MX2014002329A - Cepa bacteriana aislada del genero burkholderia y metabolitos plaguicidas formulaciones derivadas de los mismos y usos. - Google Patents

Cepa bacteriana aislada del genero burkholderia y metabolitos plaguicidas formulaciones derivadas de los mismos y usos.

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Abstract

Se proporcionan una especie de Burkholderia sp sin patogenicidad conocida para vertebrados pero con actividad pesticida (por ejemplo, plantas, algas, arácnidos, insectos, hongos, malezas y nematodos); así los métodos para controlar algas utilizando dicha especie de Burkholderia. También se proporcionan productos naturales derivados de un cultivo de dicha especie y los métodos para controlar algas y/o arácnidos utilizando dichos productos naturales.

Description

CEPA BACTERIANA AISLADA DEL GÉNERO BURKHOLDERIA Y METABOLITOS PLAGUICIDAS FORMULACIONES DERIVADAS DE LOS MISMOS Y USOS CAMPO DE LA INVENCION En la presente invención se proporciona una especie de Burkholderia sp sin patogenicidad conocida para los vertebrados, tales como mamíferos, pescado y pájaros pero con actividad pesticida contra plantas, algas, insectos, hongos, arácnidos, tales como ácaros y nematodos y formulaciones y composiciones que comprenden dichas especies. También se proporcionan productos naturales, formulaciones y composiciones derivadas de un cultivo de dicha especie y métodos de controlar algas y arácnidos, tales como ácaros, utilizando dicha Burkholderia y/o dichos productos naturales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los productos naturales son sustancias producidas por microbios, plantas, y otros organismos. Los productos naturales microbianos ofrecen una fuente abundante de diversidad química y existe una larga historia de utilización de productos naturales con fines farmacéuticos. Uno de tales compuestos es FR901228 aislado de Chromobacterium, y se ha hallado que es útil como agente antibacteriano y agente antitumoral (véase, por ejemplo, Ueda et al., Patente US No. 7.396.665) .
Sin embargo, también se ha hallado con éxito que los metabolitos secundarios producidos por los microbios tienen usos para controlar malezas y plagas en aplicaciones agrícolas (véase, por ejemplo, Nakajima et al. 1991; Duke et al., 2000; Lydon & Duke, 1999; Gerwick et al., Patente US No. 7.393.812) . Los productos microbianos naturales también se han desarrollado con éxito en insecticidas agrícolas (véase, por ejemplo, Salama et al. 1981; Thompson et al., 2000; Krieg et al. 1983) . Algunas veces, tales productos naturales se han combinado con pesticidas químicos (véase, por ejemplo, Gottlieb, Patente US No. 4.808.207) .
Acaricidas Los acaricidas son compuestos que matan los ácaros (miticidas) y garrapatas ( ixodicidas ) . Esta clase de alguicidas es grande e incluye antibióticos, carbamatos, acaricidas de formamidina, piretroides, reguladores del crecimiento de ácaros, y acaricidas organofosforados . Además de los pesticidas químicos, las tierras diatomáceas y los ácidos grasos se pueden usar para controlar los ácaros. Ellos actúan normalmente a través de la alteración de la cutícula, que seca el ácaro. Además, algunos aceites esenciales tales como aceite de menta, se usan para controlar los ácaros. A pesar de la gran variedad de compuestos acaricidas conocidos, los ácaros aún son un problema serio en la agricultura debido al daño que causan en los cultivos. Ellos pueden producir varias generaciones durante la estación, lo que facilita el desarrollo rápido de resistencia a los productos acaricidas usados. En consecuencia, se necesitan críticamente nuevos productos pesticidas con nuevos sitios blanco y nuevos modos de acción.
Alguicidas Las algas aparecen en muchas formas. Estas incluyen: (1) algas unicelulares microscópicas, algas filamentosas que se asemejan al cabello, algas que crecen en láminas y microalgas que parecen como plantas; (2) algas que viven dentro del integumento exterior ("piel") o caparazón de calcio de algunos corales, anémonas y otros invertebrados sésiles llamados zooxantelas ; (3) pequeñas manchas verdes muy difíciles de sacar que algunas veces crecen en los paneles del acuario que tampoco son algas, sino colonias de diatomeas o radiolaria (animales unicelulares microscópicos con cáscaras duras) con algas incorporadas en su matriz.
El crecimiento de algas en una pequeña cantidad de agua retenida en un recipiente durante un período de tiempo ' significativo puede ser considerable, lo que es muy indeseable. Como resultado, las algas pueden causar la obstrucción de filros en los dispositivos de filtración de agua, olores y aspecto desagradables en las piletas, agotamiento del oxígeno disuelto, y sofocación de los peces y moluscos hasta la muerte. Además de estar presentes en el agua, las algas también pueden estar presentes en materiales industriales que se exponen a la intemperie y la luz, tales como cubiertas que contienen formadores de película orgánica sobre los sustratos minerales, acabados textiles, pinturas de madera y también materiales hechos de plástico.
El control de las lagas se puede dividir en cuatro categorías: controles biológicos, mecánicos, físicos y químicos. Unos pocos hechos pertinentes se aplican en todos los métodos de control de algas, Por ejemplo, los caracoles Turbo y Astrea, algunos blénidos, algunos peces cirujanos, entre otros son buenos pastoreadores . Los caracoles son los eliminadores más ampliamente usados y en general son la mejor elección. Algunas partes de los países parecen favorecer el uso de erizos de mar, peces ángeles enanos. Los primeros mueren demasiado fácilmente y mueven la decoración y los últimos pueden ser problemáticos con ingestión de invertebrados costosos. Otros métodos incluyen espumadores de proteínas funcionales, con o sin ozono y esterilizadores ultravioleta. Estos filtros físicos eliminan y destruyen las algas en exposición y ayudan a oxidar los nutrientes a medida que el agua circula. También se pueden usar antibióticos. Sin embargo, ellos tratan solo los síntomas sin tratar las causas del problema de las algas. Los factores pueden contribuir a que el sistema del agua esté fuera del equilibrio. El cobre, usualmente en la forma de solución de sulfato de cobre se ha empleado como un alguicida, así como un agente preventivo de los parásitos epizoóticos generales. Este metal es útil en los tanques de tratamiento y cuarentena, anzuelos y disposiciones solo para peces pero es persistente y tóxico para la vida, en especial no peces.
Burkholderia El género Burkholderia, subdivisión ß de las proteobacterias, comprende más de 40 especies que habitan diversos nichos ecológicos (Compant et al., 2008) . Las especies bacterianas del género Burkholderia son organismos ubicuos en la tierra y rizosfera (Coenye y Vandamme, 2003; Parke y Gurian-Sherman, 2001) . Tradicionalmente, se han conocido como patógenos de plantas, B. cepacia es la primera descubierta e identificada como el patógeno que causa enfermedades en las cebollas (Burkholder, 1950) . Varias especies de Burkholderia han desarrollado interacciones beneficiosas con sus huéspedes de planta (véase, por ejemplo, Cabballero-Mell ado et al., 2004, Chen et al., 2007) . También se ha hallado que algunas especies de Burkholderia son patógenos oportunistas humanos (ver, por ejemplo, Cheng y Currie, 2005 y Nierman et al., 2004) . En forma adicional, se ha hallado que algunas especies de Burkholderia tienen potencial como productos de biocontrol (ver por ejemplo, Burkhead et al., 1994; Knudsen et al., 1987; Jansiewicz et al., 1988; Gouge et al., Solicitud de Patente US No. 2003/0082147; Parke et al., Patente US No. 6.077.505; Casida et al., Patente US No. 6.689.357; Jeddeloh et al., WO2001055398; Zhang et al., Patente US No. 7.141.407) . Algunas especies de este género han sido efectivas en la biorehabilitación para descontaminar suelos contaminados o aguas subterráneas (véase, por ejemplo, Leahy et al. 1996) . Además, se ha hallado que algunas especies de Burkholderia secretan una variedad de enzimas extracelulares con actividades proteoliticas , lipoliticas y hemoliticas, asi como toxinas, antibióticos, y sideróforos (véase, por ejemplo, Ludovic et al., 2007; Nagamatsu, 2001) .
PCT/US2011/026016 describe una especie de Burkholderia, particularmente Burkholderia A396 y los compuestos derivados de dichas especies sin patogenicidad conocida para vertebrados pero con actividad contra plantas, insectos, hongos y nematodos .
Oxazoles, Tlazoles e Indoles Los oxazoles, tlazoles e índoles están ampliamente distribuidos en las plantas, algas, esponjas y microorganismos. Un gran número de productos naturales contienen uno o más los oxazoles de 5 elementos, tiazol y núcleo/residuos de indol. Estos productos naturales exhiben un amplio espectro de actividad biológica de valor terapéutico demostrable. Por ejemplo, la bleomicina A (Tomohisa et al.), un fármaco anticáncer ampliamente descriptos, efectúa loa degradación oxidativa del ADN y usa un residuo de bitiazol para unirse a sus secuencias de ADN blanco (Vanderwall et al., 1997) . La bacitracina (Ming et al., 2002), un antibiótico peptídico que contiene tiazolina, interfiere en la biosíntesis de nueva pared celular bacteriana por la complejación con C55-bactoprenolpirofosfato . Tiangazol (Kunze et al., 1993) contiene una matriz en tándem de un oxazol y tres tiazolinas y exhibe actividad antiviral (Jansen et al., 1992) . Aún otros productos naturales que contienen oxazol/tiazol tal como tiostrepton (Anderson et al., 1970) y GE2270A (Selva et al., 1997) inhiben las etapas de traducción en la sínteses de proteínas bacterianas. Se han informado más de 1000 alcaloides con el esqueleto de indol provenientes de los microorganismos. Un tercio de estos compuestos son péptidos con masas superiores de 500 Da con el indol es derivado del triptofano. La variedad estructural de los restantes dos tercios es más alta, y su actividad biológica parece abarcar un intervalo más amplio, que incluye a actividad antimicrobiana, antiviral, citotóxico, insecticida, antitrombótica o inhibitoria enzimática.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan en la presente invención una cepa aislada de una Burkholderia cepacia no específica, Burkholderia plantari no específica, Burkholderia gladioli no específica, Burkholderia sp. que tiene las siguientes características: (a) Tiene una secuencia del gen de 16rARN que comprende una secuencia directa que tiene al menos 99.5% de identidad con las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 8, 11 y 12 y una secuencia inversa que tiene al menos 99.5% de identidad con la SEQ ID NO:9, 10, 13-15; (b) Tiene actividad pesticida, en particular, herbicida, alguicida, acaricida, insecticida, fungicida y nematicida; (c) Produce al menos uno de los' compuestos seleccionados del grupo que consiste en: (i) un compuesto que tiene las siguientes propiedades: (a) un peso molecular de aproximadamente 525-555 determinado por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (b) Los valores de desplazamiento en RMN-1H de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23, 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (c) tiene valores de 13C RMN de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (c) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (ii) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster, que es un derivado carboxílico (carboxylic ester group) ; al menos 17 átomos de carbono y al menos 3 oxígeno y 2 átomos de nitrógeno; (iii) un compuesto que tiene una estructura oxazol'il-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 átomos de carbono y al menos 2 oxigeno y 2 átomos de nitrógeno; (iv) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono y al menos ocho oxigeno y un átomo de nitrógeno y (d) Es no patogénico (no infeccioso) en animales vertebrados, tales como mamíferos, aves y peces; (e) Es sensible a kanamicina, cloranfenicol, ciprofloxacin, piperacilina , imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprima y (f) Contiene los ácidos grasos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3- OH, 14:0, ciclo 19:0 G)8c, 18:0.
En una modalidad de realización particular, la cepa tiene las características de identificación de una cepa Burkholderia A396 (No. de acceso NRRL B-50319) .
En una modalidad de realización particular, la primera sustancia es un sobrenadante. En una modalidad de realización aún más particular, el sobrenadante es un sobrenadante libre de células.
También se proporciona una combinación, en particular una composición o formulación que comprende (a) una primera sustancia seleccionada del grupo que consiste en un cultivo puro, fracción celular o sobrenadante derivado de la cepa de Burkholderia que se expuso anteriormente o extracto de esta para usar opcionalmente como un pesticida; y (b) opcionalmente al menos uno de un portador, diluyente, tensioactivo, adyuvante, o pesticida biológico o químico (por ejemplo, alguicida,. acaricida, herbicida, fungicida, insecticida, nematicida y particularmente, alguicida o acaricida (por ejemplo, miticide) ) . En un aspecto relacionado, en la presente invención se proporciona una semilla recubierta con dicha combinación o composición.
En una modalidad de realización particular, la composición o formulación puede comprender: (a) una primera sustancia seleccionada del grupo que consiste en a cultivo puro, fracción celular o sobrenadante derivado de la cepa de Burkholderia que se expuso anteriormente o extracto de esta para usar opcionalmente como un pesticida; (b) ácidos grasos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3-OH, 14:0, ciclo 19:0 ü8c, 18:0, parabeno C1-C7, alcohol C2-C17 y detergente y (c) opcionalmente otra sustancia donde dicha otra sustancia es un pesticida (por ejemplo, fungicida, insecticida, alguicida, acaricida (por ejemplo, miticida), herbicida, nematicida) .
En una modalidad de realización particular, el parabeno C1-C7 alifático está presente en la cantidad de aproximadamente 0.01 - 5%, el alcohol C2-C17 está presente en la cantidad de aproximadamente 0.00-10% y el detergente está presente en la cantidad de aproximadamente 0.001-10%.
También se proporcionan las sustancias pesticidas derivadas de la formulación que se expuso anteriormente, combinaciones que comprenden dichas sustancias pesticidas y otro pesticida biológico o químico y métodos para producir estas sustancias pesticidas. En una modalidad de realización particular, estas sustancias pesticidas comprenden al menos una de las siguientes características: (a) tiene propiedades pesticidas y en particular, propiedades herbicidas, insecticidas, nematicidas, y fungicidas ; (b) tiene un peso molecular de aproximadamente 210-240 y más particularmente, 222 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (e) tiene valores de d en RMN-1}! de d 7.90, 6.85, 4.28, 1.76, 1.46, 1.38, 1.37, 0.94; (d) tiene valores de d en RMN-13C de 166.84, 162.12, 131.34 (2C), 121.04, 114.83 (2C), 64.32, 31.25, 28.43, 25.45, 22.18. 12.93; (e) tiene un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 15-20 minutos, más específicamente aproximadamente 17 minutos y aun más específicamente aproximadamente 17.45 min en una columna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) utilizando un gradiente con sistema disolvente de agu : acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0 - 90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) a 0.5 mL/min de velocidad de flujo y detección UV a 210 nm; (f) El espectro 13C R N exhibió 13 señales de carbono diferenciadas que se atribuyeron a un metilo, cinco átomos de carbono de metileno, cuatro metinos, y tres átomos de carbono cuaternarios; (g) tiene una fórmula molecular de C13H18O3 que se determinó por interpretación del análisis de los datos de ES IMS y RMN; (h) tiene bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm y más particularmente a 'aproximadamente 248 nm.
También se proporcionan compuestos que tienen la estructura que se muestra a continuación: en donde X, es de modo independiente -0, -NR, o -S, donde R es H o alquilo Ci-Cio; Ri, 2, 3, 4, R5, y Re' son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En particular, la sustancia puede tener la estructura en donde X, es de modo independiente -0, -NR, ? -S, donde R es H o alquilo C1-C10; Ri, R?r s^ Y Re son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C (0) H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad de realización más particular, el compuesto es butil parabeno con la siguiente estructura: En una modalidad de realización más particular, compuesto es hexil parabeno con la siguiente estructura: En una modalidad de realización más particular, compuesto es' octil parabeno con la siguiente estructura: La sustancia pesticida derivada de la formulación expuesta anteriormente se puede obtener por (a) provisión de la formulación expuesta anteriormente; (b) incubación o conservación de la formulación provista durante un tiempo suficiente (por ejemplo, entre aproximadamente 1 dia a aproximadamente 6 meses) y a una temperatura suficiente (por ejemplo, entre aproximadamente 3°C a aproximadamente 50°C) para producir la sustancia pesticida ( s ) y (c) aislar la sustancia pesticida.
En un aspecto relacionado, se describe un método para modular la proliferación y/o crecimiento de una plaga que incluye pero sin limitación a insectos, hongos, malezas, nematodos, arácnidos, algas y particularmente, algas, arácnidos (por ejemplo, ácaros, garrapatas) que comprende aplicar en una localización donde se desea la modulación de la proliferación y/o el crecimiento de una plaga una cantidad de : (I) (a) al menos una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste 'en un cultivo celular, fracción celular, sobrenadante sustancialmente puro derivado de la cepa de Burkholderia expuesta anteriormente o extracto de esta y (b) opcionalmente otra sustancia, donde dicha sustancia es un pesticida, o (II) la combinación, composición o formulación o sustancias pesticidas derivadas de dicha formulación expuesta anteriormente, efectiva para modular la proliferación y/o el crecimiento de una plaga en dicha localización.
En la presente invención se describen compuestos aislados que opcionalmente se pueden obtener o derivar de la especie Burkholderia o alternativamente, organismos capaces de producir estos compuestos que se pueden usar para controlar varias plagas, particularmente plagas fitopatogénicas de plantas, cuyos ejemplos incluyen, pero sin limitación insectos, nematodos, bacterias, hongos. Estos compuestos también se pueden usar como herbicidas, acaricidas o alguicidas.
En particular, los compuestos pesticidas aislados pueden incluir pero sin limitación: (A) un compuesto que tiene las siguientes propiedades: (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 determinado por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (ü) Los valores de desplazamiento en RMN- H de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.'65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene valores de 13C RMN de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (iv) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster, que es un derivado carboxílico (carboxylic ester group) ; al menos 17 átomos de carbono y al menos 3 oxígeno y 2 átomos de nitrógeno; (C) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 átomos de carbono y al menos 2 oxígeno y 2 átomos de nitrógeno; (D) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono y al menos ocho oxigeno y un átomo de nitrógeno y (E) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxígeno y al menos 1 átomo de nitrógeno.
En una modalidad de realización particular, los compuestos aislados pueden incluir pero sin limitación: (A) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo éster, que es un derivado carboxílico (carboxylic ester group) , al menos 17 átomos de carbono, al menos 3 átomos de oxígeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; y que tiene al menos de uno de los siguientes: (i) un peso molecular de aproximadamente 275-435; (ii) valores de d en RMN^H de 8.44, 8.74, 8.19, 7.47, 7.31, 3.98, 2.82, 2.33, 1.08; (iii) valores de d en R N-13C de 163.7, 161.2, 154.8, 136.1, 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 111.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1, 22.7 , 22.7; (iv) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-20 minutos en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (CH3CN) y detección UV a 210 nra; (v) bandas de absorción UV a aproximadamente 226, 275, 327 nm. ; (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 átomos de carbono y al menos 2 átomos de oxígeno, al menos 2 átomos de nitrógeno; y al menos una de las siguientes características: (i) un peso molecular de aproximadamente 240-290 determinado por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (ii) valores de d en RMN^H en aproximadamente 7.08, 7.06, 6.75, 3.75, 2.56, 2.15, 0.93, 0.93; (iii) valores de d en RMN-13C de 158.2, 156.3, 155.5, 132.6, 129.5, 129.5, 127.3, 121.8, 115.2, 115.2, 41.2, 35.3, 26.7, 21.5, 21.5; (iv) a cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) tiempo de retención de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua ¡acetonitrilo (CH3CN) y (v) bandas de absorción UV a aproximadamente 230. 285, 323 nm; (C) un compuesto sin epóxidos que comprende al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos ' metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono, al menos ocho átomos de oxígeno y un átomo de nitrógeno y al menos una de las siguientes características: (i) un peso molecular de aproximadamente 530-580 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM); (ii) Los valores de 5 en RM -^ de 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81, 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04; (iii) valores de d en RMN-13C de 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71, 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11, 14.90, 12.81, 9.41; (iv) a tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (CH3CN) y detección UV a 210 nm; (v) una fórmula molecular de C28H 5NO10 que se determinó por interpretación del análisis de los datos de ESIMS y RMN; (vi) bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm; (D) un compuesto que comprende (i) al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno y al menos 1 átomo de nitrógeno, (ii) 13C RMN valores de d174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41, 98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45, 31.67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04, (iii) una fórmula molecular de C28H 3NO9 y al menos uno de: (a) valores de d en RMN-1!! en aproximadamente 6.41, 6.40, 6.01, 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81, 1.76, 1.42, 1.38, 1.17, 1.12, 1.04; (b) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (c) banda de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm y más particularmente a aproximadamente 234 nm.
En una modalidad de realización más particular, proporciona compuestos qu incluyen pero sin limitación: (A) un compuesto que tiene la estructura ##STR001## o una de sus sales o estereoisómeros aceptable para uso como pesticida, donde M es 1, 2, 3 o 4; n es 0, 1, 2, o 3 ; p y q son de modo independiente 1 o 2; X es 0, NH o NR; Rl, R2 y R3 son iguales o diferentes y de modo independiente un residuo de aminoácido de cadena lateral o un derivado de aminoácido de cadena lateral y R es un residuo alquilo, arilo o arilalquilo de cadena corta; (B) un compuesto que tiene la estructura ##STR002## ##STR002## donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -0, -NRi, o -S, donde Ri es -H o alquilo C1-C1O; Ri, R2 y m son cada uno de modo independiente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo y "m" se puede ubicar en cualquier parte sobre el anillo oxazol; (C) un compuesto que tiene la estructura ##STR002a##. en donde Ri es -H o alquilo C1-C10; 2 es un éster alquilico; (D) un compuesto que tiene la estructura ##STR003## ##STR003## en donde: X y Y son cada uno de modo independiente -OH, -NRi , o -S, donde Ri es -H o alquilo C1-C10 ; Ri , 2 y m, un sustituyente del anillo oxazol, son cada uno de modo independiente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo , cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
(E) un compuesto que tiene la estructura ##STR003a## ##STR003a## en donde Ri es -H o alquilo C 1 - C 10 ; (F) un compuesto que tiene la estructura ##STR004a## en donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -0, -NR, o -S, dondé R es H o alquilo C1-C10; Ri, R2/ R3, R4, R5, R6, R7, Re, R9, Rio, R11, R12, y R13 son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo .
