WO2020166951A1 - 신규 스트렙토마이세스 속 균주 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 - Google Patents

신규 스트렙토마이세스 속 균주 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물 Download PDF

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WO2020166951A1
WO2020166951A1 PCT/KR2020/001934 KR2020001934W WO2020166951A1 WO 2020166951 A1 WO2020166951 A1 WO 2020166951A1 KR 2020001934 W KR2020001934 W KR 2020001934W WO 2020166951 A1 WO2020166951 A1 WO 2020166951A1
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nematode
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pine
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김창진
김준헌
유민교
강민경
고상현
박동진
김춘식
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한국생명공학연구원
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a novel Streptomyces sp. ( Streptomyces sp.) AE170020 strain, and a composition for controlling pine reel nematode disease containing as an active ingredient a compound isolated from the strain or the culture of the strain.
  • Pine wood disease caused by Bursaphelenchus xylophilus , originated in Japanese pine forests from the early 20th century and is now causing concern around the world.
  • Pinus nematodes are known as hosts of 38 species of pines ( Pinus sp.) around the world, and they cannot move on their own and infect pines by moving through the vector, Monochamus alternatus .
  • the pine tree nematode in the infected tree fables and escapes, it invades the body of the insect and escapes with it, entering the pine tree and proliferating rapidly.
  • massive damage is currently occurring in the Gyeongnam region, and damage is spreading to Jeju Island, Jeonnam, Gangneung and Gyeonggi province.
  • Korean Patent No. 1501033 discloses'Streptomyces Goyang Nsis BIG11003 strain having a nematode effect and its use'
  • Korean Patent No. 1855264 discloses'Pinewood nematode containing pimprinetin as an active ingredient.
  • a composition for controlling diseases' is disclosed, but there is no description of a composition for controlling pine tree nematode disease containing a novel strain of the genus Streptomyces or a compound isolated therefrom of the present invention.
  • the present invention was derived from the above requirements, and the present inventors isolated Actinomycetes AE170020 strain showing excellent nematocidal activity against pine reel nematodes from pine trees in Gangwon-do, and to confirm the active ingredient showing nematocidal activity in the strain , 1 H-NMR, 13 C-NMR, HMQC, 1 H- 1 H COSY, and HMBC spectrum analysis was performed, the nematode active substance of the AE170020 strain was alloaureothin (2-methoxy-3, 5-dimethyl-6-[(2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-on) Confirmed.
  • the allo aureochin has a nematocidal activity that is 6 times higher than abamectin used for controlling pine reindeer in vitro , and the extract of the AE170020 strain containing the allo aureochin targets pine trees in a greenhouse.
  • the present invention was completed by confirming that it exhibited a remarkably superior effect compared to abamectin in the evaluation of the control ability of the pine reel nematodes performed.
  • the present invention provides a Streptomyces sp. AE170020 strain having an accession number of KCTC13792BP.
  • the present invention provides a composition for controlling pine tree nematode disease containing a compound represented by Chemical Formula 1, a stereoisomer thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for controlling pine tree nematode disease containing a culture solution of the strain AE170020 of the genus Streptomyces having an accession number of KCTC13792BP as an active ingredient.
  • Streptomyces sp. according to the present invention Streptomyces sp. according to the present invention ( Streptomyces sp.) AE170020 strain and alloaureothin produced from the strain have excellent nematocidal activity against pine reindeer nematodes and were confirmed to be low toxicity in stability evaluation, It is expected to be very useful in related industries as it can be used for environmentally friendly biological pesticides that are effective for control.
  • Figure 1 shows the step of confirming the effect of the killer nematode activity on a 96-well plate targeting the strains isolated in the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram of the strain of Streptomyces sp. AE170020 isolated in the present invention.
  • Figure 3 shows the spores of the strain AE170020 of the genus Streptomyces were confirmed with a scanning electron microscope.
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the separation and purification process of the active substance (compound 4.1) from the strain AE170020 of the genus Streptomyces.
  • Figure 5 shows the HPLC profile of compound 4.1 (compound 4.1).
  • 13 is a result of an experiment on the efficacy of controlling pine reindeer nematode disease using an acetone extract of a strain culture solution of AE170020 strain of Streptomyces genus.
  • the present invention provides a Streptomyces sp. AE170020 strain having an accession number of KCTC13792BP.
  • the strain AE170020 of the genus Streptomyces according to the present invention has nematode activity.
  • the nematodes may be, for example, re-nematodes, root-knot nematodes, pretty little nematodes, cyst nematodes, and the like, and preferably, pine re-nematodes ( Bursaphelenchus xylophilus ), but is not limited thereto.
  • the strain AE170020 of the genus Streptomyces of the present invention has excellent nematocidal activity against pine reindeer nematodes.
  • the strain AE170020 of the genus Streptomyces was isolated from a pine tree, and a compound having nematocidal activity against pine tree nematodes, for example, alloaureothin; 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(2R, As a strain capable of producing 4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one), etc., the streptomy Seth sp. AE170020 strain was deposited with the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center on January 17, 2019 (accession number: KCTC13792BP).
  • the present invention also provides a composition for controlling pine tree nematode disease containing a compound represented by the following Formula 1, a stereoisomer thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention also relates to the use of a compound represented by the following formula (1), a stereoisomer thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof, for controlling pine worms.
  • R 1 and R 2 are each independently hydrogen, C 1-4 alkyl or C 1-4 alkoxy;
  • R 3 is C 1-4 alkyl;
  • R 4 and R 5 are each independently hydrogen, C 1-4 alkyl, C 1-4 alkoxy, hydroxy or halo;
  • R 6 to R 8 are each independently hydrogen or C 1 to 4 alkyl;
  • n is an integer of 1, 2 or 3.
  • C x ⁇ y where x and y are integers, as used herein, refers to the number of carbon atoms in a given group.
  • a C 1-4 alkyl group is meant to contain 1 to 4 carbon atoms.
  • C 1-4 alkyl refers to a linear or branched saturated hydrocarbon group containing 1 to 4 carbon atoms. Examples of such groups include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl and the like.
  • C 1-4 alkoxy' as used herein as a group or part of a group refers to an -OC 1-4 alkyl group, in which C 1-4 alkyl is as defined herein. Examples of such groups include methoxy, ethoxy, propoxy, butoxy and the like.
  • halo' as used herein may be used in the same way as'halogen', and refers to a fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), or iodine (I) atom.
  • the compound represented by Formula 1 is preferably R 1 , R 2 , R 3 and R 7 are each independently C 1-4 alkyl; R 4 , R 5 , R 6 and R 8 are each independently hydrogen; n may be 1 or 2;, but is not limited thereto, and specifically, R 1 , R 2 , R 3 and R 7 are each independently methyl; R 4 , R 5 , R 6 and R 8 are each independently hydrogen; n may be a compound represented by Formula 2 below, which is 1;
  • the compound represented by Formula 2 may be more preferably a compound represented by Formula 3 below.
  • the compound represented by Formula 3 is more preferably alloaureothin represented by Formula 4, that is, 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[( 2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one compound, but is not limited thereto.
  • the black-filled wedge shape means a direction protruding from the front when the chemical structure is viewed three-dimensionally, that is, three-dimensionally.
  • the compound represented by Formula 4 exhibits a nematode activity 6.4 times higher than that of abamectin against Bursaphelenchus xylophilus , and also a stereoisomeric compound (eg, aureochin; 2-methoxy-3,5- Twice than dimethyl-6-[(2R,5Z)-5-[(E)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one) It is characterized by exhibiting an abnormally high nematode activity.
