譜顯示13個離散碳信號，顯示含一個甲基、5 個亞甲基碳原子、4個甲烯和3個季碳；(g)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C13H18O3；(h)UV吸收帶介於210-450nm，最具體的是約248nm。
還提供含下列結構的化合物：
其中X是獨立的-O，-NR或-S基，其中R是H或C1-C10烷基，R1、R2、R3、R4、R5和R6是各自獨立的H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H基、醯基、羟基、氨基甲酸叔丁酯、磺醯基、磺醯胺或硫。
在更具體的實施例中，此化合物是對羥苯甲酸丁酯而具有以下的結構：
在更具體的實施例中，此化合物是對羥苯甲酸己酯而具有以下的結構：
在更具體的實施例中，此化合物是對羥苯甲酸辛酯而具有以下的結構：
在另一個具體實施例中，此化合物為F7H18而分子量約為1080。
成份
本發明所揭露者為使用伯克氏菌株所製造的純培養液、細胞組成或上清液和化合物，所有這些成份可另外稱為「活性成份」，可配製成殺蟲組合物。在更具體的實施例中，此上清液是不含細胞的上清液。
上述的活性成份可使用任何方法配製，不限制性的配方實施例包括但不限於：可乳化的濃縮物(EC)、可濕性粉劑(WP)、可溶性液體(SL)、氣溶膠、超低體積濃縮物溶液(ULV)、可溶性粉劑(SP)、微膠囊化、水擴散的顆粒劑、懸浮劑(FL)、微乳劑(ME)、納米乳液(NE)、粉劑、乳劑、液體和薄片等。在本發明所述的任何配方中，化學成份百分比在0.01%至99.99%的範圍內。
固體組合物可使用固體載劑溶於懸浮殺蟲劑的化合物溶液中，並在溫和條件下如室溫或65℃或更低的溫度下，真空蒸發乾燥此懸浮液來進行製備。另外，可藉由噴霧乾燥或冷凍乾燥取得此固體組合物。
所謂的固體組合物，為一般技術人員所瞭解的實體物質，如粉劑、珠劑、顆粒、丸劑、片劑、附聚物、顆粒劑、漂浮固體和其它已知的固體製劑。一般技術人員應能夠輕易為一般技藝所熟悉的方法，進行固體配方的最佳化處理。
此組合物可包括上述的伯克氏菌株衍生物，此凝膠包覆材料可混合凝膠形成劑(如明膠、纖維素或木質素)與溶藻化合物的溶液製備而成。
此成份可再含乳化、分散、潤濕、擴散、整合、崩解控制、穩定化學成份和改善流動性或防銹用的表面活性劑。在特定的實施例中，此表面活性劑是非植物毒性的非離子型表面活性劑，最好屬EPA列表4B中的品項。在另一個特定的具體實施例中，非離子型表面活性劑是聚氧乙烯(20)單月桂酸酯。表面 活性劑整體配方的濃度可介於0.1-35%間，優選範圍是5-25%。分散劑和乳化劑如非離子型、陰離子型、兩性表面活性劑和陽離子型分散劑和乳化劑的選擇及用量，取決於這些成份對製劑的擴散能力而定。
為能夠提供含上述化學成份如粉劑、顆粒劑、水散性粉末、水分散體或有機液體中的乳液和分散液中、載劑或稀釋劑。此成份可微分為固體、有機液體、水份、濕潤劑、分散劑、加濕劑或乳化劑或任何此類適用製劑的組合。一般而言，製備液體和可濕性粉劑時，其調理劑含一種或多種的表面活性劑，其數量足以使提供一種含活性物質、微生物和可分散於水中或油中的成份。
因為這些成份可作為液體載劑噴霧，可預知屬各樣的液體載劑如水，有機溶劑，癸烷，十二烷，油、植物油，礦物油，醇，乙二醇，聚乙二醇以及可用於治療散佈於水中的病原菌製劑組合，為其他一般的技藝眾所周知。
本發明的組合物還可包括其他物質如輔助劑，表面活性劑，粘合劑，穩定劑和類似物，為常用的殺藻劑，必要時可為單方或複方製劑。
可為一般技術人員眾所周知的是，屬各種的添加劑或試劑用於容易被上述成份所殺的害蟲而增進其殺蟲效果。所謂的「可增加殺蟲劑效果的化學成份添加劑」是指任何的化合物，溶劑，試劑，物質，可增進殺蟲活性的製劑，更具體而言就是蟎蟲，即如同上述添加劑化學成份的殺蟲效果。在某些具體實施例中，這些添加劑會增加特定害蟲對化學成份的損傷敏感性。添加劑包括但不限於可削弱易感害蟲的生物防禦劑，此類的製劑包括鹽類如NaCl和氯化鈣。
此成份還包括其他的微生物和/殺蟲劑(如殺線蟲劑、殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑、殺藻劑和殺蜱劑)。此微生物包括但不限於來自下列菌種的製劑，即芽孢桿菌屬，耐冷菌，Breva芽孢桿菌屬，蚧黴屬，非白粉寄生菌屬，二形性酵母菌屬，鏈黴 菌屬，伯克氏菌屬，木黴屬，粘帚黴屬。另外，此製劑可以是天然油或石油產物，具有殺菌，除草、殺蜱、殺藻，殺線蟲和/或殺蟲活性的(如石蠟油、茶樹油、香茅油、丁香油、肉桂油、柑橘油和迷迭香油)。
特別是其成份還可包括一種殺蟲劑，此殺蟲劑包括但不限於蘇雲金芽孢桿菌、楝樹油和印楝素、多殺菌素、色桿菌、桉樹屬申提取物、昆蟲病原細菌或真菌、白殭菌和綠僵菌，而化學殺蟲劑包括但不限於有機氯化合物、有機磷化合物、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和新菸鹼類殺蟲劑。
此成份可再含一種殺線蟲劑，此殺線蟲劑包括但不限於化學殺線蟲劑如苯線磷、涕滅威、殺線威、克百威，天然產物的殺線蟲劑、阿維菌素、真菌擬青黴菌和产气霉、堅強芽孢桿菌和其他的芽孢桿菌和穿刺巴氏桿菌。
此成份可再含一種生物殺菌劑，如库页悬钩子的提取物或殺菌劑，此類的殺真菌劑包括但不限於單一部位的抗真菌劑，可包括但不限於苯並咪唑、脫甲基抑製劑(DMI)(如咪唑、呱嗪、嘧啶、三唑)、嗎啉、羥基嘧啶、苯胺基嘧啶、硫代磷酸酯、醌抑製劑、喹啉、二羧醯亞胺、甲醯亞胺、苯基醯胺、苯胺基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烴、肉桂酸、羥基苯胺、抗生素、多胺、爐甘石、鄰苯二甲醯亞胺、苯環。在另一個實施例中，此抗真菌劑一種脫甲基化抑製劑，選自咪唑例(如氟)、呱嗪、嘧啶和三唑(如雙苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙環唑、三唑酮、糠菌唑、環唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、丙環唑和氟醚唑)。
此抗菌劑也可能是多種的無機物和化學殺菌劑，選自下列成份的官能基，即腈(如chloronitrile或咯菌腈)、喹喔啉、氨基磺酰胺、膦酸酯、亞磷酸酯、二硫代氨基甲酸鹽、chloralkythios、苯基吡啶胺和氰基乙醯胺肟。
此成份可藉由組合物藉由已知的方法來應用，具體而言，這些成份可用於植物或植物部位上，依據本發明內容，這些植 物是指所有的植物和植物種群，如所需和非所需的野生植物或作物用的植物(包括天然作物的植物)。這些作物植物可藉由以下方式或傳統的植物育種和優化方法、生物技術和基因工程的方法或這些方法的組合來取得，包括基因轉作植物的栽培和種植，包括受植物保育權所保護或不受保的植物。植物部位意指所有的植物和地面上下所有部位和器官，如芽、葉、花和根，如葉字，針狀葉、秸稈、莖、花、子實體、果實、種子、根、莖及根莖部位。此植物部位還包括部份採收的原料、營養和生成的繁殖物如扡插、塊莖、根莖、分枝和種子。
上述成份對植物和植物部位的處理，可直接或讓其成份作用於週圍環境、棲息地或儲存空間，如浸漬、噴霧、蒸發、霧化、分散、塗佈和注射等。在此情況下，此成份加於種子中，此成份於播種前可藉由已知的工藝塗佈1層或多層的塗層而加於種子上。
如上所述，此成份可再含一種殺草劑的成份，此成份可再含一種或多種的殺草劑，包括不限於生物除草劑和/或化學除草劑。生物除草劑可選自下列的官能基即丁香油、肉桂油、香茅油、柑橘油、橙皮油、騰毒素、cornexistin、AAL-毒素、麥盧卡油、纖精酮、薩克多敏、假蒟亭鹼、稻內酯乙、高粱醌以及ascaulatoxin和ascaulatoxin的糖苷配基。化學除草劑包括但不限於二氟吡隆及其鹽類、麥草畏及其鹽類、苯吡唑草酮、環磺酮、S-異丙甲草胺、莠去津、甲基磺草酮、氟嘧-甲基、2,4-二氯苯氧乙酸、煙嘧磺隆、噻吩磺隆-甲基、敵稗、黃草靈、嗪草酮、禾草靈、吡氟禾草靈、精噁唑禾草靈-p-乙基、乙氧氟草醚、碸嘧磺隆、二甲四氯丙酸、二氯喹啉酸、殺草丹、異惡草酮、氰氟草酯、芐嘧磺隆、五氟磺草胺、綠草萣、咪唑乙菸酸、氯吡-甲基、二甲戊樂靈、雙嘧苯甲酸鈉、乙基克繁草、鈉-苯達松/鈉-三氟羧草醚、草甘膦、草銨膦和嘧苯胺磺隆。
此除草成份適用於液體或固體形式作為發芽前或發芽後的製劑。
關於發芽的乾燥配方，載劑顆粒大小通常為1-2毫米(直徑)，但可更小或更大取決於所需的佔地面積，顆粒可包括多孔或非多孔的顆粒。關於發芽後的配方，所用的配方成份可含蒙脫石粘土、綠坡縷石粘土和類似的膨脹粘土、增稠劑如黃原膠、阿拉伯樹膠和其它多醣增稠劑及分散穩定劑如非離子型的表面活性劑(如聚氧乙烯(20)單月桂酸酯)。
在特定實施例中，除了化學成份外，此成份可含另一種微生物和/或殺藻劑和/或殺蟎劑。微生物可包括但不限於衍生自芽孢桿菌短芽孢桿菌屬和鏈黴菌屬的製劑。
此成份也可如上文所述，屬殺藻成份可再含其他的殺藻劑如硫酸銅、敵草快或薩克多敏A。
此成份可為殺蟎成份，可再含有其他的殺蟎劑如抗生素、氨基甲酸酯類、甲脒殺蟎劑、擬除蟲菊酯類、蟎類生長調節劑、有機磷殺蟎劑和矽藻土。
用法
本發明上述的伯克氏菌株衍生物的成份和殺蟲化合物可用作為殺蟲劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、殺藻劑、殺蟎劑和除草劑。
具體而言，可使用上述的方法來控制線蟲，包括但不限於根結、環、刺、囊腫與病變的線蟲的寄生性線蟲，包括但不限於野生的線蟲、根結線蟲、胞囊和Globodera屬，尤其是南方根結線蟲(根結線蟲)以及黃金線蟲和馬鈴薯孢囊線蟲、大豆胞囊線蟲、甜菜胞囊線蟲胞囊(甜菜胞囊線蟲病)、草蟎、癭蟎(百慕達蟎)、三葉草蟎和胞囊麥長管蚜(禾穀孢囊線蟲)。
