KR102243620B1 - 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증가시키기 위한 최적 배지 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증가시키기 위한 최적 배지 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증가시키기 위한 최적 배지 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 배지 조성물은 선충을 방제하는 약품 개발에 활용되어 국내 친환경 농산물 생산량 증대에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증가시키기 위한 최적 배지 조성물 및 이의 용도{Optimal medium composition for increasing production of grammicin from Xylaria grammica strain and use thereof}
본 발명은 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증가시키기 위한 최적 배지 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물 기생성 선충은 주로 연작지 토양에서 발생하여 작물에 막대한 피해를 주는 해충으로 전 세계적으로 해마다 78조 달러의 손실을 가져오고 있다. 편형동물문에 속하는 식물 기생성 선충은 종류가 수천종이고, 섭식방법, 형태 및 기생하는 양상에 따라 뿌리혹선충(Meloidogyne spp.), 뿌리썩이선충(Paratylenchus spp.), 위축선충(Tylenchorhynchus spp.), 침선충(Paratylenchus spp.), 환선충(Criconemoides spp.), 나선선충(Hellicotylenchus spp.), 씨스트선충(Heterodera spp.), 줄기선충(Ditylenchus spp.) 및 잎선충(Aphelenchoides spp.) 등이 있다.
국내 시설원예 재배지에는 뿌리혹선충의 감염으로(성주 약 85% 재배농가 뿌리혹선충 감염) 매년 약 30-40%의 수량감소를 가져오고 있으며, 이 뿌리혹선충은 우리나라의 거의 모든 시설원예작물(오이, 수박, 참외 및 토마토 등)에 피해를 주고 있다.
뿌리혹선충(Meloidogyne spp.)은 1850년대 영국의 온실에서 재배중인 오이 뿌리혹에서 처음 발견되었는데, 1949년 치트우드(Chitwood)에 의하여 멜로이도기네 속(Meloidogyne sp.)으로 정립되었고, 세계적으로는 100여종이 분포한다. 국내에는 모두 6종의 뿌리혹선충이 보고되고 있으며, 그 중 국내 재배지에서 가장 문제가 되는 뿌리혹선충은 멜로이도기네 아레나리아(땅콩뿌리혹선충), 멜로이도기네 하플라(당근뿌리혹선충) 및 멜로이도기네 인코그니타(고구마뿌리혹선충) 등 3종이다. 이들 선충은 가지, 감자, 고추, 담배, 당근, 딸기, 땅콩, 무, 배, 상추, 수박, 시금치, 양파, 오이, 우엉, 인삼, 작약, 참깨, 참외, 콩, 토마토, 포도, 호박 등 많은 작물을 기주로 가지고 있다.
뿌리혹선충에 의한 피해는 전 세계적으로 나타나는데, 한대지방보다는 온도가 높아 선충의 번식횟수가 많은 열대나 아열대지방에서 특히 더 심하다. 국내의 경우 겨울동안에도 시설을 이용하여 채소류를 연중 재배함으로서 아열대 지방에 적응하는 고구마뿌리혹선충(M. incognita)과 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria)의 발생이 심하다.
식물 기생성 선충은 농작물에게 있어 만병의 근원이라 할 정도로 그 피해가 매우 심각하여, 한번 감염된 지역에서 이들을 완전히 방제하기는 거의 불가능하다. 이러한 선충의 피해를 감소시키는 방법으로 윤작, 객토, 태양열 소독, 담수처리, 토양 훈증, 살선충제 처리 등이 있다. 그러나 뿌리혹선충 같은 토양전염성 선충은 대부분의 생활이 토양에서 이루어지므로 토양 내 불량환경에 견딜 수 있는 내구체를 형성하므로 휴경이나 답전윤환(paddy-upland rotation)의 재배적 방제로는 효과적인 방제가 어렵다. 지금까지 선충 방제는 쉽게 구할 수 있는 유기합성 농약이 주로 사용되어 왔으나, 최근 유기합성 농약들의 인체 및 자연 환경에 미치는 악영향이 밝혀지면서 알디카브(aldicarb), 페나미포스(fenamiphos), 메틸 브로마이드(methyl bromide), 디브로모클로로프로판(dibromochloropropane) 및 에틸렌 디브로마이드(ethylene dibromide) 등 효과 좋은 살선충제들의 등록이 취소됨으로써, 이러한 농약들을 대신할 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
그람미신(grammicin)은 천연물질로 2001년 영국 화학자 에드워드 등에 의해 처음 발견되었으나 구체적인 활성이 알려지지 않았다. 최근 국내에서 자생 지의류에 서식하는 곰팡이에서 그람미신을 분리하였고, 그람미신이 시판 중인 친환경 살선충제인 트랜스-신남알데히드(trans-cinnamaldehyde) 보다 현저히 낮은 농도에서 살선충 활성 및 알부화 억제율이 우수함을 확인함으로써 기존 화학 농약을 대체하여 친환경 선충 방제에 활용될 것으로 기대하고 있다.