  • the compound represented by Chemical Formula 4 can be obtained by separating and purifying from an organic solvent extract of a culture solution of Streptomyces sp. AE170020 strain having an accession number of KCTC13792BP, or a method for synthesizing a compound known in the art. It can also be synthesized accordingly.
  • agrochemically acceptable salt includes, for example, a metal salt, a salt with an organic base, a salt with an inorganic acid, a salt with an organic acid, a salt with a basic or acidic amino acid, etc.
  • Suitable metal salts include, for example, alkali metal salts such as sodium salts, potassium salts and the like; Alkaline earth metal salts such as calcium salt, magnesium salt, and barium salt; Aluminum salts and the like may be included.
  • Salts with organic bases are, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, 2,6-lutidine, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, cyclohexylamine, dicyclohexylamine, N ,N-dibenzylethylenediamine and the like may be included.
  • Salts with inorganic acids may include, for example, salts of hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • Salts with organic acids may include, for example, salts of formic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, phthalic acid, fumaric acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid, citric acid, succinic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and the like.
  • Salts with basic amino acids may include, for example, salts with arginine, lysine, ornithine.
  • Salts with acidic amino acids may include, for example, aspartic acid, glutamic acid, and the like.
  • the present invention also provides a composition for controlling pine nematode disease containing as an active ingredient a culture medium of a strain of Streptomyces sp. AE170020 having an accession number of KCTC13792BP.
  • the present invention also relates to the use of a culture solution of Streptomyces sp. AE170020 strain having an accession number of KCTC13792BP for controlling pine reproductive diseases.
  • the'culture solution' of the strain AE170020 of the genus Streptomyces having the accession number KCTC13792BP may include a culture solution of the strain, a supernatant of the culture solution, or a dried product thereof.
  • the culture medium of the strain AE170020 of the genus Streptomyces having the accession number of KCTC13792BP may contain a compound represented by Formula 1, a stereoisomer thereof, or an agrochemically acceptable salt thereof.
  • composition for controlling pine tree nematode disease of the present invention can be prepared in the form of direct sprayable solutions, powders and suspensions, or in the form of highly concentrated aqueous, oily or other suspensions, dispersions, emulsions, oily dispersions, pastes, dusts, scattering substances or granules. , Is not limited thereto.
  • the composition for controlling pine tree nematode disease of the present invention is powder, pellet, or granule to contain, for example, a culture solution of cultured cells, freeze-dried cells and starch, crude protein and rock powder, etc., according to a method of microbial pesticide formulation in a manner known in the art. , It can be formulated as a microcapsule and used as it is.
  • the composition is obtained by adding other ingredients that are easy to apply depending on the target nematodes and crops, such as a surface activator, an inert carrier, a preservative, a wetting agent, a supply accelerator, an attractant, an encapsulating agent, a binder, an emulsifier, a dye, a UV protection agent, and a buffer. can do.
  • the composition of the present invention may be in a form suitable for direct application by diluting with an appropriate amount of water or other diluent prior to application, or in a concentrate or primary composition. It will be clearly understood in the art that the nematode concentration, in particular, whether concentrated or used directly, may vary depending on the nature of the particular agent, the type of plant to be applied, the soil and climate of the cultivation area, and the like.
  • composition for controlling pine nematodes of the present invention may further include an agriculturally acceptable carrier.
  • suitable solid carrier materials are, in principle, all porous and agriculturally acceptable carriers, for example mineral earths (such as silica, silica gel, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bowl, ocher, clay, Dolomite, diatoms, calcium sulfate, magnesium sulfate, magnesium oxide, pulverized synthetic substances), fertilizers (e.g. ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea), vegetable products (e.g. grain flour, bark flour, wood meal) And nut shell powder) or cellulose powder, but is not limited thereto.
  • the solid carrier may be used alone or in combination of two or more.
  • composition for controlling pine nematode disease of the present invention may additionally contain a nematode active substance, and the nematode active substance is not limited thereto, but avermectin-based nematode active substance, morantel tartrate (morantel tartrate), mesulfenfos (mesulfenfos) and may be one or more selected from the group consisting of levamisol (levamisol).
  • the avermectin-based nematode active material may be emamectin benzoate, abamectin, milbemectin, or ivermectin, but is not limited thereto.
  • the plant may be a pine genus, a fir genus, a spruce genus or a birch genus plant, preferably a pine genus plant, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for preventing or controlling pine tree nematode disease of a plant comprising the step of treating the composition for controlling pine tree nematode disease on a plant, plant seed or cultivation site.
  • the composition for controlling pine tree nematode disease is as described above.
  • the composition for controlling pine reindeer nematode disease begins to appear, or as a preventive and protective measure before the appearance of pine nematode disease, in the plant or cultivation of these plants It can be transmitted or sprayed on soil or seeds to suppress or reduce the damage caused by the pine tree nematode.
  • the method of the present invention is not limited as long as it is a tree in need of controlling pine nematode disease, and for example, the composition of the present invention may be treated on cultivation of pine, fir, spruce or birch.
  • the treatment method may be a method known in the art such as immersion treatment, soil drench treatment or foliar spray treatment.
  • the present invention also provides a method for preparing a composition for controlling pine reindeer nematode disease of a plant comprising the step of culturing a strain of Streptomyces sp. AE170020 having an accession number of KCTC13792BP.
  • Streptomyces sp. AE170020 strain having the accession number of the present invention KCTC13792BP is alloaureothin (alloaureothin; 2-methoxy-3,5-dimethyl-) showing excellent nematode activity against pine nematodes ( Bursaphelenchus xylophilus ). 6-[(2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one) Therefore, by culturing the strain of the present invention it is possible to prepare a composition for controlling pine nematode disease.
  • the method of culturing the strain of the present invention can be cultured according to a method commonly used in the art, and a method of separating and purifying the allo aureochin compound from the culture medium of the strain is also a method commonly used in the art. Can be done.
  • Actinomycetes used in the experiment were HV agar (Humic acid-Vitamin agar) medium (0.1% humic acid: dissolved in 0.2N NaOH, 0.05% Na 2 HPO 4 , 0.171% KCl, 0.005% MgSO 4 , 0.001% from pine trees in Pyeongchang, Gangwon-do) FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.002% CaCO 3 , 50 ppm cycloheximide, 10 ppm nalidixic acid, 8 kinds of vitamins including thimine-HCl and 2% agar) were isolated. Identification of the isolated strain was analyzed using 16S rRNA nucleotide sequence.
  • the isolated actinomycetes were cultured in Bennett's medium (1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.2% Bacto-peptone, 0.1% beef extract).
  • culture for the evaluation of actinomycosis nematode activity was performed in GSS medium (1% soluble starch, 2% glucose, 2.5% soybean meal, 0.1% beef extract, 0.4% yeast extract, 0.2% NaCl, 0.025% K 2) at 28°C. HPO 4 and 0.2% CaCO 3 ) were used.
  • the nematode activity test for the isolated strain is as follows. Bursaphelenchus xylophilus , which is the cause of pine reel nematode disease, was distributed from the National Institute of Forest Science and was subcultured on PDA (Potato Dextrose Agar) flat medium in which Botrytis cinerea , a food for pine reel nematode, was cultured and used as a test nematode. For screening for nematode activity, an equal amount of acetone was added to 0.5 ml of the actinomycetes culture solution, shaking at room temperature, followed by ultrasonic extraction for 15 minutes. After centrifugation, 0.2 ml of the supernatant was concentrated, dissolved in 50 ⁇ l of DMSO, and used for the nematode activity test.
