KR102480072B1 - 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 u67-46 균주 - Google Patents

스트렙토마이세스 속 돌연변이주 u67-46 균주 Download PDF

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임희경
장경수
김영숙
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한국화학연구원
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Abstract

본 발명은 본 발명은 해충방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주에 관한 것으로, 이를 이용하여 나비목 해충의 산란 억제 및 살유충을 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주{Streptomyces sp. mutant U67-46}
본 발명은 해충방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주에 관한 것이다.
화학 살충제는 해충방제 효율이 높아 해충으로부터 식물을 보호하기 위해 가장 널리 사용되고 있다. 그러나, 동시에 독성 잔류물이 축적되어 토양 및 수질 오염을 발생시키고, 해충의 살충제 내성 발달로 인해 환경, 인간 및 비표적 유기체에 부정적인 영향을 끼치고 있다. 또한 합성 살충제의 사용은 해충의 번식과 2차 해충의 증식으로 이어지며 궁극적으로 자연적 해충 포식자를 죽임으로써 생태계의 생태학적 균형을 파괴한다. 이러한 종래 화학 살충제의 문제점을 보완하기 위해 안전하고 환경 친화적인 생물학적 방제제의 개발이 요구되고 있다.
해충 관리를 위한 생물학적 방제로서 생물농약 대사산물은 환경 친화적이고, 선택적이며, 분해 가능하고, 독성이 없는 천연물이므로, 이에 대한 많은 연구가 수행되고 있다. 미생물에서 유래한 생물학적 방제제(biological control agent) 중 방선균류(actinomycetes)는 살충제로 사용하기 위한 다양한 형태의 활성 화합물을 생산하기 때문에 가장 중요한 미생물 자원 중 하나이다. 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.)은 토양에 서식하면서 살충 활성을 나타내는 방선균의 주요 군이다.
야생형 균주에서 2차 대사산물을 생산하고 적용하는 것은 경제적인 관점에서 효율적이지 않다. 따라서 야생형 균주의 활성을 향상시키고 효율을 높이는 방법이 요구된다. UV 조사법은 미생물 균주 개량에 있어 간편하고 안전하여 널리 사용되고 있다. 또한 2차 대사산물의 질(활성)과 양은 대사산물이 배양되는 배지, 온도, 교반 속도, 배지의 초기 pH, 발효 기간 등 다양한 환경적 요인에 따라 영향을 받는다.
이와 같은 점들을 고려하여, 본 발명자들은 해충방제 활성이 높은 스트렙토마이세스 속 균주를 선별하고, 돌연변이 유발을 통해 균주의 활성을 증가시키며, 이 균주가 우수한 해충방제 활성을 나타내는 배양 조건을 확립하였다.
대한민국 등록특허 제10-0961524호 (2010.06.07. 공고)
본 발명의 목적은, 해충방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주를 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP)을 제공한다.
상기 균주는 해충방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주의 배양액은 해충방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주 배양액의 1 내지 30배 희석액은 60% 이상의 해충 방제율을 가질 수 있다.
상기 해충방제 활성은 해충의 산란 억제 또는 살유충 활성일 수 있다.
상기 균주는 배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대한 해충방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주는 나비목 해충으로서, 담배거세미나방(Spodoptera 　 litura), 파밤나방(Spodoptera 　 exigua), 도둑나방(Mamestra 　 brassicae), 배추좀나방(Plutella 　 xylostella), 배추순나방(Hellula 　 undalis), 배추흰나비(Pieris rapae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 해충에 대한 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 균주는 온도 25 내지 35℃에서 배양될 수 있다.
상기 균주는 교반 속도 200 내지 350rpm에서 배양될 수 있다.
상기 균주는 초기 pH 6.5 내지 7.5에서 배양될 수 있다.
상기 균주는 M3 또는 GS33 배지에서 배양될 수 있다.
상기 균주는 1 내지 7일 동안 배양될 수 있다.
본 발명에 따르면, 해충방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주를 제공하고, 이를 이용하여 나비목 해충의 산란 억제 및 살유충을 효과적으로 수행하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 해충방제 활성이 우수한 박테리아 균주를 스크리닝하기 위해, 배추좀나방에 대한 유충 치사율이 80% 이상인 6개 균주의 살유충 활성을 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 배양액의 적정 희석배율을 확인하기 위해, 희석 배율에 따른 배추좀나방의 유충 치사율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 배양액의 2배 희석액 처리 5일 후 배추유모(A)의 상태를 무처리 대조군(B)과 비교한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 균주 KR0006 배양액의 배추좀나방 산란 억제 및 유충 방제 활성을 확인하기 위하여, KR0006 배양여액을 처리하지 않은 배추유모와 처리한 배추유모에 배추좀나방 성충을 각각 접종한 후 배추유모의 생육상태를 비교한 사진이다[A: 무처리 대조군 6일 경과, B: 1차 처리군 6일 경과, C: 무처리 대조군 10일 경과(A에서 4일 더 경과, 총 10일 경과), D: 2차 처리군 4일 경과(B에 2차 처리한 후 4일 경과, 1차 처리 이후 총 10일 경과)]
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006의 16S rRNA의 유전자 염기서열 분석에 근거한 계통수를 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006에 의해 생산된 유효 살충 활성 물질의 분리 및 정제 방법을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 배양액의 조 추출물(crude extract)에 대한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석 결과(a)와 물질의 UV spectrum(b)를 나타낸 것이다.