本發明的方法可控制植物的病原昆蟲包括但不限於下列各綱的昆蟲，即：(a)鱗翅類如卷蛾屬、褐帶卷蛾屬、水青蛾、切根蟲、棉葉蟲、Amylois屬、黎豆夜蛾、卷蛾屬、紅紋卷葉蛾屬、夜蛾屬、玉米楷夜蛾、粉斑螟蛾、桃小食心蟲、水稻螟蟲、卷蛾、葡萄果蠹蛾、卷葉螟屬、雲卷蛾屬、紋卷蛾屬、鞘蛾、大菜螟、蘋 果異形小卷蛾、蘋果蠹屬、蔗螟屬、蘇丹棉鈴蟲、金鋼鑽、粉斑螟、捲葉蛾屬、黃毒蛾屬、黃毒蛾屬、地老虎、梨小屬、綠蚜蟲、棉鈴蟲屬、菜心螟、美國白蛾、番茄莖麥蛾、旋紋潛蛾、紋潛蛾屬、葡萄小卷葉蛾、毒蛾屬、葉蛾屬、天幕毛蟲、甘藍夜蛾、煙草天蛾、冬尺蠖、玉米螟、超小卷葉蛾、褐卷蛾屬、棉紅鈴蟲、玉米穗蟲、菜粉蝶屬、白粉蝶、粉蝶屬、小菜蛾、巢蛾、白禾螟屬、大螟屬、捲葉蛾屬、夜蛾屬、透翅蛾屬、舟蛾屬、捲葉蛾屬、粉紋夜蛾和巢蛾屬；(b)聖甲蟲屬如金針蟲屬、棉鈴象甲、穀類蚜蟲、甜菜脛跳甲、象鼻蟲屬、象甲屬、皮蠹屬、黃瓜條葉甲屬、食植瓢蟲屬、吻甲蟲、馬鈴薯甲蟲、稻水象甲、金龜屬、鋸穀盜屬、大苜蓿耳象屬、象鼻蟲、弧麗金龜屬、蚤屬、金龜子科屬、玉米屬、麥蛾屬、黃粉蟲屬、赤擬穀盜屬、鏈格孢屬和斑皮蠹屬；(c)直翅目，例如蠊屬、小蠊屬、螻蛄屬、馬德拉蜚蠊、飛蝗種、大蠊屬和沙漠蝗屬屬；(d)等翅目如散白蟻屬；(e)囓蟲目如書蝨屬；(f)蝨目，例如豬虱屬、長顎虱屬、蝨屬、天皰瘡屬、和根瘤蚜屬；(g)食毛目，如畜虱屬和齧毛虱屬；(h)纓翅目如薊馬屬(包括Hercinotnrips屬和帶薊馬屬)、南黃薊馬、棉薊馬和薊馬蚧；(i)半翅目如臭蟲屬、可哥瘤盲蝽、星椿象屬、美洲蝽屬、盾蝽屬、大稻緣菌、樁象屬、皮蝽屬、獵蝽屬、可哥褐盲蝽、黑椿屬、乳草蝽屬、盲蝽屬和錐鼻蟲屬；(j)條同翅目如絲絨粉虱、菜粉虱、圓蚧屬，蚜科、棉蚜屬、蚧屬、煙粉蝨、實蠅屬、褐圓盾介殼蟲、柑橘褐軟蚧、葉蟬屬、蘋果棉蚜，斑葉蟬屬、介殼蟲屬、灰飛蝨屬、褐盔蠟蚧、蠣屬、管蚜屬、蚜蟲屬、黑尾葉蟬屬、飛蝨屬、Paratoria屬、癭綿蚜屬、粉蚧屬、介殼蟲屬、蘭粉介殼蟲屬、木蝨屬、Pulvinaria aethiopica、圓蚧屬、縊管蚜屬、硬介殼蟲屬、葉蟬屬、麥二叉蚜屬、麥屬、溫室白粉蝨、木蝨和矢蟎；(k)膜翅目如切葉蟻、切葉蟻屬、麥莖屬、松葉蜂屬、膜翅目松葉蜂科、松葉蜂、梨實屬、蟻屬、小黃家蟻、葉蜂屬、火蟻和胡蜂屬；(l)雙翅目昆蟲如伊蚊屬、 高梁芒蠅、毛蚋、麗蠅、地中海實蠅屬、金蠅屬、庫蚊屬、鼠瘤蠅屬、寡鬃實蠅屬、黑腹果蠅、廁蠅屬、馬蠅屬、舌蠅屬、牛皮蠅屬、蝨蠅屬、美洲斑潛蠅屬、綠蠅屬、蠅屬、家蠅屬、狂蠅屬，癭蠅屬、麥桿蠅屬、甜菜潛葉(花)蠅、大戟屬、蘋果實蠅、菇蚋、刺蠅屬、虻屬、帶絛蟲屬和大蚊屬；(m)蚤目，如鼠蚤屬和印鼠客蚤和(n)纓尾目綱，如蠹、白菜象鼻蟲和油料種子作物，如油菜、芥菜籽及其雜交種以及水稻和玉米中的蚜蟲。在特定實施例中，此昆蟲可能是夜盜蛾屬的成員，更具體地說就是甜菜夜蛾、桃蚜、小菜蛾或美洲蝽屬。
此物質和成份也可用於調節單子葉植物的芽前或芽後配方製劑，包括莎草科或雙子葉雜草。在特定實施例，此包括但不限於藜屬(如藜)、檾麻屬(如檾)、向日葵屬(如向日葵)、丁香屬(如水丁香)、豚草屬(如豚草)、莧屬(如反枝莧、長芒莧)、旋花屬(如田旋花)、旋花屬、甘藍菜屬(如野芥)、蘿蔔屬、蒲公英屬(如蒲公英)、矢車菊屬(如黃矢車菊)、小蓬草屬(如香絲草)、薊屬(如絲路薊)、獨行菜屬、鎵屬、茄屬(如龍葵)、錦葵屬(如圓葉錦葵)、香附屬(如香附子)、紫葉酢漿草屬、大戟屬、三葉草屬、紫花苜蓿屬、輪葉黑藻、紅萍屬、馬唐屬(如馬唐)、狗尾草屬(如金狗尾草)、狗牙根、無芒雀麥屬(如短葉扭扣蘚)、早熟禾屬(如早熟禾、草地早熟禾)、黑麥草屬、(如黑麥草)、高粱屬(如石茅)、蘆竹、羊茅屬(如高羊茅)、稗屬(如稗草、水稗)。
上述的伯克氏菌株化合物和成份也可作為殺菌劑，針對的真菌可為鐮刀菌、番茄灰黴病菌、褐腐菌、炭疽菌、棉花黃萎病菌、菜豆殼球孢菌、疫病菌、毛黴、叉絲單囊殼菌、立枯絲核菌、霜黴病菌、白地黴、莖點黴和青黴。在另一個最特別的實施例中，此細菌就是黃單胞菌。
此物質或成份可藉由殺藻劑或殺藻活性而用於控制、降低或消除海洋性和非海洋性微觀和宏觀藻類的生長和增殖，包括但不限於單細胞、多細胞和矽藻、紅藻、綠藻和藍綠藻如月芽 藻、根枝藻屬、Cladophoera屬、魚腥藻、念珠藻屬、水網藻屬、輪藻、微囊藻和雙囊藻、衣藻、柵藻、顫藻、團藻屬、舟形藻和裙帶菜、鞘藻屬、水綿藻屬、紅藻、紅皮藻、絹絲藻和裙帶菜。
上述的化學成份可用於含有海藻的部位，這些部位包括但不限於水體如池塘、湖泊、小溪、河流、水族館、水處理設施、發電廠或固體表面，如塑膠、混凝土、木材、玻璃纖維、鐵製和聚氯乙烯製的管路、表面覆蓋塗層和/或塗料。
如上所述，此活性成份可用於含蛛形綱動物的部位，如蟎類包括但不限於全爪蟎屬(如柑桔紅蜘蛛和蘋果全爪蟎)、葉蟎屬(如神澤葉蟎、二斑葉蟎、太平洋葉蟎、土耳其斯坦葉蟎和硃砂葉蟎)、葉蟎屬(如石榴小爪蟎、酪梨葉蟎、草地小爪蟎和茶紅葉蟎)、刺癭蟎(如桃銀蟎、梅銹蟎和番茄赤褐色蟎)、枇杷始葉蟎屬(如尤馬紅蜘蛛蟎、六斑蟎、果苔蟎、梨上癭蟎、梨葉疹蟎、紅漿果葉蟎、側多食跗線蟎、柑橘癭蟎、劉氏短須蟎、柑桔銹蟎、麥岩蟎、橄欖葉蟎)、根蹣屬、粉蟎(如大頭梅蟎和冬糧蟎、鱷梨紅蟎、扁平蟎、黑色和紅色芒果蜘蛛蟎、木瓜捲葉蟎、德州柑桔蟎、歐洲紅蟎、葡萄蟎(水泡蟎)、太平洋蜘蛛蟎、Willamette蜘蛛蟎、粉紅柑桔銹蟎。
此類部位包括但不限於感染蟎類或其他蛛形綱動物(如蚜蟲)的作物。
本發明藉由下列非限制性實施例的參考內容提供更詳細的說明。
實施例
上述的成份和方法將更詳細說明如下列的非限制性實施例。這些將藉由不同的具體實施例來說明，而不限於本發明中，其材料、條件、重量比、加工參數和類似陳述相關的專利聲明內容。
1.實施例1微生物的分離和鑑定
1.1微生物的分離
使用業界眾所周知的成熟技術，自日本日光山輪王寺的常青樹土壤樣品採集並分離微生物。此分離方法可採用Lorch等人於1995年公佈的詳細步驟，使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)進行分離。在此過程中，土壤樣品先使用無菌水稀釋，然後塗佈於固體瓊脂的培養基上，如馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)。培養板於25℃下生長5天後，將各別的微生物菌落分離於各別的PDA培養板中。被分離的細菌屬革蘭氏陰性菌，呈圓形不透明的奶油色菌落，長時間下變為粉紅色和粉褐色粘糊狀。
1.2微生物鑑定
微生物鑑定是根據基因序列，以通用的細菌引物來擴增16S rRNA的區域。採用下列的實驗步驟：伯克氏菌屬.A396在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養板上進行培養，用無菌環刮下已生長24小時的舊培養板並重新懸浮於DNA提取緩衝液中，使用MoBio超淨微生物DNA提取試劑盒來提取DNA，以5μl的1%瓊脂糖凝膠檢查DNA提取物的品質/數量。
PCR反應設定如下：2μl的DNA提取物、5μl的PCR緩衝液、1μl的dNTPs(各10mM)、1.25μl的正向引物(27F；5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)，1.25μl的反向引物(907R；5'CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3'(SEQ ID NO：2)和0.25μl的Taq酶。使用無菌無核酸酶的水將反應體積加到50μl，PCR反應包括95℃下的初始變性步驟持續10分鐘，隨後進行30次94℃/30秒、57℃/20秒，72℃/30秒和最後72℃下最後延伸持續進行10分鐘。
該產品的近似濃度和大小，以5μl的體積在1%瓊脂糖凝膠下算出，比較產品頻帶和質量階梯。
使用MoBio PCR的清潔套件自PCR產物中，除去過量的引物、dNTPs和酶，將清除的PCR產物使用27F引物(同上述)530F(5'-GTGCCAGCCGCCGCGG-3'(SEQ ID NO：3))、1114F(5'-GCAACGAGCGCAACCC(SEQ ID NO：4))和1525R(5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3'(SEQ ID NO：5))、1100R(5'- GGGTTGCGCTCGTTG-3'(SEQ ID NO：6))和519R(5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'(SEQ ID NO：7)直接進行測序。
A396菌株的16S rRNA基因序列，可使用BLAST比對β-變形菌綱代表性基因序列。菌株A395 A396與洋蔥伯克氏菌複合菌密切相關，與多噬伯克氏菌、Burkholderia vietnamensis和洋蔥伯克氏菌的許多分離物有99%以上的相似性。BLAST的搜尋排除了洋蔥伯克氏菌複合菌，顯示與B.plantarii,B.gladioli和伯克氏菌屬.有98%的相似性。
使用鄰接法的樹距測試結果顯示A396與多噬伯克氏菌和其他的洋蔥伯克氏菌複合菌分離物有關，植物伯克氏菌和英克伯克氏菌各自分佈於不同樹枝群組中。
經隔離的伯克氏菌株經發現含下列的序列：正向序列，具有27F引物和815個核苷酸的DNA序列(SEQ ID NO：8)TGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTTGGGCTAATACCCCGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGA CTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAATMGAGGGTKGKKTGKKGGGGGGAAA
反向序列、1453 bp、使用引物1525R、1100R和519R(SEQ ID NO：9)GTCATGAATCCTACCGTGGTGACCGTCCTCCTTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTTCCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCTTGCGTAGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTATCGGTTCTCTTTCGAGCACTCCCGAATCTCTTCAGGATTCCGACCATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACT GCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCTAGCTTGCCAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGTCTTAACAAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCCCGGGGTATTAGCCCAAAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCGCCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGTGCAAGCACCCGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAG.