  • the nematode effect was tested in duplicate in each well of a 96-well MicrotestTM Tissue Culture Plate with 5 ⁇ l of actinomycetes culture extract and 95 ⁇ l of nematode solution (including 30-40 nematodes).
  • a 96-well plate treated with a culture medium was placed in a thermostat at 25°C and reacted for 24 hours. Under a dissecting microscope, after 24 hours, the nematodes that were stiff and immobile were regarded as dead nematodes, and the flexible and moving nematodes were considered live nematodes.
  • the killing nematode rate was investigated (Fig. 1).
  • the criterion for deciding the rate of killing nematodes is 1 point when the mortality rate of pine tree nematodes is 0-20%, 1.5 points when 21-40%, 2 points when 41-75%, 2.5 points and 100% when 76-99% When it was set to 3 points (Table 1).
  • the identification of the nematode active strain was analyzed based on the 16S rRNA sequence. Phylogenetic analysis was performed based on the results of analysis of the 16S rRNA gene nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of the AE170020 strain of Streptomyces sp. Genomic DNA was extracted from the cells using acetyltrimethylammonium bromide at 4° C. for 20 minutes.
  • 16S rRNA is the following with Ex Tag polymerase (Takara, Japan) and universal primer set (27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (SEQ ID NO: 2); 1492R, 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3' (SEQ ID NO: 3)) PCR was performed as a step to amplify: 5 minutes at 94°C ⁇ (94°C 30 seconds, 58°C 30 seconds, 72°C 30 seconds) x 34 times ⁇ 7 minutes at 72°C.
  • the PCR product was purified using the GeneAll Expin TM PCR purification kit (GeneAll, Korea), and sequence analysis was requested by Macrogen (Korea).
  • the analyzed sequence was confirmed by comparing similarity using the EZBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify) program.
  • the system diagram was completed by repeating the bootstrap 1,000 times using the neighbor-joining method using the MEGA program package.
  • Streptomyces sp. AE170020 strain was cultured in Bennett's solid medium at 28° C. for 7 days. The shape, size and color of spores produced by the strain were observed using a scanning electron microscope (FEI Quanta 250 FEG; FEI, Switzerland). Culture characteristics of strain AE170020 of the genus Streptomyces were observed in ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, and Bennett's solid medium. Strains AE170020 of the genus Streptomyces were plated on each medium, cultured at 28° C. for 7 days, and observed with the naked eye.
  • the strain extract was dissolved in DPPT emulsion composition (20% DMSO, 20% Propylene glycol monomethyl ether, 50% Propylene glycol, 10% Tween-20) to prepare samples at concentrations of 228, 114, 57, 28.5 mg/100 ⁇ l. .
  • Abamectin, used as a positive control, was purchased from Sigma, and was dissolved in a DPPT emulsion at 1.8 mg/100 ⁇ l to obtain a concentration of 1.8%.
  • the sample used for safety evaluation was prepared by dissolving acetone extract from the culture solution of strain AE170020 of the genus Streptomyces containing alloaureothin in DPPT emulsion to make it 200 mg/ml. And used according to the concentration.
  • the toxicity level and grade of each item of the acetone extract of the AE170020 strain culture solution of Streptomyces genus were evaluated for the toxicity evaluation items published for the registration of eco-friendly organic materials.
  • Toxicity was evaluated for bee acute contact toxicity test (bee), skin irritation test (rabbit), eye mucosa irritation test (rabbit), acute fish toxicity (carp), acute oral toxicity (rat), and acute dermal toxicity (rat).
  • the toxicity test was carried out by an accredited institution, Korea Biosafety Research Institute.
  • the culture and morphological characteristics of AE170020 selected as a nematode active strain against pine nematodes, were evaluated.
  • the spore morphology characteristics of the AE170020 strain were photographed with a scanning electron microscope. As a result, it was confirmed that the spore chain had a Retinaculiaperti type and the number of chains was 24 or more (FIG. 3).
  • the surface type of spores was smooth, and the size was found to be 0.5-1 ⁇ m (Table 4).
  • Example 3 Isolation and purification of a material for controlling pine worms from AE170020
  • the fraction was subjected to Sephadex LH-20 column chromatography, which is a size exclusion gel, to obtain a fraction (10.75 mg) having control activity, and then two substances having activity against pine tree nematodes were separated by preparative silica-gel TLC method. Finally, a substance having a control activity was separated and purified through high performance liquid chromatography (HPLC), and finally 5.3 mg of Compound 4.1 was obtained (FIG. 4).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • FIG. 4 As a result of checking by HPLC, when the mobile phase was flowed with 15% methanol at 220 nm, the peak of the active material was confirmed in about 22 minutes, and it was confirmed that the separated material was a single material (FIG. 5).
  • the present inventors confirmed the control activity of this material, named it Compound 4.1, and determined its chemical structure by performing NMR analysis.
  • nematode activity was evaluated.
  • Abamectin was used as a positive control for the evaluation of pine re-nematode activity, and the activity was compared with the purified material.
  • aureochin and pine re-nematode which are other compounds isolated from the AE170020 strain culture, were compared.
  • LC 50 value of abamectin is 4.1 ⁇ g / was ml confirmed, brother LC 50 value of Leo Chin 1.27 ⁇ g / was confirmed by ml, the egg brother of Leo parent LC 50 isolated and purified the active substance from AE170020 The value was confirmed to be 0.64 ⁇ g/ml, and the compound of the present invention was found to be about 6.4 times higher than abamectin and about 2 times higher than aureochin in terms of the nematode activity of the present invention (Table 7). According to the above results, it was confirmed that the excellent nematode active material produced by the AE170020 strain was allo aureochin.
  • the efficacy of controlling pine tree nematode disease against acetone extract of the AE170020 strain culture solution containing alloaureothin was evaluated under greenhouse conditions. According to the results of Example 4, the purified allo aureochin showed about 6.4 times higher activity than abamectin used as a positive control, and a pot test was conducted based on the result. Efficacy in greenhouse conditions was evaluated using a DPPT emulsion using an acetone extract of the AE170020 strain culture solution according to the commercially available abamectin emulsion concentration of 1.8% (1.8 mg/100 ⁇ l). The acetone extract of the AE170020 strain culture was used by calculating the concentration containing allo aureochin as an active ingredient.
  • the amount of acetone extract obtained in 1L culture of the AE170020 strain was 320 mg, and the allo aureochin was 0.75 mg.
  • the AE170020 strain culture solution When treated with 114 mg/100 ⁇ l of acetone extract, the active ingredient (alloaureochin) was about 0.27 mg, which was judged to be similar to or equal to the activity in the in vitro nematode test, so the corresponding concentration was selected.
  • the acetone extract of the AE170020 strain culture was treated with a total of 4 concentrations (228, 114, 57, 28.5 mg/100 ⁇ l) at a higher and lower concentration than the 114 mg, and compared with abamectin.
  • the safety evaluation of the acetone extract emulsion in the culture of AE170020 strain was conducted by the Korea Institute of Biosafety Co., Ltd., and acute contact toxicity test for bees (bee), skin irritation test (rabbit), eye mucosa irritation test (rabbit), acute toxicity to fish (carp ), acute oral toxicity (rat), acute dermal toxicity (rat) were evaluated.