도 8은 발명의 일 실시예에 따른 균주 KR0006 활성을 증가시키기 위한 UV 돌연변이 방법을 나타낸 것이다.
도 9는 발명의 일 실시예에 따른 돌연변이 균주 U67-46을 온도 30℃, 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1에서 6일 동안의 M3와 GS33 배지에서 배양함에 따른 유충 치사율을 나타낸 것이다.
본 발명을 상세하기 설명하기 전에, 본 명세서에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 무조건 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 발명자가 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해서 각종 용어의 개념을 적절하게 정의하여 사용할 수 있고, 더 나아가 이들 용어나 단어는 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 알아야 한다.
즉, 본 명세서에서 사용된 용어는 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기 위해서 사용되는 것일 뿐이고, 본 발명의 내용을 구체적으로 한정하려는 의도로 사용된 것이 아니며, 이들 용어는 본 발명의 여러 가지 가능성을 고려하여 정의된 용어임을 알아야 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 단수의 표현은 문맥상 명확하게 다른 의미로 지시하지 않는 이상, 복수의 표현을 포함할 수 있으며, 유사하게 복수로 표현되어 있다고 하더라도 단수의 의미를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
본 명세서의 전체에 걸쳐서 어떤 구성 요소가 다른 구성 요소를 "포함"한다고 기재하는 경우에는, 특별히 반대되는 의미의 기재가 없는 한 임의의 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 임의의 다른 구성 요소를 더 포함할 수도 있다는 것을 의미할 수 있다.
또한, 이하에서, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 구성, 예를 들어, 종래 기술을 포함하는 공지기술에 대한 상세한 설명은 생략될 수도 있다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC14896BP 로 기탁된 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주를 제공한다.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주(본 명세서에서 'U67-46 균주' 또는 '균주 U67-46'과 혼용됨)는 해충방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주의 배양액은 해충방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 해충방제 활성은 해충의 산란 억제 또는 살유충 활성일 수 있다.
상기 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주는 토양 샘플에서 해충방제 활성이 높은 스트렙토마이세스 속 KR0006 균주(본 명세서에서 'KR0006 균주' 또는 '균주 KR0006'와 혼용됨)를 선별한 후 두 차례에 걸친 돌연변이 유발을 통해 해충방제 활성이 현저히 증대된 변이 균주이다.
본 발명의 일 실시예에서, 배추좀나방에 대해 80% 이상의 유충 치사율을 나타내는 박테리아 균주들을 스크리닝 하여 가장 높은 활성을 나타내는 스트렙토마이세스 속 KR0006 균주를 선별하였다.
도 1을 참조하면, 배추좀나방에 대해 80% 이상의 유충 치사율을 나타내는 6종의 균주 중 KR0006 균주가 가장 높은 유충 치사율을 나타냄을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, KR0006 균주 배양액을 희석배율에 따른 유충 치사율을 확인하였다.
도 2를 참조하면, KR0006 균주 배양액 처리 후 5일 경과한 결과 1 내지 5배 희석액으로 90% 이상의 유충 치사율이 관찰된 반면, 10배 이상 희석액으로 처리 시 30% 미만의 치사율을 나타내었다. 도 3을 참조하면, 2배 희석액으로 처리 시 5일 경과한 결과 유충 치사율은 100% 임을 확인하였다. 구체적으로는, KR0006 균주 배양액의 유충 생육억제 활성을 확인하기 위하여 KR0006 균주 배양여액을 분무 처리한 배추유묘(A)와 처리하지 않은 무처리 배추유묘(B)에 배추좀나방 유충을 각각 10마리씩 접종하고 접종 5일 후 유묘의 생육상태 및 살충수를 비교한 결과, 접종 초기의 유충에 의한 섭식흔이 약간 존재하나 KR0006 배양여액을 분무 처리한 배추에서 100%의 유충 방제 활성을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, KR0006 균주 배양액의 배추좀나방 산란 억제 및 유충 생육억제 활성을 확인하였다. 구체적으로는 KR0006 배양여액을 처리하지 않은 배추유모와 처리한 배추유모에 배추좀나방 성충을 각각 접종한 후 배추유모의 생육상태를 비교하였다.
