KR101700597B1

KR101700597B1 - 방선균을 포함하는 인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제

Info

Publication number: KR101700597B1
Application number: KR1020140158712A
Authority: KR
Inventors: 송재경; 원항연; 김다연; 안재형
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2014-11-14
Publication date: 2017-02-01
Also published as: KR20160058293A

Abstract

본 발명은 방선균 균주를 포함하는 인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제에 관한 것으로 인삼의 뿌리썩음병원균에 대하여 길항 작용을 갖는 방선균 BK185균주 KACC91826P 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.
본 발명의 방선균 BK185균주 KACC91826P 또는 그 배양액을 함유하는 미생물제제는 인삼뿌리썩음병원균에 대하여 우수한 길항능력을 갖고 있으며 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

방선균을 포함하는 인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제{Microbial agent possessing antifungal activity against ginseng root rot pathogens containing soil actinomycete strain}

본 발명은 방선균을 포함하는 인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제에 관한 것으로서, 상세하게는 주요 인삼 뿌리썩음병원균에 대하여 길항작용을 갖는 토양 방선균 BK185 균주를 유효성분으로 포함하는 인삼 뿌리썩음병원균 방제용 미생물 제제에 관한 것이다.

인삼은 식물학적으로 오가과(araliace)의 인삼속(人蔘屬)에 속하며 학명은 파낙스 진생(Panax ginseng C. A. Meyer)으로서 그 뿌리를 약용으로 하는 초본식물(草本植物)이다.

고려인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)은 과거부터 우리나라를 비롯하여 중국, 일본 등에서 주로 건강증진을 위한 목적으로 널리 사용하여 왔다. 인삼의 유효성분들은 인삼의 종류, 뿌리 부위, 수확 년생, 수확 시기, 제조방법에 따라 현저한 차이가 있는 것으로 알려져 있는데, 인삼의 연근별로는 일반적으로 저년근에는 당 함량이 많고 고년근에서는 사포닌 함량이 많은 것으로 알려져 있다.

인삼은 운동능력, 스트레스 반응효과, 인지능력, 심리안정 등 피로회복 능력을 보유한 물질임이 Bahrke 등의 인삼연구문헌에서 밝혀져 있으며, 신체의 감염물질과 같은 이물질에 대항하는 비특이적인 방어작용을 활성화시키는 물질로서 면역력 강화 효과를 나타냄을 과학적으로 입증 받았다.

인삼의 식물체는 땅 밑에 뿌리와 뇌두, 땅 위에는 줄기, 잎, 꽃(열매)으로 이루어져 있으며, 다년생이므로 매년 봄이 되면 땅속의 뿌리에서 새싹이 나오고 줄기는 매년 가을이 되면 고사되며, 그때 뇌두(腦頭)에 1년마다 착생한 흔적을 남긴다. 뿌리의 발육과 형태는 년생에 따라 차이가 있고 수확은 4~6년생 때 이루어진다. 인삼은 4~6년 동안 동일 포장에서 장기간 재배를 하여야 하고, 인삼을 수확한 후 다른 작물을 재배하지 않고 1-2년 간 경작 예정지 관리 후 다시 인삼을 경작하는 연작방식 때문에 각종 병해에 의한 피해가 매우 크고 연작장해의 발생가능성이 높다.

연작장해의 주요 요인으로는 독소물질의 축적, 미량원소의 결핍과 같은 화학적 요인과 토양병원균의 밀도 증가 등의 생물학적 요인이 알려져 있다(Jang et al., 2005). 인삼 뿌리썩음병을 유발시키는 토양병원균으로는 세균, 선충, 곰팡이등의 다양한 토양 생물체들이 알려져 있는데, 특히 곰팡이 병원균의 피해가 극심한 것으로 보고되어 있다(Seifert et al., 2003). 이중에서 실린드로카폰(Cylindrocarpon), 푸사리움(Fusarium), 리족토니아(Rhizoctonia), 스클레로티니아 (Sclerotinia)등이 인삼 뿌리썩음병의 주 원인균으로 보고되어 있다(Lee, 2004).

인삼 뿌리썩음병은 진행속도가 느려서 조기 발견이 어렵고, 증상이 발견되었을 때는 이미 병 진행이 만연되어 방제가 늦은 경우가 대부분이다(Jang et al., 2010; Fu et al., 2012). 이들 병원균은 토양 내에 장기간 서식하면서 뿌리부위를 침해하므로 식물 전체를 죽게 하는 전신감염성의 병해를 초래한다(Lee, 2004).

최근 농업기술원 연구결과에 따르면 4년근 이상 인삼의 결주 원인은 지역과 병해 종류 및 발생정도의 차이는 있지만 뿌리썩음병 35%, 잿빛곰팡이병 32%, 줄기반점병 등이 15%를 차지하고 있으며, 인삼뿌리썩음병은 토양에서 월동함에 따라 뿌리에 직접 병을 일으키기 때문에 인삼 식재 후 방제가 어렵고, 병에 의한 결주율 피해가 초작지 4년근 21.8%, 6년근 50%이상이며, 재작지 4년근에는 30-80%에 이르는 등 인삼생산에 있어 최대의 적으로 평가되고 있다.