  • the acetone extract emulsion of the AE170020 strain culture solution showed low toxicity in all items according to the toxicity result table (Table 9). According to the results of the toxicity test, it was confirmed that the acetone extract emulsion of the AE170020 strain culture solution could be registered as a natural organic material.

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Abstract

본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주 및 상기 균주 또는 상기 균주로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 스트렙토마이세스 속 균주 및 이로부터 분리한 화합물은 소나무재선충병 방제에 효과적인 환경친화형 생물농약을 제공할 수 있어 관련 산업에 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

신규 스트렙토마이세스 속 균주 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물
본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주 및 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물에 관한 것이다.
소나무재선충( Bursaphelenchus xylophilus)이 원인인 소나무재선충병(Pine wood disease)은 20세기 초부터 일본의 소나무 숲에서부터 시작되어 현재 전 세계적으로 우려를 불러 일으키고 있다. 소나무재선충은 전 세계적으로 소나무류( Pinus sp.) 38종이 숙주로 알려져 있으며, 스스로 이동하지 못하고 매개충인 솔수염하늘소( Monochamus alternatus)를 통해서 이동하여 소나무류를 감염시킨다. 감염목 내에 있는 소나무재선충은 솔수염하늘소 성충이 우화하여 탈출할 때, 곤충의 체내에 침입해 함께 탈출하여 소나무 속에 들어가 급속히 증식하게 된다. 우리나라에서 현재 경남지역에서 대규모 피해가 발생하고 있으며, 그 외에 제주도, 전남, 강릉 및 경기도 지역까지 피해가 확산되고 있다.
현재 소나무재선충병을 방제하기 위한 방법으로 살충제를 도포하거나 살충활성을 가지는 화합물과 함께 나무에 수관주사로 소나무재선충을 제어하는 방법을 사용하고 있다. 그러나 작업이 어렵고, 수관주입용 약제들은 고가로 비용이 많이 든다는 단점이 있다. 따라서 효과적인 살선충 효과를 가지는 화합물에 대한 연구가 이루어지고 있다.
본 발명에서는 소나무로부터 분리한 다수의 방선균(Actinomyces) 중에서 소나무재선충에 대해 특히 우수한 살선충활성을 가지는 균주를 확인하였고, 상기 균주가 생산하는 활성물질을 분리 및 정제하였다.
한편, 한국등록특허 제1501033호에는 '살선충 효과를 가지는 스트렙토마이세스 고양엔시스 BIG11003 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1855264호에는 '핌프리네틴을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 신규 스트렙토마이세스 속 균주 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 강원도 소나무로부터 소나무재선충에 대한 우수한 살선충 활성을 보이는 방선균 AE170020 균주를 분리하였고, 상기 균주에서 살선충 활성을 보이는 활성 성분을 확인하기 위해, 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, 1H- 1H COSY, 및 HMBC 스펙트럼 분석을 수행한 결과, AE170020 균주의 살선충 활성 물질은 알로아우레오친(alloaureothin; 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-on)인 것을 확인하였다. 또한, 상기 알로아우레오친이 in vitro에서 소나무재선충 방제에 사용되는 아바멕틴에 비해 6배 이상 높은 살선충 활성이 있고, 상기 알로아우레오친을 함유하는 AE170020 균주의 추출물이 소나무를 대상으로 온실에서 수행한 소나무재선충의 방제능 평가에서도 아바멕틴에 비해 현저히 우수한 효과를 보이는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주 및 상기 균주에서 생산되는 알로아우레오친(alloaureothin)은 소나무재선충에 대한 살선충 활성이 우수하며 안정성 평가에서 저독성으로 확인되었으므로, 소나무재선충병 방제에 효과적인 환경친화형 생물농약에 활용될 수 있어 관련 산업에 매우 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에서 분리한 균주들을 대상으로 96 웰 플레이트 상에서의 살 재선충활성 효과를 확인하는 단계를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주의 계통도이다.
도 3은 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주의 포자를 주사전자현미경으로 확인한 것이다.
도 4는 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주로부터 활성물질(compound 4.1)의 분리정제 과정을 나타낸 모식도이다.
도 5는 화합물 4.1(compound 4.1)의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 6은 화합물 4.1(compound 4.1)의 ESI-Mass 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 화합물 4.1(compound 4.1)의 1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 화합물 4.1(compound 4.1)의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 화합물 4.1(compound 4.1)의 HMQC 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 화합물 4.1(compound 4.1)의 1H- 1H COSY 스펙트럼을 나타낸다.
도 11은 화합물 4.1(compound 4.1)의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다.
도 12는 화합물 4.1(compound 4.1)의 화학 구조를 나타낸다.
도 13은 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물을 이용한 소나무재선충병 방제 효능 실험 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주는 살선충 활성을 갖는다. 상기 선충은 예를 들면, 재선충, 뿌리혹선충, 예쁜꼬마선충, 시스트선충 등일 수 있고, 바람직하게는 소나무재선충( Bursaphelenchus xylophilus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주는 소나무재선충에 대한 우수한 살선충 활성을 갖는다. 상기 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주는 소나무로부터 분리하였으며, 소나무재선충에 대한 살선충 활성을 가지는 화합물, 예를 들면 알로아우레오친(alloaureothin; 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one) 등을 생산할 수 있는 균주로, 상기 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2019년 1월 17일자로 기탁되었다(기탁번호 : KCTC13792BP).
본 발명은 또한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염의 소나무재선충병 방제 용도에 관한 것이다.
Figure PCTKR2020001934-appb-img-000001
상기 화학식 1에서,
R 1 및 R 2는 각각 독립적으로 수소, C 1~4 알킬 또는 C 1~4 알콕시이고; R 3은 C 1~4 알킬이고; R 4 및 R 5는 각각 독립적으로 수소, C 1~4 알킬, C 1~4 알콕시, 히드록시 또는 할로이고; R 6 내지 R 8은 각각 독립적으로 수소, 또는 C 1~4 알킬이고; n은 1, 2 또는 3의 정수이다.
본 명세서에 사용된 접두어 "C x~y" (여기서, x 및 y는 정수임)는 주어진 기에서의 탄소 원자의 수를 지칭한다. 따라서, C 1~4 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 것을 의미한다.
기 또는 기의 일부로서 본 명세서에 사용된 용어 'C 1~4 알킬'은 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 지칭한다. 이러한 기의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸 등을 포함한다.
기 또는 기의 일부로서 본 명세서에 사용된 용어 'C 1~4 알콕시'는 C 1~4 알킬이 본 명세서에 정의된 바와 같은 것인 -O-C 1~4 알킬 기를 지칭한다. 이러한 기의 예는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시 등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 '할로'는 '할로겐'과 동일하게 사용될 수 있고, 플루오린(F), 염소(Cl), 브로민(Br) 또는 아이오딘(I) 원자를 의미한다.
본 발명에 따른 소나무재선충병 방제용 조성물에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 바람직하게는 R 1, R 2, R 3 및 R 7은 각각 독립적으로 C 1~4 알킬이고; R 4, R 5, R 6 및 R 8은 각각 독립적으로 수소이고; n은 1 또는 2;인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 R 1, R 2, R 3 및 R 7은 각각 독립적으로 메틸이고; R 4, R 5, R 6 및 R 8은 각각 독립적으로 수소이며; n은 1;인 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2020001934-appb-img-000002
상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 더욱 바람직하게는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.