(G) un compuesto que tiene la estructura ##STR004b## en donde Ri, R2, R3, R , R5, Re, R7, Rs, Rg, Rio, R11, R12, y R13 son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfoni'lo, sulfonamida, o sulfurilo; (H) un compuesto que tiene la estructura ##STR004c## en donde Ri, R2, R3, R , R5, R6, R7, Rs, R11, son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (I) un compuesto que tiene la estructura ##STR005## ##STR005## en donde X e Y son cada uno de modo independiente -OH, -NRi, o -S, donde Ri, R2 son 'cada uno de modo independiente -H, alquilo (por ejemplo, alquilo C1-C10) , alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o suifurilo; (J) un compuesto que tiene la estructura ##STR006a## en donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -0, -NR, o -S, donde R es H o alquilo C1-C10; Ri, R2, R3, , 5, 6, T, R8, R11, Ri2r y R13 son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C (0) H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad de realización más particular, los compuestos pueden incluir pero sin limitación (i) templazol A; ( ii ) temp1azo1 B ; (iii) templamida A; (iv) templamida B; (v) FR901228; (vi) (viii) (xvi) I ix) (xxii ) (xl) FR901465; (xli) F8H17, un compuesto activo de la fracción F8, al que se ha asignado un peso molecular de 1080 sobre la base del pico de ion molecular en 1081.75 ( + H) en modo positivo de ESI y también se confirmó por el ESIMS negativo con pico base en 1079.92. Este compuesto mostró absorción UV en 234 nm.
En un aspecto relacionado, se describe un método para modular la proliferación y/o el crecimiento de una plaga (por ejemplo, algas, arácnidos, nematodos, insectos, hongos) que comprende aplicar en una localización donde se desea una modulación de proliferación y/o crecimiento de una plaga (por ejemplo, algas, arácnidos, nematodos, insectos, hongos) una cantidad de (I) ' (a) los compuestos aislados expuesto anteriormente y (b) opcionalmente otra sustancia, donde dicha sustancia es un alguicida o (II) la composición o combinación expuesta anteriormente en una cantidad efectiva para modular la proliferación y/o el crecimiento de la plaga en dicha localización.
En otro aspecto relacionado, se describe un método para modular la proliferación y/o el crecimiento de algas y/o modular la infestación con plagas en una planta y/o un método para modular la aparición y/o crecimiento de malezas monocotiledóneas , juncos o dicotiledóneas que comprende aplicar en una localización donde se desea la modulación de la proliferación y/o el crecimiento de algas y/o modulación de la infestación de un arácnido y/o modulación de la aparición y/o el crecimiento de dicha maleza una cantidad de (A) la formulación expuesta anteriormente o sustancia efectiva como pesticida derivada de esta; (B) la combinación expuesto anteriormente; (C) templamida A; (D) templamida B; (E) FR901465; (F) FR901228 efectiva para modular dicah proliferación y/o crecimiento de algas y/o infestación con plagas y/o aparición o crecimiento de malezas monoc'otiledóneas , juncos o dicotiledóneas 'en dicha localización. La infestación con nematodos y/o insectos se modula con templamida A, templamida B,- FR901465 y/o FR901228. En una modalidad de realización más particular, se modulan la infestación de insectos, específicamente Oncopeltus sp. (por ejemplo, 0. fasciatus) y/o Lygus sp. y/o nematodos de vida libre y/o nematodos parasitarios (por ejemplo, M. incógnita) .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la comparación de la tasa de crecimiento de Burkholderia A396 con Burkholderia multivorans ATCC 17616.
La Figura 2 muestra el esquema general usado para obtener fracciones de MBI-206 formulada.
La Figura 3 muestra el esquema general usado para obtener fracciones y los compuestos de un cultivo de MBI-206.
La Figura 4 muestra las actividades insecticidas (chupadores) de los compuestos analizados contra chinches (Oncopeltus fasciatus) .
La Figura 5 muestra las actividades insecticidas (ingestión) de los compuestos puros contra Lygus Hesperus.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Si bien las composiciones y métodos de aqui en adelante son susceptibles para diversas modificaciones y formas alternativas, en la presente invención se describirán en detalle ejemplos de modalidades de realización. Se debe entender, sin embargo, que no existe intento de limitar la invención a las modalidadess particulares descritas, sino que por el contrario, la intención es cubrir todas modificaciones, equivalentes, y alternativas que se incluyen dentro del espíritu y alcance de la invención definido por las reivindicaciones anexas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor interviniente , a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto establezca claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de este intervalo y cualquier otro valor indicado o interviniente en este intervalo indicado, se incluye en la presente invención. Los intervalos más pequeños también se incluyen. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños también se incluyen en la presente invención, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados én la presente invención tienen el mismo significado que son comúnmente entendidos por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Si bien cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente invención también se pueden usar en la práctica o análisis de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
Cabe mencionar que como se usa en la presente invención y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" "y" y "el/la" incluyen las referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se define en la presente, "derivado de" significa aislado u obtenido directamente de una fuente particular o alternativamente que tiene características de identificación de una sustancia u organismos aislado u obtenido de una fuente particular.
Como se define en la presente invención, un "compuestos aislado" está esencialmente libre de otros compuestos o sustancias, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% puro, con preferencia al menos aproximadamente 40% puro, con más preferencia aproximadamente 60% puro, aun con más preferencia aproximadamente 80% puro, con máxima preferencia aproximadamente 90% puro, y aún con máxima preferencia áproximadamente 95% puro, determinado 'por métodos analíticos, que incluyen pero sin limitación métodos cromatográficos , métodos electroforéticos .
Como se usa en la presente invención, el término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarbonado de cadena lineal o ramificada monovalente que tiene de uno a aproximadamente 12 átomos de carbono, que incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, ter-butilo, n-hexilo, y similares.
Como se usa en la presente invención, "alquilo sustituido" se refiere a grupos alquilo que también portan uno o más sustituyentes seleccionados de hidroxi, alcoxi, mercapto, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido, halógeno, ciano, nitro, amino, amido, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carboxilo, sulfonilo, sulfonamida, sulfurilo, y similares .
Como se usa en la presente invención, "alquenilo" se refiere a grupos hidrocarbilo de cadena lineal o ramificada que tienen uno o más enlaces doble carbono-carbono, y que tiene en el intervalo de aproximadamente 2 hasta 12 átomos de carbono, y "alquenilo sustituido" se refiere los grupos alquenilo que también portan uno o más sustituyentes expuestos anteriormente.
Como se usa en la presente invención, "alquinilo" se refiere a a grupos hidrocarbilo de cadena lineal o ramificada que tienen uno o más enlaces triple carbono-carbono, y y que tiene en el intervalo de aproximadamente 2 hasta 12 átomos de carbono, "alquinilo sustituido se refiere a grupo alquinilo que también portan uno o más sustituyentes expuestos anteriormente .
Como se usa en la presente invención, "arilo" se refiere a grupos aromáticos que tienen en el intervalo de 6 hasta 14 átomos de carbono y "arilo sustituido" se refiere a grupos arilo que también portan uno o más sustituyentes expuestos anteriormente .
Como se usa en la presente invención, "heteroarilo" se refiere a anillos aromáticos que contienen uno o más heteroátomos (por ejemplo, N, O, S, o similares) como parte de esta estructura anular, y que tiene en el intervalo de 3 hasta 14 átomos de carbono y "heteroarilo sustituido" se refiere grupos heteroarilo que también portan uno o más sustituyentes expuestos anteriormente.
Como se usa en la presente invención, "alcoxi" se refiere al residuo -O-alquilo-, donde alquilo es como se definió anteriormente, y "alcoxi sustituido" se refiere grupos alcoxilo que también portan uno o más sustituyentes expuestos anteriormente.
Como se usa en la presente invención, "tioalquilo" se refiere al residuo -S-alquilo-, donde alquilo es como se definió anteriormente, y "tioalquilo sustituido" se refiere a grupos tioalquilo que también portan uno o más sustituyentes expuestos anteriormente.
Como se usa en la presente invención, "cicloalquilo" se refiere grupos alquilo que contiene un anillo en el intervalo de aproximadamente 3 hasta 8 átomos de carbono, y "cicloalquilo sustituido" se refiere a grupos cicloalquilo que también portan uno o más sustituyentes expuestos anteriormente .
Como se usa en la presente invención, "heterociclo" , se refiere a grupos cíclicos (es decir, que contienen un anillo) que contienen uno o más heteroátomos (por ejemplo, N, O, S, o similares) como parte de la estructura anular, y que tiene en el intervalo de 3 hasta 14 átomos de carbono y "heterociclo sustituido" se refiere a grupos heterociclos que además portan uno o más de los sustituyente expuestos anteriormente.
Como se usa en la presente invención "algas" se refiere a alguno de los diversos organismos principalmente acuáticos, eucarióticos , fotosintéticos , que varían de tamaño desde formas unicelulares a la kelp gigante. El término también se puede referir protistas fotosintéticos responsables de mayor parte de la fotosíntesis en la tierra. Como grupo, las algas son polifiléticas . Por consiguiente, el término se puede referir a cualquier protista considerado como algas de los siguientes grupos, alveoladas, chloraraachniophytes , criptomonadas , euglenoides, glaucofitas, haptofitos, algas rojas tales como Rhodophyta, stramenopiles , y viridaeplantae . El término se refiere las algas verde, amarillo verdoso, marrón, y rojo en los eucariotas. El término también se puede referir a las cianobacterias de los procariotas. El término también se refiere a algas verdes, algas azules, y lagas ro as .
Como se usa en la presente invenció "alguicida" se refiere a uno o más agentes, compuestos y/o composiciones que tienen actividad alguistática y/o alguicida.
Como se usa en la presente invención "alguicida" como se usa en la presente significa la muerte de las algas.
Como se usa en la presente invención "alguistático" como se usa en la presente significa que inhibe el crecimiento de algas, lo que puede ser reversible en ciertas condiciones.
Cepa Burkholderia La cepa Burkholderia descrita en la presente invención un complejo de Burkholderia cepacia no específica Burkholderia plantari no específica, Burkholderia gladioli no específica, Burkholderia sp y no patogénica para los vertebrados tales como aves, mamíferos y peces. Esta cepa se puede aislar de una muestra de suelo utilizando procedimientos conocidos en la en la técnica y descriptos por Lorch et al., 1995. La cepa Burkholderia se puede aislar de muchos tipos celulares diferentes de suelo o medio de crecimiento. La muestra luego se siembra en agar de dextrosa de papa (PDA) . Las bacterias son gram negativas, y forman colonias redondas, color crema opacas que cambian a color rosa y marrón rosado, y de consistencia mucoide o viscosa con el tiempo.
Las colonias se aislan de las placas de agar dextrosa de papa y se analizan para determinar las que tienen características biológicas, genéticas, bioquímicas y/o enzimáticas de la cepa Burkholderia de la presente invención expuesta en los siguientes Ejemplos. En particular, la cepa Burkholderia tiene un gen de ARNr 16S que comprende una secuencia directa que es al menos aproximadamente 99.5%, con más preferencia aproximadamente 99.9% y con máxima preferencia aproximadamente 100% idéntica con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 8, 11 y 12 y una secuencia directa que es al menos aproximadamente 99.5%, con más preferencia aproximadamente 99.9% y con máxima preferencia aproximadamente 100% identical con la secuencia mostrada en ¦la SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14 y 15 determinado por análisis clustal. Además, como se expone a continuación, esta cepa Burkholderia , como se expone a continuación, puede tener actividad pesticida, particularmente, viricida, herbicida, germicida, fungicida, nematicida, bactericida e insecticida y más particularmente, actividad herbicida, alguicida, acaricida, insecticida, fungicida y nematicida. No es patogénica para los animales vertebrados, tales como mamíferos, aves y peces.
En forma adicional, la cepa de Burkholderia produce al menos los compuestos pesticidas establecidos en la presente descripción .
La cepa de Burkholderia es sensible a kanamicina, cloranfenicol , ciprofloxacin, piperacilina , imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprima y contiene los ácidos grasos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3- OH, 14:0, ciclo 19:0, 18:0.
Esta cepa de Burkholderia se puede obtener por el cultivo de un microorganismo que tiene las características de identificación de Burkholderia A396 (No. de acceso NRRL B-50319) en agar dextrosa y papa (PDA) o en un medio de fermentación que contiene fuentes de carbono definidas, tales como glucosa, maltosa, fructosa, galactosa, y fuentes de nitrógeno no definidas tales como peptona, triptona, soytone, y N-Z-a'mine.
Compues tos alg icidas y acariciólas Los compuestos alguicidas y acaricidas descriptos en la presente pueden tener las siguientes propiedades: (a) se pueden obtener de una nueva especie de Burkholderia , por ejemplo, A396; (b) es, en particular, tóxica para las plagas de insectos agrícolas más comunes; (c) tiene un peso molecular de aproximadamente 525-555 y más particularmente, 540 determinado por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (d) tiene valores de desplazamiento en RMN-¾ de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (d) tiene valores de dezplamiento en RMN-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 (e) tiene un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, más específicamente aproximadamente 12 minutos y aun más específicamente aproximadamente 12.14 min en una columna C-18 de HPLC de fase reversa ( Phenomenex, Luna 5µ C18 (2) 100A, 100 x 4.60 mm) utilizando un gradiente como sistema disolvente de agua : acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min 90-0% de CH3CN acuoso, '20-24 min 100% de CH3CN, 24-27 min,' 0-90% de CH3CN acuoso, 27-30 min 90% de CH3CN acuoso) con un velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV a 210 nm (f) tiene una fórmula molecular, C2 H36N406S2 , que se determina por la interpretación de los datos de RMN-XH, 13C y CL/EM (g) un espectro de RMN-13C con señales para los 24 átomos de carbono, que incluyen 5 metilos, 4 metilenos, 9 metinos y 6 átomos de carbono cuaternarios y (g) el espectro de RMN-1!! que exhibe características de un depsipéptido típico, que ilustra tres protones de amina [4.63, 4.31, 3.93], y un protón del éster carbinol [5.69] . En una modalidad de realización particular, el compuesto tiene la estructura ##STR001##: O una de sus sales o estereoisómeros aceptables para uso como pesticida donde M es 1, 2, 3 o 4; n es 0, 1, 2, o 3; p y q son de modo independiente 1 o 2; X es O, NH o NR; Rl, R2 y R3 son iguales o diferentes y de modo independiente un residuo de aminoácido de cadena lateral o un derivado de aminoácido de cadena lateral de aminoácido y R es un residuo alquilo, arilo o arilalquilo de cadena corta.
En una modalidad de realización aun más particular, el compuesto tiene la estructura de FR901228: En la presente se proporcionan los compuestos expuestos en ##STR002##: ##STR002## en donde: X, Y y Z son cada uno de modo independiente -0, -NRi, o -S, donde Ri es -H o alquilo C1-C10; Ri, R2 y m son cada uno de modo independiente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida , o sulfurilo.
En aun otra modalidad de realización particular, los compuestos de la Familia ##STR002## puede ser los compuestos expuestos en (vi) - (xix) . (viii) (XÜ) Ixv) (xviii ) Estos provienen de materiales naturales o compuestos obtenidos de fuentes comerciales o por síntesis química. Las fuentes naturales de la Familia de compuestos ##STR002## incluyen, pero sin limitación, microorganismos, algas, y esponjas. En una modalidad de realización más particular, los microorganismos que incluye la Familia de compuestos ##STR002## incluyen pero sin limitación, o alternativamente, la Familia de compuestos #STR002## se puede derivar de especies tales como Streptoverticillium waksmanii (compuesto vi) (Umehara, et al., 1984) , Streptomyces pimprina (compuesto vii) (Naiket al., 2001), Streptoverticillium olivoreticuli (compuestos viii, ix, x) (Koyama Y., et al., 1981), Streptomyces sp (compuestos xi, xii) (Watabe et al., 1988), Pseudomonas syringae (compuestos xiii, xiv) (Pettit et al., 2002) . La Familia de compuestos ##STR002## también puede derivar de algas que incluyen pero sin limitación alga roja (compuesto xv) (N'Diaye, et al., 1996) , alga roja Martensia fragilis (compuesto xvi) (Takahashi S. et al., 1998), Diazona chinensis (compuestos xvii & xviii) (Lindquist N. et al., 1991), Rhodophycota haraldiophillum sp (compuesto xix) (Guella et al . , 1994 ) .
También se proporciona ##STR003##: donde: X e Y son cada uno de modo independiente -OH, -NRi, o -S, donde Ri es -H o alquilo Ci-Ci0; Ri, R2 y m, un sustituyente del anillo oxazol, son cada uno de modo independiente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acil'o, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
También se proporciona ##STR005##: en donde X e Y son cada uno de modo independiente -OH, -NRi, o -S, donde Ri, R2 son cada uno de modo independiente -H, alquilo (por ejemplo, alquilo C1-C10) , alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad de realización particular, la Familia de compuestos ##STR005## tales como compuestos de xx-xxiii que se exponen a continuación pueden derivar de fuentes naturales o comerciales o por síntesis química. (xx) ( xi) ( ( Las fuentes naturales de la Familia de compuestos ##STR005## incluyen, pero sin limitación plantas, corales, microorganismos, y esponjas. Los microorganismos incluyen, pero sin limitación Streptomyces griseus (compuesto xx) (Hirota et al., 1978), Streptomyces albus (compuesto xxi) (Werner et al., 1980) . La Familia de compuestos STR004 también se pueden derivar de las algas que incluyen pero sin limitación Háraldiophillum sp (compuesto xxii (Guélla et al., 2006), y algas rojas (compuesto xxiii) (N' Diaye et al., 1994) .
En una modalidad de realización, el compuesto se puede derivar o se puede obtener de un microorganismo, y en particular de la especie Burkholderia y se caracteriza por tener una estructura que comprende al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono y al menos ocho oxigeno y un átomo de nitrógeno. El compuesto también comprende al menos una de las siguientes características: (a) propiedades pesticidas y en particular, propiedades nematicidas, fungicidas, insecticidas, acaricidas, alguicidas y herbicidas; (b) un peso molecular de aproximadamente 530-580 y más particularmente, 555 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (c) valores de d en RMN-1H de 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81, 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04; (d) valores de d en RMN-13C de 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71, 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11, 14.90, 12.81, 9.41; (e) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, más específicamente aproximadamente 10 minutos e incluso más específicamente aproximadamente 10.98 min en una columna C-18 de HPLC de fase reversa ( Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) utilizando un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90% de CH3CN acuoso, 27- 30 min; 90% de CH3CN acuoso) con un velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV a 210 nm; (f) el espectro RMN-13C que exhibe 28 señales de carbono diferenciadas que se pueden atribuir a seis metilos, cuatro átomos de carbono de metileno, y trece metinos que incluyen cinco carbonos sp , cuatro átomos de carbono cuaternarios; (g) una fórmula molecular de C28H45 O10 que se determinó por interpretación del análisis de los datos de ESIMS y RMN; (h) bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm y más particularmente a aproximadamente 234 nm.
También se proporcionan compuestos que tiene la estructura ##STR004a##: en donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -0, -NR, o -S, donde R es H o alquilo Ci-Cio; Ri, R2, R3, , R5, 6, R7, R8, R9, Rio, R12, y R13 son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo .
En una modalidad de realización particular, el compuesto tiene la estructura mostrada en ##STR004b##: R OR| en donde Rlr R2, R3, R4, R5, Re, R7 , Rs, Rg, Rio, R11, R12, Y R13 son como se definieron previamente para ##STR004a##! En una modalidad de realización más particular, el compuesto es Templamida A con la siguiente estructura: Templamida A En otra modalidad de realización, se proporciona un compuesto que tiene la fórmula ##STR004c##: en donde Ri, R2, R3, R4, R5, R6, 7, Ra, y R11 son como se definieron previamente para ##STR004a##.
En otra modalidad de realización, se proporciona un compuesto que se puede derivar de la especie Burkholderia species y que se caracteriza por tener una estructura que comprende al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono y al menos 8 oxigeno y 1 átomo de nitrógeno, y actividad pesticida. El compuesto también comprende al menos una de las siguientes características : (a) propiedades pesticidas y en particular, propiedades insecticidas, fungicidas, nematicidas, acaricidas, alguicidas y herbicidas; (b) un peso molecular de aproximadamente 520-560 y particularmente 537 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/E ) ; (c) valores de d en RMN-1!! de aproximadamente 6.41, 6.40, 6.01, 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81, 1.76, 1.42, 1.38, 1.17, 1.12, 1.04; (d) valores de d en RMN-13C de 174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41, 98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45, 31.67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04; (e) tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) , particularmente, un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 8-15 minutos, más específicamente aproximadamente 11 minutos y aun más específicamente aproximadamente 11.73 min en "una columna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) utilizando un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0 - 90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) con un velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV a 210 nm; (f) una fórmula molecular de C28H43NO9 que se determinó por interpretación del análisis de los datos de ESIMS y RMN; (g) bandas de absorción UV a aproximadamente 210-450 nm y más particularmente a aproximadamente 234 nm.
En una modalidad de realización particular, el compuesto tiene la estructura ##STR006a##: en donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -0, -NR, o -S, donde R es H o alquilo C1-C10; Ri, R2, R3, R4, R5, R6 Ri, Ra, R11, R12, y R13 son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido,' heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad de realización particular, el compuesto tiene la estructura: TemplamiclaA En otra modalidad de realización, se proporciona un compuesto que tiene la fórmula ##STR006b##: en donde Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs, y R11 son como se definieron previamente para ##STR006a##.