한편, 한국등록특허 제0574348호에서는 '그리세오풀빈을 생산하는 자일라리아 속 AH001 균주, 이를 포함하는 선충 방제용 제제 및 이를 이용하여 선충을 방제하는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1144987호에서는 '크리세오박테리움 FBF-7 균주 배양물 및 이를 함유하는 뿌리혹선충 방제용 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증가시키기 위한 최적 배지 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 다양한 탄소원 및 질소원을 비교하여 그람미신(grammicin)을 생산하는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL000614 균주로부터 그람미신의 생산을 증진시키기 위한 최적의 배지 조건을 선정하였고, 상기 배지조건에서 자일라리아 그람미카 EL000614 균주를 배양한 결과, 25℃에서 3주 동안 정치배양하면 종래 PDB(potato dextrose broth) 배지에 비해 그람미신 생산량이 4배 이상 증진된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가용성 전분(soluble starch) 및 펩톤(peptone)을 유효성분으로 포함하는 그람미신(grammicin)을 생산하는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주로부터 그람미신의 생산을 증진시키기 위한 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용하여 제조한 액체 배지를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 액체 배지에 그람미신을 생산하는 자일라리아 그람미카 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 그람미신의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 배지 조성물은 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신을 대량으로 생산할 수 있고, 상기 그람미신은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 뿌리혹 선충에 대해 우수한 방제활성을 나타내므로, 본 발명의 배지 조성물은 환경 친화적인 천연물 살선충제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL000614 균주(KCTC13121BP)를 20℃ 또는 25℃에서 진탕배양(shaking incubation) 또는 정치배양(stationary incubation)한 후 자일라리아 그람미카의 그람미신(grammicin) 생산량을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 배지에 첨가되는 탄소원(Carbon source; A) 및 질소원(Nitrogen source; B)의 종류에 따른 자일라리아 그람미카 EL000614의 그람미신 생산량 및 균사 생중량(fresh mycelial weight)을 측정하여 나타낸 그래프이다. glucose; 글루코오스, sucrose; 수크로오스, fructose; 프룩토오스, cellulose; 셀룰로오스, soluble starch; 가용성 전분, (NH4)2SO4; 황산암모늄, yeast extract; 효소 추출물, NaNO3; 질산나트륨, tryptone; 트립톤, peptone; 펩톤, PDB; potato dextrose broth.
도 3은 배지에 첨가되는 탄소원(가용성 전분; S)과 질소원(펩톤; P)의 혼합 비율에 따른 자일라리아 그람미카 EL000614의 그람미신 생산량을 4주 동안 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 자일라리아 그라미카 EL000614 균주의 최적배지(가용성 전분 90g 및 펩톤 8g) 배양여액(optimum medium CF)과 종래 자일라리아 그라미카 EL000614 균주 배양에 사용된 PDB(potato dextrose broth) 배지 배양여액을 이용하여 그람미신의 생산량을 4주 동안 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 자일라리아 그라미카 EL000614 균주의 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신의 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita; A) 및 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria; B) 2령 유충에 대한 살선충 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 가로축; 그람미신의 농도, 배양여액의 경우 그람미신 함량을 기준으로 희석하여 처리(0.137㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 0.137㎍/㎖이 되도록 41,902.62배 희석, 0.41㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 0.41㎍/㎖이 되도록 13,967.64배 희석, 1.23㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 1.23㎍/㎖이 되도록 4,655.88배 희석, 3.7㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 3.7㎍/㎖이 되도록 1,551.96배 희석, 11.1㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 11.1㎍/㎖이 되도록 517.32배 희석, 33.3㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 33.3㎍/㎖이 되도록 172.44배 희석, 100㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 100㎍/㎖이 되도록 87.48배 희석, 300㎍/㎖; 배양여액을 그람미신 함량 기준으로 최종농도가 300㎍/㎖이 되도록 19.16배 희석).
도 6은 자일라리아 그라미카 EL000614 균주의 최적배지 배양여액과 PDB 배지 배양여액의 고구마뿌리혹선충(M. incognita; A) 및 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria; B) 2령 유충에 대한 살선충 활성을 측정하여 나타낸 그래프이다. 가로축; 최적배지 배양여액 및 PDB 배지 배양여액을 각 배양여액에 함유된 그람미신 함량을 기준으로 희석한 희석배수.
도 7은 자일라리아 그라미카 EL000614 균주의 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신의 고구마뿌리혹선충(M. incognita; A) 및 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria; B)의 알 부화 억제율을 나타낸 그래프이다. 가로축; 그람미신의 농도(배양여액의 경우 배양여액에 함유된 그람미신 함량을 기준으로 희석하여 처리).