反向序列824 bp，使用引物907R(SEQ NO：10)CCAGGCGGTCACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCTAGCTTGCCAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGTCTTAACAAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCCCGGGGTATTAGCCCAAAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTC
ACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCGCCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGTGCAAGCACCCGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGTG
正向序列1152 bp，使用引物530F(SEQ ID NO：11)TCGGATTACTGGGCGTAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGGAGCCCCCTGGGCCTATACTGACCCTCATGCTCGAAAGCGTGAGGACCCAACCGGATTAGATGCCCTGATAGGCCATGCCCCACACCATGCCATGTGTTAGGGGCCCATTTCCTTAGGGAGGCAGCTATGGGGAATTTTGGACAATGTGGGAAACCCTGATCCAACAATGCCGCGTGTGTGAATAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTATCCGGATAGATTCCTTTTGGGCTAAACCTCCGTAGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAACCACCGGGTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGACGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGGCGAAGCAGCTCCTGGGGCAATACTGACGCTCATGCACAAGATCGTGCGAAACAAACAGGATAAAACCCCT GTATTCCACGCCCAAAACGATGTCCACCAAGTTGTTGGCGATCCTTTCCTTCGTATCGTAGCTACGCGGGAATTTGACCCCCTGGGGACTAGGCCGCATATAAAACTCAAGGGAATTCCGGGGACCCCCAGAGCTGTGTATGATGTGATTATTCCGATGCGCGGAAAACCTTCCTTATCTTTGAATGGCGGTACTCCTGAAAATTGCGGAGTGCTCGAAAACACCGAACCCGGGTCTTTCTGCGTGTCCTCCCTCGTGTGGGATATGCTGGATATCCCGCAGACGCATCTTTGACTTAGTGCTCCCAAAACTGAGAGCTGGGAGGACTCGAGAGGGGATCCCTGCCTCCCCGGCTTGGGTGCTCCCCTTATGGGGGAAACAGGTACACGGGGGGATCATCCCATACCTA
正向序列1067 bp，使用引物1114F(SEQ ID NO：12)TCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAACCCTTTGGCCTAATAACCCCGGGGGAATAAGTACCGAAAAAAAAAAAAACTGGATAACTTCCGTGCCACAACCCGCGGAAAAATCTAGGGGGGGGGAGCTTAAATGGAAATTTACGGGGCCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTAAACACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAGTATGGCACAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCATTGAATGCATAGAGATGAGAGGATACCGATGGAGAAGGGCGCCCCCGGGGACAATATGACGC CTATGCCACAAAGCTGTGGCACAATAGGTTAAATACCTGTGTTGTCCCCGCCTAAACAGATTACACTTGTTGTGGGTATTTTCTCATAAAATACTACACACGGGAGAATACACTGGGGGGCTTCGTCAATTATCACAACAATGATTGCGGGCACCCACGGGGGTAGATGGGTAATAAATCGACGGCAACTATCTACTTACTTGGATGATCGCACAGATTGGGCGGGAGAGAAGAGAACAGCGTGTGTGTGCTCCTCCGCGAGTGATAGGTAATCGGACAATACTTTGACAGGACTTAACTGGGTAGCGGGATCGAGTGGATTCCCGTCGGATGGCCTCCGCAGGTACGGCAGCTGGGGATTACATC
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反向序列1194 bp，使用引物519R(SEQ NO：15)TTCTTCGGTACCGTCATCCCCCCGGGGTATTAGCCCAAAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCGCCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGTGCAAGCACCCGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTGAGGGGGGGGGCCTTCAACGGAACGACTGGGCAAAAAGCGTGCCCAGGCGTTTTGTTAAGACAGATGTGAAACCCCGGGGCTTAACCTGGAAACTGCATTTGTGA CTGGAAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCATTGAAATGCGTAGAAATGGAGAGGAATACCGATGGGAGAGGGCAGCCCCCGTGGGCAAATACTGGCGCTTATGAACAAAGTTGGGGCGCGCCGCCGGGATATGTTCCCCTGGGATATCCCCCCCCTAAACTGCTTACAAATATTGTGTGGGAAACTTTTTCTCTAAAAAATAGAACACAACGGGAGATATCACCCCCGGGGGGCCACCGCCAGATTAAACCCCCAAAAAGTATTTGGCGGGCACCCCCCCGGGGGGTGAGATGGGGTAAAATAAATCCGTGCGACGAGCAAACCCTCCCCACACCTGGGATGGTCGCGACCACAGATGAGATGCGGGCGGAGAGAACGATACCCAAGCGTGGTTGTTTGCCTGCATCCCCTCCGTCGGGAGTGGATATAGTAGAGTAATTACGGCACGACTGCATTTTTTTTTCTTCAGTACACCTTATCACACTGTTGGATGCACCGCGAGAAATCCGGAGGTGTGAGTACTCCCCCCCTCTCCTCGGGATGTGTCGGCGCTCCCTTCTCCCGTTCAGGGGTGGGTAAGCACCGCG
1.3證明伯克氏菌A396不屬於洋蔥伯克氏菌複合菌
1.3.1使用特定PCR引物的分子生物學研究工作
為了確認伯克氏菌A396為多噬伯克氏菌，需進行必需基因的其他基因測序，已知伯克氏菌A396是屬於洋蔥伯克氏菌複合菌的成員，目前著重於recA基因的PCR，如Mahenthiralingam等人於2000年研究報告所述。使用下列引物：如Mahenthiralingam等人於2000年研究報告所述，使用上述的BCR1和BCR2來確認多噬伯克氏菌的匹配性。第一引物組合中，產物生成的PCR反應可確認微生物是屬於洋蔥伯克氏菌複合菌，第二引物組合中，產物生成的PCR反應可確認微生物的確屬於多噬伯克氏菌複合菌。
任何一對的引物無法取得PCR產物，使用多噬伯克氏菌ATCC 17616(陽性對照)和荧光假單胞菌(陰性對照)測試PCR反應和引物的特性，使用兩組的的引物可發現到多噬伯克氏菌 的強頻帶，熒光假單胞菌沒有看到頻帶，此結果顯示A396是伯克氏菌，而非洋蔥伯克氏菌複合菌的成員，也不是多噬伯克氏菌。這也證明在比較培養實驗中，A396和多噬伯克氏菌兩者同時並側進行振盪培養，並使用600nm的光密度量測計每天監測其生長。在設定條件下，A396品種的增長速度遠遠超過多噬伯克氏菌型菌株(圖1)。
1.3.2 DNA-DNA雜交
為了確認分離的A396是伯克氏菌新菌種，即進行與多噬伯克氏菌的DNA-DNA雜交實驗(與16SrRNA基因序列有最相近的匹配)。在ISP2培養液中，於Fernbach燒杯中，在200 rpm/25℃下培養48小時，進行了A396和多噬伯克氏菌的生物量測定。在無菌條件下，離心收集生物量。將培養液傾析，將細胞沉澱再懸浮於1：1的水和異丙醇溶液中，使用DSMZ於浮於德國收集培養的微生物，進行DNA-DNA雜交實驗。使用法式細胞破碎器(Thermo Spectronic)進行DNA分離，並進行色譜法的純化，如Cashion等人於1977年的研究報告。DNA-DNA雜交的進行如De Ley等人1970年的研究報告及Huss等人1983的研究報告，使用配備有Peltier恒溫6x6多細胞交換器和現場溫度探測器(Varian)的Cary Bio UV/VIS分光光度計的實驗修改，而進行DNA-DNA雜交實驗。DSMZ回報的DNA-DNA百分比顯示A396和多噬伯克氏菌類似在37.4%之間。結果顯示比對特設委員會(Wayne et al.,1987)對菌種所定義的70% DNA-DNA相似性，認定伯克氏菌A396菌株不屬於多噬伯克氏菌菌種。
1.4使用Biolog BN2板的生化特性數據
關於碳源利用的特性數據，A396於馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)上隔夜培養。培養液轉移到BUG瓊脂，按照製造商(Biolog,Hayward,CA)的建議製造Biolog實驗適當的培養液。
使用Biolog GN2板培養來判定微生物的生化特性數據，使用MicroLog 4自動化微測井進行24小時的培養後，讀取培 養板的數據。藉由比對Microlog 4革蘭陰性菌資料庫的碳利用模式，即可鑑定未知的細菌。
並未發現與Biolog特性數據明確的匹配性，A396最接近的匹配都低於35%的相似性，刺狀假單胞菌(伯克氏菌)、洋蔥伯克氏菌和類鼻疽伯克氏菌其結果如表1。
1.5脂肪酸組成
在28℃培養24小時後，取得生長良好的細胞，並使用本發明所述的Sherlock微生物鑑定系統(MIDI)製備、分離和鑑定脂肪酸甲基酯(見Vandamme et al.,1992)。在伯克氏菌A396主要的脂肪酸如下：16：0(24.4%),cyclo 17：0(7.1%),16：0 3- OH(4.4%),14：0(3.6%),19：0 ω8c(2.6%)cyclo,18：0(1.0%)。相對於總峰值面積26.2%和20.2%，分別為總結特性(含18：1 ω7c)和總結特性(含16：1 ω7c和16：1 ω6c)。相對於5.8%的總峰值面積，總結特性2含12：0 ALDE,16：1 iso I和14：0 3-OH，相對於總峰值面積0.4%，總結特性5含18：n ANTE和相對於0.4%的18：2 ω6,9c。其他A396檢測到的少量脂肪酸包括：比例13：1，12-13(0.2%),14：1 ω5c(0.2%),15：0 3-OH(0.13%),17：1 ω7c(0.14%),17：0(0.15%),16：0 iso 3-OH(0.2%),16：02-OH(0.8%),18：1 ω7c 11-methyl(0.15%),and 18：1 2-OH(0.4%)。
A396的脂肪酸成份比對MIDI資料庫下，顯示新菌種A396脂肪酸最接近新洋蔥伯克氏菌。
1.6耐藥性
伯克氏菌A39的抗生素易感性使用PML微生物技術資料表#535所述，於Muller-Hinton培養基的抗生素盤上進行測試，在25℃培養72小時後的結果如下表2。
結果顯伯克氏菌A396的抗生素易感性與病原性的洋蔥伯克氏菌複合菌非常不同，伯克氏菌A396對卡那黴素、氯黴素、環丙沙星、呱拉西林、亞胺培南及磺胺和甲氧芐啶混合物具有易感性，在比較下，Zhou等人於2007年的研究，對取自囊性纖維化患者的洋蔥伯克氏菌菌進行2,62一個不同菌株的易感性測試，發現到所有菌株中，只有7%和5%的菌株對亞胺培南和環丙沙星具有易感性。他們也發現到所有的菌株中，85%對耐氯黴素(15%易感性)具有耐藥性，95%(5%易感性)對磺胺和甲氧芐啶的組合具有耐藥性。Zhou等人於2007年的研究結果類似Pitt等人於1996年判定366B cepacia分離物對抗生素的耐藥性，而指出大部份的菌株對環丙沙星、頭孢呋辛、亞胺培南、氯黴素、四環素和磺胺噁唑具有抗藥性。
2.實施例2伯克氏菌配方和配方產品餾分物
下列過程用於自含有伯克氏菌種全細胞培養液的MBI-206配方產品進行提取化合物的純化。
10-L發酵伯克氏菌株(A396)於海蘭大豆生長培養基的培養液，使用甲基0.1%和丙酯、對羥基苯甲酸酯0.1%和己醇0.67%跡象配方的調配，使用Amberlite XAD-7樹脂，藉由在室溫以225rpm的轉速持續搖晃提取0.67%的Glycosperse 0-20(Asolkar et al.,"Weakly cytotoxic polyketides from a marine-derived Actinomycete of the genus Streptomyces strain CNQ-085." J.Nat.Prod.69：1756-1759.2006)。樹脂和細胞塊藉由粗布濾網收集，並使用蒸餾水除去鹽份，樹脂、細胞塊和粗布持續浸泡在丙酮中2小時，然後過濾丙酮並使用旋轉蒸發器(MBI-206-FP-CE)在真空下乾燥。粗提取物再由反相C18真空液相色譜(H2O/CH3OH梯度80：20~0：100%)進行餾分得到10個餾分物(見圖1內容)，這些餾分物使用旋轉蒸發器進 行濃縮乾燥，將得到的乾燥殘留物使用整株植物的殺蟲測定篩選其生物活性。在這些活性餾分物中，餾分物3、4、5和6分別標示為MBI-206-FP-3、MBI-206-FP-4、MBI-206-FP-5和MBI-206-FP-6，然後進行返復的反相HPLC分離(Spectra System P4000(Thermo Scientific)而得到純化合物，然後進行上述生物測定的篩選以尋找/辨識化學成份(見圖2)。
