KR101855264B1

KR101855264B1 - 핌프리네틴을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물

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Publication number: KR101855264B1
Application number: KR1020180003834A
Authority: KR
Inventors: 김창진; 박해룡; 서상태; 최윤영; 고상현; 박동진; 유민교; 이승규; 주윤정
Original assignee: 한국생명공학연구원; 대한민국(산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2018-01-11
Filing date: 2018-01-11
Publication date: 2018-05-04

Abstract

본 발명에서는 스트렙토마이세스 네트롭시스 AN110065 균주로부터 분리한 화합물인 핌프리네틴(pimprinethine, 2-ethyl-5-(3'-indolyl)oxazole)을 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 처리한 결과, 100% 사멸되는 점을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 스트렙토마이세스 네트롭시스 AN110065 균주로부터 분리한 핌프리네틴은 소나무재선충병 방제에 효과적인 환경친화형 생물농약을 제공할 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

핌프리네틴을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물{Composition for controlling pine wilt disease comprising pimprinethine as effective component}

본 발명은 핌프리네틴을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물에 관한 것이다.

소나무재선충병은 소나무에 심각한 피해를 일으켜 국제검역대상 제1호로 분류되는 식물병으로서, 1900년대에 일본에서 처음 발생하였으며, 우리나라에서는 1988년 부산 금정산에서 최초로 소나무재선충이 확인되었다. 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 소나무를 비롯하여 Abies , Picea , Pseudotsuga , Lalix, Cedrus 및 Tsuga spp.속의 기주에서 증식하여 나무를 죽이는 병원체로 스스로 이동할 능력이 없으며 매개충인 솔수염하늘소(Monochamus alternatus)를 통해 이동하여 기주식물을 감염시킨다. 현재 부산, 울산 및 경남지역에서 대규모의 피해지가 발생하고 있으며 그 외에도 전남 목포, 제주도, 강릉 및 경기도 광주지역까지 그 피해가 확산되고 있다.

소나무재선충 방제 방법에는 소나무재선충 자체를 방제하는 방법과 매개충인 솔수염하늘소를 방제하는 방법이 있다. 소나무재선충 자체를 방제하는 방법은 아바멕틴(abamectin), 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate) 등의 살선충제를 소나무에 수간주사하여 소나무재선충의 침입 및 증식을 막는 방법으로, 사전예방에 효과가 있으나 산림 내에서 작업이 어려우며, 수간주입용 방제약제들이 고가여서 비용이 많이 드는 단점이 있다. 또한, 환경에 대한 위해성의 우려가 있어 저비용으로 환경 위해성이 낮거나 없는 방제약제에 대한 요구도가 증가되고 있는 실정이다. 매개충인 솔수염하늘소를 방제하는 방법은 매개충의 우화 및 성충 활동 시기에 살충제를 항공 살포하거나 매개충의 산란목을 벌채, 훈증, 소각시키는 방법이 있다. 그러나 소나무재선충 감염목, 매개충 산란목을 처리하는 방법은 소나무재선충병의 확산을 방지할 수는 있으나 소나무재선충 감염 전에 방제하는 방법으로는 적절하지 않으며 현재까지는 살선충제의 수간주사가 가장 현실적인 방법으로 알려져있다. 최근에는 살선충제 수간주사의 단점을 보완하기 위하여 화학농약을 대체하는 소나무재선충 살선충 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 그 중 미생물로부터 소나무재선충 방제에 활성을 가지는 물질을 찾는 연구가 중요한 방법으로 사료되고 있다.

따라서, 본 발명에서는 소나무재선충병의 방제를 위해 토양으로부터 방선균을 분리하여 살선충활성을 확인한 후, 소나무재선충 방제에 활성을 나타내는 물질을 분리, 정제하여 화학구조를 결정하고자 한다.

한국공개특허 제2017-0054792호에서는 '방선균 유래의 5-(3'-인도릴)옥사졸을 유효성분으로 함유하는 벼흰잎마름병균 억제용 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1101783호 '항균활성과 살충력이 우수한 신규한 스트렙토마이세스속 균주 및 이의 배양방법과 배양물을 이용한 제제'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '핌프리네틴을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 스트렙토마이세스 네트롭시스(Streptomyces netropsis) AN110065 균주(KCTC12490BP)로부터 분리된 핌프리네틴(pimprinethine, 2-ethyl-5-(3'-indolyl)oxazole)이 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 핌프리네틴(pimprinethine) 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 식물의 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 소나무재선충병 방제용 조성물을 식물, 식물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충병을 예방 또는 방제하는 방법을 제공한다.