도 4는 (A) KR0006 배양여액을 처리하지 않은 배추유모에 배추좀나방 성충을 접종한 후 6일 경과된 무처리 대조군, (B) KR0006 배양여액을 1차 분무 처리한 배추유묘에 50마리의 배추좀나방 성충을 접종한 후 6일 경과된 1차 처리군, (C) A에서 4일이 더 경과된(총 10일 경과된) 무처리 대조군, (D) 1차 처리군에 KR0006 배양여액을 2차 분무 처리한 후 4일 경과한 2차 처리군을 비교한 것이다. 1차 처리 후 6일 경과한 (B)는 배추좀나방의 산란 억제로 인하여 유충의 발생이 현저히 저해되어 배추의 섭식흔이 관찰되지 않았고, 무처리 후 10일 경과한 (C)는 유충으로 인해 유묘의 생육이 완전히 저해된 반면, 2차 처리 후 4일 경과한 (D)는 1차 처리에 의한 산란 억제로 유충발생이 현저히 적고 2차 처리 시 유충의 방제효과가 100%로 이루어져 유충에 의한 섭식흔이 발견되지 않았다. 따라서, KR0006 균주 배양액 처리 후 10일 경과 결과 나방과 유충을 100% 폐사시켰으며, 이로써 나방 산란과 유충 성장 및 발달에 대한 완전한 억제 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KR0006 균주의 분류학적 구분을 위해 16S rRNA 유전자의 염기서열을 다른 스트렙토마이세스 균주의 염기서열과 비교하였다. 도 5는 KR0006 균주의 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것으로, KR0006 균주는 스트렙토마이세스 시네레오루버(Streptomyces cinereoruber) NBRC 12756 균주와 99% 일치하는 경향을 나타내므로 스트렙토마이세스 시네레오루버의 아속으로 분류될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KR0006 균주 배양액에 포함된 활성 화합물을 확인하기 위하여 도 6과 같이 KR0006 균주 배양액을 추출, 분리 및 정제하였다.
도 7을 참조하면 HPLC 분석 결과 5개의 피크(HP-1, HP-2, HP-3, HP-4, HP-5)가 확인되었고, 표 1을 참조하면 NMR 분석 및 고분해능 전자분무 이온화 질량분석을 통해 316-HP2는 안티마이신 A3a, 316-HP3은 안티마이신 A8a, 316-HP5는 안티마이신 A1a로 확인되었다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 KR0006 균주의 해충 방제 활성을 향상시키기 위해 도 8과 같이 UV 처리를 수행하여 돌연변이 균주를 생성하였다. 1차 돌연변이 균주들의 배양액 처리 후 경과 시간에 따른 유충 치사율을 표 2로 나타내었다.
표 2를 참조하면, 돌연변이 균주 U67는 배양액 처리 24시간 후 70% 살충율을 나타내었고, 처리 48시간 이내에 100% 살충율을 나타내어 다른 돌연변이 균주 및 야생 균주와 비교하여 가장 높은 활성을 나타내었다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 1차 돌연변이 균주 U67에 2차 UV 처리를 수행하여 돌연변이 균주를 생성하였다. 2차 돌연변이 균주 배양액의 희석 배율에 따른 유충 치사율을 야생형 및 1차 돌연변이 균주 U67과 비교하여 표 3으로 나타내었다.
표 3을 참조하면, 2차 돌연변이 균주 U67-46이 20배 희석액에서 1차 돌연변이 균주 U67에 비해 살충 활성이 4배 정도로 향상되었음을 확인할 수 있다. 따라서 야생형 및 1차 돌연변이 균주에 비해 살충 활성이 현저히 증가한 2차 돌연변이 균주 U67-46을 본 발명에 따른 해충방제 활성을 가지는 균주로 선발하였다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주 배양액의 1 내지 30배 희석액은 60% 이상의 해충 방제율을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 균주 배양액을 해충 방제용으로 사용하는 경우 1 내지 30배 희석액을 사용하는 것이 바람직하며, 1 내지 20배 희석액을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
표 3을 참조하면, 균주 U67-46 배양액의 1 내지 30배 희석액은 60% 이상의 해충 방제율을 나타내고, 1 내지 20배 희석액은 100%의 해충 방제율을 나타낸다. 야생형은 20배 희석액의 경우 15±4b%, 30배 희석액의 경우 0%, 균주 U67은 20배 희석액의 경우 25±3c%, 30배 희석액의 경우 0%를 나타내었으나, 균주 U67-46은 1 내지 20배 희석액의 경우 100% 살충율을 나타내었고, 30배 희석액의 경우에도 65±10b%의 살충율로 야생형과 균주 U67에 비해 현저히 우수한 효과를 나타내었다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주는 배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대한 해충방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
최근 상기 작물들에 대한 해충 피해 발생 및 면적이 넓어지고 있는 것은 십자화과 주요 채소인 양배추, 배추, 무 등의 재배면적이 늘어나고 있고, 비닐하우스 등 시설재배를 통한 채소의 연중재배가 이루어지면서 먹이 조건이 좋아졌을 뿐만 아니라 채소류의 재배가 단지화되고 연작되면서 진딧물류 등 채소의 해충방제를 위한 약제의 집중살포로 천적이 감소하였고, 해충의 세대기간이 연간 9~12세대로 짧고 발생횟수가 많아 약제에 대한 저항성이 빠르게 발달되어 해충방제 효과가 떨어지기 때문이다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주는 나비목 해충으로서, 구체적으로 밤나방과의 담배거세미나방(Spodoptera 　 litura), 파밤나방(Spodoptera 　 exigua), 도둑나방(Mamestra 　 brassicae), 집나방과의 배추좀나방(Plutella 　 xylostella), 명나방과의 배추순나방(Hellula 　 undalis), 흰나비과의 배추흰나비(Pieris rapae)로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 해충에 대한 방제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 해충들은 약제에 대한 저항성이 빠르게 발현되어 방제 효과가 쉽게 떨어진다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 작용 특성이 다른 약제를 교대로 살포하는 방안 등이 이용되고 있으나 한계가 있다. 이에 본 발명과 같은 미생물을 이용한 해충방제 제제가 요구되고 있다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주는 온도 25 내지 35℃에서 배양되는 것이 바람직하고, 온도 27 내지 35℃에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. 균주 U67-46가 상기 범위 이외의 온도에서 배양되는 경우 배양액의 해충방제 활성이 낮아질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 배양 온도 및 배양 일수에 따라 생산된 균주 U67-46의 배양액을 처리 3일 후 유충 생존율을 조사하였다.