Figure PCTKR2020001934-appb-img-000003
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 더 더욱 바람직하게는 하기 화학식 4로 표시되는 알로아우레오친(alloaureothin) 즉, 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Figure PCTKR2020001934-appb-img-000004
상기 화학식 4에 있어서, 검은색 채워진 쐐기모양은 화학구조식을 입체적으로 보았을때, 즉 3차원으로 보았을때 전면으로 튀어나온 방향을 의미한다.
상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 소나무재선충( Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 아바멕틴(abamectin) 보다 6.4배 높은 살선충 활성을 나타내며, 또한 입체이성질체 화합물(예컨대, 아우레오친; 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(2R,5Z)-5-[(E)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one)보다 2배 이상 높은 살선충 활성을 나타내는 것이 특징이다. 상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주 배양액의 유기용매 추출물로부터 분리·정제하여 획득할 수 있고, 또는 당업계에 공지된 화합물의 합성방법에 따라 합성할 수도 있다.
본 명세서에서 사용한 용어 '농약학적으로 허용 가능한 염'이라 함은, 예를 들어, 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성, 또는 산성 아미노산과의 염 등이 포함될 수 있다. 적합한 금속염은, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등과 같은 알칼리 토금속염; 알루미늄염 등이 포함될 수 있다. 유기 염기와의 염은, 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 포함될 수 있다. 무기산과의 염은, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 포함될 수 있다. 유기산과의 염은, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 포함될 수 있다. 염기성 아미노산과의 염은, 예를 들어, 알기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 포함될 수 있다. 산성 아미노산과의 염은, 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 포함될 수 있다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주 배양액의 소나무재선충병 방제 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 소나무제선충 방제용 조성물에 있어서, 상기 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주의 '배양액'은 상기 균주의 배양액, 배양액의 상등액 또는 이의 건조물을 포함할 수 있다.
또한, 상기 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주 배양액은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다.
본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 직접 분사가능한 용액, 분말 및 현탁액의 형태 또는 고농축 수성, 유성 또는 다른 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 당업계에 공지된 방식의 미생물 농약제제화 방식에 따라, 예컨대 배양된 균체의 배양액, 동결건조 균체와 전분, 조단백질 및 암석분 등을 포함하도록 분말, 펠렛 또는 과립, 마이크로캡슐 등으로 제형화하여 그대로 사용할 수 있다. 상기 조성물은 표면 활성화제, 비활성 담체, 보존제, 습윤제, 공급 촉진제, 유인제, 캡슐화제, 결합제, 유화제, 염료, U.V 보호제, 완충제 등 목적 선충 및 작물에 따라 적용하기 용이한 다른 성분을 부가함으로 수득할 수 있다. 본 발명의 조성물은 적용하기전에 적당한 양의 물 또는 다른 희석제로 희석을 하여 직접 적용하기에 적합한 형태 또는 농축액 또는 1차 조성물일 수 있다. 살선충성 농도는 특히 농축 또는 직접 사용하거나 하는 것은 특정 제제의 성질, 적용 식물의 종류, 재배지역의 토양 및 기후 등에 따라 다양할 수 있음은 당업계에 명백히 이해될 것이다.
또한, 본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 농업적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 고형 담체 물질은 원칙적으로, 모두 다공성이고, 농업적으로 허용가능한 담체, 예를 들어 광물토류(예컨대 실리카, 실리카 겔, 실리케이트, 활석, 고령토, 석회암, 석회, 초크, 보울, 황토, 점토류, 백운석, 규조 토류, 황산칼슘, 황산 마그네슘, 산화마그네슘, 분쇄 합성물질), 비료(예컨대 황산암모늄, 인산암모늄, 질산암모늄, 우레아), 식물성 제품(예컨대 곡물 가루, 나무 껍질 가루, 목분(wood meal) 및 견과 껍질 가루) 또는 셀룰로오스 분말일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 고형 담체는 1종류 또는 2종류 이상을 혼합하여 사용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 소나무재선충병 방제용 조성물은 살선충 활성물질을 추가로 함유할 수 있으며, 상기 살선충 활성물질은 이에 제한되지 않으나, 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos) 및 레바미솔(levamisol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 아버멕틴(avermectin)계 살선충 활성물질은 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 아바멕틴(abamectin), 밀베멕틴(milbemectin) 또는 이버멕틴(ivermectin)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 식물은 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 식물일 수 있고, 바람직하게는 소나무속 식물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 소나무재선충병 방제용 조성물을 식물, 식물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 식물의 소나무재선충병을 예방 또는 방제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법에서, 소나무재선충병 방제용 조성물은 전술한 바와 같다.
본 발명의 소나무재선충병을 예방 또는 치료하는 방법에서, 소나무재선충병 방제용 조성물은 소나무재선충병이 나타나기 시작하거나, 나타나기 전 예방보호 조치로, 소나무재선충병의 방제가 필요한 식물에 또는 이들 식물의 재배토양이나 종자에 전달 또는 살포하여 소나무재선충에 의한 피해를 억제하거나 줄일 수 있다.
본 발명의 방법은 소나무재선충병 방제가 필요한 수목이면 제한되지 않으며, 예를 들면, 소나무속, 전나무속, 가문비나무속 또는 잎갈나무속 재배지에 본 발명의 조성물을 처리할 수 있다. 처리 방법은 침지 처리, 토양관주 처리 또는 엽면살포 처리 등 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물의 소나무재선충병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주는 소나무재선충( Bursaphelenchus xylophilus)에 우수한 살선충 활성을 보이는 알로아우레오친(alloaureothin; 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one) 등의 화합물을 생산할 수 있으므로, 본 발명의 균주를 배양하면 소나무재선충병 방제용 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 균주의 배양액으로부터 알로아우레오친 화합물을 분리 및 정제하는 방법도 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 방선균 분리, 배양 및 동정
실험에 사용한 방선균은 강원도 평창의 소나무로부터 HV 한천(Humic acid-Vitamin agar) 배지(0.1% humic acid: dissolved in 0.2N NaOH, 0.05% Na 2HPO 4, 0.171% KCl, 0.005% MgSO 4, 0.001% FeSO 4·7H 2O, 0.002% CaCO 3, 50 ppm cycloheximide, 10 ppm nalidixic acid, thimine-HCl을 비롯한 8종의 비타민 및 2% agar)를 사용하여 분리하였다. 분리한 균주의 동정은 16S rRNA 염기서열을 이용하여 분석하였다. 분리한 방선균의 보존을 위하여 Bennett's medium(1% glucose, 0.1% yeast extract, 0.2% Bacto-peptone, 0.1% beef extract)에서 배양하였다. 또한, 방선균의 살선충 활성 평가를 위한 배양은 28℃에서 GSS 배지(1% soluble starch, 2% glucose, 2.5% soybean meal, 0.1% beef extract, 0.4% yeast extract, 0.2% NaCl, 0.025% K 2HPO 4 and 0.2% CaCO 3)를 이용하였다.
2. 살선충 활성균주 선발실험
분리균주에 대한 살선충 활성시험은 다음과 같다. 소나무재선충병의 원인인 소나무재선충( Bursaphelenchus xylophilus)을 국립산림과학원에서 분양받아 소나무재선충의 먹이인 곰팡이( Botrytis cinerea)가 배양된 PDA(Potato Dextrose Agar) 평판배지에 계대배양하여 시험선충으로 사용하였다. 살선충 활성 스크리닝을 위하여 방선균 배양액 0.5 ㎖에 동량의 아세톤을 가하여 실온에서 쉐이킹(shaking)한 후 15분간 초음파추출을 하였다. 원심분리하여 상등액 0.2 ㎖을 농축하여 DMSO 50 ㎕에 녹여서 살선충 활성실험에 사용하였다.