2.1配方餾分物的分析
這些餾分物於配備有Finnigan Surveyor PDA偵測器、自動採樣、MS幫浦和4.6 mm x 100 mm Luna C18 5 μm柱析裝置(Phenomenex)的Thermo高性能液體色譜儀(HPLC)上進行分析，溶劑系統包括有水(溶劑A)和乙腈(溶劑B)。溶劑B的流動相開始出現於10%溶劑，而在20分鐘內線性增加到100%，然後維持4分鐘，最後在3分鐘內回到10%溶劑。流速為0.5mL/min，注射量是10μL，樣本保持在室溫下放於自動採樣器中。
要辨識化合物，需記錄如LC/MS和UV的其他分光數據，對應餾分物5的化合物，保留時間是17.45分鐘，未見於任何的初始原料中，即表示此化合物是介於微生物發酵液間的化學反應產物，而有一個或多個化合物出現於配方製劑中。具體而言，此餾分物使用ESI-LCMS於Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus電噴灑離子化(ESI)儀器，使用正負離子化全掃描模式(m/z 100-1500 Da)，在LCQ的DECA XPplus質量光譜儀(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)進行分析。質譜分析在下列條件下進行：鞘部和輔助/吹掃氣流的氮氣流速分別固定在30和15arb，在5000V和毛細管電壓35.0V下進行電噴灑離子化，毛細管溫度設定在400℃，數據在Xcalibur軟體中進行分析，餾分物5中發現到新的化合物而分子量(MW)為194(RT=14.74分鐘)和222(RT=17.43分鐘)。
2.2生物測定
選用2或3片健康蘿蔔的真葉進行測試，蘿蔔在實驗處理 時為13天齡，儲存這些植物，所有的處理物皆有相同的葉表面積和株高，培養罐上標示有處理數量和重複次數，每次測試處理重複3次。
取用10個MBI-206配製產物的餾分物進行測試，餾分物濃度為10mg/ml，也測試配方產品和培養液的餾分物，未處理的對照組(使用去離子水處理過)和陽性對照組(總和超濃縮液年度為每加侖2.5盎司)也用於測試中。
處理測試結果如表3所示：
使用前所有的產品和處理物先搖晃均勻，處理物使用2盎司噴嘴來處理，各個處理物使用各別的噴嘴，均勻適量噴灑植物的葉子(既不噴灑過少也不噴灑過多而溢流)。各個處理物的3次重複處理中，同時噴灑2毫升，即每株植物約使用0.67毫升。
植物在空氣中乾燥，然後隨機放於托盤中，每個托盤標記實驗名稱和處理日期並放在實驗室溫室架中。實驗室溫度保持在70-80℉的溫度下而相對濕度為30-40%，在整個生物測定中，用適量的水從托盤下麵澆水，可讓植物的葉子保持乾燥。
處理後在第3、8和14天擷取實驗結果，可能症狀包括樹 葉枯乾和發育遲緩，以下等級如表4，用來量化處理效果，這些等級藉由觀察未經處理對照組的植物相關的因素，即植物的整體健康、平均株高和頁表健康來判定。受影響植物的症狀可能包括樹葉的變色/斑點/枯乾/漂白和樹葉的彎曲/扭曲/捲曲(由於頂端分生組織的受損)以及植物枯梢或死亡。
表4：等級
0-0%控制症狀
0.5-5%控制症狀
1-10%控制症狀
2-25%控制症狀
3-50%控制症狀
4-75%控制症狀
5-100%控制症狀
在整個植物的除草試驗中，餾分物4和5顯示具有良好的除草活性(見圖2)。
2.3從配方中分離殺蟲化合物
此餾分物再使用HPLC C-18柱析裝置(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 30)、水和乙腈的梯度溶劑系統(0-10分鐘：80%的CH3CN水溶液，10-25分鐘：80-65%的CH3CN水溶液，50-60分鐘：50-70%的CH3CN水溶液，60-80分鐘：70-0%的CH3CN水溶液，80-85分鐘：0-20%的CH3CN水溶液)在0.8毫升/分鐘流速和210nm的UV波長下測定，分別產生對羥基苯甲酸丁酯，保留時間為59.15分鐘(MBI206-FP-F5H32)和己基苯甲酸酯，保留時間為74.59分鐘(MBI206-FP-F5H40)。
2.3.1化合物的NMR譜分析
NMR譜在Bruker 600 MHz的梯度場光譜儀上測量。參考設定四甲基矽烷為內部標準(TMS 0.00 ppm)。
2.3.1.1己基苯甲酸酯的結構鑑定(MBI206的FP-F5H40)
使用UV吸收波長248nm分離後的活性化合物為無色固體，(-)ESIMS顯示的分子離子峰位於221(M-H)，對應的分子 量為222。此化合物顯示1H NMR δ對信號在7.90、6.85、4.28、1.76、1.46、1.38、1.37、0.94和13C NMR值為166.84、162.12、131.34(2C)、121.04、114.83(2C)、64.32、31.25、28.43、25.45、22.18和12.93。藉由NMR和ESI質譜數據測定，顯示其分子式為C13H18O3(5個不飽和度)。1H NMR譜顯示有一個A2B2型的芳族信號，δ值在7.90,2H d,J=8.5 Hz和6.85,2H d,J=8.5 Hz。此外，1H NMR譜顯示出現有-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3的官能基，δ值為4,28,2H,t,J=7.3 Hz；1,76,2H,m；1.46,2H,m；1.38,2H m；1.37,2H,m和0.94,3H,t,J=7.3 Hz。根據上述的光譜數據分析，芳族聚酮化合物的結構建立成己基對羥基苯甲酸酯，可由COSY，HMQC和HMBC實驗的詳細分析證實，文獻顯示此化合物屬合成的化合物。
2.3.1.2對羥基苯甲酸丁酯的結構鑑定(MBI206 FP-F5H32)
在UV對打波長248nm取得的此化合物為無色固體，陰性模式LCMS分析顯示分子離子在m/z 193，所對應的分子量為194。比對UV、MS和NMR的己基對羥基苯甲酸酯數據下，其分子量為222，此該化合物屬己基對羥基苯甲酸酯的類似物。唯一的差別僅在於側鏈，因此，此對羥基苯甲酸丁酯的結構顯示此化合物的分子量為194。文獻的研究顯示此化合物也屬合成的化合物。
2.3.2除草活性
在10 mg/ml的濃度下，可從5個餾分物取得純化合物(丁基對羥基苯甲酸酯[MBI206-FP-F5H32]和己基對羥基苯甲酸酯[MBI206-FP-F5H40])而進行。未處理的對照組(使用去離子水處理過)、無添加物配方(3% v/v & 10% v/v)和陽性對照組(總和超濃縮液的濃度為每加侖2.5盎司)也用於測試中。
下列的處理測試結果如表5所示：表5：處理方法
所得結果列於表6。
根據上表的數據，可發現到己基對羥基苯甲酸酯是最有效的除草化合物。
2.3.3殺蟲活性
丁基對羥基苯甲酸酯(MBI206-FP-F5H32)和己基對羥基苯甲酸酯(MBI206-FP-F5H40)的殺蟲活性，在實驗室使用96孔的飲食疊加法與第一齡的甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)幼蟲，使用200μl的固體微量滴定板，而各孔放入人工培養的甜菜夜蛾進行測定。各個樣本有100 mL(含40μg樣本)用移液管 滴在食物上(各孔各有一個樣本)，樣本在空氣中乾燥直到表面乾燥為止。各個樣本重複進行6次測試，使用水和市售的Dipel產品，並分為陰性和陽性對照組。使用一個第一齡的測試幼蟲(甜菜夜蛾)放於各孔中，培養板覆蓋有氣孔設計的塑膠蓋。裝有昆蟲的培養板在26℃下培養6天，每日進行死亡率的評估。根據表7的結果，己基對羥基苯甲酸酯和對羥基苯甲酸丁酯分別具有71%和9%的死亡率。
2.3.4殺線蟲活性：在丁基對羥基苯甲酸酯(MBI206-FP-F5H32)和己基對羥基苯甲酸酯(MBI206-FP-F5H40)的體外測試：丁基對羥基苯甲酸酯和己基對羥基苯甲酸酯的純樣本用於體外細胞培養，放於96孔塑板的生物測定裝置上，在50μL升的水溶液中，15-20隻線蟲曝露於20 mg/ml峰值的3μL於 25℃下放置24小時。完成培養後，紀錄各孔線蟲幼蟲(J2)使用化合物處理可見的活力鈍化情況，各個處理物再放於4孔複製培養井中測試。結果顯示表8中，其中顯示兩個不同的96孔化合物處理其培養板提取物生物測定的結果。。每次測試包括有3個對照組樣本，一個為陽性(1% Avid)和2個陰性(DMSO和水)，測試(T1)使用M.incognita，而另一個測試(T2)使用M.hapla線蟲，將樣本溶於100%DMSO中。己基苯甲酸酯(MBI206-FP-F5H40)顯示對M.incognita線蟲有93.75%的活力鈍化控制效果，相較於對羥基苯甲酸丁酯只有81.25%。
2.3.5在產品配方期間的對羥基苯甲酸酯形成研究
為能夠瞭解這些對羥基苯甲酸酯的形成，也考慮到配方在酒精中的變化。將不同的碳鏈醇用於配方中，新的對羥基苯甲酸酯也藉由LCMS進行監測。
4個各別的配方樣本使用丁醇、己醇、辛醇、鯨蠟醇，而所有其他成份保持不變來進行實驗。經過2天和3週的期間，進行配方產品的提取，取自配方的粗提取物藉由LCMS進行分析，鯨蠟醇除外，所有的醇類都有對應的苯甲酸酯形成。生成的對羥基苯甲酸酯是對羥基苯甲酸丁酯中最多的成份，再來是己基對羥基苯甲酸酯和辛基對羥基苯甲酸酯，而用於1天齡的配方產品中。即使3週後分析結果仍然相同，即對羥基苯甲 酸丁酯>己基苯甲酸酯>辛基苯甲酸酯。因此，這些對羥基苯甲酸丁酯的生成速率如己基對羥基苯甲酸酯和辛基對羥基苯甲酸酯，取決於對應溶劑(醇類)的碳鏈(碳原子數量)而用於配方中(正丁醇(C4)>己醇(C6)>辛醇(C8)等)。直到3週的期間仍無法檢測到對羥基苯甲酸酯，可發現對羥基苯甲酸酯的產量隨著時間而增加。
另一組的實驗中，用於瞭解對羥基苯甲酸酯類似物全細胞培養液(WCB)的作用，在4個不同的實驗中，進行下列配方的變更：
實驗-1：對羥基苯甲酸丙酯(不含對羥苯甲酸甲酯)+WCB+其他成份
實驗-2：對羥基苯甲酸丙酯(不含對羥基苯甲酸丙酯)+WCB+其他成份
實驗-3：不含對羥基苯甲酸酯(兩者)+WCB+其他成份
實驗-4：對羥基苯甲酸甲酯+對羥基苯甲酸丙酯+其他成份+無WCB
上述配方進行各別的提取，而粗提取物再使用LCMS分析。在前兩個實驗中僅觀察到己基對羥基苯甲酸酯的形成，因此，這些實驗顯示WCB在對羥基苯甲酸酯的形成中攸關重要。
3.實施例3 Templazole A和B的分離
方法和材料
下列過程用於自伯克氏菌種(參見圖3)的細胞培養物中，提取純化Templazole A和B：取自海蘭大豆生長培養基中的10-L發酵伯克氏菌(A396)培養液，藉由Amberlite XAD-7樹脂(Asolkar et al.,2006)和225rpm轉速於室溫下進行細胞懸浮液的提取。樹脂和細胞塊藉由粗布濾網收集，並使用蒸餾水除去鹽份，樹脂、細胞塊和粗布持續浸泡在丙酮中2小時，然後過濾丙酮並使用旋轉蒸發器(MBI-206-FP-CE)在真空下乾燥。粗提取物再由反相C18真 空液相色譜(H2O/CH3OH梯度90：10~0：100%)進行餾分得到一個餾分物(見圖1內容)，這些餾分物使用旋轉蒸發器進行濃縮，將得到的乾燥殘留物使用96孔培養板生物測定裝置進行篩檢。活性餾分物藉由反相HPLC(Spectra System P4000(Thermo Scientific)得到純化合物，然後藉由上述的生物測定裝置篩選、尋找/識別活性化合物。要辨識化合物，需記錄如LC/MS和UV的其他分光數據。
活性餾分物5再使用HPLC C-18柱析裝置(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 30)、水和乙腈的梯度溶劑系統(0-10分鐘：80%的CH3CN水溶液，10-25分鐘：80-65%的CH3CN水溶液，50-60分鐘：50-70%的CH3CN水溶液，60-80分鐘：70-0%的CH3CN水溶液，80-85分鐘：0-20%的CH3CN水溶液)在0.8毫升/分鐘流速和210nm的UV波長下測定，而生成templazole B，保留時間為46.65分鐘。活性餾分物7再使用HPLC C-18柱析裝置(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 30)、水和乙腈的梯度溶劑系統(0-10分鐘：80%的CH3CN水溶液，10-25分鐘：80-65%的CH3CN水溶液，50-60分鐘：50-70%的CH3CN水溶液，60-80分鐘：70-0%的CH3CN水溶液，80-85分鐘：0-20%的CH3CN水溶液)在0.8毫升/分鐘流速和210nm的UV波長下測定，而生成templazole B，保留時間為70.82分鐘。
此純化合物的質譜分析採用ESI-LCMS於ThermoFinniganLCQDecaXPPlus電噴灑離子化(ESI)儀器，使用正負離子化全掃描模式(m/z100-1500Da)，在LCQ的DECAXPplus質量光譜儀(ThermoElectronCorp.,SanJose,CA)進行分析。Thermo高性能液相色譜(HPLC)儀器配備有FinniganSurveyorPDA偵測器、自動採樣器、MS幫浦於4.6mmx100mmLunaC185μmcolumn(Phenomenex)的柱析裝置中進行分析。溶劑系統包括有(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，溶劑B的流動相開始出現於10%溶劑，而在100分鐘內線性增加到 20%，然後持續4分鐘後，最後在10分鐘內回到3%。流速為0.5mL/min，注射量是10μL，樣本保持在室溫下放於自動採樣器中。此化合物使用LC和反相色譜藉由LC-MS進行分析，此化合物的質譜分析在下列條件下進行：鞘部和輔助/吹掃氣流的氮氣流速分別固定在30和15arb，在5000V和毛細管電壓35.0V下進行電噴灑離子化，毛細管的溫度設定在400℃，數據在Xcalibur軟體中進行分析，此活性化合物templazoleA的相對分子量為298，顯示負離子模式為297.34m/z值，TemplazoleB的LC-MS色譜圖顯示分子量為258，顯示負離子模式為257.74值。
1H，13C和2D NMR光譜於Bruker 500 MHz & 600MHz的梯度場進行光譜儀測定，參考設定四甲基矽烷為內部標準(TMS 0.00 ppm)。
