WO2018062823A2 - 그람미신 화합물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

그람미신 화합물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin

Definitions

  • Root-knot nematodes in Korea are affected by root-knot nematodes (about 85% of cultivated farmers), resulting in a decrease of about 30-40% annually. And melon and tomatoes).
  • nematodes include eggplants, potatoes, peppers, tobacco, carrots, strawberries, peanuts, radishes, pears, lettuce, watermelons, spinach, onions, cucumbers, burdock, ginseng, peony, sesame seeds, melon, beans, tomatoes, grapes, pumpkins, etc. Has a crop as a host.
  • patulin also known as mycotoxin.
  • patulin showed high cytotoxicity in colon cancer cells, while grammycin did not show any toxicity at the test concentration.
  • the nematicidal activity against root-knot nematodes was very strong in grammycin, but little in the form of patulin.
  • Figure 4 is a chair Ilaria gram mica (Xylaria grammica) as a control drug and one gram myth isolated from the culture filtrate extract trans-cinnamaldehyde sweet potato root-knot nematode (M. incognita) 2 command nematocide for the larvae of (trans -cinnamaldehyde) Activity is shown.
  • Ilaria gram mica Xylaria grammica
  • Figure 5 shows the inhibition of hatching of grammycin isolated from the extract of Xylaria grammica culture filtrate and M. incognita eggs of trans -cinnamaldehyde ( trans -cinnamaldehyde) as a control agent will be.
  • the present invention provides a composition for controlling nematodes, which contains a grammicin compound of Formula 1 or a salt thereof as an active ingredient.
  • the nematode control composition of the present invention may further contain an nematode active material and an induction resistant material.
  • the nematicidally active substance may be an avermectin-based nematicidally active substance, morantel tartrate, mesulfenfos, levamisol, and the like, but is not limited thereto.
  • Xylaria grammica prepared Xylaria grammica
  • the ethyl acetate and butanol extracts were dissolved in methanol and the water layer was dissolved in water 100 times higher than the treated concentration, and each sample was treated with nematode larvae at 1% to give a final concentration of 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250. , 500, 1,000 ⁇ g / ml.
  • 1% acetone and methanol were treated.
  • the 96-well plate was stirred for 30 seconds to mix well, and then placed in a 100% plastic container with a relative humidity, and then stored at room temperature.
  • Egg hatching rate (%) number of larvae / [number of eggs + number of larvae] ⁇ 100
  • the active substance grammycin isolated from the present invention has nematicidal activity on the second-larvae larvae of sweet potato root hump nematode ( M. incognita ) and carrot root hump nematode ( M. hapla ) and sweet potato root hump nematode ( M. incognita ) It was confirmed that the egg hatching inhibitory activity also.

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Abstract

본 발명은 자일라리아 그람미카 균주로부터 분리한 그람미신 화합물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 선충 방제용 물질인 그람미신(grammicin)은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 뿌리혹선충에 대해 우수한 방제활성을 나타내므로, 환경 친화적인 천연물 살선충제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 동물 및 인체의 선충을 방제하는 약품 개발에 직접적으로 또는 선도물질로서 이용될 수 있다. 이러한 기술이 개발되어 국내기업에 이양되고 생물적방제 제품이 생산된다면 국내 친환경농산물 생산에 이바지할 뿐만 아니라, 세계시장에 수출되어 외화 획득에 기여할 수 있다.

Description

그람미신 화합물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 자일라리아 그람미카 균주로부터 분리한 그람미신 화합물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물기생성선충은 주로 연작지 토양에서 대량 발생하여 작물에 막대한 피해를 주는 해충으로 전 세계적으로 해마다 78조 달러의 손실을 가져오고 있다. 편형동물문에 속하는 식물기생성 선충은 종류가 수천종이고, 섭식방법, 형태 및 기생하는 양상에 따라 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.), 뿌리썩이선충(Paratylenchus spp.), 위축선충(Tylenchorhynchus spp.), 침선충(Paratylenchus spp.), 환선충(Criconemoides spp.), 나선선충(Hellicotylenchus spp.), 씨스트선충(Heterodera spp.), 줄기선충(Ditylenchus spp.) 및 잎선충(Aphelenchoides spp.) 등이 있다.