도 1은 본 발명에서 분리한 균주들을 대상으로 96 웰 플레이트 상에서의 살 재선충활성 효과를 확인하는 단계를 나타낸 것이다.
도 2는 AC-17-20의 분리정제 과정을 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 AC-17-20의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 4는 AC-17-20의 ESI-질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 5는 AC-17-20의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 AC-17-20의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 AC-17-20의 HMQC 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 AC-17-20의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 AC-17-20의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 AC-17-20의 HMBC 및 ¹H-¹H COSY 상관관계를 나타낸다.
도 11은 AC-17-20의 화학 구조를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핌프리네틴(pimprinethine) 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 식물의 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 핌프리네틴(pimprinethine)은 하기 화학식 1의 2-에틸-5-(3'-인돌닐)옥사졸{2-ethyl-5-(3'-indolyl)oxazole}이다.

본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 바람직하게는 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물은 살선충활성물질을 추가로 함유할 수 있으며, 바람직하게는 상기 살선충활성 물질은 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos) 및 레바미솔(levamisol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성물질은 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 아바멕틴(abamectin), 밀베멕틴(milbemectin) 또는 이버멕틴(ivermectin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 식물은 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 식물일 수 있고, 바람직하게는 소나무속 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법에서, 소나무재선충병 방제용 조성물은 전술한 바와 같이, 항세균활성 물질을 유효성분으로 함유하거나 또는 항세균활성 물질과 살선충활성물질을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 소나무재선충병 방제용 조성물의 처리는 침지 처리, 토양관주 처리 또는 엽면살포 처리일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 소나무재선충병 방제가 필요한 수목이면 제한되지 않으며, 예를 들면, 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 본 발명의 조성물을 처리할 수 있다. 처리 방법은 침지 처리, 토양관주 처리 또는 엽면살포 처리 등 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1) 방선균 분리, 배양 및 동정

실험에 사용한 방선균은 강원도 평창군 초지 토양으로부터 HV 한천(Humic acid-Vitamin agar) 배지(0.1% humic acid : dissolved in 0.2N NaOH, 0.05% Na₂HPO₄, 0.171% KCl, 0.005% MgSO₄, 0.001% FeSO₄·7H₂O, 0.002% CaCO₃, 50 ppm 시클로헥사미드, 10 ppm 날리딕스산 (nalidixic acid), 티민-HCl을 비롯한 8종의 비타민 및 2% 아가)를 사용하여 분리하였다. 분리한 균주의 동정은 16S rRNA 염기서열을 이용하여 분석하였다. 분리한 방선균의 보존을 위하여 Bennett's medium (1% 글루코스, 0.1% 효모 추출물, 0.2% 박토 펩톤, 0.1% 소고기 추출물)에서 배양하였다. 또한, 방선균의 살선충 활성 평가를 위한 배양은 28℃에서 GSS 배지(1% 가용성 전분, 2% 글루코스, 2.5% 대두박, 0.1% 소고기 추출물, 0.4% 효모 추출물, 0.2% NaCl, 0.025% K₂HPO₄ 및 0.2% CaCO₃)를 이용하였다. 살선충 활성을 스크리닝하기 위하여 배양액 0.5mL을 동량의 아세톤을 가하여 실온에서 진탕한 후 15분간 초음파추출을 하였다. 원심분리하여 상등액 0.2mL을 농축하여 DMSO 50㎕에 녹여서 살선충 활성실험에 사용하였다.

2) 살선충 활성균주 선발실험

분리균주에 대한 살선충 활성시험은 다음과 같다. 소나무재선충병의 원인인 재선충(Bursaphelenchus xylophilus)을 국립산림과학원에서 분양받아 곰팡이(Botrytis cinerea)가 배양된 PDA(potato dextrose agar) 평판배지에 계대배양하여 시험선충으로 사용하였다. 살재선충 효과는 방선균배양액 추출물 5㎕과 95㎕의 선충용액(30~40여 마리 선충 포함)을 96-well Microtest™ Tissue Culture Plate의 각 웰에 2반복으로 실험하였다. 살선충 활성은 배양액으로 처리한 96 웰 플레이트를 25℃ 항온기에 넣고 반응시켜 24시간 후 해부현미경 하에서 곧게 경직되고 움직이지 않는 선충은 죽은 선충으로, 유연하고 움직임이 있는 선충은 산 선충으로 간주하여 살선충율을 조사하였다.