Templazole A的結構鑑定中，純化合物的分子量為298，再使用500MHz NMR儀器分析，1H NMR δ值為8.44、8.74、8.19、7.47、7.31、3.98、2.82、2.33、1.08和13C NMRδ值為163.7、161.2、154.8、136.1、129.4、125.4、123.5、123.3、121.8、121.5、111.8、104.7、52.2、37.3、28.1、22.7、22.7。Templazole的UV吸收峰在226、275和327nm，即表示出現有吲哚和噁唑環。1H，13C NMR和HRESI MS data m/z 299.1396(M+H)+(Calcd for C17H19N2O3,299.1397)測定的分子式為C17H18N2O3，由10個雙鍵當量顯示具有高度的不飽和性。13C-NMR譜顯所有17個碳原子的信號，包括兩個甲基，一個甲氧基、一個亞甲基碳原子、一個脂族次甲基、一個酯族羰基和一個芳族碳原子的信號。H-1H COSY and HMBC光譜數據顯示3'-取代基的吲哚，1H-1H COSY和HMBC也顯示出現有羧酸甲基酯基團和-CH2-CH-(CH3)2的側鏈。從1H-1H COSY，13C和HMBC數據詳細分析下，顯示是含噁唑核的衍生性化合物。從2D分析結果發現異丁基的側鏈在C-2位上，在C-4上有羧酸甲酯，在C-5的吲哚而生成templazole A。
第2種除草活性化合物templazole B的分子量為258，500 MHz NMR儀器分析下，1H NMR δ值為7.08、7.06、6.75、3.75、2.56、2.15、0.93和0.93，而13C NMR δ值為158.2、156.3、155.5、132.6、129.5、129.5、127.3、121.8，115.2，115.2、41.2、35.3、26.7、21.5、21.5。根據1H,13C NMR和質量數據，分子式為C15H18N2O2；13C-NMR譜顯示所有15個碳原子的信號，包括兩個甲基，兩個亞甲基碳原子，一個脂族次甲基，一個醯胺羰基和9該芳族碳。1H和13C NMR質譜推導出的樣本結構特性，顯示對位取代基的芳香環結構[δ值7.08(2H,d,J=8.8 Hz),6.75(2H,d,J=8.8 Hz和132.7,129.5,115.2,127.3,115.2,129.5]。此結構的1H NMR質譜隨同1H-1H COSY和HSQC NMR的質譜，顯示有異丁基基團的特徵信號[δ值0.93(6H,d,J=6.9 Hz),2.15(1H,sept.,J=6.9 Hz),2.57(2H,d,J=6.9 Hz)]。此外，在1H和13C的質譜顯示一個烯烴/芳族質子(δ值7.06)和羰基碳基團(δ值158.9)，檢查HMBC質譜下，異丁基基團的H-1'信號與烯烴的碳(C-2，δ值156.3)有關，烯烴質子H-4與(C-5δ值155.5、C-2、156.3 C-1、41.2)有關。亞甲基信號位於δ值3.75與芳族基團對位取代基的C-5、C-4和C-2有關，所有這些觀察到的相關性顯示異丁基間的關聯性，芐基基團的對位取代基為所示的架構。此外，根據H-4和H-6上的芳族質子其HMBC的關聯性，顯示是在對位基的位置上。因此，根據上述數據，此結構為templazole B。
4.實施例4 FR901228的分離
伯克氏菌種和全細胞培養液放於未知的培養基中，在225rpm轉速於室溫下，使用Amberlite XAD-7樹脂(Asolkar et al.,2006)進行細胞懸浮液的提取。樹脂和細胞塊藉由粗布濾網收集，並使用蒸餾水除去鹽份，樹脂、細胞塊和粗布持續浸泡在丙酮中2小時，然後過濾丙酮並使用旋轉蒸發器在真空下乾燥。粗提取物再由反相C18真空液相色譜(H2O/CH3OH梯度90：10~0：100%這些餾分物使用旋轉蒸發器進行濃縮乾燥，將 得到的乾燥殘留物使用昆蟲生物測定和除草生物測定裝置進行篩選。活性餾分物藉由反相HPLC(Spectra System P4000(Thermo Scientific)得到純化合物，然後藉由下列的除草、殺蟲和殺線蟲的生物測定裝置篩選、尋找/識別此活性化合物。要辨識化合物，需記錄如LC/MS和NMR的其他分光數據。
此純化合物的質譜分析於ThermoFinniganLCQDecaXPPlus電噴灑離子化(ESI)儀器上，使用正負離子化全掃描模式(m/z100-1500Da)，在LCQ的DECAXPplus質量光譜儀(ThermoElectronCorp.,SanJose,CA)進行分析。Thermo高性能液相色譜(HPLC)儀器配備有FinniganSurveyorPDA偵測器、自動採樣器、MS幫浦於4.6mmx100mmLunaC185μmcolumn(Phenomenex)的柱析裝置中進行分析。溶劑系統包括有(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，溶劑B的流動相開始出現於10%溶劑，而在100分鐘內線性增加到20%，然後持續4分鐘後，最後在10分鐘內回到3%。流速為0.5mL/min，注射量是10μL，樣本保持在室溫下放於自動採樣器中。此化合物使用LC和反相色譜藉由LC-MS進行分析，此化合物的質譜分析在下列條件下進行：鞘部和輔助/吹掃氣流的氮氣流速分別固定在30和15arb，在5000V和毛細管電壓35.0V下，進行電噴灑離子化，毛細管的溫度設定在400℃，數據在Xcalibur軟體中進行分析，根據LC-MS的分析，在負離子模式下，餾分物6的殺蟲化合物分子量為540。
關於結構鑑定，餾分物6和純化殺蟲化合物分子量為540，再使用500 MHz NMR儀器分析，1H NMR δ值為6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23、1.74、1.15、1.12、1.05、1.02、而13C NMR δ值為172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51。NMR數據顯示該化合物含有氨基、酯、羧酸、 脂肪族甲基、乙基、亞甲基、氧亞甲基、次甲基、接氧次甲基和硫官能基。詳細的1D和2DNMR分析確認化合物的結構為FR901228的已知化合物。
5.實施例5 Templamide A、B、FR901465和FR901228的分離
方法和材料
取自海蘭大豆生長培養基中的10-L發酵伯克氏菌(A396)培養液，藉由Amberlite XAD-7樹脂(Asolkar et al.,2006)和225rpm轉速於室溫下持續搖晃2小時，進行細胞懸浮液的提取。樹脂和細胞塊藉由粗布濾網收集，並使用蒸餾水除去鹽份，樹脂、細胞塊和粗布持續浸泡在丙酮中2小時，然後過濾丙酮並使用旋轉蒸發器在真空下乾燥。粗提取物再由反相C18真空液相色譜(H2O/CH3OH梯度90：10~0：這些餾分物使用旋轉蒸發器進行濃縮乾燥，將得到的乾燥殘留物使用96孔培養板(除草)和第3齡甜菜夜蛾(殺蟲)的生物測定裝置，進行生物活性的篩檢。活性餾分物藉由反相HPLC(Spectra System P4000(Thermo Scientific)重複餾分而得到純化合物，然後藉由上述的生物測定裝置尋找/識別活性化合物。要辨識化合物，需記錄如LC/MS,HRMS和NMR的其他分光數據。
活性餾分物6再使用HPLC C-18柱析裝置(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 30)、水：乙腈梯度溶劑系統(0-10分鐘80% CH3CN水溶液、10-25分鐘80-65% CH3CN水溶液、25-50分鐘65-50% CH3CN水溶液、50-60分鐘50-70% CH3CN水溶液、60-80分鐘70-0% CH3CN水溶液、80-85分鐘0-20% CH3CN水溶液)，在8 mL/min的流速和210nm UV波長檢測得到templamide A，保留時間為55.64分鐘，FR901465保留時間為63.59分鐘，FR90128保留時間為66.65分鐘。活性餾分物6再使用HPLC C-18柱析裝置(Phenomenex,Luna 10u C18(2)100 A,250 x 30)、水：乙腈梯度溶劑系統(0-10分鐘70-60% CH3CN水溶液、10-20分鐘60-40% CH3CN水 溶液、20-50分鐘40-15% CH3CN水溶液、50-75分鐘15-0% CH3CN水溶液、75-85分鐘0-70% CH3CN水溶液)，流速為8 mL/min而UV檢測波長為210nm取得templamide B，保留時間為38.55分鐘。
此純化合物的質譜分析採用ESI-LCMS於Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus電噴灑離子化(ESI)儀器，使用正負離子化全掃描模式(m/z 100-1500 Da)，在LCQ的DECA XPplus質量光譜儀(Thermo Electron Corp.,San Jose,CA)進行分析。Thermo高性能液相色譜(HPLC)儀器配備有FinniganSurveyorPDA偵測器、自動採樣器、MS幫浦於4.6mmx100mmLunaC185μmcolumn(Phenomenex)的柱析裝置中進行分析。溶劑系統包括有(溶劑A)和乙腈(溶劑B)，溶劑B的流動相開始出現於10%溶劑，而在100分鐘內線性增加到20%，然後持續4分鐘後，最後在10分鐘內回到3%。流速為0.5mL/min，注射量是10μL，樣本保持在室溫下放於自動採樣器中。此化合物使用LC和反相色譜藉由LC-MS進行分析，此化合物的質譜分析在下列條件下進行：鞘部和輔助/吹掃氣流的氮氣流速分別固定在30和15arb，在5000V和毛細管電壓45.0V下，進行電噴灑離子化，毛細管的溫度設定在300℃，數據在Xcalibur軟體中進行分析，此templamideA活性化合物templazoleA的相對分子量為555，顯示負離子模式下，m/z值為556.41[M+H]+和578.34[M+Na]+。正離子模式電離templamide乙的LC-MS分析表明相對分子質量為537基於538.47的m/z離子[M+H]+和560.65[M+的Na+。根據LCMS分析，FR901465和FR901228化合物的分子量為523和540。
1H，13C和2D NMR質譜在Bruker 600 MHz的梯度場光譜儀上測量，參考設定四甲基矽烷為內部標準(TMS，0.00 ppm)。
關於templamide A的結構鑑定，純化合物的分子量是555，再使用600 Mhz NMR分析，1H NMR δ值為6.40、6.39、 6.00、5.97、5.67、5.54、4.33、3.77、3.73、3.70、3.59、3.47、3.41、2.44、2.35、2.26、1.97、1.81、1.76、1.42、1.37、1.16、1.12、1.04、和13C NMR δ值為173.92、166.06、145.06、138.76、135.71、129.99、126.20、123.35、99.75、82.20、78.22、76.69、71.23、70.79、70.48、69.84、60.98、48.84、36.89、33.09、30.63、28.55、25.88、20.37、18.11、14.90、12.81、9.41。13C NMR譜顯示28個離散碳信號，顯示含6個甲基，4個甲基碳原子，13個次甲基其中包括5個sp2和4個季碳；根據1H,13C NMR和HRESI MS ESIMS的數據，分子式為C28H45NO10；1H-1H COSY、HMBC和HMQC質譜數據的詳細分析，顯示下列的結構(I-IV)和兩個分離的亞甲基和單甲基官能基。這些結構後來藉由HMBC的關聯性而得到化合物的平面結構，目前未有研究報告指出就是templamide A的物質，此聚酮化合物的分子含兩個四氢吡喃醇環和一個共軛醯胺。
1D & 2D NMR質譜數據顯示子結構I-IV
第2種除草化合物的(+)ESIMS分析顯示m/z值在538.47[M+H]+和560.65[M+的Na]+，對應的分子量為537。ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C28H43NO9，此化合物的1H和13C NMR質譜類似templamideA，但templamideA中出現有新分離的-CH2而不是非耦合性的亞甲基基團除外。小胚芽耦合常數為4.3Hz，具有環氧化物亞甲基基團的特徵。此環氧化物的存在進一步證實13C NMR轉變自templamideA中的60.98，而成為41.07其分子量為537。可按照環氧化物的形成而扣除水份子，合理解釋這兩種化合物分子式的區別。因此，根據NMR和MS的分析，可推出新化合物的結構就是 templamideB。
關於結構鑑定，來自餾分物6的純化合物的分子量為523，再使用600MhzNMR分析，1H NMRδ值為6.41、6.40、6.01、5.98、5.68、5.56、4.33、3.77、3.75、3.72、3.65、3.59、3.55、3.50、2.44、2.26、2.04、1.96、1.81、1.75、1.37、1.17、1.04、和13C NMRδ值為172.22、167.55、144.98、138.94、135.84、130.14、125.85、123.37、99.54、82.19、78.28、76.69、71.31、70.13、69.68、48.83、42.52、36.89、33.11、30.63、25.99、21.20、20.38、18.14、14.93、12.84。化合物詳細的1H和13C NMR分析顯示此化合物很類似templamideB，唯一區別是酯側鏈，側鏈出現有一個乙酸乙酯基團而非丙酸基團。詳細的1D和2DNMR分析確認化合物的結構為FR901465的已知化合物。
根據LC-MS分析，在負離子模式下，餾分物6的殺蟲化合物分子量為540。關於結構鑑定，餾分物5和純化殺蟲化合物分子量為540，再使用500 MHz NMR儀器分析，1H NMR δ值為6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23、1.74、1.15、1.12、1.05、1.02和13C NMR值172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51。NMR數據顯示該化合物含有氨基、酯、羧酸、脂肪族甲基、乙基、亞甲基、氧亞甲基、次甲基、接氧次甲基和硫官能基。詳細的1D和2DNMR分析確認化合物的結構為FR901228的已知化合物。
其他取自F8餾分物的活性化合物(F8H17)，依據正ESI模式分子離子峰為1081.75(M+H)，再由ESIMS的1079.2的基峰，顯示分子量為1080，此化合物顯示在234nm處的UV吸收帶。
實施例6伯克氏菌作為殺藻劑