En una modalidad de realización más particular, el compuesto es Templamida B con la siguiente estructura: Templamida B En aun otra modalidad de realización particular, el compuesto se puede derivar de la especie Burkholderia y que se caracteriza por tener una estructura que comprende al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono y al menos 8 oxígeno y al menos 1 átomo de nitrógeno. El compuesto también comprende al menos una de las siguientes características: (a) propiedades pesticidas y en particular, propiedades insecticidas, fungicidas, acaricidas, nematicidas, alguicidas y herbicidas; (b) un peso molecular de aproximadamente 510-550 y particularmente aproximadamente 523 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (c) valores de d en RMN^H de aproximadamente 6.41, 6.40, 6.01, 5.98, 5.68, 5.56, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.65, 3.59, 3.55, 3.50, 2.44, 2.26, 2.04, 1.96, 1.81, 1.75, 1.37, 1.17, 1.04; ' (d) valores de d en R N-13C de 172.22, 167.55, 144.98, 138.94, 135.84, 130.14, 125.85, 123.37, 99.54, 82.19, 78.28, 76.69, 71.31, 70.13, 69.68, 48.83, 42.52, 36.89, 33.11, 30.63, 25.99, 21.20, 20.38, 18.14, 14.93, 12.84; (e) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) , particularmente, un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 8-15 minutos, más específicamente aproximadamente 10 minutos y even más específicamente aproximadamente 10.98 min en una columna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) utilizando un gradiente con sistema disolvente de agua:acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0 - 90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) con un velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV a 210 nm; (f) una fórmula molecular de C27H41NO9 que se determinó por interpretación del análisis de los datos de ESIMS y RMN; (g) bandas de absorción UV a aproximadamente 210-450 nm y más particularmenté a aproximadamente 234 nm.
En una modalidad de realización más particular, el compuesto es un compuesto conocido FR901465 que se aisló primero del caldo de cultivo de una bacteria de Pseudomonas sp. No. 2663 (Nakajima et al. 1996) y se ha informado que tiene actividad anticáncer con la siguiente estructura: FR901 65 En aun otra modalidad de realización particular, los compuestos de la Familia ##STR006a## pueden ser los compuestos expuestos de xxiv a xxxix. Estos provienen de materiales naturales o compuestos obtenidos de fuentes comerciales o por síntesis química. Las fuentes naturales de los compuestos de la Familia ##STR006a## incluyen, pero sin limitación, microorganismos, algas, y esponjas. En una modalidad de realización más particular, los microorganismos incluyen los compuestos de la Familia ##STR006a## que se pueden derivar de especies tales como Pseudomonas sp. No. 2663 (compuestos xxiv-xxvi) (Nakajima et al., 1996), los análogos sintéticos del FR901464 (xxv i-xxxix) se han sintetizado y patentado como compuestos anticáncer (ver Koide et al., solicitud de patenté US No. 2008/0096879 Al) .
También se proporcionan los compuestos pesticidas producidos por la formulación expuesta anteriormente que comprende al menos una de las siguientes características: (a) tiene propiedades pesticidas y en particular, propiedades herbicidas, insecticidas, nematicidas y fungicidas ; (b) tiene un peso molecular de aproximadamente 210-240 y más particularmente, 222 determinado por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (e) tiene valores de desplazamiento en RMN-1!! de d 7.90, 6.85, 4.28, 1.76, 1.46, 1.38, 1.37, 0.94; (d) tiene valores de desplazamiento en RMN-13C de 166.84, 162.12, 131.34 (2C), 121.04, 114.83 (2C), 64.32, 31.25, 28.43, 25.45, 22.18. 12.93; (e) tiene un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 15-20 minutos, más específicamente aproximadamente 17 minutos y aun más específicamente aproximadamente 17.45 min en una columna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) utilizando un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (CH3CN) (0-20 min; 90 - 0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0-90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso) con un velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV a 210 nm; (f) El espectro de RMN-13C exhibió 13 señales de carbono diferenciadas que se atribuyeron a un metilo, cinco átomos de carbono de metileno, cuatro metinos, y tres átomos de carbono cuaternarios; (g) tiene una fórmula molecular de Ci3His03 que se determinó por interpretación del análisis de los datos de ESIMS y RMN; (h) tiene bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm y más particularmente a aproximadamente 248 nm.
También se proporcionan compuestos que tienen la estructura que se muestra a continuación en donde X, es de modo independiente -O, -NR, o -S, donde R es H o alquilo Ci-Cio; Ri, R2, R3? Rir Rs y e son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heter'ociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad de realización más particular, el compuesto es butil parabeno con la siguiente estructura: En una modalidad de realización más particular, compuesto es hexil parabeno con la siguiente estructura: En una modalidad de realización más particular, el compuesto .es octil parabeno con la siguiente estructura: En aún otra modalidad de realización, el compuesto es F7H18, queh tiene un peso molecular de aproximadamente 1080.
Composiciones Un cultivo, fracción celular o sobrenadante y compuestos sustancialmente puros producidos por la cepa Burkholderia descripta en la presente, los cuales se denominan en modalidad alternativa como "ingredientes activos", se pueden formular en composiciones pesticidas. En una modalidad de realización particular, el sobrenadante puede ser un sobrenadante libre de células.
Los ingredientes activos expuestos anteriormente se pueden formular de cualquier manera. Los ejemplos de formulación limitantes incluyen pero sin limitación concentrados emulsionables (EC) , polvos humectables (WP) , líquidos solubles (SL), aerosoles, soluciones del concentrado de volumen ultra bajo (ULV) , polvos solubles (SP), microencapsulación, gránulos dispersos en agua, fluidos (FL), microemulsiones (ME), nano-emulsiones (NE) , polvos, emulsiones, líquidos, escamas, etc. En cualquier formulación descripta en la presente, el porcentaje de ingrediente activo está dentro de un intervalo de 0.01% a 99.99%.
Se puede preparar una composición sólida por la suspensión de un portador sólido en una solución de compuestos pesticidas y secado de la suspensión en condiciones moderadas, tales como evaporación a temperátura ambiente o evaporación al vacio a 65°C o menor. En modalidad alternativa, una composición sólida se puede derivar por medio de secado por aspersión o secado por congelación.
Cuando se hace referencia a las composiciones sólidas, los expertos en la técnica deben entender que las formas físicas tales como espolvoreados, perlas, polvos, particulados, pellets, comprimidos, aglomerados, gránulos, sólidos flotantes y se incluyen otras formulaciones sólidas. Los expertos en la técnica podrán optimizar fácilmente una formulación sólida particular para una aplicación determinada utilizando métodos bien conocidos en la técnica.
La composición puede comprender compuestos encapsulados en gel derivados de la cepa de Burkholderia expuesta anteriormente. Tales materiales encapsulados en gel se pueden preparar por la mezcla de un agente formador de gel (por ejemplo, gelatina, celulosa, o lignina) con una solución de compuestos alguicidas y la inducción de la formación de gel del agente.
La composición adicíonalmente puede comprender un tensioactivo para usar con el fin de emulsión, dispersión, humectación, extensión, integración, control de desintegración, estabilización de ingrediente activos, y mejora de la fluidez o inhibición de herrumbre. En una modalidad de realización particular, el tensioactivo es un tensioactivo no iónico fitotóxico con preferencia que pertenece a EPA Lista 4B. En otra modalidad de realización particular, el tensioactivo no iónico es monolaurato de polioxietileno (20) . La concentración de tensioactivo puede variar entre 0.1-35% de la formulación total, el intervalo preferido es 5-25%. La elección de agentes de dispersión y emulsión, tales como agentes de dispersión y emulsión no iónico, aniónico, anfotérico y catiónico, y la cantidad empleada determinada por la naturaleza de la composición y la capacidad del agente para facilitar la dispersión de estas composiciones .
A fin de proporcionar las composiciones que contienen los ingredientes activos expuestos anteriormente en la forma de polvos, gránulos, polvos dispersables en agua, dispersiones acuosas, o emulsiones y dispersiones en líquidos orgánicos, el agente portador o diluyente en tales composiciones pueden ser un sólido finamente dividido, un líquido orgánico, agua, un agente humectante, un agente dispersante, agente humectante, o agente emulsionante, o cualquier combinación de estos. En general, cuando se preparan líquidos y polvos humectables, un agente acondicionador que comprende uno o más agentes activos en superficie o tensioacti os está presente en cantidades suficientes para producir una composición determinada que contiene el material activo, el microorganismo, dispersable en agua o aceite.
Debido a que estas composiciones se pueden aplicar como un spray que utiliza un portador líquido, se contempla una amplia variedad portadores líquidos tales como, por ejemplo, agua, disolventes orgánicos, decano, dodecano, aceites aceites vegetales, aceite mineral, alcohol, glicol, polietilenglicol , agentes que producen una distribución diferencial de bacterias patogénicas en el agua que se está tratando. Se pueden usar combinaciones de estos y otras conocidas por los profesionales expertos.
Las presentes composiciones también pueden incluir otras sustancias que no son per udiciales para el ingrediente activo tales como adyuvantes, tensioactivos , aglutinantes, estabilizantes y similares, que se usan comúnmente en alguicidas, en forma individual o en combinación, según sea necesario .
Los expertos en la técnica entenderán que varios aditivos o agentes que predisponen a plagas sensibles al ingrediente activo expuesto anteriormente se añaden para aumentar su acción pesticida. Por la frase "aditivo que aumenta la acción pesticida del ingrediente activo" se entiende cualquier compuesto, disolvente, reactivo, sustancia, o agente que aumenta el efecto del ingrediente activo hacia las plagas y más particularmente, los ácaros en comparación con el efecto pesticida del ingrediente activo en ausencia de dicho aditivo. En algunas modalidads de realización, estos aditivos aumentarán la susceptibilidad de una plaga particular al ingrediente activo. Los aditivos adicionales incluyen pero sin limitación agentes que debilitan las defensas biológicas de las plagas susceptibles. Tales agentes pueden incluir sales, tales como NaCl y CaCl2.
La composición también puede comprender otro microorganismo y/o pesticida (por ejemplo, nematicida, fungicida, insecticida, herbicida, alguicida, acaricida) . El microorganismo puede incluir pero sin limitación a un agente derivado de Bacillus sp., Pseudomonas s . , Brevabacillus sp . , Lecanicillium sp., no ñmpelomyces sp . , Pseudozyma sp., Streptomyces sp, Burkholderia sp, Trichoderma sp, Gliocladiu sp . En forma alternativa, el agente puede ser un aceite natural o producto oleoso que tiene actividad fungicida, herbicida, acaricida, alguicida, nematicida y/o insecticida (por ejemplo, aceite parafinico, aceite de árbol de té, aceite de lemongrass, aceite del clavo, aceite de canela, aceite de citrus, aceite de romero) .
La composición, en particular, también puede comprender un insecticida. El insecticida puede incluir, pero sin limitación avermectina, Bacillus thuringiensis, aceite de neem y azadiractina, espinosad, Chromobacterium subtsugae, extracto de eucalyptus, bacterias entomopatogénicas u hogos tales como Beauveria bassiana , y Metarrhizium anisopliae e insecticidas químicas que incluyen pero sin limitación compuestos organoclorado, compuestos organofosforados , carbamatos, piretroides, y neonicotinoides .
La composición también puede comprender un nematicida.
Los nematicidas pueden incluir, pero sin limitación nematicidas químicos tales como fenamifos, aldicarb, oxamilo, carbofurano, producto nematicida natural, avermectina, los hongos Paecilomyces lilacinas y Muscodor spp. , las bacterias Bacillus fírmus y otros Bacillus spp. y Pasteuria penetrans .
La composición también puede comprender un biofungicida tal como extracto de R. sachalinensis (Regalía) o un fungicida. Tales fungicidas incluyen, pero sin limitación, un agente antifúngico de sitio único que puede incluir pero sin limitación a bencimidazol , un inhibidor de desmetilación (DMI) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimidina, triazol) , morfolina, hidroxipirimidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inhibidor externo de quinona, quinolina, dicarboximida , carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarburo aromático, ácido cinámico, hidroxianilida, antibiótico, poliamina, calamina, ftalimida, benzenoid (xililalanina) . En aún otra modalidad de realización, el agente antifúngico es un inhibidor de desmetilación seleccionado del grupo que consiste en imidazol (por ejemplo, triflumizol ) , piperazina, pirimidina y triazol (por ejemplo, bitertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol , triadimefon, bromuconazol , ciproconazol , diniconazol, fenbuconazol , hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol, propiconazol).
El agente antimicrobiano también puede ser un fungicida químico, no inorgánico multisitio seleccionado del grupo que consiste en un nitriloe (por ejemplo, cloronitrilo o fludioxonilo) , quinoxalina, sulfemida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquiltios , fenilpiridin-amina , ciano-acetamida oxima.
Las composiciones se pueden aplicar utilizando métodos conocidos en la técnica. En forma específica, estas composiciones se pueden aplicar a las plantas o partes de planta. Se entiende que las plantas significan en el presente contexto todas las plantas y poblaciones de plantas (tales como plantas salvajes deseadas y no deseadas o plantas de cultivo (que incluyen las plantas de cultivo naturales) . Las plantas de cultivo pueden ser plantas que se pueden obtener por métodos de reproducción y optimación de plantas convencionales o por métodos biotecnológicos y de ingeniería genética o por combinaciones de estos métodos, que incluyen las plantas transgénicas y que los cultivares de plantas protegibles o no protegibles por los derechos del cultivador. Se entiende que las partes de plantas significan todas las partes y órganos de las plantas por encima y debajo de la tierra, tal como brote, hoja, flor y raíz, ejemplos de los cuales se pueden mencionar hojas, agujas, tallos, vástagos, flores, cuerpos del frutos, frutos, semillas, raíces, tubérculo y rizomas. Las partes de planta también incluyen material cosechado, y material de propagación vegetativo y generativo, por ejemplo, esquejes, tubérculos, rizomas, retoños y semillas.
El tratamiento de las plantas y partes de planta con las composiciones expuestas anteriormente se puede realizar directamente o dejando que las composiciones actúen en sus alrededores, hábitat o espacio de almacenamiento, por ejemplo, por inmersión, aspersión, evaporación, nebulización, dispersión, pintura, inyección. En el caso de que la composición se aplique a una semilla, la composición se puede aplicar a la semilla como una o más capas antes de plantar la semilla utilizando una o más capas mediante métodos conocidos en la técnica.
Como se indicó antes, las composiciones pueden ser composiciones herbicidas. La 'composición también puede comprender uno o más herbicidas. Estos pueden incluir, pero sin limitación, un bioherbicida y/o un herbicida químico. El bioherbicida se puede seleccionar del grupo que consiste en aceite de clavo, aceite de canela, aceite de lemongrass, aceite de citrus, aceite de cáscara de naranja, tentoxina, cornexistina, AAL-toxina, aceite de manuka, leptospermona , taxtomina, sarraentina, momilactona B, sorgoleona, ascaulatoxina y ascaulatoxina aglicona. El herbicida químico puede incluir, pero sin limitación, diflufenzopir y sus sales, dicamba y sus sales, topramezona, tembotriona, S-metolaclor, atrazina, mesotriona, primisulfuron-metilo, ácido 2 , 4-diclorofenoxiacético, nicosulfurona, tifensulfuron-metilo, asulam, metribuzina, diclofop-metilo , fluazifop, fenoxaprop-p-etilo, asulam, oxifluorfeno, rimsulfuron, mecoprop, y quinclorac, tiobencarb, clomazona, cihalofop, propanilo, bensulfuron-metilo, penoxsulam, triclopir, imazetapir, halosulfuron-metilo, pendimetalina, bispiribac-sodio, carfentrazona etilo, bentazon sódico/acifluorfeno sódico, glifosato, glufosinato y ortosulfamurona .
Las composiciones herbicidas se pueden aplicar en forma líquida o sólida como formulaciones de pre-aparición o posaparición .
Para las formulaciones secas de pre-aparición, el tamaño del' gránulo del portador es normalmente 1-2 mm (diámetro) pero los gránulos pueden ser más pequeños o más grandes de conformidad con la cobertura de tierra requerida. Los gránulos pueden comprender partículas porosas o no porosas.
Para las formulaciones de pos-aparición, los componentes de la formulación usados pueden contener arcillas de esmectita, arcillas de attapulgita y arcillas hinchables similares, espesantes tales como gomas de xantano, goma arábiga y otros espesantes de polisacáridos así como estabilizantes de la dispersión tales como tensioactivos no iónicos (por ejemplo polioxietileno (20) monolaurato) .
En una modalidad de realización particular, la composición puede comprender además del ingrediente activo otro microortganismo y/o alguicida y/o acaricida. El microorganismo puede incluir pero sin limitación un agente derivado de Bacillus sp., Brevibacillus sp., y Streptomyces sp .
Las composiciones también pueden ser como se expuso anteriormente, composiciones alguicidas que también pueden comprender otros alguicidas tales como sulfato de cobre, diquat o taxtomina A.
Las composiciones pueden ser composiciones acaricidas que también pueden comprender otros acaricidas tales como antibióticos, carbamatos, acaricidas de formamidina, piretroides, reguladores del crecimiento ' de ácaros, acaricidas de organofos fato y ti eras diatomáceas.
MODALIDADES FAVORECIDAS DE LA INVENCIÓN Las composiciones y compuestos pesticidas derivados de la cepa de Burkholderia expuestos en la presente se pueden usar como pesticidas, particularmente como insecticidas, nematicidas , fungicidas, algicidas, acaricidas y herbicidas.
En forma especifica, los nematodos que se pueden controlar usando el método expuesto anteriormente incluyen pero sin limitación nemtodos parasitarios tales como nematodos del nodulo de raíz, anillo, aguijón, lanza, quiste y lesión, que incluyen pero sin limitación nematodos de vida libre, Meloidogyne , Heterodera y Globodera spp; particularmente Meloidogyne incógnita (nematodos del nodulo de raíz) , asi como Globodera rostochiensis y globodera pailida (nematodos del quiste de papa) ; Heterodera glycines (nematodos del quiste de soja); Heterodera schachtii (nematodos del quiste de remoplacha) ; Oligonychus pratensis (ácaro de los bancos de pasto) ; Eriophyes cynodoníensis (ácaro del pasto Bermuda grass mite) ; Bryobia praetiosa (ácaro del trébol) -y Heterodera avenae (nematodo del quiste de cereal ) .
Los insectos ' fitopatogénicos controlados por el 'método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, insectos del orden (a) Lepidóptero, por ejemplo, Acleris spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amilois spp., Anticarsia gemmatalis , Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochilis spp. , Coleophora spp. , Crocídolomia binotalis , Cryptophlebía leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea , Earias spp. , Ephestia spp. , Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp. , Hedya nubiferana, Heliothis spp. , Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella , Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp. , Lyonetia spp. , Malacosoma spp. , Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella , Phthorimaea operculella , Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xilostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni y Yponomeuta spp.; (b) Coleóptero, por' ejemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp. , Atomaria linearis , Chaetocnema tibialis , Cosmopolites spp. , Curculio spp. , Dermestes spp. , Diabrotica spp. , Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemLineata , Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psilliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp.; (c) Orthoptera, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., Grillotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp. y Schistocerca spp.; (d) Isoptera, por ejemplo, Reticul itermes spp.; (e) Psocoptera, por ejemplo, Liposcelis spp. ; (f) Anoplura , por ejemplo, Haematopinus spp. , Linognathus spp. , Pediculus spp. , Pemphigus spp. y Philloxera spp.; (g) Mallophaga, por ejemplo, Damalinea spp. y Trichodectes spp.; (h) Thysanoptera , por ejemplo, Frankliniella spp., Hercinotnrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii ; (i) Heteroptera, por ejemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp. , Euchistus spp. , Eurygaster spp. , Leptocorisa spp. , Nezara spp. , Piesma spp. , Rhodnius spp. , Sahlbergella singularis, Scotinophara spp., Oncopeltus spp. Lygys spp. y Tniatoma spp.; (j) Homoptera, por ejemplo, Aleurothrixus floccosus , Aleyrodes brassicae , Aonidiella spp. , Aphididae , Aphis spp. , Aspidiotus spp. , 'Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus díctyospermi , Coccus hesperidum, Empoasca spp. , Eriosoma larigerum , Erythroneura spp . r Gascardia spp . r Laodelphax spp., Lecanium comí, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nephotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp. , Planococcus spp. , Pseudaulacaspis spp. , Pseudococcus spp., Psílla spp., Pulvínaria aetiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp. , Sitobion spp. , Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae y Unaspis citri; (k) Hymenoptera , por ejemplo, Acromyrmex , Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp. y Vespa spp.; (1) Díptera, por ejemplo, Aedes spp., Antherigona soccata , Bibio hortulanus , Calliphora erythrocephala , Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxís spp., Tabanus spp., Tannía spp. y Típula spp.; (m) Siphonaptera , por ejemplo, Ceratophillus spp. und Xenopsilla chéopis y (n) del orden Thysanura, por ejemplo, Lepisma saccharina. Los ingredientes activos de conformidad con la invención también se pueden usar para controlar pulguillas de las cruciferas (Phillotreta spp.), larvas de la raíz {Delia spp.), gorogojo de la silicua de repollo (Ceutorhynchus spp.) y áfidos en cultivos de oleaginosas tales como cañóla (colza) , semilla de mostaza, y sus híbridos, y también arroz y maíz. En una modalidad de realización particular, el insecto puede ser un miembro de Spodoptera , más particularmente, Spodoptera exigua, Myzus persicae, Plutella xilostella o Euschistus sp .
Las sustancias y composiciones también se pueden usar para modular la aparición en una formulación de monocotiledónea pre-emergente o pos-emergent , que incluye juncos y pastos, o malezas dicotiledóneas . En una modalidad de realización particular, las malezas pueden incluir, pero sin limitación, Chenopodium sp . (por ejemplo C. álbum), Abutilón sp. (por ejemplo A. theophrasti) , Helianthus sp . (por ejemplo H. annuus) , Ludwigia sp. (por ejemplo L. hexapetala) , Ambrosia sp . (por ejemplo A. artemesifoiia) , A aranthus sp . (por ejemplo, A. retroflexus , A. palmeri) , Convol vulus sp. (por ejemplo C. arvensis) , Ipomoeae sp. , Brassica sp . (por ejemplo B. kaber) , Raphanus sp . , Taraxacum sp. (por ejemplo T. officinale) , Centaurea sp. (por ejemplo C. solsti'talis) r Conyza sp. (por ejemplo C. ' bonariensis) , Cirsium sp . (por ejemplo C. arvense) , Lepidium sp . , Galliu sp., Solanu sp. (por ejemplo S. nigrum) , Malva sp. (por ejemplo M. iiegrl ee ta,) , Cyperus sp. (por ejemplo C. rotundas) , Oxalis sp. , Euphorbia sp., Trifolium sp . , Medicago sp.. , Hydrilla sp . , Azolla sp . , Digitaria sp . (por ejemplo D. sanguinalis) , Setaria sp . (por ejemplo 5 . lutescens) , Cynodcn dactilon, Bromus sp . (por ejemplo, B. tectorum) , Poa sp. (por ejemplo P. annua, P. pratensis) , Lollium sp. (por ejemplo, L. perenne) , Sorghum sp. (por ejemplo S. halépense) , Arundo donax, Festuca sp. (por ejemplo F. arundinaceae) , Echinochloa sp . (por ejemplo, E. crus-galli, F, . phill opogon) .