표 4를 참조하면, 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1, M3 배지에서, 배양 온도 30℃인 경우 3-4일 배양할 때 최대 살충 활성(100%)을 나타내었고, 배양온도 27℃인 경우 5일 간 배양할 때 최대 살충 활성(100%)을 나타내었으며, 배양온도 35℃인 경우 2일 간 배양할 때 최대 살충 활성(96.7%)을 나타내었다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주는 교반 속도 200 내지 350rpm에서 배양되는 것이 바람직하고, 교반 속도 250 내지 350rpm에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. 균주 U67-46가 상기 범위 이외의 교반 속도로 배양되는 경우 배양액의 해충방제 활성이 낮아질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 배양 시 교반 속도 및 배양 일수에 따라 생산된 균주 U67-46의 배양액 처리 3일 후 유충 생존율을 조사하였다.
표 5를 참조하면, 배양 온도 30℃, 초기 pH 7.1, M3 배지에서, 교반 속도 300rpm인 경우 3-4일 배양할 때 최대 살충 활성(100%)을 나타내었고, 교반 속도 250rpm인 경우 5일 간 배양할 때 최대 살충 활성(98.7%)을 나타내었으며, 교반 속도 350rpm인 경우 3일 간 배양할 때 최대 살충 활성(95.1%)를 나타내었다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 초기 pH 6.5 내지 7.5에서 배양되는 것이 바람직하고, 초기 pH 7 내지 7.5에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다. 균주 U67-46가 상기 범위 이외의 pH에서 배양되는 경우에는 균 생육이 저조해 질 수 있다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 M3 또는 GS33 배지에서 배양되는 것이 바람직하고, M3 배지에서 배양되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 배지 종류에 따른 균주 U67-46의 배양액을 처리한 후 경과 일수에 따른 유충 치사율을 조사하였다.
도 10을 참조하면, 전체 배양 기간에서 M3 배지를 사용하는 경우 GS33 배지 보다 유충 치사율이 높게 나타났다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 U67-46 균주는 1 내지 7일 동안 배양되는 것이 바람직하고, 3일 내지 5일 동안 배양되는 것이 더욱 바람직하다.
표 3, 4 및 도 10을 참조하면, 3일 내지 5일 동안 배양될 때 높은 살충 활성을 나타내었다.
실시예
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
<재료 및 방법>
1. 스트렙토마이세스의 분리 및 발효 배양
전국 각지에서 8-20cm 깊이의 토양층에서 채취한 토양 시료에서 총 850종의 스트렙토마이세스가 분리되었다. 표준 연속 희석법에 따라 각 시료 1g을 증류수 9ml에 희석하고 5분간 볼텍싱하여 균질화하였다. 그 다음, 연속 희석을 하여 10-3까지 희석하였다. 이 희석액의 100μL 분취량을 부식산-비타민 한천[0.5g MgSO4, 5g Na2HPO4, 0.2g CaCO3, 10g 부식산(humic acid), 20g KCL, 5g 사이클로헥시미드(cycloheximide), 20g 세균 한천(bacteriological agar) 및 1L 증류수]에 플레이팅 했다. 포자가 형성될 때까지 14일 동안 암실에서 27℃에서 배양하였다. 형태적 특성에 근거하여 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.)의 단일 콜로니들을 동정하였으며 베넷 한천 배지(Bennet's agar medium)[1 g 효모 추출물, 10 g 포도당, 1 g 쇠고기 추출물, 2 g 펩톤, 20 g 세균 한천, 1 L 증류수)에서 25℃에서 7일 동안 발효 배양하였다. M3 액체 배지(CaCO3 6g, 포도당 20g, 소이톤 20g, 용해성 전분 40g, 증류수 1L)를 사용하여 균주를 유지 및 배양하였다. 스트렙토마이세스 균주들을 27℃, 초기 pH 6.9에서 7일 동안 회전식 진탕기(250rpm)에서 배양하였다. 발효 배양액을 4℃에서 10분 동안 8000rpm에서 원심분리하고 상층액을 사용하여 살충 활성을 추가로 진화시켰다.
2. 해충 관리
배추좀나방(diamondback moth, Plutella xylostella)는 어린 배추 잎을 먹였으며 12시간 명/12시간 암주기로 25℃의 일정한 온도와 65% 상대 습도를 제공했다.
3. 살충 분석
배추좀나방(Plutella xylostella) 유충에 대한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces spp.) 배양액의 살충 활성은 잎 디스크 및 전체 식물 섭식 분석을 수행하여 테스트되었다.