살재선충 활성 판정기준

활성 판정기준	사멸율 (%)
1	0
1.5	20-40
2	40-75
2.5	75-95
3	100

실시예 1. 살선충 활성균주 선발 및 동정

분리균주에 대한 살선충 활성시험 결과 추출물 0.5~2mg/mL 처리시 24시간 후 모든 농도에서 100%의 살선충을 보인 균주 AN110065를 선발하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자 계통학적 분석 결과, AN110065 균주는 스트렙토마이세스 네트롭시스(Streptomyces netropsis) NBRC 3723과 99.78% 유사도를 보였다.

살재선충 활성균주 스크리닝 결과

Strain	Scientific name	mg/mL	Activity
AN110065	*Streptomyces* *netropsis*	2	3
		1	3
		0.5	3

실시예 2. 소나무재선충 방제 물질의 분리 및 정제

2-1. 소나무재선충 방제 물질의 분리 및 정제

AN110065 균배양액을 원심분리(5000rpm, 30분)하여 브로스(Broth) 층과 마이셀리움 케이크(mycelium cake) 층으로 분리하였다. 브로스 층을 극성과 비극성 용매 조건에 따른 여러 가지 용매로 분획하여 얻어진 추출물을 바이오에세이를 통하여 방제 활성을 가지는지 확인하였다. 그 결과 에틸아세테이트층 (516 mg)에서 활성을 보였고 이 샘플을 실리카겔 TLC를 이용하여 물질에 대한 특성을 규명하였다. 이후 에틸아세테이트층을 정제하기 위하여 CHCl₃:MeOH = 50:1 전개용매를 이용하여 linear gradient 방식으로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였고, 그 결과를 바탕으로 활성을 나타내는 CHCl₃:MeOH = 50:1의 분획을 size exclusion gel인 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피로 분리하였다. 최종적으로 HPLC(high performance liquid chromatography) 단계를 거쳐 방제 활성을 가지는 물질을 분리정제하였다(도 2).

HPLC로 확인해본 결과, 254 nm에서 65%의 메탄올로 이동상을 흘렸을 때 약 16분경에 활성물질의 피크를 확인하였으며 분리된 물질이 단일물질임을 확인할 수 있었다(도 3). 본 발명자는 이 물질의 방제 활성을 확인하였으며 이를 AC-17-20이라 명명하였고, NMR 분석을 실시하여 화학구조를 결정하였다.

2-2. AC-17-20의 분자량 측정

AC-17-20의 분자량을 측정하기 위해 ESI-질량 스펙트럼을 양성 모드에서 측정하였다. 양성 모드에서는 [M+H]⁺가 m/z 213.1에서 관찰되었고 [M+Na]⁺가 m/z 235.0에서 관찰되었다. 이를 통해 분자량이 212임을 알 수 있었으며, 분자식이 C₁₃H₁₂N₂O로 결정되었다(도 4).

2-3. AC-17-20의 ¹ H-NMR과 ¹³ C-NMR 스펙트럼

AC-17-20의 ¹H-NMR (도 5)과 ¹³C-NMR (도 6)을 통해 AC-17-20는 13개의 카본과 12개의 프로톤이 존재함을 알 수 있었다. 도 5와 같이 ¹H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 7.14 ~ 7.76 ppm 사이에서 6개의 아로마틱 프로톤이 관찰되었고, 1.38 ppm에서 메틸 프로톤이 관찰되었으며, 2.85 ppm에서 1개의 메틸렌 프로톤이 관찰되었다. 또한, 도 6과 같이 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 105.4 ~ 165.0 ppm 사이에 11개의 아로마틱 카본과 11.6 ppm에서 메틸 카본 1개, 22.3 ppm에서 메틸렌 카본이 관찰되어 ¹H-NMR과 개연성이 있다는 것을 알 수 있었다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼 분석을 통해 프로톤과 카본의 케미컬 쉬프트(chemical shift)를 확인하여 표 3에 정리하였다.