La cepa Burkholderia , los compuestos y composiciones expuestos anteriormente también se pueden usar como fungicidas. El hongo blanco puede ser un Fusarium sp., Botrytis sp., Monilinia sp., Colletotrichum sp, Verticillium sp.; Microphomina sp., Phytophtora sp, Mucor s . , Podosphaera sp., Rhizoctonia sp., Peronospora sp., Geotrichum sp., Phoma, y Penicillium . En otra modalidad de realización más particular, las bacterias son Xanthomonas .
La sustancia o composiciones se pueden usar para controlar, reducir y/o eliminar el crecimiento y proliferación de micro y macro algas marinas y no marinas que incluyen pero sin limitación algas unicelulares, multicelulares y 'diatomeas, rojas, verdes y azules tales como Pseudokirchneriella subcapitata, Rhizoclonium sp . , Cladophoera sp., Anabaena sp . , Nostoc sp . , Hydrodictyon sp., Chara sp, Microcystis y Didymo sp . , Chlamydomoñas sp., Scenedesmus sp. , Oscillatoria sp., Volvox sp., Navícula sp, Oedogonium sp . , Spírogyra sp., Batrichospermum sp., Rhodymenia sp., Callithamnion sp.,Undaria sp . , a través de la actividad alguicida y alguistática .
Los ingredientes activos y las composiciones que se expusieron anteriormente se pueden aplicar en lugares que contienen algas. Estos incluyen pero sin limitación un cuerpo de agua tal como un estanque, lago, arroyo, rio, acuario, planta de tratamiento de agua, central eléctrica o una superficie sólida, tal como plástico, cemento, madera, fibra de vidrio, cañerías de hierro y cloruro de polivinilo, superficies cubiertas con materiales y/o pinturas de recubrimiento .
Como se indicó anteriormente, el ingrediente activo y las composiciones expuestas anteriormente se pueden aplicar a las localizaciones que contienen arácnidos, tales como ácaros, que incluyen pero sin limitación, Panonychus sp. tales como Panonychus citri (ácaro del citrus), y Panonychus ulmi (araña roja), Tetranychus sp . tales como Tetranychus kanzawi (araña de Kanzawa) , Tetranychus urticae (araña roja de dos manchas), Tetranychus pacificus (araña del pacífico),' Tetranychus turkestanii (araña de la frutilla) y Tetranychus cinnabarinus (araña roja carmín), Oligonychus sp . tales como Oligonychus panicae (avacado brown mite), Oligonychus perseae (persea mite), Oligonychus pratensis (Banks grass mite) y Oligonychus coffeae, Aculus sp . tales como Aculus cornatus (ácaro plateado del durazno) , Aculus fockeni (ácaro de la roya de la ciruela) y Aculus lycopersici (ácaro del bronceado) , Eotetranychus sp. tales como Eotetranychus wilametti , Eotetranychus yumensis (araña de yuma) y Eotetranychus sexmaculatis (araña de 6 manchas), Bryobia rubrioculus (arañuela parda) , Epitrimerus piri (agamuzado del peral), Phytoptus pyri (ácaro de la erinosis del peral), Acalitis essigi (araña de mora), Polyphagotarsonemus latus (ácaro blancoe) , Eriophyes sheldoni (ácaro de la yema de citrus), Brevipalpus lewisi (ácaro plano de los cítricos), Philocoptruta oleivora (ácaro del tostado del citrus), Petrobia lateens (ácaro del trigo marrón), Oxienus maxwelli (ácaro del olivo) , Rhizoglyphus spp. , Tyrophagus spp. , Diptacus gigantorhyncus (ácaro del ciruelo) y Penthaleaa major (caro invernal de los cereales), arañuela roja del té, ácaro plano, arañuela del mango negra y roja, ácaro de la Papaya, ácaro de citris Texas, arañuela roja europea, erinosis de la vid (ácaro blister) , arañuela del Pacifico, araña de Willamette, ácaro del tostado de citrus.
Tales ubicaciones pueden incluir pero sin limitación cultivos que son infestado con tales ácaros u otros arácnidos (por ejemplo, áfidos) .
La invención se describirá a continuación con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes .
Ejemplos Las composiciones y métodos expuestos anteriormente se ilustran adicionalmente en los siguientes Ejemplos no limitativos. Los ejemplos son ilustrativos de diversas modalidades de realización únicamente y no limitan la invención reivindicada respecto a los materiales, condiciones, proporciones de pesos, parámetros de proceso y similares, citados en esta memoria.
Ejemplo 1. Aislamiento e identificación de los microbios 1.1 Aislamiento del microorganismo El microbio se aisla utilizando técnicas establecidas conocidas en la técnica a partir de una muestra de suelo recolectada bajo un árbol de hojas perennes en el Templo Rinnoji, Nikko, Japón. El aislamiento ' se realiza utilizando agar papa dextrosa (PDA) utilizando un procedimiento descrito en detalle por Lorch et al., 1995. En este procedimiento, la muestra de suelo se diluye primero en agua estéril, después de lo cual se plaquea en un medio de agar sólido, tal como agar papa dextrosa (PDA) . Las placas se cultivan a 25 °C durante cinco días, después de los cuales las colonias microbianas individuales se aislan en placas de PDA separadas. La bacteria aislada es gram negativa, y forma colonias redondas, opacas, de color crema que cambian a color rosado y marrón-rosáceo y a mucoides o viscosas con el tiempo . 1.2. Identificación del microorganismo El microbio se identifica basándose en la secuenciación de genes utilizando cebadores bacterianos universales para amplificar la región de ARNr 16S. Se utiliza el siguiente protocolo: Burkholderia sp . A396 se cultiva en placas de agar papa dextrosa. El crecimiento de 24 horas de una placa es raspado con un ansa estéril y resuspendido en tampón de extracción de ADN . El ADN es extraído por medio del kit de extracción MoBio Ultra Clean Microbial DNA. El extracto de ADN es analizado para determinar calidad/cantidad mediante el procesamiento de 5 µ? en un de gel de agarosa 1%.
Las reacciones de PCR se configuran de la siguiente manera: 2 µ?. de extracto de ADN, 5 µ?, de tampón de PCR, 1 ]!. de dNTPs (10 mM cada uno), 1.25 µ? de cebador directo (27F; 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEC ID NO: 1), 1.25 µ? de cebador inverso (907R; 5 ' -CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3 ' (SEC ID NO: 2)) . y 0.25 µ?. de enzima Taq. El volumen de reacción se completa a 50 µL utilizando agua estéril libre de nucleasa La reacción de PCR incluye un paso de desnaturalización inicial a 95 °C durante 10 minutos, seguido por 30 ciclos de 94 °C/30 seg, 57 °C/20 seg, 72 °C/30 seg, y un paso de extensión final a 72 °C durante 10 minutos.
La concentración aproximada del producto y su tamaño se calculan mediante el procesamiento de un volumen de 5 µL en un gel de agarosa 1% y la comparación de la banda del producto con una escala de masas.
El exceso de cebadores, dNTPs y enzimas se retiran del producto de PCR con el kit de limpieza PCR Mobio. El producto de PCR limpio se secuencia directamente utilizando cebadores 27F (iguales a los anteriores), 530F ( 5' -GTGCCAGCCGCCGCGG-3' (SEC ID NO: 3)), 1114F ( 5 ' -GCAACGAGCGCAACCC (SEC ID NO: 4)) y. 1525R ( 5 ' -AAGGAGGTGWTCCARCC-3 ' (SEC ID NO: 5)), 1100R ( 5 ' -GGGTTGCGCTCGTTG-3 ' (SEC ID NO: 6)), 519R (5'- GWATTACCGCGGCKGCTG-3 ' (SEC ID NO: 7 ) .
La secuencia del gen de ARNr 16S de la cepa ?396 se compara con las secuencias de genes de ARNr 16S disponibles de representantes de la ß-proteobacteria mediante BLAST . La cepa A395 A396 está estrechamente relacionada con los miembros del complejo Burkholderia cepacia, con una similitud del 99% o mayor a varios aislamientos de Burkholderia multivorans , Burkholderia vietnamensis y Burkholderia cepacia. Una búsqueda de BLAST excluyendo el complejo B. cepacia mostró 98% de similitud con aislamientos de B. plantarii , B. gladiol i y Burkholderia sp.
Un árbol de distancia de los resultados utilizando el método de unión al vecino, mostró que A396 se relaciona con Burkholderia multivorans y otros aislamientos de complejo de Burkholderia cepacia. Burkholderia plantarii y Burkholderia glumae se agruparon en una rama separada del árbol.
Se encontró que la cepa de Burkholderia aislada contenia las siguientes secuencias: Secuencia directa, secuencia de ADN con cebador 27F, 815 núcleotidos (SEC ID NO: 8) TGCAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGA GTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCG CATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATG GCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAG AGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGG GGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTT CGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTTGGGCTAATACCCCGGGGGGATGA CGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGT GCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGACAGATG TGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGA GGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGC GAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCC TTAGTAACGTAGCTACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAATMG AGGGTKGKKTGKKGGGGGGAAA Secuencia inversa, 1453 bp, utilizando cebadores 1525R, 1100R, 519R (SEC ID NO: 9) GTCATGAATCCTACCGTGGTGACCGTCCTCCTTGCGGTTAGACTAGCCACTTCTGG TAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGC GGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGCACTCGAGTTGCAGAGTGCAA TCCGGACTACGA CGGTTTTCTGGGATTAGCTCCCCC CGCGGGTTGGCAACCCTCTGTTC CGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCC CACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCTCTTGCGTAGCAACTAAGGA CAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCC ATGCAGCACCTGTGTATCGGTTCTCTTTCGAGCACTCCCGAATCTCTTCAGGATTCCGACC ATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATCATCCACCGCTT GTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCA ACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCAACAACTAGTTGACATCGTTT AGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGT CAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCA CTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCTAGCTTGCCAGTCACAAATGCAG TTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGTCTTAACAAACCGCCTGCGCACGCTTTAC GCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTT AGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCCCGGGGTATTAGCCCAAAGGATTTCTT TCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCA GGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTC TCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCC TTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGTCCGAAGATC CCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCGCCGGGCTATCCCCCA CTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGTGCAAGCAC CCGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAG Secuencia inversa, 824 bp, utilizando cebador 907R (SEC NO: 10) CCAGGCGGTCACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCAACAAC TAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCT TTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACA TCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCTAGCTTGC CAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGTCTTAACAAACCGC CTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGC TGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCCCGGGGTATTAG CCCAAAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAAC'CCGAAGGCCTTCTTCACACACGC GGCATTGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCGCCACTGCTGCCTCCCGTAGG AGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCG TCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCG CGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCG CCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCC ACCAGGTGCAAGCACCCGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTT CAATCTGAGTG Secuencia directa, 1152 bp, utilizando cebador 530F (SEC ID NO: 11) TCGGATTACTGGGCGTAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGACAGATGTGAAATCC CCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTA GAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGGAG CCCCCTGGGCCTATACTGACCCTCATGCTCGAAAGCGTGAGGACCCAACCGGATTAGATGC CCTGATAGGCCATGCCCCACACCATGCCATGTGTTAGGGGCCCATTTCCTTAGGGAGGCAG CTATGGGGAATTTTGGACAATGTGGGAAACCCTGATCCAACAATGCCGCGTGTGTGAATAA GGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTATCCGGATAGATTCCTTTTGGGCTAAACCTCCGTAG GGGATGACGGTACCGGAAGAATAACCACCGGGTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC GTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAG ACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAGTA TGGCAGACGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATAC CGATGGGCGAAGCAGCTCCTGGGGCAATACTGACGCTCATGCACAAGATCGTGCGAAACAA ACAGGATAAAACCCCTGTATTCCACGCCCAAAACGATGTCCACCAAGTTGTTGGCGATCCT TTCCTTCGTATCGTAGCTACGCGGGAATTTGACCCCCTGGGGACTAGGCCGCATATAAAAC TCAAGGGAATTCCGGGGACCCCCAGAGCTGTGTATGATGTGATTATTCCGATGCGCGGAAA ACCTTCCTTATCTTTGAATGGCGGTACTCCTGAAAATTGCGGAGTGCTCGAAAACACCGAA CCCGGGTCTTTCTGCGTGTCCTCCCTCGTGTGGGATATGCTGGATATCCCGCAGACGCATC TTTGACTTAGTGCTCCCAAAACTGAGAGCTGGGAGGACTCGAGAGGGGATCCCTGCCTCCC CGGCTTGGGTGCTCCCCTTATGGGGGAAACAGGTACACGGGGGGATCATCCCATACCTA Secuencia directa, 1067 bp, utilizando cebador 1114F (SEC ID NO: 12) TCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTC ATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACC CGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAG TGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGG GTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAA CCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAG CCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTAAACCCTTTGGCCTAATAACCCCGGGGG AATAAGTACCGAAAAAAAAAAAAACTGGATAACTTCCGTGCCACAACCCGCGGAAAAATCT AGGGGGGGGGAGCTTAAATGGAAATTTACGGGGCCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTAA ACACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAG TATGGCACAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCATTGAATGCATAGAGATGAGAGGATACC GATGGAGAAGGGCGCCCCCGGGGACAATATGACGCCTATGCCACAAAGCTGTGGCACAATA GGTTAAATACCTGTGTTGTCCCCGCCTAAACAGATTACACTTGTTGTGGGTATTTTCTCAT AAAATACTACACACGGGAGAATACACTGGGGGGCTTCGTCAATTATCACAACAATGATTGC GGGCACCCACGGGGGTAGATGGGTAATAAATCGACGGCAACTATCTACTTACTTGGATGAT CGCACAGATTGGGCGGGAGAGAAGAGAACAGCGTGTGTGTGCTCCTCCGCGAGTGATAGGT AATCGGACAATACTTTGACAGGACTTAACTGGGTAGCGGGATCGAGTGGATTCCCGTCGGA TGGCCTCCGCAGGTACGGCAGCTGGGGATTACATC Secuencia inversa, 1223 bp, utilizando cebador 1525R (SEC NO: 13) TTGCTTACGACTTCACCCCAGTCATGAATCCTACCGTGGTGACCGTCCTCCTTGCG GTTAGACTAGCCACTTCTGGTAAAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGA CCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGC ACTCGAGTTGCAGAGTGCAATCCGGACTACGATCGGTTTTCTGGGATTAGCTCCCCCTCGC GGGTTGGCAACCCTCTGTTCCGACCATTGTATGACGTGTGAAGCCCTACCCATAAGGGCCA TGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGC TCTTGCGTAGCAACTAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCAC GACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTATCGGTTCTCTTTCGAGCACTCCCGA ATCTCTTCAGGATTCCGACCATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTA ATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGA CCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCCCA ACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCC ACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCT CCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCTAG CTTGCCAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATC+TGTCTTAACA AACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTAC CGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGGTACCGTCATCCCCCGGGTAT AGCCCAAAGGATTCTTTCGACAAAGTGCTTTACACCCGATGTCTCTCACACACGCGCATGC TGATCAGGTTTCCCCATGTCAAAGTCCACTGCTGCTCGTAGGTCTGGACGGGTTCAGTTCA ATGTGACTGA CGTCTTTGGACAACTACTGAACGTCCCTGTAGCTTACCCACCAACTAGCT ATAGCATGC Secuencia inversa, 1216 bp, utilizando cebador 1100R (SEC ID NO: 14) CCGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTATCGGTTCTCTTTCGAGCACTCCC GAATCTCTTCAGGATTCCGACCATGTCAAGGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAAT TAATCCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGC GACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTCACGCGTTAGCTACGTTACTAAGGAAATGAATCCC CAACAACTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCC CCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTATTGGCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTC CTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGCCATACTCT AGCTTGCGAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCTGTCTTAAC AAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTA CCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCCCCCGGG GTATTAGCCCAAAGGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCA CACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTTCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTC CCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTA CTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCC TATAGCGCGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTTTCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCG GCTTTCGCCGGGCTATCCCCCACTACAGGACATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCC ACTCGCCCCAGGTGCAAGCACCCGTGCTGCCGTTCGACTTGCATGTGTAGCATGCGCAGCG TCATCTACTAAATAAACAACTCTAAGAATTTTTGCCCGAGGGCCTCTAAACACTCGGGGCG TCGAGAGAGACTACGGATGAGGAGCATCCCTCTGTCTCTAGGTATGTGTTGTCGCCTCTCT CACAGAGGAGGGGACGCACGACGGAGCCATCGGGGACGACAACATGTACGATATACTATCT A Secuencia inversa, 1194 bp, utilizando cebador 519R (SEC ID NO: 15) TTCTTCGGTACCGTCATCCCCCCGGGGTATTAGCCCAAAGGATTTCTTTCCGGACA AAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTTCC CCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCC AGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCC ACCAACTAGCTAATCAGCCATCGGCCAACCCTATAGCGCGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTT TCATCCGTAGATCGTATGCGGTATTAATCCGGCTTTCGCCGGGCTATCCCCCACTACAGGA CATGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGCCACCAGGTGCAAGCACCCGTGCTG CCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTC TGAGGGGGGGGGCCTTCAACGGAACGACTGGGCAAAAAGCGTGCCCAGGCGTTTTGTTAAG ACAGATGTGAAACCCCGGGGCTTAACCTGGAAACTGCATTTGTGACTGGAAAGCTAGAGTA TGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCATTGAAATGCGTAGAAATGGAGAGGAATAC CGATGGGAGAGGGCAGCCCCCGTGGGCAAATACTGGCGCTTATGAACAAAGTTGGGGCGCG CCGCCGGGATATGTTCCCCTGGGATATCCCCCCCCTAAACTGCTTACAAATATTGTGTGGG AAACTTTTTCTCTAAAAAATAGAACACAACGGGAGATATCACCCCCGGGGGGCCACCGCCA GATTAAACCCCCAAAAAGTATTTGGCGGGCACCCCCCCGGGGGGTGAGATGGGGTAAAATA AATCCGTGCGACGAGCAAACCCTCCCCACACCTGGGATGGTCGCGACCACAGATGAGATGC GGGCGGAGAGAACGATACCCAAGCGTGGTTGTTTGCCTGCATCCCCTCCGTCGGGAGTGGA TATAGTAGAGTAATTACGGCACGACTGCATTTTTTTTTCTTCAGTACACCTTATCACACTG 'TTGGATGCACCGCGAGAAATCCGGAGGTGTGAGTACTCCCCCCCTCTCCTCGGGATGTGTC GGCGCTCCCTTCTCCCGTTCAGGGGTGGGTAAGCACCGCG 1.3. Prueba de que Burkholderia ?396 no pertenece al complejo Burkholderia cepacia 1.3.1 Pruebas de biología molecular utilizando cebadores de PCR específicos Con el fin de confirmar la identificación de Burkholderia A396 como Burkholderia multívorans, se realizó la secuenciación adicional de los genes constitutivos. Burkholderia multívorans es un miembro conocido del complejo Burkholderia cepacia. Los esfuerzos se centran en la PCR de los genes recA, como describen Mahenthiralingam et al., 2000. Se utilizan los siguientes cebadores: (a) BCR1 y BCR2 establecidos en Mahenthiralingam et al, 2000 para confirmar la coincidencia con el complejo de B. cepacia y (b) BCRBM1 y BCRBM2 establecidos en Mahenthiralingam et al, 2000 para confirmar la coincidencia con B. multívorans . Un producto resultante de la reacción de PCR para el primer conjunto de cebadores confirmaría que el microbio pertenece al complejo B. cepacia. Un producto resultante de la reacción de PCR para el segundo conjunto de cebadores confirmaría que el microbio es en efecto B. multivorans .
No' se obtiene ningún producto de PCR para cada par de cebadores. El rendimiento de la reacción de PCR y los cebadores es examinado utilizando Burkholderia multivorans ATCC 17616 (control positivo) y Pseudomonas fluorescens (control negativo) . Se observaron bandas fuertes para B. multivorans utilizando dos conjuntos de cebadores. No se observan bandas para Pseudomonas fluorescens . Los resultados indican que A396 es una Burkholderia , pero no un miembro del complejo de B. cepacia; y no es Burkholderia multivorans. Esto también se demuestra en un experimento de cultivo comparativo en el que A396 y un cultivo tipo de B. multivorans se cultivan en paralelo en un cultivo con agitación, y el crecimiento se controla diariamente con medidas de densidad óptica a 600 nm. En las condiciones establecidas, la especie A396 creció mucho más rápido que la cepa tipo de B. multivorans (Figura 1) . 1.3.2 Hibridación ADN-ADN Con el fin de confirmar que el aislamiento A396 es una nueva especie de Burkholderia , se lleva a cabo un experimento de hibridación ADN-ADN con Burkholderia multivorans (la secuencia de 16SrARN con coincidencia más cercana) . La biomasa para A396 y B. multivorans se produce en caldo ISP2, desarrollado durante 48 horas a 200 rpm/25 °C en matraces Fernbach. La biomasa es cosechada asépticamente por centrifugación. El caldo es decantado y el pellet de células se resuspende en una solución 1:1 de agua: isopropanol. Los experimentos de hibridación de ADN-ADN son realizados por DSMZ, la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares en Alemania. Se aisla el ADN utilizando una célula de presión francesa (Thermo Spectronic) y se purifica por cromatografía en hidroxiapatita como se describe en Cashion et al., 1977. La hibridación ADN-ADN se lleva a cabo como se describe en De Ley et al., 1970 considerando las modificaciones descritas en Huss et al., 1983 utilizando un espectrofotómetro modelo Cary 100 Bio UV/VIS equipado con cambiador multiceldas de 6x6 termostatizado Peltier y un controlador de temperatura con sonda de temperatura in situ (Varían) .