인삼뿌리썩음병의 초기 증상은 잎가장자리가 붉게 변하거나 잎이 안쪽으로 오므라드는 증상을 보이다가 고사하며, 이와 같은 증상을 나타내는 뿌리는 끝 또는 중간 부분에 적갈색 또는 흑갈색 병반을 형성하며 모상근이 적갈색으로 변색되어 부패한다. 또한 인삼뿌리썩음병은 묘삼에서부터 6년생까지 모든 연생에서 발생하며 고년생으로 갈수록 발생이 많아지는 등, 국내 인삼 재배 농가에서 가장 큰 문제로 손꼽히고 있다.

인삼뿌리썩음병균의 방제를 위하여 토양 훈증제를 사용하는 방법 및 화학농약을 이용한 방제가 알려져 있으나, 이상의 방제법으로는 뚜렷한 효과를 거두기 어렵고 인삼뿌리썩음병 등과 같은 토양 전염성 병원균들은 토양 중에 후막포자를 형성하여 열악한 조건에서도 장기간 생존할 수 있기에 완벽한 방제가 매우 어렵다.

훈증방법은 인삼경작 중에 뿌리썩음병이 발생하여 뿌리가 부패하는 경우에는 적용이 불가능하고, 유해 미생물 및 유용 미생물까지 원천적으로 제거하여 토양생태계의 파괴에 대한 위험성이 있으며, 화학농약의 경우 아직까지 방제가가 낮으며, 일부경작지에서는 무분별하게 화학농약을 남용하여 재배 인삼은 물론 주변 수질과 토양까지 심각하게 오염시킬 가능성도 있기 때문에 인삼의 뿌리썩음병을 해결하기는 쉽지 않다.

최근 저독성, 친환경적인 생물 농약의 개발이 시도되고 있으나, 상용화를 위한 노력이 필요한 실정이다. 또한 인삼뿌리썩음병은 병진전이 더디게 나타나 초기 병진단이 어렵고 식물체가 시드는 증상이 나타나도 이미 병이 뿌리에 만연되어 방제하기에는 늦은 경우가 대부분이다.

이러한 어려움를 극복하기 위해서 잔류 문제가 없으며 환경에 대한 피해가 적은 미생물제제를 이용한 생물학적 방제 연구가 다양하게 이루어지고 있다 (Guo et al., 2009; Jang and Kim, 2011).

방선균(actinomycetes)은 그람양성세균에 속하는 분류군으로 호기성 종속영양세균이며 토양 등의 자연 환경에 우점적으로 분포하는 미생물이다.

방선균은 일반적인 세균과는 달리 균사를 형성하며 생장하는데, 기저 균사체(substrate mycelium), 기중 균사체(aerial mycelium), 분절 포자(arthrospore), 포자낭(sporangia) 등의 독특한 구조를 형성한다는 점에서 다른 세균들과 형태적으로 구별된다(Goodfellow, 2010).

방선균은 다양한 활성을 보이는 효소와 대사물질을 생산하는 기능적 다양성을 지니고 있다(Hopwood, 2006). 특히 방선균이 생산하는 2차 대사산물들은 구조와 기능이 매우 다양하고 풍부하여, 지금까지 알려진 항생물질 약 10,000여 종류 중 75% 이상이 방선균에서 분리되었고, 항암제, 면역조절제, 유용효소 등 다양한 생리활성물질의 약 64% 정도가 방선균에서 유래된 것으로 보고되어 있다(Berdy, 2005). 따라서 방선균은 식품, 환경 및 농산업 분야에도 널리 활용될 수 있는 유용한 생물소재이다.

본 발명에서는 인삼 뿌리 썩음병을 억제하는 항균 활성 미생물제제를 개발하고자, 이들 병원균에 길항 효과를 갖는 유용미생물을 인삼토양에서 방선균을 선택적으로 분리, 선발하였다. 또한 선발 균주에 존재하는 2차 대사산물에 관여하는 유전자를 검출함과 동시에, 대사물질의 직접적인 화학 분석을 통해 길항 메커니즘을 밝히고자 하였다.