伯克氏菌A396菌生長於未知的礦物質培養基持續5天 (25℃，200rpm)，細胞藉由8000克的離心力進行上清液的分離，無細胞上清液用於測試對單細胞藻類(P.subcapitata)和藍綠藻類(P.subcapitata)的殺藻活性。將一定量的上清液加於24孔的聚苯乙烯培養板上，此培養板有特定的藻類生長於750mL的Gorham培養基中，以確定各種藻類關於上清液的測試的劑量反應曲線。各個實驗重複兩次完成後，使用無添加物的培養基作為陰性對照組。此培養板加蓋封住，並在室溫恒定光線的生長環境下持續培養48小時，48小時後，使用SpectraMax Gemini XS培養板讀數器，進行各個樣本孔中進行懸浮液的螢光測試(700nm)，螢光降低率轉換成百分比，用於與藻類生長控制組進行比較。下表9的結果顯示對單細胞藻類和藍綠藻類具有良好的控制效果。
實施例7伯克氏菌種粗提取物和餾分物對於衣藻的控制效果
取自伯克氏菌種粗提取物的餾分物用於測試對萊茵衣藻的除藻活性，將餾分物(濃度為20mg/mL浸泡於乙醇中)加到48孔聚苯乙烯培養板中，此培養板裝有750mL的生長藻類。各個實驗重複兩次完成後，使用溶劑(乙醇)作為陰性對照組。此培養板加蓋封住，於室溫具有恒定光線的生長環境下持續培 養72小時，72小時後，使用SpectraMaxGeminiXS培養板讀數器，進行各個樣本孔中進行懸浮液的螢光測試(680nm)，螢光降低率轉換成百分比，用於與藻類生長控制組進行比較。各個樣本與陰性對照組進行目視比較，若該孔較對照組更為清澈即表示具有活性。結果列於下表10中，顯示對餾分物5、6、7、8和9中對藻類的控制效果。測試重複兩次，680nm量測的控制降低率(%)與陰性對照組相比，各個樣本與陰性對照組進行目視比較，若該孔較對照組更為清澈即表示具有活性。
實施例8伯克氏菌種粗提物和不同餾分物對P.subcapitata的控制效果
取自伯克氏菌種粗提取物的餾分物用於測試對單細胞藻類(P.subcapitata)的除藻活性，將取自已知物(10mg/mL的濃度)對各樣本再溶解的純乙醇溶液，加入24孔聚苯乙烯板含750mLGorham培養基生長藻類的各樣本孔中，以判定對單細胞藻類中，樣本(提取物/餾分物)的殺藻效果。各個實驗重複3次完成後，使用純乙醇作為陰性對照組。此培養板加蓋封住並在室溫恒定光線的生長環境下持續培養48小時，48小時後，使用SpectraMaxGeminiXS培養板讀數器，進行各個樣本孔中進行懸浮液的螢光測試(700nm)，螢光降低率轉換成百分比，用於與藻類生長控制組進行比較。下表11的結果顯示餾分物F5、F6和F7對單細胞藻類和藍綠藻類具有良好的控制效果，但其他的樣本則無此效果。
實施例9伯克氏菌種發酵培養液純化化合物對萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的控制效果
伯克氏菌種發酵培養液純化化合物用於測試對萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)的控制效果，將餾分物(濃度為20mg/mL浸泡於乙醇中)加到48孔透明聚苯乙烯培養板中，此培養板裝有750mL的特定生長藻類。各個實驗重複兩次完成後，使用溶劑作為陰性對照組。此培養板加蓋封住，於室溫具有恒定光線的生長環境下持續培養72小時，72小時後，使用SpectraMaxGeminiXS培養板讀數器進行各個樣本孔中進行懸浮液的螢光測試(680nm)，螢光降低率轉換成百分比，用於與藻類生長控制組進行比較。各個樣本與陰性對照組進行目視比較，若該孔較對照組更為清澈即表示具有活性。結果如下表12顯示含templamideB(MW537)、FR901228(MW540)、templazoleA(MW298)和F8H18(MW1080)的樣本，對特定的藻類具有控制效果。測試重複兩次，680nm量測的控制降低率(%)與陰性對照組相比，各個樣本與陰性對照組進行目視比較，若該孔較對照組更為清澈即表示具有活性。
Templazole A於此生物測定裝置中進行測試。
實施例10伯克氏菌種熱處理發酵上清液對四尾柵藻(Scenedesmus quadricauda)的控制效果
伯克氏菌種生長於發酵培養液中，如上述內容。在發酵結束後，上清液此培養液進行加熱滅活，無細胞的上清液用於測試對四尾柵藻的除藻活性，上清液加入48孔的透明聚苯乙烯板中，此培養板含750mL的特定生長藻類。各個實驗重複兩次完成後，使用無添加物的培養基作為陰性對照組。此培養板加蓋封住，於室溫具有恒定光線的生長環境下持續培養72小時，72小時後，使用SpectraMax M2培養板讀數器進行各個樣本孔中進行懸浮液的螢光測試(680nm)，螢光降低率轉換成百分比，用於與未處理的對照組進行比較。結果列於下表13中，顯示對特定的藻類具有控制效果。測試重複兩次，680nm量測的控制降低率(%)與陰性對照組相比。
實施例11熱滅活伯克氏菌發酵上清液對小颤藻(Oscillatoria tenius)的控制效果
伯克氏菌種生長於發酵培養液中，如上述內容。在發酵結束後，上清液此培養液進行加熱滅活，無細胞的上清液用於測試對Oscillatoriatenius的除藻活性，上清液加入48孔的透明聚苯乙烯板中，此培養板含750mL的特定生長藻類。各個實驗重複兩次完成後，使用無添加物的培養基作為陰性對照組。此培養板加蓋封住，於室溫具有恒定光線的生長環境下持續培養72小時，72小時後，使用SpectraMaxM2培養板讀數器於680nm的吸收光度量測，將吸收光度的降低率轉換成百分比，用於與藻類生長的控制組進行比較。結果列於下表14中，顯示對特 定的藻類具有控制效果。測試重複兩次，680nm量測吸收光度的控制降低率(%)與未處理的對照組相比。
實施例13伯克氏菌種對二斑蜘蛛蟎為害金盞花植物的控制效果
金盞花和萬壽菊生長於6英吋的容器中，藉由將宿主植物(棉花)的葉子放於測試植物上，用於觀察受到二斑蜘蛛蟎(Tetranychus urticae)的危害情況。在14天內，約有10片葉子出現30-40隻的蜘蛛蟎於各個部位上。測試植物各別上籠而處於下列的感染情況，讓其繁衍蜘蛛蟎的族群自測試植物將宿主的葉子移開，本研究進行前未施用任何的殺蟲劑，使用Gen3噴灑設施進行將噴灑製劑校正到100gpa，各個複製物各別上籠限於下列的應用情況中，使用籠子為番茄籠30英吋高×12英吋直徑，覆蓋有防病毒的窗紗。測試植物於測試期間吸收自然光，必要時，測試植物的土壤每24小時澆水，使用設備前，進行植物的評估量(預先量測)，再於使用後第3、5和7天進行量測評估。隨機選取4片葉子，各個重複測試用的複製物量測的總面積等於6cm平方，記錄實際二斑蜘蛛蟎的死活數量，伯克氏菌種顯示對TSSM幼蟲和成蟲都具有些微的殺蟲活性，此活性顯示可防治TSSM的潛在生物殺蟲劑配方效果，也在樣本觀察到活蟎的數量減少。即可證明MBI206對TSSM具有潛在的生物殺蟲效果。
實施例14伯克氏菌種發酵上清液對二斑蜘蛛蟎為害金盞 花植物的控制效果
萬壽菊生長於6英吋的容器中，藉由將宿主(棉花)植物的葉子放於測試植物上，用於觀察受到二斑蜘蛛蟎的危害情況。在14天內，約有10片葉子出現30-40隻的蜘蛛蟎於各個部位上。測試植物各別上籠而處於下列的感染情況，讓其繁衍蜘蛛蟎的族群自測試植物將宿主的葉子移開，本研究進行前未施用任何的殺蟲劑，植物施用100%的上清液或10%的上清液(浸泡於水中)，使用拋棄式的噴霧器噴灑整個葉面。測試植物置於溫室凳子的金屬網上並佈置有一個完整的隨機區域。研究溫室使用PROCOM溫室溫度微控制系統進行控制，實驗期間，平均高溫為85℉而平均低溫為72℉。平均濕度從40%到75%不等，測試植物於測試期間吸收自然光，必要時，測試植物的土壤每24小時澆水，使用設備前，進行植物的評估量(預先量測)，再於使用後第3、5、7和14天進行量測評估。每個實驗複製物的量測總面積為6cm平方，實際紀錄二斑蜘蛛蟎幼蟲和成蟲死活的數量。
實施例14伯克氏菌種配方(MBI 206)對草莓二斑蜘蛛蟎(TSM)的控制效果-現場數據。
有5種傳統化學製劑和MBI 206僅田野的TSM控制效果的測試，將草莓移植到塑膠地膜床的田野中，此設施有13英吋高和27英吋寬，具有4英尺的床距，頭頂的噴灌設施，移植後用於持續澆灌10天，其他的實驗期間使用滴灌，每個培養盆有12.5英尺，栽種有20棵植物，每排各10棵。培養盆受到實驗菌落的感染4次，各棵植物感染有10到20隻TSM。每次實驗即完成一個實驗區塊的感染，此實驗含使用不同數量和天數的殺蟎劑噴灑，有些還混合有佐劑並進行未處理的檢查。在每個RCB的設計中，重複4次實驗。在TSM達到閥值前先使用Savey和Acramite(1月6日)，開始2週後，執行其他的治療方案。使用手提式的噴灑器以45度的噴嘴和4號碟的設計進行噴灑，噴灑器使用二氧化碳加壓到40磅，進行校 準每英畝的用量為100加侖。第1天摘取前處理的樣本，在最後施藥前持續採樣2週。每個培養盆隨機選取10棵樣本，自植物1/3處摘取。樣品再送到實驗室，將TSM的蟲和卵自葉子拿取，放於粘盤上約佔用1/10的面積，估計每片葉子的平均數量。可生長和不可生長的蟲卵，其塗佈不得有差別，紀錄所有蟲卵的作用情況。在MBI 206最高用量(3加侖/英畝)下顯示蟲卵數量可至少抵得上使用兩種農藥的控制效果。
實施例15根據田野條件對柑橘銹蟎蟲(Phyllocoptruta oleivora)的控制效果
MBI 206(伯克氏菌種培養液製劑)溶液噴灑於Valencia甜橙，用量為1、2和3加侖/英畝的組合，混合有0.25% v/v/LI-700(表面活性劑)採用100 GPA的包裝量。進行單方防治與未經處理的樣品樣本比對，處理前進行蟎蟲數量的計算，然後防治後的第1、7、10和14天治進行計算。進行每次處理每個樣本點中，10個果實的蟎蟲數量計算，在防治後的第14天觀察到，相較於未處理的對照組(每次計數約16隻蟎蟲)，使用1和2加侖/英畝的MBI 206用量(每次計數約6-8隻蟎蟲)後蟎蟲數量減少。
實施例16 Templamide、FR901465和FR901228對乳草屬植物害蟲的殺蟲(吸吮接觸)活性
純化合物templamide B(MBI 206分子量537)、FR 901465(MBI 206分子量523)和FR901228(MBI 206分子量540)的殺蟲活性，於實驗室使用抽吸接觸的生物測定系統進行測試。此化合物溶解在濃度為1mg/mL的100%乙醇中，將第4齡的乳草屬植物害蟲、若蟲和幼蟲放在各孔放有向日葵種子和1杯水(水杯放有棉芯)的5C Rubbermaid的容器中。1根Hamilton微管用於將1μL(1滴)的化合物滴到每隻乳草蟲幼蟲(MWB)的肚子上，將培養缸放於Rubbermaid容器中並上網蓋，每個樣本處理8隻幼蟲，分析物在25℃及12小時光照/12小時黑暗中培養，用藥後，在第4和第7天量測幼蟲。所有3種的化合物對MWB都具有觸殺活性，但並未殺死所有的蟲，有些某些受到影響而無法動彈。在第7天大部份的MWB已蛻皮，顯示這些化合物棵抑制蛻皮或影響MWB的正常生長。因此，相較於FR 901228(MW 540)和templamide B(圖4)，FR 901465提供更好的(87.5%)乳草蟲控制效果。
實施例17純化合物對Lygus hesperus第2齡晚期和第3齡早期的殺蟲活性
在實驗室使用分離自伯克氏菌種的templamide A、templamide B、FR901465和FR901228，使用12孔裝有綠豆生 物測定系統的培養板進行殺蟲活性的測試。將化合物溶於100%的乙醇形成11 mg/mL的濃度，將此樣本500μL加入3.5mL的水中，形成含0.25mg/mL濃度的4mL溶液中。綠豆先在漂白劑溶液中洗滌，然後用水清洗使用前先將綠豆乾燥，使用剪刀剪開放入12孔的培養板中。使用鉗子，將綠豆各自加入15ml含各個處理物的塑膠試管中，再浸入處理液整整1分鐘，各個綠豆放入各個樣本孔中，然後使用刷子將Lygus hesperus第2齡晚期和第3齡早期的幼蟲放入樣本孔中，使用封口機蓋上托盤，插上排氣孔。計算每孔的Lygus數量，將培養板放於樹枝頂端，用藥後，在第24、48和第120天量測幼蟲。根據圖5中的結構，可發現到化合物FR 901465是最有效的製劑，死亡率為91.2%，其次是templamide B有69.2%和FR901228有51.7%。
Templamide A在Lygus餵養的生物測定系統中測定無效，此測試中，陽性對照組的Avid(Avemectin)流速為13μL/10 mL。
實施例18 FR901228的殺線蟲活性
FR 901228的純樣本使用96孔塑膠培養板的生物測定裝置進行測試，15-20隻的線蟲放於50μL的水溶液中，曝露於3μL的20mg/ml的FR 901228溶液中，於25℃下持續放置24小時。完成培養後，紀錄各孔線蟲幼蟲(J2)使用化合物處理可見的靜止不動情況，各個處理物再放於4孔複製培養井中測試。每個實驗放入3個對照組樣本，一個陽性(1% Avid)和2個陰性(DMSO和水)。實驗(T1)使用野生線蟲(FLN)而實驗(T2)使用M.incognita線蟲，將樣本溶於100%DMSO中。FR 901228(MW 540)顯示對野生線蟲具有75%的活力鈍化，相較於M.incognita也有75%的活力鈍化效果。
微生物的保存
處理的微生物材料即按照佈達佩斯公約和每個的農業研究培養採集(NRRL)(1815 N.University Street,Peoria,Illinois 61604 USA)，提供以下的編號：
保存編號和日期
此菌株已在規定條件下保存，確保在本專利申請期間可隨時取用，提供專利權商標委員會按照37 CFR C.§122規定進行裁決。保存的樣本是保存菌株的純培養物，可為國外的專利法於申請或準備申請時所取用，但應瞭解到保存樣本的區域未必構成政府已實質授予專利權。
雖然本發明已參照特定的實施例加以說明，其詳細內容未必視為具有限制性，顯而易見的是每個人可使用各種等同物、變化物和修改物，但仍屬本發明的範圍以內。
本發明提出各種不同的參考文獻中，即視為全部參考內容的一部份。
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圖1顯示伯克氏菌A396於多噬伯克氏菌ATCC 17616增長速度的比較；圖2顯示用於餾分MBI-206配方的整體方案；圖3顯示用於餾分和取得MBI-206培養液化合物的整體方案；圖4顯示經測試化合物防治乳草蟲(Oncopeltus fasciatus)的殺蟲劑(吸吮)效果；圖5顯示純化合物(餵養)防治綠盲金星的效果。

Claims (18)