국내 시설원예 재배지에는 뿌리혹선충의 감염으로(성주 약 85% 재배농가 뿌리혹선충 감염) 매년 약 30-40%의 수량감소를 가져오고 있으며, 이 뿌리혹선충은 우리나라의 거의 모든 시설원예작물(오이, 수박, 참외 및 토마토 등)에 피해를 주고 있다.
뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 1850년대 영국의 온실에서 재배중인 오이 뿌리혹에서 처음 발견되었는데, 1949년 치트우드(Chitwood)에 의하여 멜로이도기네 속(Meloidogyne sp.)으로 정립되었고, 세계적으로는 78종이 분포한다. 국내에는 모두 6종의 뿌리혹선충이 서식하고 있으며, 그 중 국내 재배지에서 가장 문제가 되는 뿌리혹선충은 멜로이도기네 아레나리아(땅콩뿌리혹선충), 멜로이도기네 하플라(당근뿌리혹선충) 및 멜로이도기네 인코그니타(고구마뿌리혹선충) 등 3종이다. 이들 선충은 가지, 감자, 고추, 담배, 당근, 딸기, 땅콩, 무, 배, 상추, 수박, 시금치, 양파, 오이, 우엉, 인삼, 작약, 참깨, 참외, 콩, 토마토, 포도, 호박 등 많은 작물을 기주로 가지고 있다.
뿌리혹선충에 의한 피해는 전 세계적으로 나타나는데, 한대지방보다는 온도가 높아 선충의 번식횟수가 많은 열대나 아열대지방에서 특히 더 심하다. 국내 시설재배지대에는 겨울동안에도 시설을 이용하여 채소류를 연중 재배함으로서 아열대 지방에 적응하는 고구마뿌리혹선충(M. incognita)과 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria)의 발생이 심하다.
식물기생선충은 농작물에게 있어 만병의 근원이라 할 정도로 그 피해가 매우 심각하여, 한번 감염된 지역에서 이들을 완전히 방제하기는 거의 불가능하다. 이러한 선충의 피해를 감소시키는 방법으로 윤작, 객토, 태양열 소독, 담수처리, 토양 훈증, 살선충제 처리 등이 있다. 그러나 뿌리혹선충 같은 토양전염성 선충은 대부분의 생활이 토양에서 이루어지므로 토양 내 불량환경에 견딜 수 있는 내구체를 형성하므로 휴경이나 답전윤환의 재배적 방제로는 효과적인 방제가 어렵다. 이러한 선충 방제는 지금까지 쉽게 구할 수 있는 유기합성 농약이 주로 사용되어 왔으나, 최근 유기합성 농약들의 인체 및 자연 환경에 미치는 악영향이 밝혀지면서 알디카브(aldicarb), 페나미포스(fenamiphos), 메틸 브로미드(methyl bromide), 디브로모클로로프로판(dibromochloropropane) 및 EDB(ethl-enedibromide) 등 효과 좋은 살선충제들의 등록이 취소됨으로서, 이러한 농약들을 대신할 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
친환경적으로 식물기생성선충을 방제하는 방법으로 천적, 미생물을 이용하거나 그들이 생산하는 대사산물을 이용하는 방법이 있다. 곰팡이는 다양한 대사경로를 가져 여러 가지의 대사산물을 합성할 수 있으며 이들은 많은 항생물질과 상업적으로 이용 가능한 다양한 물질을 생산한다고 알려져 있다. 따라서 곰팡이가 생산하는 2차 대사산물의 경우 살선충활성을 가질 수 있을 것으로 판단된다.
한편, 한국등록특허 제0574348호에서는 '그리세오풀빈을 생산하는 자일라리아 속 ＡＨ001 균주, 이를 포함하는 선충 방제용 제제 및 이를 이용하여 선충을 방제하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1144987호에서는 '크리세오박테리움 ＦＢＦ-7 균주 배양물 및 이를 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '자일라리아 그람미카 균주로부터 분리한 그람미신 화합물을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 다양한 곰팡이 배양여액을 이용하여 살선충활성을 조사한 결과, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 배양여액이 강력한 살선충활성을 보인다는 사실을 발견하였고, 이에 신규한 활성물질을 분리 및 동정하였다.