살재선충 효과는 방선균배양액 추출물 5 ㎕과 95 ㎕의 선충용액(30~40여 마리 선충 포함)을 96-well Microtest™ Tissue Culture Plate의 각 웰에 2반복으로 실험하였다. 살선충 활성은 배양액으로 처리한 96-well plate를 25℃항온기에 넣고 반응시켜 24시간 후 해부현미경 하에서 곧게 경직되고 움직이지 않는 선충은 죽은 선충으로, 유연하고 움직임이 있는 선충은 산 선충으로 간주하여 살재선충률을 조사하였다(도 1). 살재선충률 판정기준은 소나무재선충의 사멸률이 0~20%일 때는 1점, 21~40%일 때는 1.5점, 41~75%일 때는 2점, 76~99%일 때는 2.5점, 100%일 때는 3점으로 하였다(표 1).
살재선충 활성 판정 기준
활성 판정기준 사멸률 (%)
1.0 0~20
1.5 21~40
2.0 41~75
2.5 76~99
3.0 100
3. 살선충 활성균주 분류동정
살선충 활성 균주의 동정은 16S rRNA 염기서열을 기초하여 분석하였다. 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열(서열번호 1) 분석 결과를 기반으로 계통 분석을 수행하였다. 균체에서 20분동안 4℃에서 아세틸트리메틸암모니움 브로마이드(acetyltrimethylammonium bromide)를 이용하여 게노믹 DNA를 추출하였다. 16S rRNA는 Ex Tag polymerase (Takara, Japan)와 universal primer set(27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2); 1492R, 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3))와 함께 하기의 단계로 PCR을 수행하여 증폭시켰다: 94℃에서 5분 → (94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) x 34회 → 72℃에서 7분. PCR 산물은 GeneAll Expin TM PCR 정제 키트 (GeneAll, Korea)를 사용하여 정제하였고, Macrogen (Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다. 분석된 서열을 EZBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify) 프로그램을 사용하여 유사성을 비교하여 확인하였다. 또한, MEGA program package를 사용하여 neighbor-joining method를 이용해 bootstrap을 1,000회 반복하여 계통도를 완성하였다.
4. 활성균주의 형태학적 및 배양적 특징 분석
형태학적 특징 중 포자(spore)의 형태를 조사하기 위해 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주를 Bennett's 고체배지에 28℃조건에서 7일 동안 배양하였다. 균주가 생산하는 포자의 형태, 크기 및 색상을 주사전자현미경 (FEI Quanta 250 FEG; FEI, Switzerland)을 사용하여 관찰하였다. 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주의 배양적 특성은 ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, Bennett's 고체배지에서 관찰하였다. 각 배지 위에 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주를 선상 도말하여 28℃ 조건에서 7일동안 배양하여 육안으로 관찰하였다.
5. 온실 조건에서의 소나무재선충병 방제 효능 평가
3년생 적송( Pinus densiflora)은 시험에 사용되기 전 3개월 동안 대한민국 대전광역시에 위치한 한국생명공학연구원에서 약 22~25℃의 온도 조절이 가능한 온실에 이식하여 보관되었다. 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주를 5L의 GSS 배지에서 7일 동안 28℃의 온도로 진탕배양하여 배양액을 회수하였고, 원심분리를 수행하여 배양 상등액과 균체로 분리하였다. 균체를 3L의 아세톤으로 추출한 뒤, 감압여과하여 아세톤 층을 분리하였고, 회전감압농축 방법으로 아세톤을 증발시킨 후 추출물 3.8 g을 수득하였다. 균주 추출물은 DPPT 유제 조성물(20% DMSO, 20% Propylene glycol monomethyl ether, 50% Propylene glycol, 10% Tween-20)에 용해시켜 228, 114, 57, 28.5 mg/100 ㎕의 농도로 시료를 조제하였다. 양성 대조군으로 사용되는 아바멕틴(abamectin)은 Sigma에서 구입하였고, DPPT 유제에 1.8 mg/100 ㎕로 용해시켜 1.8%의 농도가 되도록 조제하였다. 전동드릴(Bosch, Germany)을 이용하여 소나무 줄기 (평균 높이 119 cm, 평균 직경 1 cm)의 아래에서 5 cm에 부근에 2개의 구멍 (3 mm 직경 x 5 mm 깊이)을 45°각도로 뚫고, 각 용액을 구멍 당 50 ㎕ 씩 총 100 ㎕을 주입하였고, 시험시료는 5반복하고 아바멕틴 대조군은 10반복하였다. 시료 주입 7일 후, 소나무 줄기 아래에서 10 cm 부근에 구멍을 뚫어 시료 주입과 동일한 방법으로 소나무재선충( B. xylophilus) 1,000마리를 주입하여 감염시켰다. 또한 음성 대조군은 소나무재선충만 처리하여 5반복하여 실험하였다. 소나무재선충 접종 2개월 후, 고사된 묘목 수와 살아있는 묘목의 수를 평가하였다.
6. 농약 및 원제의 등록기준에 따른 안전성평가시험
안전성평가를 위하여 사용된 시료는 알로아우레오친(alloaureothin)을 함유하는 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물을 DPPT 유제에 용해시켜 200 mg/㎖이 되도록 제조하여 각 항목 별 시험에 사용되는 용매 및 농도에 맞추어 사용하였다. 친환경 유기농자재 등록을 위해 공시된 독성평가항목에 대한 스트렙토마이세스 속 AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물의 각 항목 별 독성정도 및 등급을 평가하였다. 독성은 꿀벌급성접촉독성시험(꿀벌), 피부자극시험(토끼), 안점막자극성시험(토끼), 어류급성독성(잉어), 급성경구독성(랫드), 급성경피독성(랫드)을 평가하였다. 독성시험은 공인기관인 ㈜한국생물안전성연구소에서 수행하였다.
실시예 1. 살선충 활성균주 선발 및 동정
소나무로부터 821개의 방선균들을 분리하였으며, 이들 모두에 대해 살선충 활성을 하였다. 분리균주에 대한 살선충 활성시험 결과, 균주 추출물 0.5~2㎎/㎖ 처리시 24시간 후 모든 농도에서 100%의 살선충을 보인 살선충 활성이 우수한 균주 AE170020을 선발하였다(표 2). 16S rRNA 유전자 염기서열에 기초한 분자 계통학적 분석 결과, AE170020균주는 스트렙토마이세스 스트라미네우스( Streptomyces stramineus)와 98.52% 유사도를 보였다(표 3). 균주 동정에 따른 계통도는 도 2에 나타내었다.
살재선충 활성균주 스크리닝 결과
Strain 추출물 처리 농도 (㎎/㎖) 살재선충 활성 판정점수
AE170020 2 3
1 3
0.5 3
선발균주 동정
Strain Scientific name Similarity
AE170020 Streptomyces stramineus 98.52%
실시예 2. AE170020의 형태학적 및 배양적 특성
소나무재선충에 대한 살선충 활성 균주로 선발되어진 AE170020의 배양적 및 형태학적 특성 평가를 진행하였다. AE170020 균주의 포자 형태 특성을 주사전자현미경으로 촬영하였다. 그 결과, 포자 사슬의 형태는 Retinaculiaperti형 이었고 사슬(chain)의 수는 24개 이상인 것으로 확인되었다(도 3). 포자의 표면 유형은 smooth 유형이었고, 크기는 0.5-1 μm인 것으로 나타났다(표 4).