Ayuso-Sacido, A. & Genilloud, O. (2005). New PCR primers for the screening of NRPS and PKS-I systems in actinomycetes: detection and distribution of these biosynthetic gene sequences in major taxonomic groups. Microb. Ecol. 49, 10-24. Bㅹrdy, J. (2005) Bioactive microbial metabolites: A personal view. J. Antibiot. (Tokyo). 58, 1-26. Jang, C.-S., J. Lee, S. Kim, J. Song, S. Yoo and H. Kim (2005) Specific detection of root rot pathogen, cylindrocarpon destructans, using nested pcr from ginseng seedlings. Research Plant Chenna, R., H. Sugawara, T. Koike, R. Lopez, T.J. Gibson, D.G. Higgins and J.D. Thompson (2003) Multiple sequence alignment with the clustal series of programs. Nucleic Acids Res. 31(13): 3497-3500. DeBoer C., Meulman P. A., Wnuk R.J. and Peterson D.H. (1970) Geldanamycin, a new antibiotic. J. Antibiot. 23: 442-447. Felsenstein, J. (1985) Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-791. Fu, J., J. Sun, R. Zhou and X. Yan (2012) Molecular detection of Cylindrocarpon destructans in infected chinese ginseng roots and soil. Afr. J. Biotechnol. 11(42): 9955-9960. Goodfellow, M., Kumar, Y., Labeda, D. P. & Sembiring, L. (2007). The Streptomyces violaceusniger clade: a home for streptomycetes with rugose ornamented spores. Antonie van Leeuwenhoek 92, 173??199. Goodfellow, M. (2010) Selective isolation of Actinobacteria, pp. 13-27. In R. H. Baltz, Demain A. L., Davies, J. E. (ed.), Manual of industrial microbiology and biotechnology ASM Press, Washington, DC. Guo, R., X. Liu, S. Li and Z. Miao (2009) In vitro inhibition of fungal root-rot pathogens of Panax notoginseng by rhizobacteria. Plant Pathol. J. 25(1): 70-76. Hopwood, D. A. (2006) Soil to genomics: The Streptomyces chromosome. Annu. Rev. Genet. 40, 1-23. Jang, C.-S., J. Lee, S. Kim, J. Song, S. Yoo and H. Kim (2005) Specific detection of root rot pathogen, cylindrocarpon destructans, using nested pcr from ginseng seedlings. Research Plant Disease, 11(1): 48-55. Jang, C.S., J.H. Lim, M.W. Seo, J.Y. Song and H.G. Kim (2010) Direct detection of Cylindrocarpon destructans, root rot pathogen of ginseng by nested pcr from soil samples. Mycobiology, 38(1): 33-38. Jang, Y.L. and Y.H. Kim (2011) Biocontrol efficacies of Bacillus species against Cylindrocarpon destructans causing ginseng root rot. Plant Pathol. J. 27(4): 333-341. Kim, B.-Y., T.D. Zucchi, H.-P. Fiedler and M. Goodfellow (2012) Streptomyces cocklensis sp. nov., a dioxamycin-producing actinomycete. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 62(2): 279-283. Kumar, S., K. Tamura and M. Nei (2004) Mega3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief. Bioinformatics 5(2): 150-163. Lee, S.-G. (2004) Fusarium species associated with ginseng (Panax ginseng) and their role in the root-rot of ginseng plant. Res. Plant Dis., 10(4): 248-259. Rascher A., Hu Z., Viswanathan N., Schirmer A., Reid R., Nierman W. C., Lewis M., Hutchinson C. R. (2003) Cloning and characterization of a gene cluster for geldanamycin production in Streptomyces hygroscopicus NRRL 3602. FEMS Microbiol. Lett. 218(2):223-30. Rothrock, C.S. and Gottlieb, D. (1984) Role of antibiosis in antagonism of Streptomyces hygroscopicus var. geldanus to Rhizoctonia solani in soil. Can. J. Microbiol., 30, 1440??1447. Saitou, N. and M. Nei (1987) The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4(4): 406-425. Seifert, K., C. McMullen, D. Yee, R. Reeleder and K. Dobinson (2003) Molecular differentiation and detection of ginseng-adapted isolates of the root rot fungus Cylindrocarpon destructans. Phytopathology 93(12): 1533-1542. Tapi, A., M. Chollet-Imbert, B. Scherens and P. Jacques (2010) New approach for the detection of non-ribosomal peptide synthetase genes in Bacillus strains by polymerase chain reaction. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85(5): 1521-1531. Toyomura K., Saito T., Emori S., Matsumoto I., et al. (2012) Effects of Hsp90 inhibitors, geldanamycin and its analog, on ceramide metabolism and cytotoxicity in PC12 cells. J. Toxicol. Sci., 37: 1049-1057. Wayne, L.G., D.J. Brenner, R.R. Colwell, P.A.D. Grimont, O. Kandler, M.I. Krichevsky, L.H. Moore, W.E.C. Moore, R.G.E. Murray, E. Stackebrandt, M.P. Starr and H.G. Trueper (1987) Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 463-464.

본 발명의 목적은 인삼 뿌리썩음병원균에 대하여 길항작용을 갖는 방선균 균주를 유효성분으로 포함하는 인삼 뿌리썩음병원균 방제용 미생물 제제를 제공하는데 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제는 인삼의 뿌리썩음병원균에 대하여 길항 작용을 갖는 방선균 BK185 균주 KACC 91826P 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 것이 특징이다.

상기 인삼 뿌리썩음병원균은 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 니발리스(Sclerotinia nivalis) 중 어느 하나 이상인 것이 특징이다.

상기 방선균 BK185 균주 KACC91826P 는 geldanamycin계열의 항생물질을 생산하는 것이 특징이다.

상기 배양액은 미생물 배지에 방선균 BK185균주 KACC91826P를 28~30℃에서 3~5일간 배양하여 수득된 배양액인 것이 특징이다.

상기 미생물 배지는 ISP2(International Streptomyces Project2; Difco)배지인 것이 특징이다.

상기 미생물 제제는 입제, 수화제 또는 캡슐제인 것이 특징이다.

상기 미생물 제제는 상기 방선균 BK185균주 KACC91826P 또는 그의 배양액에 계면활성제, 증량제 및 영양제를 첨가하여 제조되는 것이 특징이다.

상기 미생물 제제에 포함되는 미생물은 미리리터(㎖) 당 1×10⁶~1×10⁹ 마리인 것이 특징이다.