본 발명의 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액으로부터 분획한 에틸아세테이트 층과 이로부터 순수 분리한 그람미신은 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 유충에 대한 살선충활성과 알 부화 억제활성을 갖는 것으로 본 실험을 통해 확인되었다. 또한 그람미신은 당근뿌리혹선충(M. hapla) 유충에 대한 살선충활성을 갖는 것으로 확인되었다.
현재, 그람미신은 친환경 농업에서 자주 사용하고 있는 트랜스-신남알데하이드보다 더 높은 활성을 보였다. 또한 이성질체이면서 진균독소로 알려진 파튤린과는 전혀 다른 생물활성을 보였다. 즉, 대장암 세포에서는 파튤린은 높은 세포독성을 보인 반면, 그람미신은 시험 농도에서 전혀 독성을 보이지 않았다. 이에 반하여 뿌리혹선충에 대한 살선충활성은 그람미신은 매우 강한 반면, 파튤린은 거의 활성이 없는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명은 인체와 자연환경에 무해하며, 현재 존재하는 화학적 선충 방제법이 아닌, 생물학적 선충 방제법으로 사용될 수 있으며, 더욱이 선충방제에 보다 우수한 환경 친화적인 선충 방제용으로써 그람미신의 새로운 용도를 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 그람미신(grammicin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 선충 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 선충을 방제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주를 4~23g/ℓ 글루코스가 포함된 PDB(Potato dextrose broth) 배지에서 정치배양(stationary culture)하는 단계를 포함하는 그람미신(grammicin) 화합물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 선충 방제용 물질인 그람미신(grammicin)은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 뿌리혹선충에 대해 우수한 방제활성을 나타내므로, 환경 친화적인 천연물 살선충제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 동물 및 인체의 선충을 방제하는 약품 개발에 직접적으로 또는 선도물질로서 이용될 수 있다. 이러한 기술이 개발되어 국내기업에 이양되고 생물적방제 제품이 생산된다면 국내 친환경농산물 생산에 이바지할 뿐만 아니라, 세계시장에 수출되어 외화 획득에 기여할 수 있다.
도 1은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액에서 추출한 추출물에서 얻은 세 개의 유기용매 분획층의 고구마뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다. EtOAc, 에틸아세테이트; BuOH, 부탄올; Aqueous, 물.
도 2은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica)로부터 분리된 살선충 물질의 크로마토그램(A)과 최대흡광도(B)를 나타낸 것이다.
도 3는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액의 에틸아세테이트 추출물로부터 분리한 살선충활성 물질인 그람미신(grammicin)의 화학구조(A)와 이의 이성질체인 파튤린(patulin)(B)를 나타낸 것이다.
도 4은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액의 추출물로부터 분리한 그람미신과 대조약제로서 트랜스-신남알데히드(trans-cinnamaldehyde)의 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 2령 유충에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다.
도 5는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액의 추출물로부터 분리한 그람미신과 대조약제로서 트랜스-신남알데히드(trans-cinnamaldehyde)의 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 알에 대한 부화 억제율을 나타낸 것이다.
도 6은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액의 추출물로부터 분리한 그람미신과 대조약제로서 파튤린의 당근뿌리혹선충(M. hapla) 2령 유충에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다.
도 7은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액의 추출물로부터 분리한 그람미신과 이성질체인 파튤린의 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 2령 유충에 대한 살선충활성을 나타낸 것이다.
도 8은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액의 추출물로부터 분리한 그람미신과 이성질체인 파튤린의 대장암세포 SW.71 균주에 대한 인체세포독성을 나타낸 것이다.
도 9는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica)를 다양한 배지 및 조건에서 그람미신의 생산량을 조사한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 그람미신(grammicin) 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물을 제공한다.