잎 디스크 섭식 분석: 배추 잎 디스크(직경 3cm)를 방선균 배양여액에 30초 동안 침지한 후 풍건하고 배추좀나방 2령충(10마리 유충/잎 디스크)을 접종하였으며 증류수를 무처리 대조군으로 사용하였다. 배추좀나방 유충에 살충활성은 처리 3일 후(이하, 처리 후 경과 일수를 'DAT' 라고 함) 잎 디스크에 생존한 유충의 수를 조사하여 살충율을 계산하였으며 유충의 생육상태를 무처리 대조구와 비교하여 관찰하였다. 모든 생물검정 실험은 3번 반복하여 수행되었다.
전체 식물 섭식 분석: 원예용 토양을 사용하여 온실 조건(주간/야간 = 30/25 ± 5℃, 명/암 = 14/10 h)에서 10일 동안 자란 배추(2개체/컵) 잎에 KR0006의 배양여액 10mL을 분무한 후 배추좀나방 2령(10개 유충/식물)을 접종하였다. 유충 섭식 억제 활성은 5 DAT에 배추 유묘의 생육상태를 달관조사하였으며 유충의 살충율을 계산하였다.
배추좀나방의 산란억제 및 유충 방제 효과를 알아보기 위하여 30Х25Х30(폭Х길이Х높이)의 투명 상자를 이용하여 성충을 접종하였다. 먼저, 원예용 토양, 온실 조건(주간/야간 = 30/25 ± 5℃, 명/암 = 14/10 h) 하 10일 동안 키운 배추 유묘(40개체/트레이)에 KR0006 배양 상등액을 각 50mL 분무하여 풍건한 후 유리 캐비넷에 넣고 트레이 당 50마리의 성충 나방을 접종하였다. 6 DAT에 처리구의 산란 억제 효과는 산란을 통한 생성 유충의 개체 수 확인 및 섭식에 의한 잎의 섭식흔을 통해 조사하였다. 또한 접종 6일 후 2차 배양여액을 처리하고 4일 후 무처리 대조군과 배추 유묘의 상태를 비교하여 살유충 활성(larvicidal activity)을 측정하였다.
4. 통계 분석
One-Way ANOVA 통계 분석은 OriginPro 8.1(OriginLab, 2021)을 사용하여 수행되었다. 평균값을 비교하기 위해 Fisher 검정을 사용하였으며, 평균값 > 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
5. 균주의 분류학적 특성
KR0006 균주의 분류학적 특성 분석을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열 및 PCR 증폭이 수행되었다. PCR 산물은 유전자 서열분석을 수행하기 위해 Macrogen Co., Ltd.(대전, 한국)에 의뢰되었다. 확보한 16S rRNA 유전자에서 얻어진 염기서열은 NCBI의 BLASTn 프로그램(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)을 통해 분석하였고, CLUSTAL W 프로그램(MEGA 6.0.)을 이용하여 유사한 염기서열을 정렬하였다. 이 균주의 계통수(phylogenetic tree)는 MEGA 6 프로그램으로 Neighbor-joining 방법을 사용하여 생성되었다. 부트스트랩(bootstrap) 분석은 구성된 계통수의 안정성을 평가하기 위해 1000번의 복제로 구현되었다.
6. 활성 화합물의 정제 및 구조적 식별
균주 KR0006에 의해 생성된 활성 물질을 분리하기 위해 먼저 배양 여과액을 에틸 아세테이트(EtOAc)를 사용하여 추출하였다. 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 시스템 및 세파덱스(Sepadex) LH-20 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 EtOAc 분획을 순차적으로 정제하고 활성 분획을 성공적으로 분리했다. 얻어진 각 분획의 살충 활성은 잎 디스크 급이 분석을 수행하여 평가하였다(3. 살충 분석 참조). 그 후, 살충 활성을 나타내는 활성 분획을 분취용(preparative) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 추가 정제하였다. HPLC 분석은 JASCO HPLC(PU890, MD910, Tokyo, Japan)에서 수행되었으며 70% 아세토니트릴(230 nm, 0.8 ml/min, 물 T3 컬럼)이 분석의 전개 용매로 사용되었다.
NMR 분석을 통해 분리된 화합물의 구조를 확인하였다. 분리된 화합물을 CDCl3 또는 DMSO에 녹이고 800MHz 핵자기공명장치(Brucker, 독일)에서 1H-NMR, 13C-NMR, 및 2D-NMR을 수행하여 추론하였다. 화학적 이동이 있는 1H- 및 13C-NMR 스펙트럼은 CDCl3 용매 신호(1H-NMR에서 7.26ppm 및 13C-NMR에서 77.2ppm)를 참조하여 백만분율(ppm)로 표시되었다. 분자량은 고해상도 전자분무 이온화 질량분석기(ESI-MS)(YL9100S, Young Lin 장치)를 통해 측정하였다.