본 발명의 인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제의 제조방법은 (a) ISP2(International Streptomyces Project2; Difco) 배지에 BK185균주 KACC91826P 포자가 1x10⁶ conidia/ml가 되도록 접종하는 단계; (b) 상기 접종액을 28~30℃에서 3일 내지 5일간 배양하는 단계; 및 (c) (b) 단계로 얻어진 배양물의 불순물을 제거하는 단계를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명의 인삼뿌리썩음병을 방제하는 방법은 상기의 미생물제제를 이용하는 것을 특징으로, 바람직하게는 상기 미생물 제제를 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 집중하여 살포하거나, 침지시켜 방제하는 것이 특징이다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 방선균 BK185균주 KACC91826P 또는 그 배양액을 함유하는 미생물제제는 인삼뿌리썩음병원균에 대하여 우수한 길항능력을 갖고 있으며 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 선발된 균주(BK185)의 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) KACC40037, 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans) KACC44656, 푸사리움 솔라니(Fusarium solani) KACC 44891, 스클러로티니아 니발리스(Sclerotinia nivalis) KACC 45152, 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) KACC 40123에 대한 생장 억제를 나타내는 도면이다.
도 2는 선발된 균주(BK185)의 분석된 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 작성된 분자계통수이다.
도 3은 선발된 균주(BK185)가 생산하는 2차 대사 산물의 생합성에 관여하는 유전자를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 인삼뿌리 썩음병 방제용 미생물 제제는 인삼뿌리썩음병원균에 대해 길항능력을 가진 균주를 함유한다. 이때, 균주는 생육가능한 상태이어야 하며, 이는 균사(mycelial) 및 포자(spore) 형태일 수 있다.

설명하면, 본 발명에서는 인삼뿌리썩음병원균 특히, 인삼의 근부병원균 및 지상부병원균에 대해 길항능력이 있는 균주를 선별하기 위해, 강원도 인삼재배 토양에서 총 100 균주의 세균을 분리하여 이중에서 항균 활성이 가장 우수한 BK185 균주를 토양에서 분리해 낸다.

상기 분리된 BK185균주는, 인삼 뿌리썩음의 주요 원인 병원균인 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 니발리스(Sclerotinia nivalis)에 대하여 매우 높은 항균 활성을 갖는 것으로 하기 실시예를 통해 규명한다.

상기 선발된 BK185 균주는 항진균 및 항세균 효과를 지니고 있는 geldanamycin계열의 항생물질을 생산하는 것을 하기 실시예를 통해 규명한다.

상기 선발된 BK185균주는 16S rRNA 유전자 염기서열로 계통 유전학적 분석을 실시한 바, Streptomyces sporoclivatus 및 S. geldanamycininus와 가장 높은 상동성이 있는 방선균으로 동정하였다.

이에 본 발명자는 상기 균주를'Streptomyces sp. BK185'로 명명하고, 이 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하여 2013년 6월 17일 수탁번호 KACC91826P를 부여받았다.

상기 Streptomyces sp. BK185는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 1520bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다.

또한, 상기 본 발명의 인삼뿌리 썩음병 방제용 미생물 제제는 상기 토양 방선균 BK185 균주를 배양액의 형태로 함유되기도 한다.

설명하면, 본 발명에 있어서의 용어 '배양액'은 미생물 생장에 적절한 배지에 일정 농도의 포자를 접종하여 배양기에서 일정 기간 동안 미생물이 생장하도록 유도한 후 수득된, 균체, 균체가 생장하면서 분비한 물질, 및 생장에 필요한 영양성분이 혼합된 액으로서, 불순물을 걸러내는 과정을 거쳐 제조할 수 있다.

본 발명의 용어 '방제'는 일반적으로 식물 병원체 감염을 예방, 감소 또는 근절시키는 것을 포함하며, 감염에 있어서의 예방 또는 감소는 비처리된 기주식물에 대하여 통계적으로 현저한 차이가 있음을 의미한다.

이에, 본 발명의 인삼뿌리 썩음병 방제용 미생물 제제에 상기 균주를 배양액의 형태로 함유될 경우 상기 미생물 배지는 방선균 BK185균주가 생장할 수 있는 ISP2(International Streptomyces Project2; Difco)배지를 사용하며, 상기 배양액은 상기와 같이 분리된 방선균 BK185 균주를 미생물 배지에서 3~5일간 배양하여 수득된 배양액을 사용하는 것이 좋다.

상기 배양 온도는 25~31℃에서 이루어지며, 바람직하게는 28~30℃에서 배양하는 것이 좋다.

본 발명의 미생물 제제는 미생물의 안정적인 제제화를 목적으로 수화제, 입제 또는 캡슐화의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 미생물 제제에 있어서, 상기 미생물 또는 배양액을 인삼뿌리썩음병원균 방제용 조성물에 포함된 채로 공급될 수도 있고, 장기간 보존을 위해 별도로 보관하였다가 사용 직전에 혼합하여 사용할 수도 있다. 상기 미생물을 장기간 보존하기 위해 별도로 공급되는 경우에는 글리세롤 저장용액에 -70℃ 이하로 보존하거나 -20~-80℃에서 동결건조 보존하여 사용할 수 있다.

본 발명의 수화제는 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제 및 증량제/영양제를 첨가하여 혼합하여 제조된다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린(dextrin), 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용한다.

또한, 본 발명의 입제는 미생물을 접종한 고체배지를 건조시켜 분쇄한 후 계면활성제, 증량제/영양제 및 붕해제를 첨가하여 제조된다. 상기에서 계면활성제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 증량제 및 영양제로는 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용한다.또한, 본 발명의 입제는 미생물에 표면 활성제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제 및 흐름제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 것을 추가로 첨가하여 제조될 수 있다.