Figure PCTKR2017010666-appb-C000001
본 발명의 그람미신(grammicin) 화합물은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 기탁번호가 KCTC13121BP인 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주부터 분리된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 배양액으로부터 분리된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화학식 1로 표시되는 그람미신 화합물은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 배양액으로부터 분리·정제하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 화합물의 화학적 합성 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 선충 방제용 조성물에서, 상기 선충은 바람직하게는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 또는 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)일 수 있고, 가장 바람직하게는 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 또는 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla) 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 선충 방제용 조성물은 살선충활성 물질과 유도저항성물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 살선충활성 물질은 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos), 레바미솔(levamisol) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질은 에마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate), 아바멕틴(abamectin), 밀베멕틴(milbemectin), 이버멕틴(ivermectin) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유도저항성물질은 아시벤졸라-에스-메틸(acibenzolar-S-methyl), 살리실산(salicylic acid), 자스몬산(jasmonic acid) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 그람미신 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물은 천연물 살선충제로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방제용 조성물은 통상적으로 이용되는 살선충제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 활성성분 이외에 부형제로 농약학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성성분과 상기 부형제를 혼합한 방제용 조성물을 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다.
본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 선충 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 선충을 방제하는 방법을 제공한다.
상기와 같이 제형화된 본 발명의 방제용 조성물을 방제가 필요한 식물체 또는 지역에 처리함으로써 뿌리혹선충을 방제할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 방제용 조성물을 뿌리혹선충과 직접 접촉할 수 있도록 적용하여 방제하는 것으로, 토양에 혼화 처리하거나 식물에 직접 분무하는 방법이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주를 4~23g/ℓ 글루코스가 포함된 PDB(Potato dextrose broth) 배지에서 정치배양(stationary culture)하는 단계를 포함하는 상기 화학식 1의 그람미신(grammicin) 화합물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 PDB 배지에 포함된 글루코스 함량은 바람직하게는 4~23g/ℓ일 수 있고, 더욱 바람직하게는 10~20g/ℓ일 수 있고, 가장 바람직하게는 20g/ℓ일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 그람미신(grammicin) 화합물은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 기탁번호가 KCTC13121BP인 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주부터 분리된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 배양액으로부터 분리된 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주 배양액의 에틸아세테이트 분획물로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 선충 방제용 조성물에서, 상기 선충은 바람직하게는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 자바뿌리혹선충(Meloidogyne javanica), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria) 또는 토마토뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)일 수 있고, 가장 바람직하게는 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita) 또는 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla) 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 곰팡이 배양여액의 용매분획별 살선충활성 및 알 부화 억제 활성
자일라리아 그람미카(Xylaria grammica)를 감자덱스트로아가(PDA)에 25℃ 조건에 7일 동안 정치배양하였다. 왕성하게 자라고 있는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica)의 가장자리를 지름 8 mm 코르크보르를 이용해 5개의 균사 조각을 떼어내, 감자덱스트로스액체배지(PDB)(500 ml 삼각플라스크, 100 ml 배지)에 접종한 후 25℃에서 14일 동안 정치 배양하였다. 14일 후, 4겹 거즈를 이용해 균체를 제거한 후 배양여액만 획득하였다.
획득한 배양여액 500 ml을 동량의 에틸아세테이트와 70%의 부탄올을 이용하여 순차적으로 2회 분배 추출하였다. 용매 분획하여 얻어진 3개의 분획 층을 감압 농축하여 에틸아세테이트 층은 199.2 mg, 부탄올 층은 485.3 mg, 물 층은 14,933.7 mg을 획득하였다. 이들 분획 층을 뿌리혹선충 유충에 대하여 살선충활성을 조사하였다.
구체적으로, 준비된 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 에틸아세테이트 추출물과 부탄올 추출물은 메탄올에 그리고 물 층은 물에 각각 처리농도보다 100배 높은 농도로 용해한 후, 각각의 시료를 선충 유충현탁액에 1% 처리하여 최종농도 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500, 1,000 ㎍/ml으로 처리하였다. 대조구로 1% 아세톤과 메탄올을 처리하였으며, 처리 후 시료가 잘 섞이도록 96-웰 플레이트를 30초간 교반한 후 상대습도 100% 플라스틱 통에 넣은 후 실온에 보관하였다.