AE170020 균주 포자의 특성
Strain Spore chain morphology Number of chain Spore surface ornamentation type Spore size
AE170020 Retinaculiaperti 24개 이상 Smooth 0.5-1 μm
배지조성 별 AE170020 균주의 형태학적 특성을 관찰하기 위하여 ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, Bennett's agar 평판 배지에서 균주를 배양하여 특성을 관찰하였다. 그 결과 ISP5를 제외한 ISP2, ISP3, ISP4 및 Bennett's agar 평판 배지에서는 성장 정도가 우수한 것으로 관찰되었다. 균사체(aerial mycelia)의 색은 모든 배지에서 흰색으로 관찰되었고, 기질(substrate)의 색은 ISP2, ISP3 및 Bennett's agar에서는 노란색, ISP4 및 ISP5에서는 흰색으로 나타난 것을 확인할 수 있었다(표 5).
배지조성에 따른 AE170020 균주의 배양적 특성
Medium Amount of growth Color of
Aerial mycelia Substrate
ISP2 Good White Yellow
ISP3 Good White Yellow
ISP4 Good White White
ISP5 Moderate White White
Bennett's Good White Yellow
실시예 3. AE170020로부터 소나무재선충 방제 물질의 분리 및 정제
3.1. 소나무재선충 방제 물질의 분리 및 정제
AE170020 균배양액 7L를 5,000rpm, 30분으로 원심분리하여 브로스(broth) 층과 마이셀리움 케이크(mycelium cake) 층으로 분리하였다. 마이셀리움 케이크 층을 아세톤에 추출하여 감암 농축한 뒤 추출물(2.28 g)을 얻었다. 추출물을 정제하기 위하여 헥산(Hexane):아세톤 = (10:1~1:1) 전개용매를 이용하여 linear gradient 방식으로 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였고, 그 결과를 바탕으로 활성을 나타내는 분획을 실리카-겔 TLC(Thin layer chromatography)를 이용하여 물질에 대한 특성을 규명하였다. 분획물을 크기 배제 겔인 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 방제 활성을 가지는 분획물(10.75 mg)을 얻은 후, preparative silica-gel TLC 방법으로 소나무재선충에 활성을 가지는 두 가지 물질을 분리하였다. 최종적으로 HPLC(high performance liquid chromatography) 단계를 거쳐 방제 활성을 가지는 물질을 분리, 정제하여 최종적으로 5.3 mg의 Compound 4.1을 얻을 수 있었다(도 4). HPLC로 확인해본 결과, 220 nm에서 15%의 메탄올로 이동상을 흘렸을 때 약 22분경에 활성물질의 피크를 확인하였으며 분리된 물질이 단일물질임을 확인할 수 있었다(도 5). 본 발명자는 이 물질의 방제 활성을 확인하였으며 이를 Compound 4.1이라 명명하였고, NMR 분석을 실시하여 화학구조를 결정하였다.
3.2. Compound 4.1의 분자량 측정
Compound 4.1의 분자량을 측정하기 위해 ESI-Mass 스펙트럼을 양성 모드(positive mode)에서 측정하였다. Compound 4.1은 양성 모드에서는 [M+H] +가 m/z 398에서 관찰되었고 이를 통해 분자량이 397임을 알 수 있었으며, 분자식이 C 22H 23NO 6로 결정되었다(도 6).
3.3. Compound 4.1의 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼
Compound 4.1의 1H-NMR (도 7)과 13C-NMR (도 8)을 통해 Compound 4.1는 22개의 탄소와 23개의 양성자(proton)가 존재하는 것을 알 수 있었다. 도 7과 같이 1H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 3.97, 2.07, 1.97 및 1.81 ppm에서 4개의 메톡시(methoxyl) 양성자가 관찰되었다. 또한, 도 8과 같이 13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 146.2 ~ 120.7 ppm 사이에 6개의 아로마틱(aromatic) 탄소와 147.4, 139.8, 128.0 및 120.7 ppm에서 4개의 올레핀(olefin) 탄소, 182.8 ppm에서 케톤(ketone) 탄소가 관찰되었다. 1H-NMR과 13C-NMR 스펙트럼 분석을 통해 양성자와 탄소의 화학적 이동(chemical shift)을 확인하여 표 6에 정리하였다.
Figure PCTKR2020001934-appb-img-000005
3.4. Compound 4.1의 2D NMR 스펙트럼
Compound 4.1의 양성자와 탄소의 연결고리를 확인하기 위하여 HMQC 스펙트럼(도 9)을 측정한 결과, H-6 (δ H 5.24)와 C-6 (δ C 75.0), H-7 (δ H 3.08)와 C-7 (δ C 38.5), H-9 (δ H 4.60, 4.47)와 C-9 (δ C 71.3), H-10 (δ H 6.40)와 C-10 (δ C 120.7), H-12 (δ H 6.46)와 C-12 (δ C 128.0), H-14 (δ H 7.49)와 C-14 (δ C 130.8), H-15 (δ H 8.15)와 C-15 (δ C 124.6), H-17 (δ H 8.15)와 C-17 (δ C 124.6)와 H-18 (δ H 7.49)와 C-18 (δ C 130.8), 1-O-Me (δ H 3.97)와 1-O-Me (δ C 56.5), 2-Me (δ H 1.81)와 2-Me (δ C 7.1), 4-Me (δ H 1.97)와 4-Me (δ C 9.4), 11-Me (δ H 2.07)와 11-Me (δ C 24.3)의 연결을 확인하였다. 또한 1H- 1H COSY 스펙트럼(도 10)을 통해 1H- 1H 간의 교차 피크를 확인하였으며, 양성자로부터 2, 3, 4 결합에 있는 탄소의 위치를 확인하기 위해 HMBC 스펙트럼(도 11)을 측정하였다. 그 결과 Compound 4.1은 알로아우레오친(alloaureothin) 구조임을 확인할 수 있었다.
3.5. Compound 4.1의 화학구조
Compound 4.1의 화학구조를 결정하기 위해 1H-NMR, 13C-NMR, HMQC, 1H- 1H COSY, HMBC 스펙트럼의 분석을 통해서 구조를 지정(assign)해 본 결과, 최종 분리된 Compound 4.1의 화학구조는 2-methoxy-3,5-dimethyl-6-[(2R,4Z)-4-[(Z)-2-methyl-3-(4-nitrophenyl)prop-2-enylidene]oxolan-2-yl]pyran-4-one로 동정되었다(도 12).