본 발명의 미생물제제의 적용은 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 방선균 BK185균주를 집중하여 살포하고, 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 미생물의 수가 1×10⁷ 마리 이상으로 살포하는 것이 바람직하다. 또한, 미생물제제의 적용은 미리리터(㎖) 당 1×10⁶~1×10⁹마리의 미생물 농도로 희석한 용액을 인삼의 뿌리에 직접살포하거나, 미리리터당 1×10⁶~1×10⁹ 마리의 미생물 농도로 희석한 용액에 인삼을 1~2시간 동안 침지시킬 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 미생물제제는 인삼뿌리썩음병원균에 대하여 우수한 길항능력을 갖고 있으며 환경공해와 인체독성이 없어 환경 친화적인 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물제제로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 균주의 분리

1. 실험방법

인삼뿌리썩음병을 억제하는 길항 방선균을 선택적으로 분리하기 위해서, 강원도 철원군 소재 강원도 농업기술원 포장에서 토양을 채취하였다. 토양시료 2 g을 멸균 생리식염수로 희석하여 희석 현탁액 (10^-4∼10^-6)을 만든 후 0.1 ml을 선택배지에 분주하여 도말하였다. 선택배지로는 AIG (Actinomycete Isolation Agar; Difco) 배지를 이용하였다. 도말한 배지는 30℃ 항온기에서 5일간 배양하였으며 형태적 차이를 보이는 콜로니를 대상으로 무작위적으로 96주를 선별 분리하였다.

2. 실험결과

희석평판 배지로 부터 96균주를 분리하여 1차 항균성 능력을 조사하였다. 1차 시험 균주는 길항미생물에 대해 비교적 감수성이 크게 나타나는 Rhizoctonia solani KACC 40123으로 실시하였으며, 선발 균주중 총 15 균주가 병원균의 균사 생장을 억제하는 것을 관찰하였다. 1차 선발된 균주는 인삼의 뿌리썩음병의 주원인균인 Fusarium oxysporum KACC 40037과 Cylindrocarpon destructans KACC 44656를 대상으로 병원균의 균사 생장 억제를 2차로 확인하였다. 2차 시험에서 총 4 균주(BK120, BK185, BK190, BYK1158) 가 높은 생장 억제 정도를 보였으며, 이중에서 가장 큰 활성을 보이는 균주 BK185 를 최종 선발하였다.

<실시예 2> 선발 균주의 항균 활성 검정

1. 실험방법

실시예 1의 선발된 균주를 대상으로 인삼 뿌리썩음의 주요 병원균인 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 니발리스(Sclerotinia nivalis)과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사하였다. 공시 시험 균주들(C. destructans KACC 44656, C. destructans KACC 41077, F. oxysporum KACC 40037, F. solani KACC 44891, R. solani KACC 40123, S. nivalis KACC 45152)은 농촌진흥청 농업미생물은행(KACC) 으로부터 분양 받아 사용하였다. 공시한 각각의 병원균 균총을 8 mm cork borer 를 이용하여 절단한 후 PDA (Potato Dextrose Agar; Difco) 배지 중앙에 치상한 후 분리균주를 대치 배양하였다. 대치 배양된 각각의 병원균을 최적 생장온도(Cylindrocarpon destructans, Sclerotinia nivalis 는 21℃, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani 는 25℃) 에서 4-5일간 배양 한 후 선발 균주들의 균사 생장 억제 능력을 조사하였다.

2. 실험결과

최종 선발 균주 BK185를 인삼 뿌리 썩음 병원균 5종 (Cylindrocarpon destructans, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Sclerotinia nivalis) 과 대치 배양하여 균사 생장 억제능력을 조사한 결과, 모든 병원균에 대해서 항균활성을 보였다. 도 1에서 보면, 선발 균주 BK185는 특히, 인삼 뿌리 썩음병의 주원인균인 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)과 실린드로카폰 데스트럭탄스(Cylindrocarpon destructans)균주에 대한 뚜렷한 생장 억제능을 보였다, 이는 선발 균주가 인삼 뿌리썩음병 방제를 위한 미생물제제로서의 잠재적 우수성이 크다는 것을 제시한다. 추후 실제 실외 생물검정을 통해 생물적 방제제로서의 가능성을 추가적으로 확인해야 할 것으로 판단된다.

<실시예 3> 선발 균주의 동정

1. 실험방법

실시예 2에서 선발된 균주를 동정하기 위해서 16S rRNA 유전자를 분석하였다.

ISP2(International Streptomyces Project2; Difco)에 접종하여 30℃에서 24시간 배양후 원심 분리하여 균체를 수확하였다. Genomic DNA extraction kit (iNtRON, Korea) 를 사용하여 수확한 균체에서 DNA를 분리하였다.

16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F 와 1492R 을 사용하여, Kim 등(2012)의 방법대로 PCR반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 DNA 정제키트(QIAquick PCR Purification kit ,Qiagen,USA)를 사용하여 정제 하였다. 염기서열분석은 제노텍 (Genotech Co, Korea)에 의뢰하여 결정하였다.

비교 표준 균주의 염기서열은 EzTaxon 데이터베이스()를 통해서 다운로드 받아, Clustal W 프로그램으로 염기서열의 정렬을 수행하였다(Chenna et al., 2003).