뿌리혹선충에 감염된 토마토 뿌리에서 뿌리혹선충 알을 얻기 위해서는, 식물의 뿌리를 수돗물로 씻어내 이물질을 제거하였다. 뿌리를 1 cm 크기로 잘라 0.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 넣은 후 1분 동안 분쇄하였다. 분쇄 후 45 ㎛ 체와 25 ㎛ 체를 2중으로 끼운 체에 사용하여 알을 분리하였으며 분리된 알은 깔대기법(Baermann funnel)을 이용하여 부화된 유충을 분리하여 실험에 사용하였다.
뿌리혹선충의 50 마리의 유충 99 ㎕을 96-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 넣은 다음 용매추출물을 1% 처리하여 웰 당 최종 부피가 100 ㎕ 되도록 하였다. 시료 처리 후 시료가 잘 섞이도록 96-웰 플레이트를 30초간 교반한 후 상대습도 100% 플라스틱 통에 넣어 실온 보관하였다. 시료 처리 72시간 후 광학 도립현미경하에서 아래와 같은 식을 이용하여 살선충율을 조사하였다. 살선충율은 곧게 뻗어 움직임이 없는 선충을 죽은 선충으로, 유연한 곡선형으로 움직임이 있는 선충을 살아있는 선충으로 아래와 같은 식을 이용하여 살선충율을 조사하였다.
살선충율(%) = [(처리구의 치사율-대조구의 치사율)/(100-대조구의 치사율)] × 100
그 결과, 도 1에서와 같이 에틸아세테이트 층은 125 ㎍/ml의 농도 이상부터 80% 이상의 우수한 살선충활성을 나타내었으며, 62.5 ㎍/ml의 농도에서 57.6%의 살선충활성을 보였으며, 가장 낮은 농도인 15.6 ㎍/ml에서는 24.1%의 살선충활성을 보였다. 그 외, 부탄올 층과 물 층에서는 전혀 활성이 없었다. 따라서 가장 높은 활성을 나타낸 에틸아세테이트 층을 이용하여 추후 살선충활성 물질의 분리를 수행하였다.
실시예 2. 살선충활성 물질 분리
활성물질을 에틸아세테이트 층으로부터 분리하기 위하여 상기 방법으로 더 배양한 후 에틸아세테이트 층을 더 확보한 후, 에틸아세테이트 추출물(703.2 mg)을 실리카겔 컬럼에 가한 다음 클로로포름:메탄올(93:7 v/v) 용매로 용출하였다. 실리카겔 컬럼을 통하여 획득한 각 분획을 10 mg/ml 농도로 메탄올에 용해하여 96-웰 플레이트에서 200 ㎍/㎖ 수준으로 살선충활성을 조사하였으며, 무처리구의 경우 메탄올을 처리하였다. 이 중 뿌리혹선충에 대한 살선충활성을 나타내는 분획을 모아 감압농축하여 220.3 mg의 용출물을 수득하였다. 수득한 용출물(20 mg)은 Sep-Pak C18 역상컬럼에 가하였으며, 컬럼은 물로 용출을 시작하여 메탄올 함량을 증가시키면서 최종적으로 100% 메탄올로 용출하였다. 그 결과, 물:메탄올(9:1 v/v) 조건에서 용출된 단일 물질(8.4 mg)과 물:메탄올(8:2 v/v) 조건에서 용출된 단일 물질(2.1 mg)이 동일한 것으로 나타나 두 분획을 합하였다. 분리한 물질의 순도를 조사하기 위해 HPLC 분석을 수행하였다. 컬럼은 C18 역상컬럼(Atlantis T3, 5 μm, 4.6 × 250 mm, Waters, Co., Ireland)을 사용하였으며, 용매는 0.1%의 아세트산이 들어있는 물과 0.1% 아세트산이 들어있는 아세토나이트릴을 이용하여 20분 동안 메탄올 0%부터 75%로 유기용매의 비중을 높여가며 분석하였다. 그 결과 도 2에서와 같이 순수하게 분리된 하나의 크로마토그램이 확인되었다. 그 결과 도 2에서와 같이 12.7분에 순수하게 분리된 하나의 크로마토그램이 확인되었다.