AC-17-20의 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR 케미컬 쉬프트

Position	_C (ppm)	_H (ppm)	Position	_C (ppm)	_H (ppm)
2	165.0	-	3'a	125.2	-
4	119.0	7.15 (s)	4'	120.4	7.76 (d)
5	149.5	-	5'	121.2	7.14 (d)
6	22.3	2.85 (q)	6'	123.3	7.19 (t)
7	11.6	1.38 (t)	7'	112.7	7.42 (d)
2'	123.6	7.57 (s)	7'a	138.0	-
3'	105.4	-

2-4. AC-17-20의 2D NMR 스펙트럼

AC-17-20의 프로톤 및 카본의 연결고리를 확인하기 위하여 HMQC 스펙트럼 (도 7)을 측정한 결과, H-7 (_H 1.38)와 C-7 (_C 11.6), H-6 (_H 2.85)와 C-6 (_C 22.3), H-5' (_H 7.14)와 C-5' (_C 121.2), H-4 (_H 7.15)와 C-4 (_C 119.0), H-6' (_H 7.19)와 C-6' (_C 123.3), H-7' (_H 7.42)와 C-7' (_C 112.7), H-2' (_H 7.57)와 C-2' (_C 123.6), H-4' (_H 7.76)와 C-4' (_C 120.4)의 연결을 확인하였다. 또한 ¹H-¹H COSY 스펙트럼(도 8)을 통해 ¹H-¹H 간의 크로스 피크를 확인한 결과, 2.85 ppm (H-6)과 1.38 ppm (H-7)의 연결고리와 7.14 ppm (H-5'), 7.42 ppm (H-7')과 7.19 ppm (H-6')의 연결고리, 7.76 ppm (H-4')과 7.14 ppm (H-5')의 연결고리를 확인할 수 있었다(도 8). 마지막으로, 프로톤으로부터 2, 3, 4 본드에 있는 카본의 위치를 확인하기 위해 HMBC spectrum (도 9)을 측정한 결과, H-6 (_H 2.85), H-7 (_H 1.38)로부터 C-2 (_C 165.0), H-4 (_H 7.15)로부터 C-2 (_C 165.0), C-5 (_C 149.5), H-2' (_H 7.57)로부터 C-3' (_C 105.4), C-5 (_C 149.5), C-3'a (_C 125.2), C-7'a (_C138.0), H-4' (_H 7.76)로부터 C-6' (_C 123.3), C-7'a (_C 138.0), C-3'a (_C 105.4), H-5' (_H 7.14)로부터 C-3'a (_C 125.2), C-7' (_C 112.7), H-6' (_H 7.19)로부터 C-4' (_C 120.4), C-7'a (_C 138.0), H-7' (_H 7.42)로부터 C-3'a (_C 125.2), C-5' (_C121.2)으로의 롱 레인지 커플링(long range coupling)이 관찰되었고(도 10), 이는 핌프리네틴(pimprinethine) 구조임을 확인할 수 있었다.

2-5. AC-17-20의 화학구조

AC-17-20의 화학구조를 결정하기 위해 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, HMQC, ¹H-¹H COSY, HMBC 스펙트럼의 분석을 통해서 구조를 어사인(assign)한 결과, 최종 분리된 AC-17-20의 화학구조는 2-ethyl-5-(3'-indolyl)oxazole로 동정되었다(도 11).

2-6. AC-17-20(핌프리네틴)의 소나무재선충 살선충 효과

AC-17-20(핌프리네틴), 화학구조 2-ethyl-5-(3'-indolyl)oxazole 및 대조구 아바멕틴(abamectin)에 대한 소나무재선충 살선충 약효시험을 하였다, 시험방법은 살선충 활성균주 스크리닝 방법과 동일하게 실시하였으며, 시험결과 핌프리네틴 0.8mg/ml 및 아바멕틴 0.5mg/ml 농도에서 처리 24시간 후 각각 100%의 살선충효과를 나타났다.

AC-17-20(pimprinethne)의 살선충 효과

compound		Time
compound	mg/ml	12h	24
Pimprinethine	0.8	2.5	3
	0.4	1.5	1.5
	0.2	1	1
	0.1	1	1
Abamectin	0.5	3	3

사멸율 : 1; 0%, 1.5; 20~40%, 2; 40~75%, 2.5; 75~95%, 3; 100%

Claims

핌프리네틴(pimprinethine) 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 식물의 소나무재선충병 방제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 식물은 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 살선충활성물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제3항에 있어서, 상기 살선충활성 물질은 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos) 및 레바미솔(levamisol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성물질은 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 아바멕틴(abamectin), 밀베멕틴(milbemectin) 또는 이버멕틴(ivermectin)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 소나무재선충병 방제용 조성물을 식물, 식물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충병을 예방 또는 방제하는 방법.
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