7. UV 돌연변이를 통한 균주 활성 증가
선택된 배양액로부터 포자 현탁액을 연속 희석 방법으로 제조하였다. 10-2 희석액(약 104-105 포자 ml-1)의 100 μL 배양 샘플을 멸균 조건에서 베넷 한천 배지에 적용하고 27℃에서 60분 동안 배양했다. 각 페트리 플레이트에 UV 조사(254 nm, 높이 17 cm)를 4℃에서 30초 내지 90초간 처리하고, 27℃에서 72시간 동안 배양하였다. 생존 및 치사율은 UV 노출 후 평가되었고 생존 돌연변이 콜로니는 전술한 M3 액체 배지에서 배양되었다. 돌연변이 배양 상층액이 수확되면 전술한 잎 디스크 섭식 분석(3. 살충 분석 참조)을 수행하여 배추좀나방 유충에서 각 돌연변이의 활성을 스크리닝하였다.
가장 높은 살충 활성을 나타내는 돌연변이 균주를 선택하고 1차 돌연변이에서 얻은 균주의 활성을 증가시키기 위해 2차 돌연변이를 시켰다. 2차 돌연변이는 1차 돌연변이에서 수행된 돌연변이 및 스크리닝 절차와 동일하게 수행되었다.
8. 돌연변이 균주에 대한 배양 최적화
a) 온도 최적화: 2차 돌연변이 균주는 4L 작업 부피의 M3 액체 배지에서 300rpm의 교반 속도, 초기 pH 7.1에서 7일 동안 온도 25, 27, 30 및 35℃에서 배양되었다.
b) 교반 속도 최적화: 2차 돌연변이 균주는 4L 작업 부피의 M3 액체 배지에서 30℃, 초기 pH 7.1에서 7일 동안 교반 속도 200, 250, 300 및 350 rpm에서 배양되었다.
c) 배양 배지 최적화: 2차 돌연변이 균주는 4L 작업 부피의 M3(가용성 전분 2%, 포도당 1%, 소이톤 1%, CaCO3 0.3%, FeSO4 0.02%) 및 GS33(포도당 3%, 대두가루 3%)의 액체 배지에서 30℃, 초기 pH 7.1에서 6일 동안 300rpm의 교반 속도에서 배양되었다. 모든 실험에서 각 돌연변이체의 살충 활성은 전술한 잎 디스크 섭식 분석(3. 살충 분석 참조)을 수행하여 배추좀나방의 유충에 대해 결정되었다. 그러나 돌연변이 배양 배지는 적용 전 5배(x1/5) 희석하였다.
<결과>
1. 스트렙토마이세스 분리균주의 살충 활성
850개 박테리아 균주 모두는 잎 디스크 섭식 분석을 사용하여 배추좀나방의 살유충 활성에 대해 스크리닝되었다. 실험에서 유충 치사율이 80% 이상인 6개 균주 중 KR0006이 가장 높은 살유충 활성을 보였고 처리 3일 후 유충이 완전히(100%) 사멸되는 것을 확인하였다(도 1).
가장 높은 살충 활성을 나타낸 KR0006이 선택되었고 전체 식물 섭식 분석에 적용되었다. 선택된 균주의 살유충 활성은 5 DAT에 따라 용량 의존적이었고, 나방 유충을 배양 용액의 최대 5배 희석액으로 처리했을 때 90% 이상의 유충 치사율이 관찰된 반면, 10배 이상의 희석액 배양에서 처리된 경우 30% 미만의 치사율을 얻었다(도 2). 또한, 2배 희석배지를 적용한 결과, 처리 5일 후 유충 치사율은 100% 이었다. 다만, 처리 초기에는 유충 활동으로 인해 약간의 섭식자국이 보였다(도 3).
산란 억제 활성 결정 실험 결과, 배추좀나방의 산란 억제로 인한 활성 유충의 발생은 무처리 대조군에 비해 현저히 적었다. 1차 처리 시 유충 발생에 의한 섭식흔이 거의 관찰되지 않았으며 2차 처리 후 유충의 생육이 확인되지 않아 100%의 살충활성을 확인하였다(도 4). 따라서, KR0006이 10 DAT에 나방과 유충을 100% 폐사시켰으며, 이는 나방 산란과 유충 성장 및 발달에 대한 완전한 억제 효과가 있음을 의미한다. KR0006의 높은 수준의 살충 및 살유충 활성을 고려하여 분자 식별, 화학 분석 및 UV 돌연변이 유발과 같은 추가 조사를 하였다.
2. 균주 KR0006의 분류학적 구분
KR0006 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 얻기 위해 범용 프라이머를 이용한 PCR 기법을 수행하였다. 얻어진 염기서열을 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLASTn 프로그램을 통해 다른 스트렙토마이세스 균주의 염기서열과 비교하였다. 16S rRNA 염기서열분석을 통해 유사균주와 비교분석한 결과 스트렙토마이세스 시네레오루버(Streptomyces cinereoruber) NBRC 12756 균주와 99% 일치하는 경향을 보였다(도 5). 따라서 균주 KR0006은 스트렙토마이세스 시네레오루버의 아속으로 분류될 수 있다.