DSMZ informó un porcentaje de similitud de ADN-ADN entre A396 y Burkholderia multivorans del 37.4%. Los resultados indican que la cepa A396 de Burkholderia sp . no pertenece a la especie de Burkholderia multivorans cuando se consideran las recomendaciones de un valor umbral de similitud de ADN-ADN del 70% para la definición de especies bacterianas del comité ad hoc (Wayne et al., 1987) . 1.4. Perfil bioquímico utilizando placas Biolog GN2 Para el perfil de utilización de fuentes de carbono, se cultivó A396 durante una noche en Agar Papa Dextrosa (PDA) . El cultivo se transfirió a agar BUG para producir un cultivo adecuado para los experimentos en Biolog según recomendación del fabricante (Biolog, Hayward, CA) .
El perfil bioguimico del microorganismo se determina mediante la inoculación en una placa de Biolog GN2 y la lectura de la placa después de una incubación de 24 horas utilizando el sistema de micro-estación automatizado MicroLog 4. La identificación de las bacterias desconocidas es intentada mediante la comparación de su patrón de utilización de carbono con la base de datos de Gram negativos de Microlog 4.
No se encuentran coincidencias claras definitivas en el perfil de Biolog. Las coincidencias más cercanas tuvieron menos de 35% de similitud con A396: Pseudomonas spinosa {Burkholderia) , Burkholderia cepacia y Burkholdería pseudomallei . Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Perfil bioquímico de A396 Sustrato Resultado Sustrato Resultado Ciclodextrina L-arabinosa Dextrina D-arabitol Glucógeno D-celobiosa Tween 40 Eritritol Tween 80 O-Fructosa N-acetil-D-Galactosamina L-Fucosa N-acetil-D-glucosamina D-Galactosa Adonitol Gerttibiosa Mono-metil éster del ácido succínico O-Glucosa Ácido acético m-lnositol Ácido cis-aconítico Ácido cítrico Ácido fórmico Lactona del ácido D-galactónico Ácido D-galacturónico Ácido D-glucónico Ácido D-glucosamínico Ácido D-glucurónico Ácido a- idroxibutírico -Ácido ß-hidroxibutírico L-Ramonosa Ácido y-hidroxibutírico D-Sorbitol Ácido p-hidroxifenilacético Sacarosa Ácido itacórtico Ácido a-ceto butí Ácido a-ceto glut Ácido a-ceto valé Ácido D.L-láctico Ácido malónico Tabla 1. Continúa...
Sustrato Resultado Sustrato Ácido propiónico + Fenitetil-amina Ácido quínico - Putresctna Ácido D-sacárico - 2-Aminoetanol Ácido sebácico - 2.3-Butanodiol Ácido succínico + Glicerol Ácido bromosuccínico - D.L-a-glicerol fos Ácido succinámico - -D-elucosa-l-fo Giucuronamida - D-glucosa-6-fosfato + L-aianínamida D-Alanina L-aianina L-alanil-glicina L-asparagina Ácido L-aspártico + - c o -p rog ut mtco - Ácido L-glutámico Ácido glicil-L-aspárt¡co Ácido glicil-L-glutámico L-histidina Hidroxi-L-prolina + L-omitína - L-ieucina 1.5. Composición de ácidos grasos Después de la incubación durante 24 horas a 2 cosechó una ansada de células bien desarrolladas y los ésteres metílicos de los ácidos grasos fueron preparados, separados e identificados utilizando el Sistema de Identificación Microbiana Sherlock (MIDI) (ver Vandamme et al., 1992) . Los ácidos grasos predominantes presentes en Burkholderia A396 son los siguientes: 16:0 (24.4%), ciclo 17:0 (7.1%) , 16:0 3- OH (4.4%) , 14:0 (3.6%), 19:0 co8c (2.6%) ciclo, 18:0 (1.0%) . La característica 8 sumada (que comprende 18:1 6)7c) y la característica 3 sumada (que comprende 16:1 co7c y 16:1 co6c) correspondieron a 26.2% y 20.2 % del área de pico total, respectivamente. La característica 2 sumada que comprende 12:0 ALDE, 16:1 iso I, y 14:0 3-OH) correspondía a 5.8% del área de pico total mientras que la característica 5 sumada que comprende 18:0 ANTE y 18:2 ?6.9? correspondía a 0.4%. Otros ácidos grasos detectados en A396 en menores cantidades incluyeron: 13:1 a 12-13 (0.2%), 14:1 o5c (0.2%), 15:0 3-OH (0.13%), 17:1 co7c (0.14%), 17:0 (0.15%), 16:0 iso 3-OH (0.2%) , 16:0 2-OH (0.8%), 18:1 co7c 11-metil (0.15%), y 18:1 2-OH (0.4%) .
Una comparación de la composición de ácidos grasos de A396 con los de las cepas microbianas conocidas en la base de datos MIDI sugirió que los ácidos grasos en la nueva cepa A396 eran más similares a los de Burkholderia cenocepacia. 1.6 Resistencia a antibióticos La susceptibilidad a los antibióticos de Burkholderia A396 se prueba utilizando discos de antibióticos en medio Muller-Hinton como se describe en la ficha técnica # 535 de PML Microbiological. Los resultados obtenidos después de 72 horas de incubación a 25 °C se presentan en la 'Tabla 2 a continuación .
Tabla 2: Susceptibilidad de MBI-206 a diversos antibióticos. +++ muy susceptible, ++ susceptible, resistente Los resultados indican que el espectro de susceptibilidad a antibióticos de Burkholderia A396 ' es bastante diferente del de las cepas del complejo patógeno de B. cepacia. Burkholderia A396 es susceptible a kanamicina, cloranfenicol , ciprofloxacina , piperacilina, imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprima . Como comparación, Zhou et al., 2007 examinaron la susceptibilidad de 2.621 cepas diferentes en el complejo de B. cepacia aisladas de pacientes con fibrosis quistica, y encontraron que sólo el 7% y el 5% de todas las cepas fueron sensibles a imipenem o ciprofloxacina , respectivamente. También encontraron que 85% de todas las cepas eran resistentes al cloranfenicol (15% susceptibles), y 95% eran resistentes (5% susceptibles) a la combinación de sulfametoxazol y trimetoprima. Los resultados de Zhou et al., 2007 son similares a los de Pitt et al., 1996 que determinaron resistencia a los antibióticos en 366 aislamientos de B. cepacia e informaron que la mayoría de estos son resistentes a ciprofloxacina , cefuroxima, imipenem, cloranfenicol , tetraciclína y sul fametoxa zol .
Ejemplo 2: Formulación de Burkholderia y aislamiento de fracciones del producto formulado El siguiente procedimiento se utiliza para la purificación de los compuestos extraídos de un producto formulado de MBI-206 que contiene un caldo de células enteras de un cultivo de Burkholderia sp.: El caldo de cultivo derivado de la fermentación de 10 L de Burkholderia (A396) en medio de crecimiento Hy soja y formulado utilizando metil parabeno 0.1% y propil parabeno 0.1%, hexanol 0.67% y Glycosperse 0-20 0.67%, se extrae con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., "Weakly cytotoxic polyketides from a marine-derived Actinomycete of the genus Streptomyces strain CNQ-085." J. Nat . Prod. 69:1756-1759. 2006) agitando la suspensión celular con resina a 225 rpm durante dos horas a temperatura ambiente. La resina y la masa de células se recogen por filtración a través de gasa y se lavan con agua DI para eliminar las sales. La resina, la masa de células y la gasa se sumergen a continuación durante 2 h en acetona después de lo cual la acetona se filtra y se seca al vacío empleando un evaporador rotatorio para dar el extracto en bruto (MBI-206-FP-CE) . El extracto en bruto se fracciona a continuación mediante cromatografía de líquidos al vacío C18 en fase reversa (H2O/CH3OH; gradiente de 80:20 a 0:100%) para dar 10 fracciones (véase Figura 1, para el esquema) . Estas fracciones se concentran a continuación a sequedad empleando un evaporador 'rotatorio y los residuos secos resultantes se examinan para determinar la actividad biológica utilizando un ensayo completo de herbicidas vegetales. Las fracciones activas, fracciones 3, 4, 5 y 6 designadas como MBI-206-FP-3 , BI-206-FP-4 , MBI-206-FP-5 y BI-206-FP-6, respectivamente, son luego sometidas a separaciones repetidas por HPLC de fase reversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) para dar compuestos puros, que se examinan a continuación en los bioensayos mencionados anteriormente para localizar/identificar los compuestos activos (ver Figura 2) . 2.1 Análisis de fracciones de la formulación Estas fracciones se analizaron en un instrumento de cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) Thermo equipado con un detector PDA Finnigan Surveyor, un inyector automático, una bomba de MS y una columna de 4.6 mm x 100 mm Luna C18 5 µ?a ( Phenomenex ) . El sistema de disolventes consistía en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) . La fase móvil comienza con 10% de disolvente B y se incrementa linealmente hasta 100% de disolvente B durante 20 min y luego se mantiene durante 4 min, y finalmente vuelve a 10% de disolvente B durante 3 min y se mantiene durante 3 min. El velocidad es de 0.5 mL/min. El volumen de inyección es dé 10 pL y las muestras se mantienen a temperatura ambiente en un muestreador automático.
A fin de descubrir la identidad del compuesto, se registran datos espectroscópicos adicionales como CL/EM y UV. El compuesto correspondiente a la fracción 5, con un tiempo de retención de 17.45 minutos no es encontrado en ninguno de los materiales iniciales, lo que indica que el compuesto es un producto de una reacción química entre los productos naturales en el caldo de fermentación microbiana y uno o más de los compuestos encontrado en los agentes de formulación. Específicamente, esta fracción se analizó mediante ESI-LCMS en un instrumento de electroaspersión (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus utilizando los modos de ionización positivo y negativo en un modo de barrido completo (m/z 100-1500 Da) en un espectrómetro de masas LCQ Deca xpplus (Thermo Electron Corp., San José, CA) . El análisis por espectrometría de masass se lleva a cabo bajo las siguientes condiciones: el velocidad del gas átomo de nitrógeno se fijó en 30 y 15 arb para el velocidad de gas impulsor y auxiliar/de barrido, respectivamente. La ionización por electroaspersión se llevó a cabo con un voltaje de pulverización fijado en 5000 V y un voltaje capilar a 35.0 V. La temperatura del capilar se fijó en 400 °C. Los datos se analizaron en un software Xcalibur.
Se halló que los nuevos compuestos adicionales encontrados en la fracción '5 tienen un peso molecular (PM) de' 194 (RT = 14.74 min) y 222 (RT = 17.43 min) . 2.2 Bioensayo Se seleccionaron para la prueba plantas sanas de rábano con dos o tres hojas verdaderas. Las plantas de rábano tenían 13 días de edad en el tratamiento. Las plantas son ordenadas de modo que todos los tratamientos son equivalentes en superficie foliar y altura de la planta. Las macetas son etiquetadas con el número de tratamiento y el número de repetición. Se examinan tres repeticiones por tratamiento.
Se analizan diez fracciones de producto formulado MBI-206. Las fracciones están a una concentración de 10 mg/mL. Se analizan también los extractos en bruto del producto formulado y el caldo. Se incluyen en el ensayo un control no tratado (tratado con agua desionizada) y un control positivo (RoundUp Super Concentrado a una tasa de 19.525 mL/L (2.5 onzas fluidas por galón) ) .
Los siguientes tratamientos fueron ensayados como se muestra en la Tabla 3: Tabla 3 : Descripción del ensayo Todos los productos y tratamientos son bien agitados antes de la aplicación. Los tratamientos se aplican mediante una boquilla a partir de un frasco de pulverización de 56.7 g (2 onzas) . Se utilizaron boquillas de pulverización separadas para cada tratamiento. El follaje de la planta se pulverizó uniformemente y con un volumen moderado (es decir, ni un roció ligero ni una aplicación pesada que diera lugar a escurrimiento ) . Se pulverizan simultáneamente dos mililitros de cada tratamiento en las tres repeticiones de cada tratamiento, de manera que cada planta se trata con aproximadamente 0.67 mL de solución de tratamiento.
Las plantas se dejan secar al aire y luego son aleatorizadas en bandejas de retención. Cada bandeja es etiquetada con el nombre del experimento y la fecha del tratamiento y colocada en los estantes del invernadero del laboratorio. El invernadero del laboratorio se mantiene a una temperatura de 70-80 °C y una humedad relativa de 30-40%. Durante todo el bioensayo, las plantas son regadas desde abajo llenando las bandejas de retención con una cantidad apropiada de agua de modo que el follaje de la planta se mantenga seco.
Se registran los resultados a los 3, 8, y 14 dias después del tratamiento. Los síntomas incluyeron quemadura del follaje y retraso en el crecimiento de las plantas. La siguiente escala de calificación mostrada en la Tabla 4 se utiliza para cuantificar la eficacia. Las calificaciones se determinan mediante la observación de los siguientes factores en relación con las plantas del control no tratado: salud general de la planta, altura media de la planta, y salud del follaje. Los síntomas de las plantas afectadas pueden incluir follaje decolorado/manchado/quemado/blanqueado, hojas deformadas/retorcidas/encrespadas, formación de ramas laterales (debido a daño en el meristema apical), marchitamiento de la planta, o muerte.
Tabla 4: Escala de calificación En la Figura 2 se muestra la media de tres lecturas. En la prueba completa de herbicidas vegetales, las fracciones 4 y 5 muestran buena actividad herbicida (ver Figura 2). 2.3 Aislamiento de compuestos pesticidas a partir de la formulación Esta fracción se purificó adicionalmente utilizando una columna de HPLC de C-18 (Phenomenex, Luna lOu C18(2) 100 A, 250 x 30), un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (0-10 min; CH3CN 80 % en agua, 10-25 min; CH3CN 80 - 65 % en agua, 25-50 min; CH3CN 65 - 50 % en agua, 50-60 min; CH3CN 50 - 70 % en agua, 60-80 min; CH3CN 70 - 0 % en agua, 80-85 min; CH3CN 0 - 20 % en agua) a un velocidad de 8 mL/min y detección al UV a 210 nm, para dar butil parabeno, tiempo de retención 59.15 min (MBI206-FP-F5H32 ) y hexil parabeno, tiempo de retención 74.59 min (MBI206-FP-F5H40 ) , respectivamente . 2.3.1 Análisis de compuestos por espectroscopia de RMN Los espectros de RMN se midieron en un espectrómetro Bruker de 600 MHz de gradiente de campo. La referencia se establece con el estándar interno tetrametilsilano (TMS, 0.00 ppm) . 2.3.1.1 Determinación de la estructura de hexil parabeno (MBI206-FP-F5H40) El compuesto activo fue aislado en forma de un sólido incoloro, con absorción al UV a 248 nm. El (-) ESIMS mostró un ion molecular a 221 (MH) correspondiente al peso molecular de 222. El compuesto presenta un espectro de RMN-1!! con señales de 'd en 7.90, 6.85, 4.28, 1.76, 1.46, 1.38, 1.37, 0.94 y tenía valores de 13C R N de 166.84, 162.12, 131.34 (2C) , 121.04 , 114.83 (2C), 64.32, 31.25, 28.43, 25.45, 22.18, 12.93. Se asignó la fórmula molecular C13H18O3 (5 grados de insaturación) , por combinación de los datos de espectrometría de masas ESI y de RMN. El espectro de RMN-1!! exhibió señales de una estructura aromática tipo A2B2 en d 7.90, 2H d, J = 8.5 Hz, y 6.85, 2H d, J = 8.5 Hz . Además, el espectro de RMN-½ reveló la presencia de un grupo - CH2 -CH2-CH2 -CH2- CH2-CH3, en d 4.28, 2H, t, J = 7.3 Hz; 1.76, 2H, m, 1.46, 2H, m; 1.38, 2H, m; 1.37, 2H, m, y 0.94, 3H, t, J = 7.3 Hz . Del análisis de los datos espectrales anteriores, la estructura del policétido aromático se estableció como hexil parabeno, la cual se confirmó por el análisis detallado de los experimentos de COSY, HMQC y HMBC . Una búsqueda bibliográfica reveló que este compuesto ha sido reportado como un compuesto sintético . 2.3.1.2 Determinación de la estructura de butil parabeno (MBI206-FP-F5H32) Este compuesto se obtuvo como un sólido incoloro con UV máx a 248 nm. El análisis de LCMS en el modo negativo mostró un ion molecular a m/z 193 correspondiente a la fórmula molecular 194. Por ' comparación de los datos de UV, MS y RMN con el hexil parabeno con PM 222, se encontró que este compuesto era el análogo del hexil parabeno. La única diferencia entre los mismos estaba solamente en la cadena lateral. De este modo, se asignó la estructura de butil parabeno a este compuesto con PM 194. Una búsqueda en la literatura sugirió que este compuesto también es conocido como un compuesto sintético. 2.3.2 Actividad herbicida Los compuestos puros (butil parabeno [MBI206-FP-F5H32] y hexil parabeno [MBI206-FP-F5H40] ) obtenidos a partir de la fracción 5 se ensayaron a una concentración de 10 mg/mL. Se incluyen en la prueba un control no tratado (tratado con agua desionizada) , el blanco de formulación (a 3% v/v y 10% v/v) , y un control positivo (RoundUp Super Concentrado a una tasa de 19.525 mL/L (2.5 onzas fluidas por galón)).
Los siguientes tratamientos se ensayaron como se muestra en la Tabla 5: Tabla 5 : Régimen de tratamiento Descripción del ensayo os resultados obtenidos se presentan en la Tabla 6.
Tabla 6: Resultados del bioensayo Sobre la base de los datos presentados en la tabla anterior, se encontró que el hexi'l parabeno era el compuesto herbicida más potente. 2.3.3 Actividad insecticida Se examinó la actividad insecticida de butil parabeno (MBI206-FP-F5H32) y hexil parabeno (MBI206-FP-F5H 0 ) en un ensayo de laboratorio utilizando una prueba de superposición de dieta de 96 pozos con larvas de gusano soldado (Spodoptera exigua) en etapa de primer estadio empleando placas de microtitulación con 200 µ?? de dieta sólida, artificial para gusano soldado en cada pozo. Se pipetean 100 µ?, de cada muestra de ensayo (que contenían 40 pg de muestra) en la parte superior de la dieta (una muestra en cada pozo) y la muestra se deja secar bajo corriente de aire hasta que la superficie esté seca. Cada muestra se ensayó en seis repeticiones, y se utilizaron agua y un producto comercial Dipel como controles negativos y positivos, respectivamente. Se colocó una larva de primer estadio del insecto de ensayo (gusano soldado - Spodoptera exigua) en cada pozo, y la placa se cubrió con una cubierta de plástico con respiraderos. Las placas con los insectos se incubaron a 26 °C durante 6 días con evaluaciones diarias de la mortalidad. Sobre la base de los resultados presentados en la Tabla 7, hexil parabeno y buti'l parabeno produjeron 71% y 9% de mortalidad, respectivamente .
Tabla 7. Datos del bioensayo insecticida para butil parabeno ( BI206-FP-F5H32) y hexil parabeno (MBI206-FP-F5H40) contra gusano soldado en primer estadio (Spodoptera exigua) 2.3.4 Actividad nematicida; Prueba in vitro de butil parabeno (MBI206-FP-F5H32 ) y hexil parabeno" (MBI206-FP-F5H40) : La muestra pura de butil parabeno y hexil parabeno fue utilizada en un bioensayo in vitro en una placa de cultivo celular de plástico de 96 pozos. Se expusieron 15-20 nematodos en una solución de 50 µ?, de agua a 3 pL de un concentrado máximo de 20 mg/mL durante un periodo de 24 horas a 25 °C. Una vez completado el periodo de incubación, se registraron los resultados sobre la base de una clasificación visual de la inmovilidad de los nematodos juveniles (J2) en cada pozo tratado con compuestos; cada tratamiento se ensayó en repeticiones de 4 pozos. Los resultados se presentan en la Tabla 8, que muestra resultados de dos bioensayos de extractos de compuestos diferentes en placas de 96 pozos. Se incluyen tres controles en cada ensayo; uno positivo (Avid 1%) y 2 negativos (DMSO y agua) . Un ensayo (TI) se realizó utilizando nematodos M. incógnita y otro ensayo (T2) se realizó utilizando nematodos M. hapla, las muestras se disolvieron en DMSO 100%. El hexil paraben (MBI206-FP-F5H40) mostró un excelente control con inmovilidad del 93.75% frente a M. incógnita en comparación con butil parabeno con inmovilidad del 81.25%.
Tabla 8: Efecto del hexil parabeno y del butil parabeno en M. incógnita y M. hapla 2.3.5 Estudio de la formación de parabenos en la formulación del producto Con el fin de comprender la formación de estos parabenos, se tomó en consideración el efecto del cambio del alcohol en la formulación. Se utilizaron en la formulación alcoholes de diferentes cadenas de carbono y se monitoreó la formación de nuevos parabenos mediante LCMS.
Se realizaron cuatro experimentos de formulación separados utilizando butanol, hexanol, octanol y alcohol cetilico y todos los otros componentes se mantuvieron iguales. Los productos de formulación fueron extraídos durante el periodo de 2 días y 3 semanas. Los extractos en bruto obtenidos a partir de estas formulaciones se analizaron por LCMS . Se formaron los parabenos correspondientes para todos los alcoholes a excepción del alcohol cetilico. Se encontró que el rendimiento de los parabenos era más alto para el butil parabeno, seguido por hexil parabeno y luego octil parabeno para el producto de formulación con antigüedad de un dia. El resultado del análisis, incluso después de 3 semanas, seguía el mismo orden, es decir, butil parabeno > hexil parabeno > octil parabeno. De esta manera, se halló que la velocidad de formación de parabenos tales como butil parabeno, hexil parabeno y octil parabeno dependía de la cadena de átomos de carbono (número de átomos de carbono) , del disolvente (alcohol), del alcohol correspondiente utilizado en la formulación (butanol (C4 ) > hexanol (C6) > octanol (C8), etc.). La formación de cetil parabeno no se detectó hasta pasadas 3 semanas. Se halló que los rendimientos de estos parabenos aumentaban con el tiempo.
Se llevó a cabo otro grupo de experimentos para entender el papel del caldo de células enteras (WCB) en la formación de los nuevos análogos de parabeno. En 4 experimentos diferentes se realizaron los siguientes cambios en la formulación : - Experimento 1: Propil parabeno (sin metil parabeno) + WCB + otros componentes - Experimento 2: Metil parabeno (sin propil parabeno) + WCB + otros componentes - Experimento 3: Sin parabenos (ambos) + WCB + otros componentes - Experimento 4 : Metilparabeno + propilparabeno + WCB + otros componentes.