실시예 4. AE170020 균주로부터 정제된 물질의 살선충활성 평가
AE170020로부터 분리 및 정제된 활성물질의 소나무재선충에 대한 방제 효과를 확인하기 위하여 살선충 활성을 평가하였다. 아바멕틴(abamectin)은 소나무재선충활성 평가에 대한 양성 대조군으로 사용되었으며, 정제된 물질과 활성을 비교하였다. 또한, AE170020 균주 배양액으로부터 분리된 다른 화합물인 아우레오친과 소나무재선충활성을 비교하였다. 그 결과, 아바멕틴의 LC 50 값은 4.1 ㎍/㎖로 확인되었으며, 아우레오친의 LC 50 값은 1.27 ㎍/㎖로 확인되었고, AE170020로부터 분리 및 정제된 활성물질인 알로아우레오친의 LC 50 값은 0.64 ㎍/㎖으로 확인되어, 본 발명의 화합물이 살재선충 활성에 있어서 아바멕틴보다 약 6.4배, 아우레오친보다 약 2배 높은 것으로 나타났다(표 7). 상기 결과에 따라 AE170020 균주가 생산하는 우수한 살선충 활성물질은 알로아우레오친임을 확인할 수 있었다.
알로아우레오친(alloaureothin)의 살선충 활성
Sample LC 50
abamectin 4.1 ㎍/㎖
alloaureothin 0.64 ㎍/㎖
aureothin 1.27 ㎍/㎖
실시예 5. 알로아우레오친(alloaureothin)을 함유하는 AE170020 균주 추출물의 pot test
알로아우레오친(alloaureothin)을 함유하는 AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물에 대한 소나무재선충병 방제 효능을 온실 조건하에서 평가하였다. 상기 실시예 4의 결과에 따르면 정제되어진 알로아우레오친은 양성 대조군으로 사용한 아바멕틴보다 약 6.4배 활성이 높은 것으로 나타나 상기 결과를 기반으로 포트(pot) 시험을 진행하였다. 온실 조건에서의 효능 평가는 시중에서 판매되는 아바멕틴 유제 농도인 1.8% (1.8 mg/100 ㎕)에 따라, AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물을 DPPT 유제로 조제하여 사용하였다. AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물은 알로아우레오친을 유효성분으로 함유하는 농도로 계산하여 사용하였다. AE170020 균주 1L 배양에서 수득되는 아세톤 추출물의 양은 320 mg이며, 알로아우레오친은 0.75 mg이었으므로, 알로아우레오친을 아바멕틴보다 약 6.5배 낮은 농도로 처리하여 효능을 비교하기 위해서, AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물 114 mg/100 ㎕로 처리하면 유효성분(알로아우레오친)은 약 0.27 mg으로 in vitro 살선충 시험에서의 활성과 비슷하거나 동일하게 처리가능한 것으로 판단되어 해당 농도를 선택하였다. AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물은 상기 114 mg보다 높은 농도와 낮은 농도로 총 4개 농도(228, 114, 57, 28.5 mg/100 ㎕)로 처리하여 아바멕틴과 비교하였다.
그 결과, 소나무재선충만 처리한 음성 대조군의 소나무는 모두 고사한 것으로 확인되었고, 아바멕틴 처리구에서의 소나무 피해주율은 20%로 관찰되었으며, AE170020 균주 추출물 처리구는 28.5 mg/100 ㎕에서 확인된 피해주율 20%를 제외하고, 다른 모든 농도에서는 소나무재선충 피해가 관찰되지 않았다(도 13). 결과는 표 8에 정리하여 나타내었으며, 실험 결과에 따라 AE170020 균주 추출물의 소나무재선충병 방제제로서 잠재적인 가능성을 확인하였다.
AE170020 균주 추출물의 소나무재선충병 방제능 (Pot test)
Treated Dose (tree -1) Incidence (%)
No treated 0 0
Nematode only 1,000 nematodes 100
Abamectin 1.8 mg 20
AE170020 acetone ext.(alloaureothin) 228 mg (0.54 mg) 0
114 mg (0.27 mg) 0
57 mg (0.135 mg) 0
28.5 mg (0.0675 mg) 20
실시예 6. 알로아우레오친(alloaureothin)을 함유하는 AE170020 균주 추출물 유제의 안전성 평가
AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물 유제에 대한 안전성 평가는 ㈜한국생물안전성연구소에서 수행하였으며, 꿀벌급성접촉독성시험(꿀벌), 피부자극시험(토끼), 안점막자극성시험(토끼), 어류급성독성(잉어), 급성경구독성(랫드), 급성경피독성(랫드) 항목을 평가하였다. 그 결과, AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물 유제는 독성결과표에 의거 모든 항목에서 저독성으로 나타났으며(표 9). 독성시험 결과에 따라, AE170020 균주 배양액의 아세톤 추출물 유제의 천연물 유기농자재 등록의 가능성을 확인하였다.
안전성 평가 결과 요약표
시험항목 시험결과 비고
꿀벌급성접촉 24hr & 48hr LD 50값 >100.0 ㎍/bee,저독성 시험종: 꿀벌(Apis mellifera) 0%
피부자극 피부자극지수 (P.I.I.): 0.0, 자극없음 실험동물: 토끼(New Zealand White)
안점막자극 급성안자극지수 (A.O.I.): 2.0, 자극없음 실험동물: 토끼(New Zealand White)
어류급성 48hr & 96hr LC 50값 100.0 mg/L,어독성 Ⅲ급 (저독성) 시험어종: 잉어(Cyprinus carpio)
경구독성 LD 50 value: >2,000 mg/kg bw, 저독성 급성독성 Ⅳ급(저독성), 실험동물: SD 랫드
경피독성 LD 50 value: >4,000 mg/kg bw, 저독성 급성독성 Ⅳ급(저독성)실험동물: SD 랫드
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13792BP
수탁일자 : 20190117
Figure PCTKR2020001934-appb-img-000006

Claims (12)

  1. 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 소나무재선충( Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2020001934-appb-img-000007
    상기 화학식 1에서,
    R 1 및 R 2는 각각 독립적으로 수소, C 1~4 알킬 또는 C 1~4 알콕시이고;
    R 3은 C 1~4 알킬이고;
    R 4 및 R 5는 각각 독립적으로 수소, C 1~4 알킬, C 1~4 알콕시, 히드록시 또는 할로이고;
    R 6 내지 R 8은 각각 독립적으로 수소, 또는 C 1~4 알킬이고;
    n은 1, 2 또는 3의 정수이다.
  4. 제3항에 있어서, 상기 R 1, R 2, R 3 및 R 7은 각각 독립적으로 C 1~4 알킬이고; R 4, R 5, R 6 및 R 8은 각각 독립적으로 수소이고; n은 1 또는 2;인 것인, 소나무재선충병 방제용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2020001934-appb-img-000008
  6. 제5항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2020001934-appb-img-000009
  7. 제6항에 있어서, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2020001934-appb-img-000010
  8. 기탁번호가 KCTC13792BP인 스트렙토마이세스 속( Streptomyces sp.) AE170020 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배양액은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 농약학적으로 허용가능한 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2020001934-appb-img-000011
    상기 화학식 1에서,
    R 1 및 R 2는 각각 독립적으로 수소, C 1~4 알킬 또는 C 1~4 알콕시이고;
    R 3은 C 1~4 알킬이고;
    R 4 및 R 5는 각각 독립적으로 수소, C 1~4 알킬, C 1~4 알콕시, 히드록시 또는 할로이고;
    R 6 내지 R 8은 각각 독립적으로 수소, 또는 C 1~4 알킬이고;
    n은 1, 2 또는 3의 정수이다.
  10. 제8항에 있어서, 살선충 활성물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 살선충 활성물질은 아버멕틴(avermectin)계 살선충 활성물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos) 및 레바미솔(levamisol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 살선충 활성물질은 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 아바멕틴(abamectin), 밀베멕틴(milbemectin) 또는 이버멕틴(ivermectin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 방제용 조성물.
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