정렬된 염기서열은 MEGA 3.0 프로그램(Kumar et al., 2004)을 사용하여 계통도를 작성하였다. 계통도 작성은 Neighbor-joining 알고리즘(Saitou and Nei, 1987)을 사용하였다.

계통도 견고성을 확인하기 위해서 1000회 반복으로 bootstrapping (Felsenstein, 1985)을 수행하여 수치를 계통도에 표시하였다(도 2). 분석된 16S rRNA 유전자 서열은 GenBank 온라인 데이터베이스에 등록(accession number FR692113) 하였다.

2. 실험결과

Streptomyces sporoclivatus와 S. antimycoticus 종의 표준균주와 99.86%의 높은 상동성을 보였다. 이것은 비교된 16S rRNA 유전자의 전체 1465개 nucleotides 중에서 2개의 nucleotide 가 차이를 보이는 결과이다. 또한 S. melanosporofaciens 와 S. castelarensis도 각각 99.79%와 99.66% 의 높은 상동성을 보였다. 이들 네 개의 종(species)은 16S rRNA 유전자 서열만으로는 분류학적 구분이 불가능한 Taxonomic group으로 EzTaxon 에 지정되어 있다. 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 선발 균주의 분자계통도를 작성한 것을 도 2에 나타내었다. 염기서열 상동성 비교와는 달리 분자 계통도에서는 선발 균주가 Streptomyces geldanamycininus NRRL B-3602^T균주와 가장 가까운 근연 관계를 보였다. 그러나 상동성은 99.59%로 비교된 전체 1446개의 nucleotide 들 중에서 6개의 nucleotide가 달라서 비교적 앞에 기술한 다른 종들에 비해서 상동성은 낮게 나타났다. 계통도의 안정성을 확인하기 위한 Bootstrap 값도 87%로 높은 수치를 보이고 있어, 이 균주는 S. geldanamycininus와 근연종의 균주로 추정되지만, 정확한 분류학적 종 동정 (Taxonomic identification)을 위해서는 여러 가지 생리생화학적 검사와 비교 균주들과의 DNA-DNA relatedness 실험이 추가적으로 필요하다(Wayne et al., 1987). 가장 가까운 근연종인 S. geldanamycininus 종의 표준균주인 NRRL 3602 는 기존에 S. hygro scopicus subsp. geldanus 종으로 분류되어 있던 균주로 Goodfellow 등(2007)에 의해서 기존의 종과는 다른 신종인 Streptomyces geldanamycininus 으로 재분류되었다. 이 종의 표준균주인 NRRL 3602 균주는 항진균 효과를 보이는 geldanamycin을 생산하는 것으로도 알려져 있다(Rascher et al., 2003). 이와 같은 선발 균주의 분류학적 위치는 계통유전학적으로도 이 균주가 매우 높은 항균활성을 보유하고 있음을 뒷받침해준다.

<실시예 4> 2차 대사산물 생합성 유전자 검출 및 염기서열분석

1. 실험방법

Streptomyces 속 방선균은 여러가지 2차 대사물질을 생산하는 것으로 알려져 있다 (Bㅹrdy, 2005). PCR을 통한 생합성 유전자의 검출은 실제 대사물질들을 화학적으로 분석하지 않아도 쉽게 유전적 특성을 확인할 수 있는 유용한 방법이다 (Tapi et al., 2010). 일반적으로 방선균이 생산하는 것으로 알려진 PKS (Type-I polyketide synthase) 와 NRPS (Non-ribosomal polypeptide synthetase) 유전자의 검출을 위해서 Ayuso-Sacido와 Genilloud (2005)의 방법대로 PKS와 NRPS 유전자 특이 프라이머를 사용한 PCR 반응을 수행하였다(표 1). 표 1에 상기 PCR 반응에 사용된 프라이머 정보를 나타내었다.

Primer	Sequence(5'-3')	Target genes*	Size of PCR product (bp)
K1F	TSAAGTCSAACATCGGBCA	PKS-I	1200 - 1400
M6R	CGCAGGTTSCSGTACCAGTA	PKS-I	1200 - 1400
A3F	GCSTACSYSATSTACACSTCSGG	NRPS	700 - 800
A7R	SASGTCVCCSGTSCGGTAS	NRPS	700 - 800

* Specific primer sequences used for the detection of the NRPS and PKS genes in this study. (NRPS, non-ribosomal peptide synthetase; PKS-1, type- I polyketide synthase).

증폭된 산물은 클로닝을 통해 개별 콜로니를 분리하여 염기서열을 결정하였다. PCR 반응은 2X TOPsimple^TM DyeMIX - Tenuto PCRkit(EnzymonicsCo.,Korea)를 사용하였다. 전체 반응물 20μl내에 1μl 의 DNA(50 ng) 와 10pmol primer들을 넣었다. PCR 반응 온도는 제조사의 안내서에 따라서 initial denaturation (95℃, 2분), 30회 반복으로 denaturation (95℃, 30초), annealing (55℃, 45초), elongation (72 ℃, 1분)을 하였으며, 최종 elongation 반응은 72℃에서 5분간 실시하였다.