Las formulaciones anteriores se extrajeron por separado y los extractos en bruto obtenidos fueron analizados mediante LCMS . La formación de hexil parabeno se observó sólo en los dos primeros experimentos. De este modo, estos experimentos sugieren que el WCB desempeña un papel muy importante en la formación de estos parabenos.
Ejemplo 3. Aislamiento de Templazol A y B Métodos y Materiales Se utilizó el siguiente procedimiento para la purificación de Templazol A y B extraído a partir del cultivo de células de Burkholderia sp (ver Figura 3) : El caldo de cultivo resultante de la fermentación de 10 L de Burkholderia (A396) en medio de crecimiento Hy soja se extrae con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) agitando la suspensión celular con resina a 225 rpm durante dos horas a temperatura ambiente. La resina y la masa de células se recogen por filtración a través de gasa y se lavan con agua DI para eliminar las sales. La resina, la masa de células y la gasa se sumergen a continuación durante 2 h en acetona después de lo cual la acetona se filtra y se seca al vacio empleando un evaporador rotatorio para dar el extracto en bruto. El extracto en bruto se fracciona a continuación mediante cromatografía de líquidos al vacío C18 en fase reversa (H20/CH3OH; gradiente de 90:10 a 0:100%) para dar 11 fracciones. Estas fracciones se concentran a continuación a sequedad empleando un evaporador rotatorio y los residuos secos resultantes se examinan para determinar la actividad biológica utilizando un ensayo de siembra de lechuga en placas de 96 pozos. Las fracciones activas son luego sometidas a HPLC de fase reversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) para dar compuestos puros, que se examinan a continuación en los bioensayos mencionados anteriormente para localizar/identificar los compuestos activos. Para confirmar la identidad del compuesto, se registraron datos espectroscópicos adicionales tales como CL/EM y RMN.
La fracción activa 5 se purificó adicionalmente por HPLC utilizando una columna C-18 (Phenomenex, Luna lOu C18 (2) 100 A, 250 x 30), un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (0-10 min; CH3CN 80% en agua, 10-25 min; CH3CN 80 - 65% en agua, 25-50 min; CH3CN 65 - 50 % en agua, 50-60 min; CH3CN 50-70%, 60-80 min; CH3CN 70-0% en agua, 80-85 min; CH3CN 0 - 20% en agua) a un velocidad de 8 mL/min y detección al UV a 210 nm, para dar templazol B, tiempo de retención 46.65 min. La otra fracción activa 7 se purificó también utilizando una columna de HPLC C-18 (Phenomenex, Luna lOu C18(2) 100 A, 250 x 30), un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (0-10 min; CH3CN 80 % en agua, 10-25 min; CH3CN 80 - 60 % en agua, 25-50 min; CH3CN 60 - 40% en agua, 50-60 min; CH3CN 40%, 60-80 min; CH3CN 40-0% en agua, 80-85 min; CH3CN 0-20 % en agua) a un velocidad de 8 mL/min y detección al UV a 210 nm, para dar templazol A, tiempo de retención 70.82 min.
El análisis por espectrometría de masas de los compuestos puros se llevó a cabo en un instrumento de electroaspersion (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus utilizando los modos de ionización positivo y negativo en un modo de barrido completo ( /z 100-1500 Da) en un espectrómetro de masa DECA LCQ xpplus (Thermo Electron Corp., San José, CA) . La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) s realizó en un instrumento Thermo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA, un inyector automático, una bomba MS y una columna Luna C18 de 5 µp? de 4.6 mm x 100 mm ( Phenomenex ) . El sistema de disolventes consistía en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) . La fase móvil comienza a 10% de disolvente B y se incrementa linealmente hasta 100% de disolvente B durante 20 min y después se mantiene durante 4 min, y finalmente vuelve a 10% de disolvente B durante 3 min y se mantiene durante 3 min. La velocidad fue de 0.5 mL/min. El volumen de inyección fue de 10 y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un muestreador automático. Los compuestos se analizaron por LC-MS utilizando una cromatografía de líquidos en fase reversa. El análisis por espectrometría de masas de los presentes compuestos se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: El velocidad del gas átomo de nitrógeno se fijó en 30 y 15 arb para el velocidad de gas impulsor y auxiliar/de barrido, respectivamente. Se realizó una ionización por electroaspersión con un voltaje de pulverización fijado en 5000 V y un voltaje capilar a 35.0 V. La temperatura del capilar se fijó en 400 °C. Los datos se analizaron en un software Xcalibur. El compuesto activo templazol A tiene una masa molecular de 298 y mostró un ion m/z a 297.34 en el modo de ionización negativo. El cromatograma por LC-MS para templazol B sugiere una masa molecular de 258 y exhibió un ion m/z a 257.74 en el modo de ionización negativo.
Los espectros de RMN-^H y 13C, y R N de 2D se realizaron en un espectrómetro Bruker de gradiente de campo a 500 MHz y 600 MHz. La referencia se fijó en el estándar interno tetrametilsilano (TMS, 0.00 ppm) .
Para la determinación de la estructura de templazol A, el compuesto purificado con un peso molecular de 298 se analizó adicionalmente utilizando un instrumento de RMN de 500 MHz , y tiene valores de d en RMN-1H de 8.44 , 8.74, 8.19, 7.47, 7.31, 3.98, 2.82, 2.33, 1.08 y valores de d en RMN-13C de 163.7, 161.2, 154.8, 136.1, 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 111.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1, 22.7, 22.7. Templazol A tiene bandas de absorción al UV a 226, 275, 327 nm, lo que sugiere la presencia de anillos de indol y oxazol. La fórmula molecular, C1 H18N2O3, fue determinada por interpretación de datos de XH, 13C RMN y HRESI MS m/z 299.1396 (M+H)+ (Calculado para C17H19 2O3, 299.1397), lo que implica un alto grado de insaturación mostrado por 10 equivalentes de dobles enlaces . El espectro de 13C RMN reveló señales para los 17 átomos de carbono, incluyendo dos metilos, un metoxi, un carbono metileno, un metino alifático, un carbonilo de un éster, y once átomos de carbono aromáticos. La presencia de indol 3 ' -sustituido fue revelada a partir de datos espectrales de 1ñ-1E COSY y HMBC . y HMBC indicaron también la presencia de un grupo éster metílico de ácido carboxílico y una cadena lateral -CH2-CH- (CH3 ) 2. A partir del análisis detallado de datos de 1ti-1H COSY, 130 y HMBC se calculó que el compuesto contenía un núcleo oxazol. A partir del análisis 2D se encontró que la cadena lateral de iso-butilo se unía en posición C-2, un éster metílico del ácido carboxílico en posición C-4 y la unidad de indol en posición C-5 para dar templazol A.
El segundo compuesto con actividad herbicida, templazol B, con un peso molecular de 258 se analizó adicionalmente utilizando un instrumento de RMN de 500 MHz, y tiene valores d en RMN-1H de 7.08, 7.06, 6.75, 3.75, 2.56, 2.15, 0.93, 0.93 y valores de d en RMN-13C de 158.2, 156.3, 155.5, 132.6, 129.5, 129.5, 127.3, 121.8, 115.2, 115.2, 41.2, 35.3, 26.7, 21.5, 21.5. La fórmula molecular, se asigna como Ci5H18N202, la cual se determina por interpretación de datos de 1H,13C RMN y masa. El espectro de RMN-13C reveló señales para los 15 átomos de carbono, incluyendo dos metilos, dos átomos de carbono metilénicos, un metino alifático, un carbonilo amídico, y nueve átomos de carbono aromáticos. La naturaleza general de la estructura se dedujo a partir de espectros de 1R y 13c RMN que mostraron un anillo aromático para-sustituido [d 7.08 (2H, d, J = 8.8 Hz) , 6.75 (2H, d, J = 8.8 Hz), y 132.7, 129.5, 115.2, 127.3, 115.2, 129.5] . El espectro de RMN-^H de es'ta estructura junto con los espectros de 1H-1H COSY y HSQC, mostraron las señales características de un residuo isobutilo [d 0.93 (6H, d, J = 6.9 Hz) , 2.15 (1H, sept, J = 6.9 Hz ), 2.57 (2H, d, J = 6.9 Hz) . Además, se encontraron también un protón olefínico/aromático en (d 7.06, s) y un grupo carbono de carbonilo (d 158.9) en el espectro de 1H y 130 RMN . En la inspección del espectro de HMBC, la señal H-l' en el resto isobutilo se correlacionó con el carbono olefínico (C-2, d 156.3) , y el protón olefínico H-4 se correlacionó con (C-5, d 155.5; C-2, 156.3 y C-l", 41.2) . La señal de metileno a d 3.75 se correlacionó con C-5, C-4, así como el C-2" del resto aromático para-sustituido. Todas estas correlaciones observadas sugirieron la conectividad entre los restos isobutilo, y bencilo para-sustituido para el esqueleto de la estructura mostrada. Además, se asigna el grupo carboxamida en la posición para- del resto bencilo basándose en la correlación de HMBC del protón aromático en la posición H-4'' y H-6' ' . De este modo, sobre la base de los datos anteriores, la estructura fue designada como templazol B.
Ejemplo 4. Aislamiento de FR901228 El caldo de células enteras derivado de la fermentación de Burkholderia sp . en un medio de crecimiento indefinido se extrajo con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) mediante agitación de la suspensión celular cón resina a 225 rpm durante dos horas a temperatura ambiente. La resina y la masa de células se recolectaron por filtración a través de gasa y se lavaron con agua DI para eliminar las sales. La resina, la masa de células y la gasa se sumergieron a continuación durante 2 h en acetona después de lo cual se filtró la acetona y se secó al vacio empleando un evaporador rotatorio para dar el extracto en bruto. El extracto en bruto se fracciona a continuación mediante cromatografía de líquidos al vacío C18 en fase reversa (H2O/CH3OH; gradiente de 90:10 a 0:100%) para dar 11 fracciones. Estas fracciones después se concentran a sequedad empleando un evaporador rotatorio y los residuos secos resultantes se analizan para determinar la actividad biológica utilizando bioensayos en insectos y bioensayos herbicidas . Las fracciones activas se somete a continuación a HPLC de fase reversa/normal (Spectra System P4000; Thermo Scientific) para dar los compuestos puros, que se investigan a continuación en bioensayos herbicidas, insecticidas y nematicidas descritos a continuación para localizar/identificar los compuestos activos. Para confirmar la identidad del compuesto, se registran datos espectroscópicos adicionales como CL/EM y RMN.
El análisis por espectroscopia de masas de picos activos se lleva a cabo 'en un instrumento de electroaspersión (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus utilizando los modos de ionización positivo y negativo en un modo de barrido completo [m/z 100-1500 Da) en un espectrómetro de masas DECA LCQ xpplus (Thermo Electron Corp., San José, CA) . La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) s realizó en un instrumento Thermo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA, un inyector automático, una bomba MS y una columna Luna C18 de 5 µ?? de 4.6 mm x 100 mm (Phenomenex) . El sistema de disolventes consistía en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) . La fase móvil comienza a 10% de disolvente B y se incrementa linealmente hasta 100% de disolvente B durante 20 min y después se mantiene durante 4 min, y finalmente vuelve a 10% de disolvente B durante 3 min y se mantiene durante 3 min. El velocidad fue de 0.5 mL/min. El volumen de inyección fue de 10 µ?, y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un muestreador automático. Los compuestos se analizaron por LC-MS utilizando una cromatografía de líquidos en fase reversa. El análisis por espectrometría de masas de los presentes compuestos se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: El velocidad del gas átomo de nitrógeno se fijó en 30 y 15 arb para el velocidad de gas impulsor y auxiliar/de barrido, respectivamente. Se realizó una ionización por electroaspersion con un voltaje de pulverización fijado en 5000 V y un voltaje capilar a 35.0 V. La temperatura del capilar se fijó en 400 °C. Los datos se analizaron en un software Xcalibur. Sobre la base del análisis de LC-MS, el compuesto activo insecticida de la fracción 6 tiene una masa molecular de 540 en el modo de ionización negativo.
Para la determinación de la estructura, el compuesto insecticida purificado de la fracción 6 con un peso molecular de 540 se analizó adicionalmente utilizando un instrumento de RMN de 500 MHz , y tuvo valores de d en RMN-1H de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21 , 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02, y valores de d en RMN-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51. Los datos de RMN indican que el compuesto contiene grupos amino, éster, ácido carboxilico, metilo alifático, etilo, metileno, oximetileno, metino, oximetino y azufre. El análisis detallado de de los espectros unidimensionales y en 2D de RMN confirma la estructura del compuesto FR901228 como un compuesto conocido.
Ejemplo 5. Aislamiento de Templamida A, , FR901465 y FR901228 Métodos y Materiales El caldo de cultivo resultante de la fermentación de 10 L de Burkholderia (A396) en medio de crecimiento Hy soja se extrae con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) agitando la suspensión celular con resina a 225 rpm durante dos horas a temperatura ambiente. La resina y la masa de células se recogen por filtración a través de gasa y se lavan con agua DI para eliminar las sales. La resina, la masa de células y la gasa se sumergen a continuación durante 2 h en acetona después de lo cual la acetona se filtra y se seca al vacio empleando un evaporador rotatorio para dar el extracto en bruto. El extracto en bruto se fracciona a continuación mediante cromatografía de líquidos al vacío C18 en fase reversa (H20/CH3OH; gradiente de 90:10 a 0:100%) para dar 11 fracciones. Estas fracciones se concentran a continuación a sequedad empleando un evaporador rotatorio y los residuos secos resultantes se examinan para determinar la actividad biológica utilizando un ensayo de siembra de lechuga (herbicida) y con gusano soldado en tercer estadio (insecticida) en placas de 96 pozos. Las fracciones activas son luego sometidas a separación repetida por HPLC de fase reversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) para dar compuestos puros, que se examinan a continuación en los bloensayos mencionados anteriormente para localizar /identificar los compuestos activos. Para confirmar la identidad del compuesto, se registraron datos espectroscópicos adicionales tales como CL/EM, HRMS y RMN .
La fracción activa 6 se purificó adicionalmente por HPLC utilizando una columna C-18 (Phenomenex, Luna lOu C18(2) 100 A, 250 x 30), un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (0-10 min; CH3CN 80% en agua, 10-25 min; CH3CN 80 - 65% en agua, 25-50 min; CH3CN 65 - 50 % en agua, 50-60 min; CH3CN 50-70%, 60-80 min; CH3CN 70-0% en agua, 80-85 min; CH3CN 0 - 20% en agua) a un velocidad de 8 mL/min y detección al UV a 210 nm, para dar templamida A, tiempo de retención 55.64 min y FR901465, tiempo de retención 63.59 min y FR90128, tiempo de retención 66.65 min, respectivamente. La otra fracción activa 6 también se purificó utilizando una columna de HPLC C-18 (Phenomenex, Luna lOu C18(2) 100 A, 250 x 30), un gradiente con sistema disolvente de agua : acetonitrilo (0-10 min; CH3CN 70-60% en agua, 10-20 min; CH3CN 60-40% en agua, 20-50 min; CH3CN 40 - 15% en agua, 50-75 min; CH3CN 15 - 0%, 75-85 min; CH3CN 0 - 70% en agua) a un velocidad de 8 mL/min y detección al UV a 210 nm, para dar templamida B, tiempo de retención 38.55 min.
El análisis por espectrometría de masas de los compuestos puros se llevó a cabo en un ' instrumento de electroaspersión (ESI) Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus utilizando los modos de ionización positivo y negativo en un modo de barrido completo (m/z 100-1500 Da) en un espectrómetro de masa LCQ DECA xpplus (Thermo Electron Corp., San José, CA) . La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) s realizó en un instrumento Thermo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA, un inyector automático, una bomba S y una columna Luna C18 de 5 µ?? de 4.6 mm x 100 mm (Phenomenex) .
El sistema de disolventes consistía en agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B) . La fase móvil comienza a 10% de disolvente B y se incrementa linealmente hasta 100% de disolvente B durante 20 min y después se mantiene durante 4 min, y finalmente vuelve a 10% de disolvente B durante 3 min y se mantiene durante 3 min. El velocidad fue de 0.5 mL/min. El volumen de inyección fue de 10 µL y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un muestreador automático. Los compuestos se analizaron por LC-MS utilizando una cromatografía de líquidos en fase reversa. El análisis por espectrometría de masas de los presentes compuestos se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: El velocidad del gas átomo de nitrógeno se fijó en 30 y 15 arb para el velocidad de gas impulsor y auxiliar/de barrido, respectivamente.' Se realizó una ionización por electroaspersion con un voltaje de pulverización fijado en 5000 V y un voltaje capilar a 45.0 V. La temperatura del capilar se fijó en 300 °C. Los datos se analizaron en un software Xcalibur. El compuesto activo templamida A tiene una masa molecular de 555 sobre la base del pico de m/z a 556.41 [M + H]+ y 578.34 [M + Na]+ en modo de ionización positivo. El análisis por LC-MS en el modo de ionización positivo para templamida B sugiere una masa molecular de 537 basada en los iones m/z a 538.47 [M + H] + y 560.65 [M + Na] + . Los pesos moleculares de los compuestos FR901465 y FR901228 son asignados como 523 y 540, respectivamente, sobre la base del análisis de LCMS .
Los espectros de 1H, 13c y 2D de RMN se midieron en un espectrómetro Bruker de gradiente de campo a 600 MHz . La referencia se establece en el estándar interno tetrametilsilano (TMS, 0.00 ppm) .
Para la determinación de la estructura de templamida A, el compuesto purificado con peso molecular 555 se analiza adicionalmente utilizando un instrumento de RMN de 600 MHz, y tiene valores de d en RMN-XH de 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70 , 3.59, 3.47, 3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81, 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04 y valores de d de 13C RMN en 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71, 129.99, 126.20/ 123.35 , 99.75, 82.20, 78.22, 76.69', 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11, 14.90, 12.81, 9.41. El espectro de 13C RMN presenta 28 señales de carbono discretas que se atribuyen a seis metilos, cuatro átomos de carbono metilénicos y trece metinos incluyendo cinco sp2 , cuatro átomos de carbono cuaternarios.
La fórmula molecular, C28H 5NO10, se determina por interpretación de los datos de RMN-^H, 1 C y HRESI MS . El análisis detallado de datos espectrales de 1H-1H COSY, HMBC y HMQC revela las subes tructuras siguientes (I - IV) y dos grupos aislados metileno y metilo singlete. Estas subestructuras son conectadas posteriormente mediante las correlaciones de HMBC clave para dar la estructura planar del compuesto, que aún no ha sido informada en la literatura y es designada como templamida A. Esta molécula de policétido contiene dos anillos tetrahidropiranosa , y una amida conj ugada .
Subestructuras I-IV elucidadas a través del análisis de los datos espectroscópicos de RMN unidimensional y en 2D.
El análisis de (+) ESIMS para el segundo compuesto herbicida, muestra iones m/z a 538.47 [M + H]+ y 560.65 [M + Na]+ correspondientes al peso molecular de 537. La fórmula molecular de C28H43 O9 se determina por interpretación del análisis de datos de ESIMS y RMN. El XH y 13c RMN de este compuesto es similar al de templamida A, excepto porque aparece un nuevo -CH2- aislado en lugar del grupo metileno no acoplado de templamida A. La constante de acoplamiento geminal pequeña de 4.3 Hz es característica de la presencia de un grupo metilesin epóxidos. La presencia de este epóxido se confirma además por el desplazamiento en RMN-13C de 60.98 en la templamida A a 41.07 en el compuesto con PM 537.
La diferencia de las fórmulas moleculares entre estos dos compuestos es explicada razonablemente por la eliminación de la molécula de agua seguida por la formación de un epóxido. De esta manera, sobre la base del análisis de RMN y MS, se asignó la estructura para el nuevo compuesto y se designó como templamida B.
Para la determinación de la estructura, el compuesto purificado a partir de la fracción 6 con peso molecular 523 se analiza adicionalmente utilizando un instrumento de RMN de 600 MHz, y tiene valores de desplazamiento en RMN-1?! de 6.41, 6.40, 6.01, 5.98, 5.68, 5.56, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.65, 3.59, 3.55, 3.50, 2.44, 2.26, 2.04, 1.96, 1.81, 1.75, 1.37, 1.17, 1.04, y valores de desplazamiento en RMN-13C de 172.22, 167.55, 144.98, 138.94, 135.84, 130.14, 125.85, 123.37, 99.54, 82.19, 78.28, 76.69, 71.31, 70.13, 69.68, 48.83, 42.52, 36.89, 33.11, 30.63, 25.99, 21.20, 20.38, 18.14, 14.93, 12.84. El análisis detallado de los espectros de RMN_1H y 13C del compuesto sugirió que este compuesto era bastante similar al compuesto templamida B, la única diferencia estaba en la cadena lateral éster; un resto acetato estaba presente en lugar del resto propionato en la cadena lateral.
El análisis detallado de los espectros unidimensional y en 2D de RMN confirma la estructura del compuesto FR901465 como un compuesto conocido.
Sobre la base del análisis de LC-MS, el otro compuesto derivado de la fracción 6 tiene una masa molecular de 540 en el modo de ionización negativo.
Para la determinación de la estructura, el compuesto purificado a partir de la fracción 5 con peso molecular 540 se analiza adicionalmente utilizando un instrumento de RMN de 500 MHz, y tiene valores de desplazamiento en RMN-1!! de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02, y valores de desplazamiento en RMN-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, '62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00', 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51.
Los datos de RMN indican que el compuesto contiene grupos amino, éster, ácido carboxilico, metilo alifático, etilo, metileno, oximetileno, metino, oximetino y azufre. El análisis detallado de los espectros unidimensionales y en 2D de RMN confirma la estructura del compuesto FR901228 como un compuesto conocido.
El peso molecular para el otro compuesto activo (F8H17) derivado de la Fracción F8 fue asignado como de 1080 basado en el pico del ion molecular a 1081.75 (M + H) en el modo ESI positivo y confirmado además por los ESIMS negativos con pico base a 1079.92. Este compuesto mostró absorción al UV a 234 nm.