실시예 3. 분리한 물질의 구조 결정
순수 분리한 화합물을 EI-MS와 1H-13C NMR 등을 통해 구조를 동정하였다. 살선충활성 물질은 EI-MS 분석결과 [M]+ 값으로 m/z 154가 검출되었으며 NMR 분석을 통해 도 3A에 게시한 바와 같이 C7H6O4 분자식을 갖는 것으로 확인되었다. 살선충활성 물질은 13C-NMR 스펙트럼에서 7개의 탄소가 관측되었다. 5개의 탄소는 메틴(methine) 구조로 이루어져 있으며, 나머지 2개의 탄소는 4가 탄소로서 9번인 δ 164.90과 2번인 δ 169.58에 해당한다. 1H-NMR 스펙트럼에서 δ 5.28 수소는 4번 탄소에 연결되어 있으며, COSY 분석에 의하면 δ 5.28, 4.98, 6.38 수소는 서로 연결된다. 분리한 활성물질의 1H-13C-NMR 데이터는 아래 표 2에 정리하였다. 이와 같은 분광학적 데이터를 통해 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주가 생산하는 살선충활성 물질은 그람미신(grammicin)으로 동정되었다. 도 3B는 곰팡이가 생성하는 독소의 한 종류인 파튤린(patulin)의 구조로써, 그람미신은 파튤린의 이성질체이다.
Figure PCTKR2017010666-appb-T000001
실시예 4. 분리한 살선충물질의 뿌리혹선충 2령 유충 및 알 부화 억제 활성
분리한 활성물질의 살선충활성과 알 부화 억제능을 조사하기 위해 시료는 메탄올에 용해하였으며 대조약제로서 트랜스-신남알데히드(trans-cinnamaldehyde)는 에탄올에 용해하여 실험에 사용하였다. 모든 시료는 처리 농도보다 100배 높은 농도로 조제하였으며, 1.56-100 ㎍/ml 농도 수준으로 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 및 당근뿌리혹선충(M. hapla) 2령 유충에 대한 살선충활성을 조사하였다. 또한 같은 농도로 고구마뿌리혹선충(M. incognita)의 알 부화 억제 활성을 검정하였다. 무처리구로 1% 메탄올과 에탄올을 사용하였으며 앞서 설명한 방법으로 살선충활성과 알 부화 억제활성을 조사하였다. 실험은 3 반복을 수행하였으며, 시료 처리 3일 후 살선충율을 조사하였고, 14일 후 알 부화 억제율을 조사하였다. 알 부화 억제율은 다음과 같은 식으로 구하였다.
알 부화 억제율(%) = [(C-T)/C] × 100,
C= 대조구의 알부화율*, T= 처리구의 알부화율
*알 부화율(%) = 유충의 수/[알의 수 + 유충의 수] × 100
그 결과, 도 4에서 나타낸 것처럼 활성물질의 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 2령 유충에 대한 살선충활성은 12.5 ㎍/ml 농도에서 52.8%의 치사율을, 50 ㎍/ml의 농도에서 100%의 치사율을 보였다. 이를 LC50 값으로 나타낸 결과는 당근뿌리혹선충(M. hapla) 결과와 함께 아래 표 2에 정리하였다. 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 알 부화 억제율은 도 5에서와 같이 3.1 ㎍/ml 농도에서 68.2%, 25 ㎍/ml 농도에서 91.4%로 대조구로 사용한 트랜스-신남알데히드(3.1 ㎍/ml 농도에서 31.3%, 25 ㎍/ml 농도에서 65.0 ㎍/ml)보다 알 부화 억제 활성이 훨씬 우수한 것으로 나타났다.
또한, 도 6에서 나타낸 것처럼 활성물질의 당근뿌리혹선충(M. hapla) 2령 유충에 대한 살선충율 25 ㎍/ml 농도에서 62.4%의 치사율을, 50 ㎍/ml의 농도에서 100%의 치사율을 보였다. 따라서 본 발명에서 분리한 활성물질 그람미신(grmmicin)은 고구마뿌리혹선충(M. incognita)과 당근뿌리혹선충(M. hapla)의 2령 유충에 살선충활성을 갖으며 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 알 부화 억제활성 또한 갖는 것으로 확인하였다.