증폭된 PCR산물은 전기영동을 통해서 예상된 크기의 산물임을 확인하였고, 클로닝에 사용하였다. 클로닝은 EZ-Fusion Cloning^TMkit(EnzymonicsCo.,Korea)를 사용하였다. 제조사의 사용법에 따라서 전체 부피 6 ㅅl의 혼합물을 실내온도에 5분간 반응하였고, competent E. coli 세포에 열충격 방법으로 형질전환하였다. 형질전환된 세포들을 16시간 배양후 white/blue 콜로니 선별방법으로 양성 세포들만 선별한 후, Plasmid mini-prep kit (iNtRON, Korea) 로 클로닝된 plasmid를 추출하여 Genotech Co. (Korea) 에서 목적 유전자의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 NCBI 의 Blast search 방법(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) 으로 검색한 후 GenBank에 등재된 유전자중에서 상동성이 가장 높은 유전자들을 확인하였다.

2. 실험 결과

검출된 PCR 산물로 E. coli에 클로닝한 후에 NRPS 유전자 clone 8개와 PKS 유전자 clone 11개를 선별해서 염기서열을 분석하였다. 개별 clone들에서 결정된 염기서열을 바탕으로 NCBI Blast 검색을 수행하였다. 표 2와 같이, NRPS 유전자 clone 7개는 모두 S. rapamycinicus NRRL 5491 균주가 보유하는 Enterobactin synthase 유전자와 높은 상동성(93%)을 보였으며, 1개의 clone은 S. iranensis가 보유한 amino acid adenylation domain 유전자와 높은 상동성(94%)을 보였다.

Target gene	Clone name	Identities (%)	Closest (Product)	Origin	Accession number
NRPS	#4, #7, #15, #16, #17, #19, #20	657/704 (93%)	Enterobactin synthase	Streptomyces rapamycinicus NRRL 5491	CP006567.1
NRPS	#11	660/704 (94%)	Amino acid adenylation domain	Streptomyces iranensis	LK022848.1
PKS	#3, #7, #15	597/721 (83%)	Type-I modular polyketide synthase	Streptomyces iranensis	LK022848.1
PKS	#16	707/734 (96%)	Beta-ketoacyl synthase	Streptomyces violaceusniger Tu 4113	CP002994.1
PKS	#11, #13, #14, #21	696/706 (99%)	Polyketide synthase	Streptomyces geldanamycininus NBRC 14620	AB430980.1
PKS	#4, #8	692/699 (99%)	Unknown polyketide biosynthetic gene	Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus JCM 4427	DQ249342.1
PKS	#9	726/774 (94%)	Geldanamycin biosynthesis gene	Streptomyces geldanamycininus NRRL B-3602	AY179507.1

* BLAST search of NRPS and PKS genes in the strain BK185

11개의 PKS 유전자 clone들은 모두 5개 그룹의 S. hygroscopicus clade의 종들에서 유래된 polyketide synthase 유전자들과 높은 상동성(83~99%)을 보였다. 특히 4개의 clone 들(#11, #13, #14, #21)은 S. geldnanamycininus NBRC 14620 균주에서 유래한 PKS 유전자와 매우 높은 상동성(99%)을 보였고, 1개의 clone (#9)은 표준균주인 S. geldanamycininus NRRL B-3602가 보유한 geldanamycin 생합성 유전자와 94%의 상동성을 보였다. 이러한 결과는 BK185 균주가 PKS와 NRPS 계열의 2차 대사물질을 생산하는 가능성을 제시한다.

<실시예 5> 2차 대사물질의 화학분석

1. 실험방법

선발 균주 BK185의 생산물질을 확인하기 위해서 대량배양을 통해 LC/MS를 이용하여 물질의 구조를 확인하고자 하였다. 전배양을 위해서 선발 균주 BK185를 125 ml 삼각플라스크에 50 mL YEME 액상 배지(4g yeast extract, 10g malt extract, 4g glucose/ 1L distilled water)에서 72시간 1차 배양하였다. 본 배양을 위해서는 2.8 L Fernbach 플라스크를 사용하여, YEME 액상배지 1L씩 전체 6L를 6일간 배양한 후 9L의 에틸아세테이트로 배양액을 추출하였다. 추출된 에틸아세테이트층을 별도로 분리하여 sodium sulfate로 잔존 수분을 제거한 후 농축하여 추출물을 얻었다. 획득된 추출물을 Sep-Pak C₁₈cartridge에 옮긴 후에 각각 20 mL의 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올 용매를 사용하여 분획하였다. 각각의 분획물을 Mass (Agilent Technologies 6130 Quadrupole mass spectrometer, USA)가 장착된 액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 series, USA)장비로 정밀 분석하였다. 분리용 컬럼은 C₁₈reversecolumn(PhenomenexLuna,100×4.6mm)을 사용하였으며, 20분 동안 10% acetonitrile 에서 100% acetonitrile 로 높아지는 gradient 방법으로 이동상 조건을 설정하였다.

2. 실험결과

선발 균주 BYK185를 6일간 본배양후에 에틸아세테이트로 추출하여 농축한 결과, 총 3g의 추출물을 얻을 수 있었다. 추출물을 각기 다른 농도의 메탄올 용매로 분획하였고, 그 중 60% 와 80% 메탄올 농도의 분획에서 가장 많은 물질들이 모인 것을 확인할 수 있었다. 60% 와 80% 농도의 분획물을 대상으로 LC/MS를 사용하여 추출된 대사 물질을 분석한 결과, 각각 12분대와 17분대에서 특이적인 UV spectrum과 Mass spectrum을 갖는 물질을 검출하였다(도 3). 두 개의 peak중 17분대의 peak가 UV diode array absorbance 유형과 mass spectrum 비교를 통해 geldanamycin 계열의 항생물질임을 확인하였다. Geldanamycin은 Streptomyces hygroscopicus의 유사종들에 의해 생산되는 물질로 herbimycin이나 macbecin과 같은 benzoquinone ansamycin계열의 항생물질이다.(DeBoer et al., 1970; Rascher et al., 2003). 이 물질은 식물병원균을 포함한 광범위한 항진균 및 항세균 효과를 지니고 있으며(Rothrock and Gottlieb, 1984), 최근에는 우수한 항암 효과도 보이는 것으로 보고되어 있다(Toyomura et al., 2012).