  1. 一種配方，包括有：(A)一分離菌株或發酵培養液，包括下列菌種的細胞和培養基，即非洋蔥伯克氏菌、非植物伯克氏菌、非唐菖蒲伯克氏菌、伯克氏菌屬、非洋蔥伯克氏菌、非多噬伯克氏菌和伯克氏菌屬，而具有下列特性：(1)一16rRNA基因序列包括一個正向序列與SEQ ID NO：8、11和12至少有99.5%的同一性和反向序列與SEQ ID NO：9、10、13、14和15至少有99.5%的同一性；(2)殺蟲活性；(3)產生至少下列一種的殺蟲化合物：(a)具有下列特性的化合物：(i)液相色譜/質譜法(LC/MS)測定的分子量為525-555；(ii)1H NMR δ值6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23.1.74、1.15、1.12、1.05、1.02；(iii)172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51；(iv)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，而使用反相C-18 HPLC柱採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(b)此化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子；(c)此化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯胺基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子；(d)該化合物具至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有3個亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子，及 (e)此化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有一個環氧化合物亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子，以及(4)對脊椎動物屬非致病性；(5)對卡那黴素、氯黴素、環丙沙星、呱拉西林、亞胺培南以及磺胺和甲氧芐啶的混合物具有易感性；及(6)含脂肪酸16：0，環基17：0，16：0 3-OH，14：0，環基19：0 ω8c，18：0；以及(B)C1-C7的對羥基苯甲酸酯，C2-C17醇和洗滌劑。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述之配方，其中C1-C7脂族對羥基苯甲酸酯存在量約0.01-5%，C2-C17醇是的存在量約0.001-10%，而洗滌劑的存在量約0.001-10%。
  3. 一種含殺蟲效果的物質，該物質來自申請專利範圍第1項，其中所謂的殺蟲有效物質是：(a)具有下列特性的化合物：(i)具有殺蟲特性，(ii)液相色譜/質譜法(LC/MS)判定的分子量約210-240，(iii)1H NMR值δ值為7.90、6.85、4.28、1.76、1.46、1.38、1.37、0.94；(iv)在13C NMR值為166.84、162.12、131.34(2C)、121.04、114.83(2C)、64.32、31.25、28.43、25.45、22.18、12.93；(v)高壓液相色譜法(HPLC)在反相C-18 HPLC柱(Phenomenex,Luna 5μ C18(2)100A,100 x 4.60 mm)上的保留時間約15-20分鐘，而使用水：乙腈(CH3CN)的梯度系統，高壓液相色譜法(HPLC)(0-20分鐘90-0%乙腈溶液，20-24分鐘100% CH3CN，24-27分鐘，0-90% CH3CN)，流速為0.5 mL/min，而UV檢測波長是210nm；(vi)13C NMR譜顯示13個離散碳信號，顯示含一個甲基，5個亞甲基碳原子，4個甲烯和3個季碳；(vii)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C13H18O3；(viii)UV吸收帶介於210-450nm，最具體的是約248nm，或(b)一種具有下列結構的物質， 其中X是獨立的-O，-NR或-S基，其中R是H或C1-C10烷基，R1、R2、R3、R4、R5和R6是各自獨立的H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H基、醯基、羟基、氨基甲酸叔丁酯、磺醯基、磺醯胺或硫；包括有：(A)如申請專利範圍第1項的配方；(B)提供足夠的時間和溫度培養此配方，產生有效殺蟲的物質；及(C)分離有效的殺蟲物質。
  4. 一種組合物，包括有：(A)申請專利範圍第1項的配方或其有效的殺蟲物質；及(B)至少一個：(1)第2種物質，其中所謂的第2種物質是化學或生物殺藻劑或殺蟎劑，或(2)至少一可接受的殺蟲載體、稀釋劑、表面活性劑和輔助劑。
  5. 一種組合物，包括有：(I)第一種物質選自含下列的組合成份：(A)一純培養物、細胞餾分物、上清液或提取物，取自下列的菌株，即非洋蔥伯克氏菌、非植物伯克氏菌、非唐菖蒲伯克氏菌、伯克氏菌屬、非洋蔥伯克氏菌、非多噬伯克氏菌和伯克氏菌屬，而具有下列特性： (1)一個16rRNA基因序列包括一個正向序列與SEQ ID NO：8、11和12至少有99.5%的同一性和反向序列與SEQ ID NO：9、10、13、14和15至少有99.5%的同一性；(2)殺蟲活性；(3)產生至少含下列組合成份的殺蟲化合物：(a)一化合物具有下列特性：(i)液相色譜/質譜法(LC/MS)測定的分子量約525-555；(ii)1H NMR δ值為6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23.1.74、1.15、1.12、1.05、1.02；(iii)13C NMR值為172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51；及(iv)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，而使用反相C-18 HPLC柱採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(b)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一種吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子；(c)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯胺基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子；(d)一化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有3個亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子；及(e)一化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有一個環氧化合物亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子； (B)一分離的殺蟲化合物可選自伯克氏菌種含下列的組合成份：(1)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一種吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子，而具有下列至少一種的特性：(a)分子量為275-435；(b)1H NMR δ值為8.44、8.74、8.19、7.47、7.31、3.98、2.82、2.33、1.08；(c)13C NMR值為163.7、161.2、154.8、136.1、129.4、125.4、123.5、123.3、121.8、121.5、111.8、104.7、52.2、37.3、28.1、22.7、22.7；(d)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-25分鐘，而使用反相C-18 HPLC柱採用水：乙腈(CH3CN)梯度，UV偵測波長為210nm；(e)UV吸收帶為226、275和327nm；(2)一化合物具有噁唑-芐基結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子，具有下列至少一種的特性：(a)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約240-290；(b)1H NMRδ值約7.08、7.06、6.75、3.75、2.56、2.15、0.93、0.93；(c)13C NMR δ值為158.2、156.3、155.5、132.6、129.5、129.5、127.3、121.8、115.2、115.2、41.2、35.3、26.7、21.5、21.5；(d)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約6-15分鐘，而反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；及(e)UV吸收帶約230、285和323nm；(3)一非環氧化合物，含至少一個酯、至少一個醯胺、至少3個亞甲基官能基、至少一個四氢吡喃醇基團、至少3個烯屬 雙鍵、至少6個甲基官能基、至少3個羥基官能基、至少25個碳原子、至少有8個氧原子和一個氮原子和至少下列一種的特性：(a)液相色譜質譜(LC/MS)測定的分子量約530-580；(b)1H NMRδ值為6.40、6.39、6.00、5.97、5.67、5.54、4.33、3.77、3.73、3.70、3.59、3.47、3.41、2.44、2.35、2.26、1.97、1.81、1.76、1.42、1.37、1.16、1.12、1.04；(c)13C NMR δ值173.92、166.06、145.06、138.76、135.71、129.99、126.20、123.35、99.75、82.20、78.22、76.69、71.23、70.79、70.48、69.84、60.98、48.84、36.89、33.09、30.63、28.55、25.88、20.37、18.11、14.90、12.81、9.41；(d)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約7-12分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度，UV偵測波長為210nm；(e)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C28H45NO10；(f)UV吸收帶介於210-450nm；(4)一化合物包括有：(a)至少一個酯化合物，至少一個醯胺，一個環氧亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和至少一個氮原子；(b)13C NMR δ值為174.03、166.12、143.63、137.50、134.39、128.70、126.68、124.41、98.09、80.75、76.84、75.23、69.87、69.08、68.69、68.60、48.83、41.07、35.45、31.67、29.19、27.12、24.55、19.20、18.95、13.48、11.39、8.04；(c)分子式為C28H43NO9和至少下列之一的：(i)1H NMRδ值約6.41、6.40、6.01、5.97、5.67、5.55、4.33、3.77、3.75、3.72、3.64、3.59、3.54、3.52、2.44、2.34、2.25、1.96、1.81、1.76、1.42、1.38、1.17、1.12、1.04；(ii)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約6-15分鐘，反相 C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(iii)UV吸收帶約210-450nm；(II)可選自第2種物質，其中所謂的第2種物質屬化學物質或生物殺藻劑或殺蜱劑；及(III)可為至少之一的載劑、稀釋劑、表面活性劑和輔助劑。
  6. 依據申請專利範圍第4或5項所述之組合物，其中所謂的組合物為一種成份。
  7. 依據申請專利範圍第4項所述之組合物，其中所謂的殺蟲有效物質具有下列的結構： 其中X是-O，R1是羥基，R2,R3,R4,R5是各個H,R6 C4-10的烷基，C4-10是取代烷基。
  8. 依據申請專利範圍第4項所述之組合物，其中所謂的有效物質是丁基、己基或辛基對羥基苯甲酸酯。