Ejemplo 6. Burkholderia sp. , como alguicida Se cultiva Burkholderia sp . A396 en un medio mineral indefinido durante 5 días (25 °C, 200 rpm) . Las células se separan del sobrenadante por centrifugación a 8.000 g, y el sobrenadante libre de células se utiliza para probar la actividad alguicida contra una especie de algas unicelulares (P. subcapitata) y una especie de alga azul-verdosa {Anabaena sp.) . Se añade una cantidad creciente especificada de sobrenadante eri los pozos de una placa de poliestir'eno de 24 pozos que presenta las algas especificadas creciendo en 750 microlitros de medio de Gorham a fin de determinar la curva de dosis respuesta para el sobrenadante de prueba en cada tipo de algas .
Cada tratamiento se realiza en dos repeticiones, y se utiliza el medio de crecimiento blanco como un control negativo. La placa se cierra con una tapa y se incuba durante 48 horas bajo luz constante a temperatura ambiente. Después de 48 horas, se mide la fluorescencia (a 700 nía) de la suspensión en cada pozo utilizando un lector de placas SpectraMax Gemini XS, y la reducción de la fluorescencia comparada con el control sin tratar se convierte en un porcentaje de control del crecimiento de las algas.
Los resultados presentados en la Tabla 9 a continuación muestran un excelente control de las algas unicelulares y un buen control o efecto algistático de las algas azul-verdosas.
Tabla 9. Control de dos especies de algas por caldo libre de células de' Burkholderia A396 medido como una reducción de la fluorescencia a 700 nm Ejemplo 7: Control de Chlam domonas reinhardtii mediante un extracto en bruto y fracciones de Burkholderia sp.
Las fracciones obtenidas a partir del fraccionamiento del extracto en bruto de Burkholderia sp. fueron analizadas en cuanto a actividad alguicida contra Chlamydomonas reinhardtii. Se añadió un volumen creciente de fracción (con concentración de 20 mg/mL en etanol) a una placa de poliestireno transparente de 48 pozos con 750 microlitros del alga especificada en crecimiento. Cada tratamiento se realizó por duplicado y se utilizó el disolvente (etanol) como control negativo. La placa se cerró con una tapa y se incubó durante 72 horas bajo luz constante a temperatura ambiente. Después de 72 horas, se midió la fluorescencia (a 680 nm) de la suspensión en cada pozo utilizando un lector de placas SpectraMax 2 , y la reducción de la fluorescencia en comparación con el control negativo se convirtió en un porcentaje de control del crecimiento de las algas.
Cada muestra se comparó visualmente con el control negativo; un pozo que era visualmente más claro que el control negativo se calificó como activo. Los resultados presentados en la Tabla 10 a continuación muestran el control del alga especificada en las fracciones 5, 6, 7, 8, y 9. Las pruebas se realizaron por duplicado y el % del control se calculó como una reducción de la fluorescencia a 680 nm en comparación con el control negativo. Cada muestra se comparó visualmente con el control negativo; un pozo que era visualmente más claro que el control negativo se calificó como activo.
Tabla 10 : Control de Chlamydomonas reinhardtii mediante extracto en bruto y fracciones de Burkholderia sp. (MBI ) Muestra µ? de muestra % de Visual por 750 ? de Inhibición algas Blanco de solvente 22,5 0.00 No activo 11 0.00 No activo 5 0.00 No activo Extracto en bruto 22.5 97.10 Activo 11 89.54 Activo 5 90.82 Activo MBI 206F1 22,5 -74.47 No activo 11 46.47 No activo 5 46.21 No activo MBI 206F2 22.5 12.64 No activo 11 -214.35 No activo 5 -297.56 No activo MBI 206F3 22.5 -143.92 No activo 11 -740.16 No activo 5 32.68 No activo MBI 206F4 22.5 -98.S0 No activo 11 -155.41 No activo 5 58.51 No activo MBI 206F5 22.5 92.89 Activo 11 79.45 Activo 5 71.60 Débil Tabla 10. Continúa...
Muestra µ? de muestra % de Visual por 750 µ? de Inhibición algas MBI 206F6 22.5 94.88 Activo 11 96.33 Activo 5 86.45 Activo BI 206F7 22.5 97.32 Activo 11 98.96 Activo 5 97.89 Activo MBI 206F8 22.5 94.35 Activo 11 32.17 Débil 5 -13.51 No activo MBI 206F9 22,5 85.35 Activo 11 96.49 Activo 5 97.73 Activo MBI 206F10 22,5 50.30 No activo 11 48.54 No activo 5 -108.24 No activo MBI 206F11 22.5 -121.50 No activo 11 -16.21 No activo s 36.46 No activo Ejemplo 8: Efecto alguicida de un extracto en bruto y distintas fracciones obtenidas a partir de Burkholderia sp. frente a P. súbcapitata El extracto en bruto, asi como las fracciones obtenidas de Burkholderia sp . , se analizaron para determinar la actividad algúicida contra una especie de algas unicelulares {P. subcapitata) . Se añadió un volumen creciente de solución de etanol puro derivada de la redisolución de una cantidad conocida de material (concentración 10 mg/mL) correspondiente a cada muestra a los pozos de una placa de poliestireno de 24 pozos que tenia el alga especificada en crecimiento en 750 microlitros de medio de Gorham a fin de determinar el efecto algúicida de la muestra (extracto/fracciones) sobre un alga unicelular. Cada tratamiento se realizó por triplicado, y se utilizó etanol puro como control negativo. Después de mezclar, la placa se cerró con una tapa y se incubó durante 48 horas bajo luz constante a temperatura ambiente. Después de 48 horas, se midió la fluorescencia (a 700 nm) de la suspensión en cada pozo utilizando un lector de placas SpectraMax Gemini XS, y la reducción de la fluorescencia comparada con el control sin tratar se convirtió en un porcentaje de control del crecimiento de las algas. Los resultados presentados en la Tabla 11 a continuación muestran un excelente control de las algas unicelulares con las fracciones F5, F6 y F7 mientras que no se obtuvo ningún efecto algúicida sustancial con otras muestras.
Tabla 11: Efecto alguicida obtenidas a partir de Burkholderia realizado por triplicado utilizando organismo de ensayo Tabla 11. Continúa... 40.1 No activo 88.6 Activo 3.0 Activo 36.8 No activo 50.0 No activo 65.9 No activo 66.3 No activo 40.7 No activo 51.8 No activo 26.8 No activo 27.5 No activo 32.9 No activo 25;9. No activo 32.8 No activo 39.2 No activo 45.6 No activo 69.6 Débil 70.0 Débil 0.0 No activo 0.0 No activo 0.0 No activo Ejemplo 9: Control de Chlamydomonas reinhardtii mediante compuestos purificados a partir de ' un caldo de fermentación de Burkholderia sp.
Los compuestos purificados a partir del caldo de fermentación de Burkholderia sp. fueron examinados en cuanto a actividad alguicida contra Chlamydomonas reinhardtii. Se añadió un volumen creciente de los compuestos purificados (c 20 mg/mL en etanol) a una placa de poliestireno transparente de 48 pozos con 750 microlitros del alga especificada en crecimiento. Cada tratamiento se realizó por duplicado y se utilizó el disolvente como control negativo. La placa se cerró con una tapa y se incubó durante 72 horas bajo luz constante a temperatura ambiente. Después de 72 horas, se midió la fluorescencia (a 680 nm) de la suspensión en cada pozo utilizando un lector de placas Spectra ax M2 , y la reducción de la fluorescencia en comparación con el control negativo se convirtió en un porcentaje de control del crecimiento de las algas. Cada muestra se comparó visualmente con el control negativo; un pozo que era visualmente más claro que el control negativo se calificó como activo. Los resultados presentados en la Tabla 12 a continuación muestran el control del alga especificada en muestras que contienen templamida B (PM 537), FR901228 (PM 540), templazol A (PM 298) y F8H18 ( PM 1080) . Las pruebas se realizaron por duplicado y el % del control se calculó como una reducción de la fluorescencia a 680 nm en comparación con el control negativo. Cada muestra se comparó visualmente con el control negativo; un pozo que era visualmente más claro que el control negativo se calificó como activo.
Tabla 12 : Control de Chlamydomonas reinhardtix mediante compuestos purificados a partir de un caldo de fermentación de BurJchoIderia sp. (MBI 206) Tabla 12. Continúa...
Templazol A fue examinado dos veces en este bioensayo.
Ejemplo 10: Control de Scenedesmus quadricauda mediante un sobrenadante de fermentación de Burkholderia sp. tratado con calor Se cultivó Burkholderia sp . en un caldo de fermentación como se ha descrito previamente. El caldo fue tratado con calor al final de la fermentación para inactivar todas las células. Se examinó el sobrenadante libre de células para determinar actividad alguicida contra Scenedes'mus quadrícauda. Se añadió un volumen creciente de sobrenadante a una placa de poliestireno transparente de 48 pozos con 750 microlitros del alga especificada en crecimiento. Cada tratamiento se realizó por duplicado y se utilizó el medio de crecimiento blanco como control negativo. La placa se cerró con una tapa y se incubó durante 72 horas bajo luz constante a temperatura ambiente. Después de 72 horas, se midió la fluorescencia (a 680 nm) de la suspensión en cada pozo utilizando un lector de placas SpectraMax M2, y la reducción de la fluorescencia en comparación con el control negativo se convirtió en un porcentaje de control del crecimiento de las algas. Los resultados presentados en la Tabla 13 a continuación muestran el control del alga especificada. Las pruebas se realizaron por duplicado y el % del control se calculó como una reducción de la fluorescencia a 680 nm en comparación con el control no tratado.
Tabla 13: Control of Scenedesmus quadricauda mediante un sobrenadante de Burkholdería sp. , eliminada por calor (MBI 206) Material Volumen (µ?) % de Inhibición MBI 206 120 100 95.9474484 Ejemplo 11: Control de Oscillatoria tenius mediante un sobrenadante de Burkholdería sp. eliminada por calor Se cultivó Burkholdería sp. en un caldo de fermentación como se ha descrito previamente. El caldo fue tratado con calor al final de la fermentación para inactivar todas las células. Se examinó el sobrenadante libre de células para determinar actividad alguicida contra Oscillatoria tenius. Se añadió un volumen creciente de sobrenadante a una placa de poliestireno transparente de 48 pozos con 750 microlitros del alga especificada en crecimiento. Cada tratamiento se realizó por duplicado y se utilizó el medio de crecimiento blanco como control negativo. La placa sé cerró con una tapa y se incubó durante 72 horas bajo luz constante a temperatura ambiente. Después de 72 horas, se midió la fluorescencia a 680 nm de la suspensión en cada pozo utilizando un lector de placas SpectraMax M2 , y la reducción de la fluorescencia en comparación con el control no tratado se convirtió en un porcentaje de control del crecimiento de las algas. Los resultados presentados en la Tabla 14 a continuación muestran el control del alga especificada. Las pruebas se realizaron por duplicado y el % del control se calculó como una reducción de la fluorescencia a 680 nm en comparación con el control no tratado.
Tabla 14: Control de Osclllatoria tenius median-te un sobrenadante de Burkholderia. sp . eliminada por calor (MBI 206) Material Volumen (µ?) % Control o o Ejemplo 13: Eficacia de B rkholderia sp. contra araña roja de dos manchas que infestan plantas dé caléndulas Las caléndulas, Tagetes erecta, cultivadas en recipientes de 6" se infestaron con araña roja de dos manchas, Tetranychus urticae, mediante la colocación de hojas extraídas la planta huésped (al odón) sobre las plantas de ensayo. Se colocaron aproximadamente diez (10) hojas con 30-40 arañas presentes en varias partes de las plantas de ensayo durante catorce días (14) . Las plantas de ensayo se enjaularon en forma individual después de la infestación para permitir que se forme la población de arañas.- Las hojas huésped se retiraron de la planta de ensayo. No se aplicaron pesticidas a las plantas de ensayo antes de la aplicación del estudio. La aplicación de spray se aplicó utilizando una cabina de pulverización Gen3 calibrada a 100 gpa . Cada replicado se enjauló en forma individual inmediatamente después de la aplicación. Descripción de la jaula; una jaula de alambre de tomate 30" de altura x 12" de diámetro, cubierta con filtro de insecto antivirus. Las plantas de ensayo recibieron luz natural durante el ensayo. Las plantas de ensayo se regaron en el suelo cada veinticuatro (24) horas según sea necesario. Las plantas se evaluaron antes de la aplicación (pre-recuento) , 3, 5 y 7 días después de la aplicación. Cuatro hojas se seleccionaron en forma aleatoria y recolectaron de cada replicado, lo que equivale a 6 cm sq del área de superficie total evaluada. El recuento real se registró respecto de arañas roja de dos manchas vivas y muertas. Burkholderia sp . mostró ligera actividad contra las ninfas y adultos de TSSM. Esta actividad muestra potencial para las formulaciones de biopesticida contra TSSM. Los tratamientos también redujeron el número de ácaros vivos observados en las muestras. Estas es una evidencia convincente de que MBI206 muestra potencial para las formulaciones de biopesticida contra TSSM.
Ejemplo 14: Eficacia del sobrenadante de fermentación de Burkholderia sp. contra la araña roja de dos manchas que que infestan plantas de caléndulas Las caléndulas, Tagetes erecta, cultivadas en recipientes de 6" se infestaron con araña roja de dos manchas, Tetranychus urticae, mediante la colocación de hojas extraídas la planta huésped (algodón) sobre las plantas de ensayo. Se colocaron aproximadamente ocho a diez (8-10) hojas con aproximadamente 30-40 arañas presentes en varias partes de las plantas de ensayo durante catorce días (14) . Las plantas de ensayo se enjaularon en forma individual después de la infestación para permitir que se forme la población de arañas. Las hojas ' huésped se retiraron de la planta de ensayo. No se aplicaron pesticidas a las plantas de ensayo antes de la aplicación del estudio. Las plantas se trataron con 100% de sobrenadante o 10% de sobrenadante (en agua) . La aplicación del spray se aplicó para cobertura total sin escurrimiento utilizando un rociador de mano desechable. Las plantas de ensayo se colocaron en el invernadero de investigación en una mesada elevada con malla de alambre y se dispusieron en un diseño en bloque aleatorizado completo. El invernadero de investigación se controla con el sistema de control de temperatura del Procom, Micro Grow Greenhouse System. Las condiciones ambientales promediaron una temperatura alta de 85F a temperatura baja de 72F durantes las fechas de ensayo. Los niveles de humedad promedio variaron de 40% a 75%. Las plantas de ensayo recibieron luz natural durante todo el ensayo. Las plantas de ensayo se regaron en el suelo cada veinticuatro (24) horas según sea necesario. Las plantas se evaluaron antes de la aplicación (pre-recuento) , 3, 5, 7 y 14 días después de la aplicación. Las evaluaciones se tomaron en un átoral de 6cm cuadrados por replicado. El recuento real se registró como araña roja de dos manchas ninfa viva/muerta y araña roja de dos manchas adulta viva/muerta.
Ejemplo 14: Eficacia de la formulación de Burkholderia sp. (MBI 206) para controlar las araña roja de dos manchas (TSM) en frutilla - datos del campo Se evaluaron las eficacias de cinco formulaciones derivadas de agentes químicos tradicionales y MBI 206 para el control de TSM en condiciones de campo. Los trasplantes de 'Strawberry Festival' se establecieron en el campo en macizos con cobertura vegetal plástica, de 0.33 m (13 pulgadas) de alto y 0.69 m (27 pulgadas) en la parte superior y con 1.22 m de espaciado de macizo. Se aplicó irrigación aérea durante 10 días después de la colocación para ayudar al establecimiento de los trasplantes. Se usó riego por goteo para el resto del experimento. Cada parcela de 3.81 m. consistió en 20 plantes en hileras de diez plantas por macizo. Las parcelas se infestaron a partir de una colonia de laboratorio en cuatro sesiones con 10 a 20 TSM móviles, por planta. Cada sesión logró la infestación de un bloque del experimento. El experimento consistió en tratamientos de varias tasas y esguemas de aplicación de miticidas, algunos se combinaron con un adyuvante, y una verificación de no tratado. Los tratamientos se replicaron cuatro veces en un diseño RCB . Los tratamientos Savey y Acramite se aplicaron antes de que las densidades de TSM alcancen los niveles umbral (6 de enero); el resto de los programas de tratamiento comenzaron 2 semanas más tarde. Los tratamientos sé aplicaron utilizando un rociador manual con una varilla rodadora equipada con una boquilla que contiene un núcleo de 45 grados y un disco número cuatro. El rociador se presurizó con CO2, a 0.28 MPa (40 psi), y se calibró para administrar 1,121 L/ha (100 gal por acre) . Las muestras pre-tratamiento se tomaron en el Día 1 y el muestreo continuó una vez por semana hasta 2 semanas después de la aplicación de los tratamientos. Las muestras consistían en diez hojuelas seleccionadas aleatoriamente por parcela y se recolectaron del tercio medio del estrato de las plantas. Las muestras se transportaron al laboratorio donde se quitaron las TSM mótiles y huevo de las hojuelas en discos adherentes giratorios y se contaron en 1/10 de la superficie del disco para estimar las cantidades promedio por hojuela. No se pudieron realizar distinciones entre los huevos viables y no viables, en consecuencia se registró el número total de huevos. MBI 206 en la tasa más alta 33.63 L/ha (3 gal/acre) muestra la disminución del número de huevos en un nivel comparable con al menos dos de los controles químicos.
Tabla 15. Efectos de varias formulaciones de la producción del huevo TSM Tratamiento/ Tasa No. huevo de TSM/hojuela Formulación cantidad/haDía 1 Día 9 Dia 16 Día 22 Día 30 Día 37 D,a 44 Día 52 Día 58 Día 65 Non-tratado 15.5 10 27.5 12.3 25.3 122 181.5 587 559 423 B¡fenazate+ Mezcla de alquil arll 1,12 kg 3.8 6 6 0.8 8.3 20.5 3 28 66.5 128.3 polioxialcanos éteres, ácidos grasos libres y dimetil polisiloxano Dispersante no iónico 949.9 mL 6.8 15.5 11.8 16.8 31.5 148.3 114 3Z1 525.3 377 ¡16 ozfl) fenpiroxlmato EW al S% 2338.24 mL 11.3 12.8 35 19.3 11 24.5 17.8 49.8 213 234.3 {32 oz fl) fenpiroximato EC al 5% 2338.24 mt 9.3 11.8 12.3 12.5 1 34.5 20.8 28.5 97.3 240.8 15 17 22 71.5 128.S 281.5 3S3.5 533 20 12 12.5 65.5 83.3 292 478 320.5 dimetil polisitoxano MBI 206 + Mezcla de alquil aril 33.63 L 3.3 - 8.8 13.5 21 54.3 72 158 301.3 Z78 polioxialcan éteres, ácidos grasos libres y(3 gal) dimetilo poiisiloxano Ejemplo 15: Control del ácaro del tostado de los citrus (Phillocoptruta oleivora) sobre el citrus en condiciones de campo Se pulverizó MBI 206 (caldo formulado de Burkhoderia sp.) sobre naranja dulce de Valencia a razón de 11.21, 22.42, y 33.63 L/ha (1, 2, y 3 gal/acre) en combinación con 0.25% v/v/ de LI-700 ( tensioactivo ) y se administró en un volumen de 100 GPA. Se administró un solo tratamiento en comparación con una muestra no tratada. Se realizaron los recuentos de ácaros pre- tratamiento, y luego a 1, 7, 10 y 14 días después del tratamiento. Los recuentos de ácaros fueron un promedio de 10 frutos por tratamiento por punto de muestreo. Se observó una reducción de la cantidad de ácaros presentes en los tratamientos con MBI 206 a los 14 días después de los tratamientos con 11.21 y 22.42 L/ha (1 y 2 gal/acre) de MBI 206 (aproximadamente 6-8 ácaros por recuento) , cuando se compararon con el control no tratado (aproximadamente 16 ácaros por recuento) .
Ejemplo 16: Actividad insecticida (contacto por succión) de Templamida, FR901465 y FR901228 contra chinches La actividad insecticida de los compuestos puros templamida B (MBI 206; MW 537), FR 901465 (MBI 206; MW 523) y FR901228 (MBI 206; MW 540) se analizó en un ensayo de laboratorio utilizando un sistema de bioensayo de contacto por succión. Los compuestos se disolvieron en 100% de étanol a concentraciones de 1 mg/mL. Las larvas de chinche de las asclepias en 4a fase individuales, penúltima ninfa, se colocaron en un recipiente 5C Rubbermaid con 2 semillas de girasol en cada cuba y 1 taza de agua (agua en la taza de contacto con mecha de algodón) en cada cuba. Se usó una micropipeta Hamilton para aplicar 1 L (1 gota) de compuesto en el abdomen de las chinches (MWB) de cada larva. Los tubos se colocaron en el recipiente Rubbermaid y se taparon con cubierta de malla. Se trataron ocho larvas por muestra. El ensayo se incubó a 25°C, 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Las larvas se calificaron en los días 4 y 7 después de la aplicación. Los tres compuestos exhibieron actividad de contacto contra las MWB, si bien no todos los insectos murieron pero muchos fueron claramente afectados e incapaces de moverse. La mayor parte de las MWB en el día 7 habían mudado de piel, lo gue sugiere que los compuestos pueden inhibir el proceso de mudar piel o afectar el desarrollo normal de MWB. En consecuencia, FR 901465 proporcionó un mejor (87.5 %) control de las chinches, que FR 901228 (MW 540) y templamida B (La Figura 4) .
Ejemplo 17: Actividad insecticida de los compuestos puros contra Lygus hesperús estapa 2a tardía/3a temprana Se analizó la actividad insecticida de los cuatro compuestos, templamida A, templamida B, FR901465 & FR901228 aislados de Burkholderia en un ensayo de laboratorio que usa una placa de 12 pozos con el sistema de bioensayo de porotos verdes tratados. El compuesto se disolvió en 100% de etanol a concentraciones de 1 mg/mL y se añadieron 500 mL de esta muestra a 3.5 mL de agua para obtener un volumen total de 4 mL que contiene 0.25 mg/mL de concentración del compuesto. Los porotos verdes se lavaron primero en una solución blanqueadora y luego se sentaron en agua para lavar. Los porotos se secaron antes de usar y luego se cortaron con tijeras para caber en los pozos de la placa de 12 pozos. Con la ayuda de pinzas se remojaron los porotos en un tubo falcon de plástico de 15 mL que contienen cada tratamiento y luego se sumergieron en el tratamiento durante exactamente 1 minuto. Se colocó una parte del poroto en cada pozos y luego se colocaron Lygus hesperús individuales de la etapa 2a tardia/3a temprana en los pozos con ayuda del cepillo. Se usó sellador de placa para cubrir la placa y el orificio en el sellador de la placa para aireación. Se contaron las cantidades de Lygus/pozo y las placas se colocaron en la mesada. Las larvas se calificaron en 24, 48 y 120 horas después de la aplicación. Sobre' la base de los resultados presentados en la Figura 5, se halló que el compuesto FR 901465, es el más potente con mortalidad de 91.2%, seguido por la templamida B con 69.2%, y FR901228 con 51.7%. La templamida A fue inactiva en el bioensayo de alimentación de Lygus . El control positivo usado en esta prueba fue Avid (Avemectin)a la tasa de 13 mL/10 mL .