본 발명에서, 토양에서 분리한 방선균 균주가 인삼 뿌리썩음병을 억제하는 강한 길항능과 이에 관여하는 2차 대사물질이 존재하는 것을 분자생물학적 실험과 화학적 분석 방법으로 증명하였다. 이를 통해 선발 균주가 인삼 뿌리썩음병 방제를 위한 미생물제제로서 활용가치가 충분함을 제시하였다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

국립농업과학원 농업유전자원센터

KACC91826P

20130711

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Microbial agent possessing antifungal activity against ginseng root rot pathogens containing soil actinomycete strain <130> P2014-0152 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1520 <212> RNA <213> Streptomyces sp. BK185 <400> 1 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac 60 gatgaaccgg tttcggccgg ggattagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggcaatctg 120 ccctgcactc tgggacaagc cctggaaacg gggtctaata ccggatatga cacgctcccg 180 catgggatgc gtgtggaaag ctccggcggt gcaggatgag cccgcggcct atcagcttgt 240 tggtggggtg atggcctacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc 300 acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac 360 aatgggcgaa agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa 420 cctctttcag cagggaagaa gcgagagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact 480 acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg cgcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540 aagagctcgt aggcggcttg tcgcgtcgga tgtgaaagcc cggagcttaa ctccgggtct 600 gcattcgata cgggcaggct agagttcggt aggggagatc ggaattcctg gtgtagcggt 660 gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg tggcgaaggc ggatctctgg gccgatactg 720 acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780 taaacgttgg gaactaggtg tgggcgacat tccacgttgt ccgcgccgca gctaacgcat 840 taagttcccc gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900 ccgcacaagc ggcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc 960 ttgacataca ccggaaacct ctggagacag gggccccctt gtggtcggtg tacaggtggt 1020 gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080 ccttgttctg tgttgccagc atgcctttcg gggtgatggg gactcacagg agactgccgg 1140 ggtcaactcg gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat gtcttgggct 1200 gcacacgtgc tacaatggcc ggtacaatga gctgcgaagc cgtgaggtgg agcgaatctc 1260 aaaaagccgg tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag tcggagtcgc 1320 tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380 cgtcacgtca cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ccaacccttg tggggggagc 1440 cgtcgaaggt gggactggcg attgggacga agtcgtaaca aggtagccgt accggaaggt 1500 gcggctggat cacctccttt 1520

Claims

방선균 BK185균주 KACC91826P 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 및 스클레로티니아 니발리스(Sclerotinia nivalis) 중 어느 하나 이상으로 유도되는,
인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 방선균 BK185균주 KACC91826P는 geldanamycin계열의 항생물질을 생산하는 것을 특징으로 하는,
인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제.
제 1항에 있어서,
상기 배양액은 미생물 배지에 방선균 BK185균주 KACC91826P를 28~30℃에서 3~5일간 배양하여 수득된 배양액인 것을 특징으로 하는,
인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제.
제 4항에 있어서,
상기 미생물 배지는 ISP2(International Streptomyces Project2; Difco)배지인 것을 특징으로 하는,
인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제.
제 1항에 있어서,
상기 미생물 제제는 입제, 수화제 또는 캡슐제인 것을 특징으로 하는,
인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제.
제 1항에 있어서,
상기 미생물 제제는 상기 방선균 BK185균주 KACC91826P 또는 그의 배양액에 계면활성제, 증량제 및 영양제를 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는,
인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제.
제 1항에 있어서,
상기 미생물 제제에 포함되는 미생물은 미리리터(㎖) 당 1×10⁶~1×10⁹ 마리인 것을 특징으로 하는,
인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제.
(a) ISP2(International Streptomyces Project2; Difco)배지에 방선균 BK185 균주 KACC91826P의 포자가 1×10⁶ spore/ml가 되도록 접종하는 단계;
(b) 상기 접종액을 28~30℃에서 3일 내지 5일간 배양하는 단계 및
(c) 상기 (b) 단계로 얻어진 배양물의 불순물을 제거하는 단계를 포함하는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 및 스클레로티니아 니발리스(Sclerotinia nivalis) 중 어느 하나 이상으로 유도되는 인삼의 뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제의 제조방법.
제 1항, 제 3항 내지 제 8항 중 선택된 어느 한 항의 미생물제제를 이용하여 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 및 스클레로티니아 니발리스(Sclerotinia nivalis) 중 어느 하나 이상으로 유도되는 인삼뿌리썩음병을 방제하는 방법.
제 10항에 있어서,
상기 미생물 제제는 인삼의 뿌리나 이에 근접한 토양에 집중하여 살포되거나, 침지되는 것을 특징으로 하는, 인삼뿌리썩음병을 방제하는 방법.