3. 활성 화합물의 정제 및 구조적 측정
스트렙토마이세스 균주 KR0006의 배양액을 에틸아세테이트를 사용하여 분배하고 분류 및 중압 액체 크로마토그래피(MPLC) 및 세파덱스 LH20 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리하였다(도 6). 배추좀나방 유충에 활성을 갖는 분획을 0.02% 트리플루오르아세테이트산을 함유하는 70% 아세토니트릴을 전개용매로 HPLC(230 nm, 0.8 ml/min, Water, atlantis T3 컬럼) 분석을 실시한 결과 5개 피크(316-HP1~HP5)가 확인되었으며 각 피크는 고압 액체크로마토그래피(HPLC) 시스템을 이용하여 정제되었다(도 7).
5개의 화합물 중 살충활성이 강한 활성 화합물 316-HP2, HP3, HP5의 구조를 결정하기 위해 NMR 분석을 수행하였다. 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR 실험과 고해상도 전자분무 이온화 질량분석법을 통해 316-HP2, 316-HP3, 316-HP5 화합물은 각각 antimycin A3a, antimycin A8a, antimycin A1a로 확인되었다(표 1).
활성 물질 316-HP3(안티마이신 A8a)은 고분해능 질량분석기([M+H]+, m/z 535.26) 결과 C5H11의 알킬기를 지닌 화학식 C27H38N2O9의 물질로 확인되었다. 또한 COSY NMR 분석 시 2.53ppm(7-H)에서 메틴으로부터 1.65 및 1.36ppm(Hα)에서 메틸렌 수소로, 1.06ppm(Hβ)에서 Ha에서 메틸렌으로, 1.45ppm(Hγ)에서 Hα에서 메탄으로, 0.83ppm(Hα 및 Hβ)에서 Hγ에서 6개의 수소 메틸 이중선으로의 변환은 알킬 측쇄가 이소펜틸(3-메틸 부틸)임을 나타낸다. HMBC 분석 시 Hδ 및 Hε에서 Cγ 및 Cβ로의 연결은 측쇄 구조를 확인하였다.
또한 화학식 C26H36N2O9([M+H]+, m/z 520.24)를 갖는 활성 물질 316-HP2의 경우, 화합물 316-HP3과 상당히 유사함을 확인하였다. 측쇄에 선형 알킬로 보이므로 분지된 CH 피크가 없었고 화학식 C28H40N2O9([M+H]+, m/z 549.28)를 갖는 316-HP5도 316-HP3의 호변이성질체로 확인되었다.
Figure 112022047619285-pat00001
MW R1 R2
Antimycin A3a (316-HP2) 519 (CH2)3CH3 CH(CH3)CH2CH3
Antimycin A8a (316-HP3) 534 (CH2)2CH(CH3)2 CH(CH3)CH2CH3
Antimycin A1a (316-HP5) 548 (CH2)5CH3 CH(CH3)CH2CH3
4. UV 돌연변이를 통한 균주 활성 향상
선택된 균주 KR0006의 살충 활성은 도 8과 같이 UV 처리를 통한 돌연변이 분석을 수행하여 향상되었다. 돌연변이 콜로니의 수는 UV 노출 시간이 증가함에 따라 감소했으며 UV 노출로부터 획득된 살아남은 돌연변이는 원래의 뉴클레오티드 서열과 표현형을 복원하지 않고도 여러 세대 동안 안정적으로 유지될 수 있었다. 각 돌연변이체(다른 UV 처리 시간)의 살충 활성은 배추좀나방의 유충에 대해 스크리닝되었다.
표 2를 참조하면, 실험한 UV 돌연변이체 중에서 돌연변이체 U67에서 가장 높은 활성이 관찰되었다. 돌연변이 U67의 5배 희석에서 유충 사망률은 처리 24시간 후 70%, 처리 48시간 후 100%로 다른 돌연변이 및 야생형에 비해 살충력이 증가한 것을 확인하였다.
처리 유충 치사율 (%)
24시간 후 48시간 72시간
U21 0±0e 60±5c 95±4a
U22 0±0e 70±5b 70±5b
U23 30±2c 75±5b 100±0a
U24 0±0e 50±4c 80±10b
U25 0±0e 15±3d 92±2a
U26 0±0e 0±0e 100±0a
... ... ... ...
U67 70±5a 100±0a 100±0a
U73 50±5b 80±10b 100±0a
... ... ... ...
야생형 5±2d 20±5d 45±5c
상기와 같이 우수한 살충력을 나타낸 돌연변이 U67을 선택하고, 이에 2차 UV 돌연변이를 시켰다. 돌연변이 U67을 사용한 두 번째 UV 돌연변이 유발에서는 돌연변이 U67-46이 선택되었다. 잎 디스크 섭식 분석에 의한 돌연변이 U67-46의 유충 활성은 각각 20배 및 30배 희석액으로 처리했을 때 98% 및 65% 이었다. 2차 돌연변이 균주 U67은 배양여액을 10배 희석하여 처리했을 때 유충 치사율이 55%로 2차 돌연변이체 U67-46의 살충활성이 1차 돌연변이 균주 U67에 비해 2배, 야생형보다 5배 이상 증가한 것으로 나타났다. 또한, 2차 돌연변이 균주 U67-46은 20배 희석액에서 1차 돌연변이 균주 U67에 비해 살충 활성이 4배 정도를 나타내었다(표 3).