  9. 一種可調節藻類的增殖和/或生長，和/或節肢動物的侵染之方法，包括施用於藻類的增殖和/或生長，和/或節肢動物的侵染部位：(A)申請專利範圍第5項的組合物；(B)一純培養物、細胞餾分物、上清液或提取物，取自下列的菌株，即非洋蔥伯克氏菌、非植物伯克氏菌、非唐菖蒲伯克氏菌、伯克氏菌屬、非洋蔥伯克氏菌、非多噬伯克氏菌和伯克氏菌屬，而具有下列特性：(1)一個16rRNA基因序列包括一個正向序列與SEQ ID NO：8、11和12至少有99%的同一性和反向序列與SEQ ID NO：9、10、13、14和15至少有99%的同一性；(2)殺蟲活性； (3)產生至少含下列組合成份的殺蟲化合物：(a)一化合物具有下列特性：(i)液相色譜/質譜法(LC/MS)測定的分子量約525-555；(ii)1H NMR δ值為6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23.1.74、1.15、1.12、1.05、1.02；(iii)13C NMR值為172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51；及(iv)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，使用反相C-18 HPLC柱採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(b)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一種吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子；(c)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯胺基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子；(d)一化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有3個亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子；及(e)一化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有一個環氧化合物亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子；(C)一分離的殺蟲化合物可選自伯克氏菌種含下列的組合成份：(1)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一種吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基 團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子，而具有下列至少一種的特性：(a)分子量為275-435；(b)1H NMRδ值為8.44、8.74、8.19、7.47、7.31、3.98、2.82、2.33、1.08；(c)13C NMRδ值為163.7、161.2、154.8、136.1、129.4、125.4、123.5、123.3、121.8、121.5、111.8、104.7、52.2、37.3、28.1、22.7、22.7；(d)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-20分鐘，使用反相C-18 HPLC柱採用水：乙腈(CH3CN)梯度，UV偵測波長為210nm；(e)UV吸收帶為226、275和327nm；(2)一化合物具有噁唑-芐基結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子，具有下列至少一種的特性：(a)液相色譜/質譜(LC/MS)測定的分子量約240-290；(b)1H NMRδ值約7.08、7.06、6.75、3.75、2.56、2.15、0.93、0.93；(c)13C NMR δ值為158.2、156.3、155.5、132.6、129.5、129.5、127.3、121.8、115.2、115.2、41.2、35.3、26.7、21.5、21.5；(d)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約6-15分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；及(e)UV吸收帶約230、285和323nm；(3)一非環氧化合物，含至少一個酯、至少一個醯胺、至少3個亞甲基官能基、至少一個四氢吡喃醇基團、至少3個烯屬雙鍵、至少6個甲基官能基、至少3個羥基官能基、至少25個碳原子、至少有8個氧原子和一個氮原子和至少下列一種的特性：(a)液相色譜質譜(LC/MS)測定的分子量約530-580； (b)1H NMRδ值為6.40、6.39、6.00、5.97、5.67、5.54、4.33、3.77、3.73、3.70、3.59、3.47、3.41、2.44、2.35、2.26、1.97、1.81、1.76、1.42、1.37、1.16、1.12、1.04；(c)13C NMR δ值173.92、166.06、145.06、138.76、135.71、129.99、126.20、123.35、99.75、82.20、78.22、76.69、71.23、70.79、70.48、69.84、60.98、48.84、36.89、33.09、30.63、28.55、25.88、20.37、18.11、14.90、12.81、9.41；(d)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約7-12分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度，UV偵測波長為210nm；(e)ESIMS和NMR數據分析測定的分子式為C28H45NO10；(f)UV吸收帶介於210-450nm；(4)一化合物包括有：(a)至少一個酯化合物，至少一個醯胺，一個環氧亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和至少一個氮原子；(b)13C NMR δ值為174.03、166.12、143.63、137.50、134.39、128.70、126.68、124.41、98.09、80.75、76.84、75.23、69.87、69.08、68.69、68.60、48.83、41.07、35.45、31.67、29.19、27.12、24.55、19.20、18.95、13.48、11.39、8.04；(c)分子式為C28H43NO9和至少下列之一的：(i)1H NMRδ值約6.41、6.40、6.01、5.97、5.67、5.55、4.33、3.77、3.75、3.72、3.64、3.59、3.54、3.52、2.44、2.34、2.25、1.96、1.81、1.76、1.42、1.38、1.17、1.12、1.04；(ii)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約6-15分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(5)一化合物包括有下列特性：(i)液相色譜質譜(LC/MS)測定的分子量約525-555；(ii)1H NMR δ值為6.22，5.81，5.69，5.66，5.65，4.64， 4.31，3.93，3.22，3.21，3.15，3.10，2.69，2.62，2.26、2.23、1.74、1.15、1.12、1.05、1.02；(iii)13C NMR δ值172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51；及(iv)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(6)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一種吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基團、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子；(7)此化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯胺基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子；(8)一非環氧化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有3個亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子；及(9)一化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有一個環氧化合物亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子；以及(II)可選自另一種物質，其中所謂的此物質為殺藻劑或殺蜱劑，其數量可有效調節藻類的可調節藻類的增殖和/或生長，和/或節肢動物在該部位的侵染。
  10. 一種方法，其係可調節藻類的增殖和/或生長，和/或節肢動物的侵染，包括以所需的數量施用於藻類的增殖和/或生長，和/或節肢動物的侵染部位：(I)一化合物選自下列的組合成份：(A)一化合物而具有下列的結構式##STR001## 或可接受的殺蟲劑鹽類或立體異構物，其中M是1、2、3或4，n為0、1、2或3，p和q分別為1或2，X是O，NH或NR、R1、R2和R3可以是相同或各別不同的氨基酸側鏈基團或氨基酸側鏈衍生物，R是低級鏈烷基，芳基或芳基烷基的基團；(B)一化合物而具有下列的結構式##STR002## 其中X、Y和Z分別是-O，-NR1或-S，其中R1是-H或C1-C10烷基，R1、R2和m分別是-H、烷基，取代烷基，鏈烯基，取代鏈烯，炔基，取代炔基，芳基，取代芳基，雜芳基，取代雜芳基，雜環基，取代雜環基，環烷基，取代環烷基，烷氧基，取代烷氧基，硫代烷基，取代烷硫基，羥基、鹵素，氨基，醯氨基，羧基，-C(O)H基，醯基，羟基，氨基甲酸叔丁酯，磺醯基，磺醯胺或硫，而m可位於噁唑環上的任意位置點；(C)一化合物而具有下列的結構式##STR003## 其中X，Y和Z分別是-O，-NR1或-S，其中R1是-H或C1-C10烷基，R1、R2和m為位於噁唑環上取代物，分別是-H、烷基、取代的烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代烷硫基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；(D)一化合物而具有下列的結構式##STR005## 其中X和Y分別是-OH、-NR1或S，其中的R1和R2分別是-H、烷基(如C1-C10烷基)、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基鏈烯基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；(E)一化合物而具有下列的結構式##STR004a## 其中X、Y和Z分別是-O，-NR或-S，其中R是H或C1-C10烷基、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12和R13分別是H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫； (F)一化合物而具有下列的結構式##STR006a## 其中X、Y和Z分別是-O，-NR或-S，其中R是H或C1-C10烷基、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R11、R12、和R13分別是H、烷基、取代烷基、鏈烯基、取代鏈烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、雜芳基、取代雜芳基、雜環基、取代雜環基、環烷基、取代環烷基、烷氧基、取代烷氧基、硫代烷基、取代硫代烷基、羥基、鹵素、氨基、醯氨基、羧基、-C(O)H、醯基、羟基、氨基甲酸酯、磺醯基、磺醯胺或硫；(II)可選自另一種物質，其中所謂的此物質為殺藻劑或殺蜱劑，其數量可有效調節藻類的可調節藻類的增殖和/或生長，和/或節肢動物的侵染。
  11. 依據申請專利範圍第10項所述之方法，其中所謂的化合物選自下列的組合成份：(i)templazole A；(ii)templazole B；(iii)templamide A；(iv)templamide B；(v)FR901228； (viii) (xiv) (xl)FR901465；(xli)F8H17。
  12. 依據申請專利範圍第9或10項所述之方法，其中所謂的伯克氏菌種為具有伯克氏菌A396(NRRL Accession NO B-50319)識 別特性的菌種。
  13. 依據申請專利範圍第3項所述之物質，其中所謂的上清液為無細胞的上清液。
  14. 一種化合物的使用，係選自下列的組合成份：(A)一化合物具有下列的特性：(i)液相色譜質譜(LC/MS)測定的分子量約525-555；(ii)1H NMRδ值為6.22、5.81、5.69、5.66、5.65、4.64、4.31、3.93、3.22、3.21、3.15、3.10、2.69、2.62、2.26、2.23.1.74、1.15、1.12、1.05、1.02；(iii)13C NMRδ值為172.99、172.93、169.57、169.23、167.59、130.74、130.12、129.93、128.32、73.49、62.95、59.42、57.73、38.39、38.00、35.49、30.90、30.36、29.26、18.59、18.38、18.09、17.93、12.51，和(iv)高壓液相色譜法(HPLC)的保留時間約10-15分鐘，反相C-18 HPLC柱析採用水：乙腈(CH3CN)梯度；(B)一化合物具有噁唑-吲哚的結構，含至少一個吲哚基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個羧酸酯基、至少17個碳原子和至少3個氧原子和2個氮原子；(C)一化合物具有噁唑-芐基結構，含至少一個芐基基團、至少一個噁唑基團，至少一個取代烷基和至少一個醯基團、至少15個碳原子和至少2個氧原子和2個氮原子；(D)一化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有2個亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮；及(E)一化合物具有至少一個酯化合物，至少一個醯胺，至少有一個環氧化合物亞甲基，至少一個四氢吡喃醇基團和至少3個烯屬雙鍵，至少6個甲基，至少有3個羥基，至少25個碳原子，至少8個氧原子和一個氮原子；可作為殺蟲劑使用用於調節藻類的增殖和/或生長，和/或調節節肢動物的侵染部位。
  15. 一種方法，係用於調節藻類增殖，和/或調節受有害蟲侵染的 植物，和/或調節單子葉或雙子葉雜草或莎草生長的方法，用於某個部位，而調節藻類的增殖和/或生長，和/或調節節肢動物蟲蛀，和/或調節其上述雜草其出現和/或生長達所需的數量，(A)申請專利範圍第1項的配方或有效殺蟲的物質為此物質所衍生；(B)申請專利範圍第5項的組合物；(C)templamide A；(D)templamide B；(E)FR901465；(F)FR901228；有效調節所謂的藻類和/或害蟲和/或增殖和/或生長，和/或單子葉植物、莎草或雙子葉雜草在所述位置的害蟲侵染或出現害蟲。
  16. 依據申請專利範圍第14項所述之方法，其中所謂的線蟲和/或昆蟲侵染，即使用templamide A、templamide B、FR901465和FR901228來調節防治。
  17. 依據申請專利範圍第15項所述之方法，其中所謂的線蟲和/或昆蟲侵染，即使用templamide A、templamide B、FR901465和FR901228來調節防治。
  18. 一種種子，其係包含申請專利範圍第3或9項或第1項配方的組合物。
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