Ejemplo 18: Actividad nematicida de FR901228 La muestra pura de FR 901228 se analizó utilizando un bioensayo de placa de cultivo celular de 96 pozos in vitro. Se expusieron 15-20 nematodos en una 50 µ? de solución de agua a 3 µ? de una solución de 20 mg/mL de FR 901228 durante un periodo de 24 horas a 25C. Una vez que se completó el periodo de incubación, los resultados se registraron sobre la base de la clasificación visual de la inmovilidad de los nematodos juveniles (J2) en cada pozo tratado con los compuestos; cada tratamiento se analizó en replicado de 4 pozos. Se incluyen tres controles en cada ensayo; 1 positivo (1% Avid) & 2 negativo (DMSO & agua) . Los ensayos (TI) se llevaron a cabo utilizando nematodos de vida libre (FLN) y el rastreo (T2) se llevó cabo utilizando los nematodos M. incógnita , las muestras se disolvieron en 100% de DMSO. FR 901228 (MW 540) mostró el excelente control con inmovilidad de 75% frente a los nematodos de vida libre en comparación con M. incógnita con 75% de inmovilidad.
DEPÓSITO DE MICROORGANISMO El siguiente material biológico se ha depositado bajos los términos del Tratado de Budapest con la Agricultural Research Culture Collection (NRRL) , 1815 N. University Street, Peoría, Illinois 61604 USA, y se asignó el siguiente número : La cepa se ha depositado en condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la tramitación de esta solicitud de patente a uno determinado por el Commissioner de Patents and Trademarks para tener derecho a la misma bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible según sea requerido por las leyes de patente extranjera en los países donde las contrapartes de la solicitud presente o su progenie sean presentadas. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la presente invención en derogación dé los derechos de la patente concedidos por la acción gubernamental.
Si bien esta invención se ha descripto con referencia a las modalidades de realización especificas, los detalles de esta no se consideran como limitantes, ya que es obvio que se pueden usar varios equivalentes, cambios y modificaciones y aún están dentro del alcance de la presente invención.
Se citan varias referencias a lo largo de esta memoria descriptiva, cada una de las cuales se incorpora en la presente en su totalidad.
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Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES : I. Una formulación caracterizada porque comprende: (A) una cepa aislada o caldo de fermentación caracterizados porque comprenden células y medio de cultivo de una Burkholdería cepacia no especifica, Burkholderia plantari no especifica, Burkholderia gladioli no especifica, Burkholderia sp . , Burkholderia cepacia no especifica, Burkholderia multivorans no especifica, Burkholderia sp . , que tiene las siguientes características: (1) la secuencia del gen de ARNr 16S caracterizada porque comprende la secuencia directa que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 8, II, 12 y una secuencia inversa que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14 y 15; (2) actividad pesticida; (3) produce un compuesto pesticida seleccionado del grupo que consiste en: (a) Un compuesto que posee las siguientes propiedades: (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (ii) valores de desplazamiento (d) en R N-^H de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) presenta valores d en R N-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (iv) un tiempo de retención en la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna para HPLC C-18 de fase reversa utilisando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (b) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster, que es un derivado carboxílico (carboxylic ester group) , al menos 17 átomos de carbono, al menos 3 átomos de oxígeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (c) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos une residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida, al menos 15 átomos de carbono, al menos 2 átomos de oxigeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (d) un compuesto que contiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono, al menos ocho átomos de oxigeno y al menos un átomo de átomo de nitrógeno, y (e) un compuesto que contiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno y al menos 1 átomo de átomo de nitrógeno; (4) no es patogénica para los animales vertebrados; (5) es susceptible a kanamicina, cloranfenicol , ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprima, y (6) contiene los ácidos grasos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3-OH, 14:0, ciclo 19:0 co8c, 18:0, y (B) parabeno de C1-C7, alcohol de C2-C17 y detergente. 2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dicho parabeno de Cl-7 está presente en la cantidad de aproximadamente 0.01-5.00 %, el alcohol de C2-C17 está presente e la cantidad de aproximadamente 0.001-10.00 %, y el detergente está presente en la cantidad de aproximadamente 0.001-10%. 3. Un método para obtener una sustancia efectiva como pesticida derivada de la formulación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha sustancia efectiva como pesticida es: (a) una sustancia que tiene las siguientes propiedades: (1) tiene propiedades pesticidas; (ii) tiene un peso molecular de aproximadamente 210-240 como se determinó por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/E ) ; (iii) tiene valores d en R N-^ de 7.90, 6.85, 4.28, 1.76, 1.46, 1.38, 1.37, 0.94; (iv) tiene valores d en RMN-13C de 166.84, 162.12, 131.34 (2C) , 121.04, 114.83 (2C) , 64.32, 31.25, 28.43, 25.45, 22.18, 12.93; (v) tiene un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 15-20 minutos en una columna C-18 de HPLC de fase reversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) como un sistema gradiente de disolventes, (0-20 min; 90-0% de CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% de CH3CN, 24-27 min; 0 -90% de CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% de CH3CN acuoso), a 0.5 mL/min de velocidad de flujo y detección UV a 210 nm; (vi) espectro de RMN- C que presenta 13 señales de carbono separadas asignadas a un metilo, cinco átomos de carbono de metileno, cuatro metinos, y tres átomos de carbono cuaternarios; (vii) tiene una fórmula molecular de C13H18O3 que se determinó por la interpretación del análisis de los datos de ESIMS y RMN; (viii) tiene bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm y más particularmente a aproximadamente 248 nm o (b) una sustancia que tiene la estructura en donde X, es de modo independiente -O, -NR, o -S, en donde R es H o alquilo de C1-C10; Ri/ 2r R3/ R4, Rs, y Re son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, eteroarilo sustituido, heterocíclo, heterocíclo sustituido, cicloalquilo , cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida , o sulfurilo caracterizado porque comprende: (A) proporcionar la formulación de conformidad con la reivindicación 1; (B) incubar dicha formulación durante un tiempo y a una temperatura suficiente para producir dicha sustancia efectiva como pesticida y (C) aislar dicha sustancia efectiva como pesticida. 4. Una combinación caracterizada porque comprende (A) la formulación de conformidad con la reivindicación 1 o sustancia efectiva como pesticida derivada de esta y (B) al menos una de (1) una segunda sustancia, donde dicha segunda sustancia es un alguicida o acaricida de origen químico o biológico o (2) al menos uno de un portador, diluyente, tensioactivo, adyuvante aceptable para uso como pesticida. 5. Una combinación caracterizada porque comprende (I) una primera sustancia seleccionada del grupo que consiste en (A) un cultivo puro, fracción celular, sobrenadante o extracto derivado de una cepa aislada de una Burkholdería cepacia no específica, Burkholdería plantar! no específica, Burkholdería gladioli no específica, Burkholdería sp. Burkholdería cepacia no específica, Burkholdería multivorans no específica, Burkholderia sp. que tiene las siguientes características: (1) una secuencia del gen de ARNr 16S que comprende la secuencia directa que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 8, 11, 12 y una secuencia inversa que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 9, 10, 13, 14 y 15; (2) actividad pesticida; (3) produces un compuesto pesticida seleccionado del grupo que consiste en: (a) un compuesto que tiene las siguientes propiedades : (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (ii) valores d en RMN^H de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23, 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene valores d en R N-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (iv) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (b) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster, que es un derivado carboxílico (carboxylic ester group) , al menos 17 átomos de carbono, al menos 3 átomos de oxígeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (c) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida, al menos 15 átomos de carbono, al menos 2 átomos de oxígeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (d) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos .seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono, al menos ocho átomos de oxígeno y al menos un átomo de átomo de nitrógeno, y (e) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno y al menos 1 átomo de nitrógeno; (B) un compuesto pesticida aislado, opcionalmente obtenible de una especie Bur kholderia, seleccionado del grupo que consiste en: (1) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster, que es un derivado carboxilico (carboxylic ester group) ; al menos 17 átomos de carbono y al menos 3 oxigeno y 2 átomos de nitrógeno; y que tiene al menos de uno de los siguientes: (a) un peso molecular de 275-435; (b) valores de d en RMN-^H de 8.44, 8.74 , 8.19, 7.47, 7.31, 3.98, 2.82, 2.33, 1.08; (c) valores de d en R N-13C de 163.7, 161.2, 154.8, 136.1, 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 111.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1, 22.7, 22.7; (d) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-20 minutos en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando como gradiente un sistema disolvente de agua : acetonitrilo (CH3CN) y detección UV a 210 nm; (e) bandas de absorción UV a 226, 275, 327 nm; (2) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo amida; al menos 15 átomos de carbono, al menos 2 átomos de oxígeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; y al menos una de las siguientes características: (a) un peso molecular de aproximadamente 240-290 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (b) valores de d en R N-1!! de aproximadamente 7.08, 7.06, 6.75, 3.75, 2.56, 2.15, 0.93, 0.93; (c) valores de d en RMN-13C de 158.2, 156.3, 155.5, 132.6, 129.5, 129.5, 127.3, 121.8, 115.2, 115.2, 41.2, 35.3, 26.7, 21.5, 21.5; (d) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC en fase reversa utilizando como gradiente agua : acetonitrilo (CH3CN) y (e) bandas de absorción UV en aproximadamente 230, 285, 323 nm; (3) un compuesto sin epóxidos que comprende al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa , al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono, al menos ocho átomos de oxígeno y un átomo de nitrógeno, y al menos una de las siguientes características: (a) tiene un peso molecular de aproximadamente 530-580 determinado por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (b) valores de d en RMN^H de 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81, 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04; (c) valores de d en R N-13C de 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71, 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11, 14.90, 12.81, 9.41; (d) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un agua : acetonitrilo (CH3CN) con un sistema disolvente por gradiente y detección UV a 210 nm; (e) tiene una fórmula molecular de C28H45NO10, que fue determinada por la interpretación del Análisis de los datos de ESIMS y RMN; (f) tiene bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm; (4) un compuesto que comprende (a) al menos un grupo éster, al menos un grupo amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno y al menos 1 átomo de nitrógeno, (b) valores de d en R N-13C de 174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41, 98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45, 31.67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04, (c) una fórmula molecular de C28H 3NO9 y al menos uno de : (i) valores de d en RMN-1!-! de aproximadamente 6.41, 6.40, 6.01, 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81, 1.76, 1.42, 1.38, i:i7, 1.12, 1.04; (ii) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (iii) bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm; (II) opcionalmente una segunda sustancia, caracterizada porque dicha segunda sustancia es un alguicida o acaricida de origen químico o biológico, y (III) opcionalmente al menos uno de: un portador, diluyente, tensioactivo, adyuvante. 6. La combinación de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5, caracterizada porque dicha combinación es una composición. 7. La combinación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque dicha sustancia efectiva como pesticida tiene la estructura En donde X, es -0; Ri es hidroxi, R2, R3, R4, R5 son H, R6 alquilo de C4-10, alquilo de C4-10 sustituido. 8. La combinación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque dicha sustancia efectiva como pesticida es butil, hexil u octil parabeno. 9. Un método de modulación de la proliferación y/o crecimiento de algas, y/o modulación de la infestación de un arácnido; que comprende la aplicación en un lugar donde se desea la modulación de la proliferación y/o crecimiento de algas y/o modulación de la infestación de un arácnido: (A) la combinación de conformidad con la reivindicación 5; (B) un cultivo puro, fracción celular, sobrenadante o extracto derivado de una cepa aislada de una Burkholderia cepacia no específica, Burkholderia plantari no específica, Burkholderia gladioli no específica, Burkholderia sp. Burkholderia cepacia no específica, Burkholderia multivorans no específica, Burkholderia sp . , que tiene las siguientes características: (1) una secuencia del gen de ARNr 16S que comprende la secuencia directa que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 8, 11, 12 y una secuencia inversa que tiene al menos 99% de identidad con la secuencia mostrada en la SEQ ID N0:9, 10, 13, 14 y 15; (2) actividad pesticida; (3) produces a compuesto pesticida seleccionado del grupo que consiste en: (a) un compuesto que tiene las siguientes propiedades : (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (ii) valores de desplazamiento en RMN-1H de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene valores de desplazamiento en RMN-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51; y (iv) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (b) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster, que es un derivado carboxílico (carboxylic ester group) , al menos' 17 átomos de carbono, al menos 3 átomos de oxigeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (c) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida, al menos 15 átomos de carbono, al menos 2 oxigeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (d) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa , al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono, al menos ocho átomos de oxigeno y al menos un átomo de nitrógeno; y (e) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno y al menos 1 átomo de nitrógeno; (C) an compuesto pesticida aislado, opcionalmente obtainable de una especie de Burkholderia, seleccionado del grupo que consiste en: (1) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol' que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster, que es un derivado carboxilico (carboxylic ester group); al menos 17 átomos de carbono y al menos 3 oxigeno y 2 átomos de nitrógeno; y que tiene al menos de uno de los siguientes: (a) un peso molecular de 275-435; (b) valores de d en RMN-1H de 8.44, 8.74, 8.19, 7.47, 7.31, 3.98, 2.82, 2.33, 1.08; (c) valores de d en RMN-13C de 163.7, 161.2, 154.8, 136.1, 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 111.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1, 22.7, 22.7; (d) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-20 minutos en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando agua : acetonitrilo (CH3CN) como un sistema disolvente por gradiente y detección UV a 210 nm; (e) bandas de absorción UV a 226, 275, 327 nm.; (2) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo amida; al menos 15 átomos de carbono, al menos 2 átomos de oxígeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; y al menos una de 'las siguientes características: (a) un peso molecular de aproximadamente 240-290 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/EM) ; (b) valores de d en RMN-1]-! de aproximadamente 7.08, 7.06, 6.75, 3.75, 2.56, 2.15, 0.93, 0.93; (c) los valores de d en RMN-13C de 158.2, 156.3, 155.5, 132.6, 129.5, 129.5, 127.3, 121.8, 115.2, 115.2, 41.2, 35.3, 26.7, 21.5, 21.5; (d) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN), y (e) bandas de absorción UV en aproximadamente 230, 285, 323 nm; (3) un compuesto sin epóxidos que comprende al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa , al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono, al menos ocho átomos de oxígeno y un átomo de nitrógeno; y al menos una de las siguientes características: (a) tiene un peso molecular de aproximadamente 530-580 determinado por' cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (b) valores de d en RMN^H 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81, 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04; (c) valores de d en RMN-13C de 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71, 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11, 14.90, 12.81, 9.41; (d) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando agua : acetonitrilo (CH3CN) como sistema disolvente por gradiente y detección UV a 210 nm; (e) tiene una fórmula molecular de C28H45NO10 que se determinó por interpretación del análisis de los datos de ESIMS y RMN; (f) tiene bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm; (4) un compuesto que comprende (a) al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno y al menos 1 átomo de nitrógeno, (b) valores de d en RMN-13C de 174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41, 98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45, 31.67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04, (c) una fórmula molecular de C28H 3 O9 y al menos uno de : (i) valores de d en RMN-1H en aproximadamente 6.41, 6.40, 6.01, 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81, 1.76, 1.42, 1.38, 1.17, 1.12, 1.04; (ii) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (5) un compuesto que tiene las siguientes propiedades : (i) un peso molecular de aproximadamente 525- 555 determinado por cromatografía de líquidos /Espectrometría de masas (CL/EM) ; (ii) valores de desplazamiento en RMN-1!! de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene valores de desplazamiento en RMN-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51; y (iv) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN) ; (6) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo éster, que es un derivado carboxílico (carboxylic ester group) , al menos 17 átomos de carbono y al menos 3 átomos de oxígeno y 2 átomos de nitrógeno; (7) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al' menos 15 átomos de carbono, al menos 2 átomos de oxigeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (8) un compuesto sin epóxidos que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono y al menos ocho átomos de oxigeno y un átomo de nitrógeno; y (9) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno, al menos 1 átomo de nitrógeno; y (II) opcionalmente otra sustancia, en donde dicha sustancia es una sustancia alguicida o sustancia acaricida en cantidades efectivas para modular dicha proliferación y/o crecimiento de algas y/o infestación de un arácnido en dicha ubicación . 10. Un método de modulación de la proliferación y/o crecimiento de algas y/o modular la infestación de un arácnido, caracterizado porque comprende aplicar en un lugar, donde se desea la modulación de la proliferación y/o crecimiento de algas y/o modulación de la infestación de un arácnido, una cantidad de (I) un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: (A) un compuesto que tiene la estructura ##STR001## o una sal o estereoisómeros aceptables, del mismo, para uso como pesticida, en donde M es 1, 2, 3 o 4; n es 0, 1, 2, o 3; p y q son de modo independiente 1 o 2 ; X es O, NH o NR; Rl, R2 y R3 son iguales o diferentes y de modo independiente un residuo de aminoácido de cadena lateral o un derivado de aminoácido de cadena lateral y R es un residuo alquilo, arilo o arilalquilo de cadena corta; (B) un compuesto que tiene la estructura ##STR002## ##STR002## donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -O, -NRi, o -S, donde Ri es -H o alquilo C1-C10; Ri, R2 y m son cada uno de modo independiente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, idroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo y "m" se puede ubicar en cualquier parte del anillo oxazol; (C) un compuesto que tiene la estructura ##STR003## ##STR003«# donde: X y Y son cada uno de modo independiente -OH, -NRi, o -S, donde Ri es -H o alquilo de C1-C10; Ri, 2 y un sustituyente del anillo oxazol, son cada uno de modo independiente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alqulnilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida o sulfurilo. (D) un compuesto que tiene la estructura ##STR005## ##STR005## donde: X y Y son cada uno de modo independiente -OH, -NRi, o -S, donde Ri, R2 son cada uno de modo independiente -H, alquilo (por ejemplo, alquilo de C1-C10) , alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (E) un compuesto que tiene la estructura ##STR004a## #fSTR0O4a#* donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -O, -NR, o -S, donde R es H o alquilo de C1-C10; i, 2 r ^3 r R , R5, Re, R7, R8, R9, RiO iif Ri2r y R13 son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo (F) un compuesto que tiene la estructura ##STR006a## donde X, Y y Z son cada uno de modo independiente -O, -NR, o -S, donde R es H o alquilo de C1-C10; Ri, ^2, 3, -A, RS, R6^ R7, Re, R11, Ri2í y R13 son cada uno de modo independiente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, hetéroarilo, heteroarilo sustituido, hetérociclo, heterociclo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C (O) H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo y (II) y opcionalmente otra sustancia, donde dicha sustancia es una sustancia alguicida o sustancia acaricida en cantidades efectivas para modular la proliferación y/o el crecimiento dichos de algas y/o infestación de un arácnido. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque dicho compuesto es seleccionado del grupo que consiste en: (i) templ zol A; (ii) templazol B; (iii) templamida A; (iv) templamida B; (v) FR901228; (vi) Ivii) xi, 210 ( xviii ) Ixxi) (xl) FR901465; (xli) F8H17 11. El método de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque la especie Burkholderia es una cepa de Burkholderia que tiene las características de identificación de Burkholderia A396 (No. de acceso NRRL B-50319) . 12. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque dicho sobrenadante es un sobrenadante libre de células. 13. Uso de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en: (A) un compuesto que tiene (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 determinado por cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (CL/E ) ; (ii) valores de desplazamiento en RMN-1H de 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene valores de desplazamiento en RMN-13C de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (iv) un tiempo de retención en cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna C-18 de HPLC de fase reversa utilizando un gradiente de agua : acetonitrilo (CH3CN); (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos un residuo indol, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo éster, que es un derivado carboxilico (carboxylic ester group) , al menos 17 átomos de carbono, al menos 3 átomos de oxigeno y al menos 2 átomos de nitrógeno; (C) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos un residuo bencilo, al menos un residuo oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 átomos de carbono, al menos 2 átomos de oxigeno, al menos 2 átomos de nitrógeno; (D) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa , al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco átomos de carbono, al menos ocho átomos de oxigeno y al menos un átomo de nitrógeno, y (E) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo epóxido de metileno, al menos un residuo tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 átomos de carbono, al menos 8 átomos de oxigeno, y al menos 1 átomo de nitrógeno, y opcionalmente un pesticida para formular una composición que modula la proliferación y/o crecimiento de algas y/o que modula la infestación de un arácnido en una ubicación. 15. Un método para modular la proliferación y/o el crecimiento de algas y/o modular la infestación de plagas en una planta y/o un método para modular la aparición y/o crecimiento de malezas monocotiledóneas , juncos o dicotiledóneas; caracterizados porque comprenden aplicar en un lugar donde se desea la modulación de la proliferación y/o el crecimiento de algas y/o modulación de la infestación de un arácnido y/o la modulación de la aparición y/o crecimiento de dicha maleza una cantidad de (A) la formulación de conformidad con la reivindicación 1 o sustancia efectiva como pesticida derivada de la misma; (B) la combinación de conformidad con la reivindicación 5; (C) templamida A; (D) templamida B; (E) FR901465; (F) FR901228 efectiva para modular dicha proliferación y/o crecimiento de algas y/o infestación con plagas y/o aparición o crecimiento de malezas monocotiledóneas , juncos o dicotiledóneas en dicho lugar. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque se modula la infestación con nematodos y/o insectos con templamida A; templamida B; FR901465; FR901228. 17. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque se modulan la infestación de Oncopeltus sp., y/o nematodos de vida libre y/o nematodos M. incógnita. 18. Una semilla caracterizada porque comprende la combinación de conformidad con la reivindicación 3 o 9 o la formulación de conformidad con la reivindicación 1.
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