희석 배율 유충 치사율 (%)
야생형 U67 U67-46
1 100±0a 100±0a 100±0a
2 100±0a 100±0a 100±0a
5 90±3a 100±0a 100±0a
10 15±4b 55±3b 100±0a
20 0±0c 25±3c 98±2a
30 0±0c 0±0d 65±10b
5. 2차 돌연변이 균주 U67-46에 대한 배양 최적화
2차 돌연변이 균주 U67-46은 온도 20-35℃, 교반 속도 200-350 rpm, 배양 배지 M3 또는 GS33에서 7일 동안 배양되었다.
표 4 내지 표 5, 도 8를 참조하면, 온도 30℃, 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1, M3 배지에서 3-4일 동안 배양할 때 최대 살충 활성(100%)이 관찰되었다. 그러나 상기 조건에서 4일을 초과하여 배양하면 살충 특성이 감소하였다. 한편 온도 27℃, 교반 속도 300rpm, 초기 pH 7.1에서 M3 배지에서 배양하는 경우, 최대 살충 활성(100%)을 나타내는데 배양 기간이 5일로 연장되었다. 30℃ 초과의 온도 및 300rpm 초과의 교반 속도는 살충 활성을 상대적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 도 9에 따르면, 전체 배양 일수(1 내지 6일)에서 M3 배지를 사용하는 경우 GS33 배지를 사용하는 경우보다 유충 방제 활성이 유의하게 높은 것으로 나타났다.
배양일/온도 생존 유충 ± 편차 (%, 살충률)
25℃ 27℃ 30℃ 35℃
2일 6.1 ± 1.6 (39.3) 5.3 ± 1.5 (46.6) 1.5 ± 0.2 (85.2) 0.8 ± 0.1 (92.7)
3일 4.2 ± 0.8 (58.3) 2.0 ± 1.0 (80.0) 0.0 ± 0.0 (100.0) 0.3 ± 0.0 (96.7)
4일 1.1 ± 0.4 (89.6) 1.7 ± 0.5 (83.3) 0.0 ± 0.0 (100.0) 0.9 ± 0.1 (91.6)
5일 2.1 ± 0.5 (79.3) 0.0 ± 0.0 (100.0) 1.3 ± 0.5 (87.3) 2.9± 0.2 (71.3)
6일 3.6 ± 0.1 (64.7) 3.3 ± 0.5 (66.7) 1.7 ± 0.0 (83.0) 3.4 ± 0.2 (67.3)
7일 3.7 ± 0.1 (63.7) 3.3 ± 0.5 (66.7) 3.0 ± 0.0 (70.0) 3.4 ± 0.2 (67.3)
* 상기 값은 피셔 검정(Fisher test)에서 3회 반복(n=3)의 평균이다(평균 ± 표준 오차).
배양일/rpm 생존 유충 ± 편차 (%, 살충률)
200 250 300 350
2일 10.0 ± 0.0 (0.0) 7.6 ± 1.1 (24.7) 1.5 ± 0.2 (85.2) 5.1 ± 1.1 (49.6)
3일 8.6 ± 1.1 (14.3) 3.2 ± 0.8 (68.3) 0.0 ± 0.0 (100.0) 1.8 ± 1.3 (82.6)
4일 5.3 ± 1.1 (47.4) 2.0 ± 0.2 (80.1) 0.0 ± 0.0 (100.0) 0.5 ± 0.1 (95.1)
5일 5.2 ± 0.7 (48.3) 0.2 ± 0.1 (98.7) 1.3 ± 0.5 (87.3) 1.5 ± 0.2 (85.6)
6일 2.0 ± 0.2 (80.7) 2.0 ± 0.1 (80.2) 1.7 ± 0.0 (83.0) 2.0 ± 0.5 (80.5)
7일 2.4 ± 0.0 (76.1) 2.0 ± 0.2 (80.1) 3.0 ± 0.0 (70.0) 3.4 ± 0.6 (66.6)
* 상기 값은 피셔 검정(Fisher test)에서 3회 반복(n=3)의 평균이다(평균 ± 표준 오차).
지금까지 본 발명의 스트렙토마이세스 속 돌연변이주 U67-46 균주에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP)로서,
    배추좀나방(Plutella　xylostella)에 대한 해충방제 활성을 가지고,
    상기 균주 배양액의 1 내지 20배 희석액은 90% 이상의 해충 방제율을 가지는 것을 특징으로 하는,
    스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 해충방제 활성은 해충의 산란 억제 또는 살유충 활성인 것을 특징으로 하는,
    스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP).
  6. 제1항에 있어서,
    배추, 양배추, 적양배추, 무, 순무, 유채, 갓, 브로콜리, 콜라드, 케일, 냉이로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 식물에 대한 해충방제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는,
    스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 돌연변이주 U67-46 균주(KCTC14896BP).
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KR102573995B1 (ko) * 2022-12-28 2023-09-07 한국화학연구원 잡초 방제 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속 ds001 균주

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KR100961524B1 (ko) 2007-12-14 2010-06-07 계명대학교 산학협력단 신규의 스트렙토마이세스(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)속균주 및 이를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물
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