Figure PCTKR2017010666-appb-T000002
실시예 6. 분리한 살선충물질 그람미신과 이성질체인 파튤린의 살선충활성 비교
파튤린(Patulin)은 도 3B의 화학구조이며, 분리한 살선충물질인 그람미신의 이성질체이다. 그람미신과 파튤린의 살선충활성을 비교하기 위하여 두 개의 시료 모두 메탄올에 용해하였으며 대조약제로서는 이전실험에도 사용하였던 트랜스-신남알데하이드를 사용하였다. 도 4에 게시한 바와 같이 그람미신의 경우, 최소 50 ㎍/ml에서 100%의 치사량을 보이므로 이보다 2배 높은 농도인 100 ㎍/ml부터 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12 그리고 1.56 ㎍/ml 농도까지 고구마뿌리혹선충(M.incognita) 2령 유충에 대한 살선충활성을 조사하였다. 그 결과, 도 7에서 나타낸 것처럼 고구마뿌리혹선충(M.incognita) 2령 유충에 대해 파튤린 또한 그람미신처럼 농도가 높아짐에 따라 활성이 증가하는 것을 보였으나, 실험 최고농도인 100 ㎍/ml에서 38.74%의 낮은 살선충활성을 보였다. 따라서 파튤린은 그람미신의 이성질체이나 뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충활성은 파튤린이 매우 낮은 것으로 나타났다.
실시예 7. 분리한 살선충 물질 그람미신과 이성질체인 파튤린의 대장암 세포 SW.71 대한 세포독성 비교
자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 배양여액으로부터 순수분리한 살선충활성 물질 그람미신과 이성질체인 파튤린의 대장암 세포 SW.71에 대한 인체 세포독성을 비교하기 위하여 MTT 세포 생존력 분석(cell viability assay)을 수행하였다. 실험에 사용한 세포주인 대장암세포 SW.71은 -196℃ 액체질소 탱크에 보관하여 사용하였다. 대장암세포 SW.71은 RPMI-1640(Life Technologies Inc., USA) 배지에 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco)과, 1% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건인 배양기에서 72시간 배양하여 실험에 사용하였다. MTT 시약은 티아졸릴 블루 테트라졸리움 브로미드(thiazolyl blue tetrazolium bromide)를 사용하였고, 이를 최종농도 5 mg/ml가 되도록 PBS(phosphate buffer saline)에 녹인 후, 빛을 차단하고 4℃에 보관하였다. 대장암세포 SW.71를 96 웰 플레이트에 5×103 또는 1×104 세포/웰의 농도로 130 ㎕ 씩 분주하였으며, 그람미신과 파튤린을 최종농도가 10, 5, 1, 0.5, 0.1 ㎍/ml이 되도록 DMEM 배지로 희석하여 각 웰에 14.5 ㎕씩 접종하였다. 24시간 배양 후, 세포 배양액에 MTT 용액을 한 웰당 14.5 ㎕ 첨가하여 37℃에 2시간 이상 배양 후, 배지를 조심스럽게 제거하고, 반응을 정지시키기 위하여 웰 당 108.5 ㎕ DMSO를 첨가하여 암조건의 실온상태에서 30분간 플레이트 쉐이커를 이용하여 교반하였다. 그런 다음, 마이크로플레이트 ELISA 리더기를 이용하여 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 배양 24시간 후 세포 생존률을 조사하였다. 무처리구는 DMEM 배지에 1% MeOH를 추가하였다. 모든 실험은 3 반복하였다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이 5×103 또는 1×104 세포/웰의 농도 접종구 모두에서 그람미신 처리구는 세포독성이 시험 농도에서 전혀 보이지 않는 반면, 파튤린 처리구는 두 처리 모두에서 농도가 강할수록 높은 세포독성을 보였다. 파튤린은 5×103 세포/웰 처리구에서는 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ㎍/ml 처리구는 무처리구에 비해 각각 72.2%, 72.1%, 42.1%, 43.5%, 31.4%의 세포생존률을 보였으며, 1×104 세포/웰 처리구에서는 무처리구에 비해 각각 66.2%, 80.5%, 75.3%, 58.4%, 27.6%의 세포생존률을 나타내었다. 따라서 그람미신은 파튤린보다 살선충활성은 매우 강한 반면에 세포에 대한 독성은 파튤린에 비하여 매우 낮은 것으로 나타났다.
실시예 8. 자일라리아 그람미카( Xylaria grammica ) EL 000614 균주의 그람미신(grammicin) 생산 최적 배양 조건 검토
본 발명에서는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주를 모두 정치배양(PDB, 25℃ 조건)하였다. 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주가 생산하는 살선충활성 물질 그람미신(grammicin)의 생산량을 높이기 위하여 배지조성을 바꾸어 균주를 배양하였다. 변경방법은 기존에 사용하던 배지 PDB 배지(500 ml 삼각플라스크, 100 ml PDB 배지)에 글루코스(glucose)를 첨가(5 g, 10 g, 20 g)하여 25℃ 조건에서 7일, 14일, 21일간 정치 배양하였다. 또한 정치배양과 진탕배양이 그람미신(grammicin) 생산량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 PDB 배지에 균주를 접종한 후 두 가지 다른 방법으로 배양하였다.
배양여액에서 그람미신(grammicin)의 함량을 조사하기 위하여 4겹의 거즈로 걸러 균사체를 제거한 후 획득한 배양여액을 1/10으로 희석하여 HPLC 분석을 실시하였다. 컬럼은 C18 역상컬럼(Atlantis T3, 5℃, 4.6 × 250 mm, Waters, Co., Ireland)을 사용하였으며, 용매는 0.1%의 아세트산이 들어있는 물과 0.1% 아세트산이 들어있는 아세토나이트릴을 이용하여 45분 동안 메탄올 0%부터 100%로 유기용매의 비중을 높여가며 분석하였다. 표준물질은 125, 250, 500, 1,000 ㎍/ml의 그람미신(grammicin) 용액을 사용하였다. 이후 표준검정곡선을 그린 다음 각각의 시료에서 그람미신 피크의 면적을 검정곡선에 넣어 배양여액에서의 그람미신 함량을 구하였다.
그 결과, 도 9에서와 같이 PDB 배지에 글루코스 20 g이 첨가된 배지에서는 생육 7일, 14일, 21일째에 각각 739.78, 4,720.57, 5,960.54 ㎍/ml의 그람미신(grammicin)이 생산되었고, 10 g이 첨가된 배지에는 7일, 14일, 21일째에 각각 700.82, 4389.52, 4797.34 ㎍/ml이 생산되었으며, 5 g이 첨가된 배지에는 각각 611.23, 3977.03, 4004.7 ㎍/ml이 생산되었다. 따라서 글루코스 20 g 배지에서 그람미신(grammicin)이 가장 많이 생산됨을 알 수 있었다. 또한, 순수 PDB 배지에 정치배양한 결과, 7일, 14일, 21일째에 692.84, 3006.97, 2579.29 ㎍/ml의 그람미신(grammicin)이 생산되었고, 순수 PDB 배지에 진탕배양한 결과, 7일, 14일, 21일째에 310.03, 1233.52, 1327.35 ㎍/ml의 그람미신(grammicin)이 생산되었다. 본 실험결과, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL 000614 균주에 의한 그람미신(grammicin) 생산은 PDB 배지에서 진탕배양보다 정치배양에서 보다 많은 양이 생산되었고, 또한 PDB 배지에 글루코스를 더 첨가할 경우 더욱 많은 양의 그람미신(grammicin)이 생산된다는 사실을 확인하였다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1의 그람미신(grammicin) 화합물 또는 농업적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 선충 방제용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017010666-appb-I000001
  2. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주로부터 분리된 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 선충은 뿌리혹선충인 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 살선충활성 물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 살선충활성 물질은 아버멕틴(avermectin)계 살선충활성 물질, 모란텔 타르트레이트(morantel tartrate), 메설펜포스(mesulfenfos) 및 레바미솔(levamisol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유효성분 외에 농약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 또는 젤상으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 선충 방제용 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 선충 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 선충을 방제하는 방법.
  9. 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주를 4~23g/ℓ 글루코스가 포함된 PDB(Potato dextrose broth) 배지에서 정치배양(stationary culture)하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1의 그람미신(grammicin) 화합물을 생산하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2017010666-appb-I000002
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