도 8은 토마토 식물체에 뿌리혹선충의 2령 유충을 접종하고 자일라리아 그람미카 EL000614 균주의 최적배지 배양여액과 PDB 배지 배양여액을 각각 처리한 후 토마토 뿌리에서 혹 형성(A) 및 난낭 형성(B)이 억제되는 효과를 나타낸 그래프이다. 세로축(Control value(%)); 토마토 뿌리혹 선충병 방제율, X. grammica OMCH(×5); 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 최적 배지 배양액을 5배 희석한 희석액, X. grammica OMCH(×20); 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 최적 배지 배양액을 20배 희석한 희석액, X. grammica PDCH(×5); 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 PDB 배지 배양액을 5배 희석한 희석액, X. grammica PDCH(×20); 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 PDB 배지 배양액을 20배 희석한 희석액, Sunchungtan(×4,000); 선충탄을 4000배 희석한 희석액.
도 9는 토마토에 2령 유충을 접종하고 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 최적 배지 배양액의 희석액과 PDB 배지 배양액의 희석액을 처리한 후 토마토 뿌리혹 형성 정도를 확인한 사진이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가용성 전분(soluble starch) 및 펩톤(peptone)을 유효성분으로 포함하는 그람미신(grammicin)을 생산하는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주로부터 그람미신의 생산을 증진시키기 위한 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 배지 조성물은 황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H2O), 염화칼륨(KCl), 황산철·7수화물(FeSO4·7H2O), 시트르산(citric acid), 황산아연·7수화물(ZnSO4·7H2O), 황산제일철암모늄·6수화물(Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O), 황산구리·5수화물(CuSO4·5H2O), 황산망간·1수화물(MnSO4·H2O), 붕산(H3BO4) 및 몰리브덴산나트륨·2수화물(NaMoO4·2H2O)을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배지 조성물에 있어서, 상기 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주는 수탁번호 KCTC13121BP로 기탁된 자일라리아 그람미카 EL000614 균주이다(한국등록특허 제1877932호 참고).
본 발명의 일 구현 예에 따른 배지 조성물은 구체적으로는, 80~100g/ℓ의 가용성 전분; 6~10g/ℓ의 펩톤; 0.2~0.8g/ℓ의 황산마그네슘·7수화물; 0.2~0.8g/ℓ의 염화칼륨; 8~12mg/ℓ의 황산철·7수화물; 0.5~1.5mg/ℓ의 시트르산; 0.5~1.5mg/ℓ의 황산아연·7수화물; 0.15~0.25mg/ℓ의 황산제일철암모늄·6수화물; 0.01~0.1mg/ℓ의 황산구리·5수화물; 0.005~0.1mg/ℓ의 황산망간·1수화물; 0.005~0.1mg/ℓ의 붕산; 및 0.005~0.1mg/ℓ의 몰리브덴산나트륨·2수화물 성분을 포함할 수 있고, 더욱 구체적으로는, 90g/ℓ의 가용성 전분; 8g/ℓ의 펩톤; 0.5g/ℓ의 황산마그네슘·7수화물; 0.5g/ℓ의 염화칼륨; 10mg/ℓ의 황산철·7수화물; 1mg/ℓ의 시트르산; 1mg/ℓ의 황산아연·7수화물; 0.2mg/ℓ의 황산제일철암모늄·6수화물; 0.05mg/ℓ의 황산구리·5수화물; 0.01mg/ℓ의 황산망간·1수화물; 0.01mg/ℓ의 붕산; 및 0.01mg/ℓ의 몰리브덴산나트륨·2수화물 성분을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배지 조성물은 자일라리아 그람미카 균주에서 그람미신(grammicin)의 생산량을 증가시키는 효과가 있다. 상기 그람미신은 자일라리아 그람미카 균주로부터 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 기탁번호가 KCTC13121BP인 자일라리아 그람미카 EL000614 균주로부터 분리된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 배양액으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 배지 조성물은, 최소배지 조성(표 2)에서 탄소원인 글루코오스를 가용성 전분로, 질소원인 질산나트륨(NaNO3)을 펩톤으로 대체하였는데, 탄소원 및 질소원의 변경에 따라 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신 생산량을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(도 2).
본 발명의 배지 조성물에서 자일라리아 그람미카 EL000614 균주를 배양하고 얻어진 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신은 살선충 활성 효과가 우수하다. 상기 선충은 바람직하게는 뿌리혹선충(Meloidogyne sp.)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 고구마뿌리혹선충(M. incognita), 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria), 당근뿌리혹선충(M. hapla), 자바뿌리혹선충(M. javanica) 또는 토마토뿌리혹선충(M. incognita)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 고구마뿌리혹선충(M. incognita) 또는 땅콩뿌리혹선충(M. arenaria)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 배지 조성물을 이용하여 제조한 액체 배지 및 상기 액체 배지에 그람미신(grammicin)을 생산하는 자일라리아 그람미카 균주를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 그람미신의 대량 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 일 구현 예에 따른 그람미신의 대량 생산 방법은 그람미신(grammicin)을 생산하는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주를 15~30℃에서 2~4주 동안 정치배양할 수 있으며, 바람직하게는 25℃에서 2~3주 동안 정치배양할 수 있다.
본 발명에 일 구현 예에 따른 그람미신의 대량 생산 방법은 일예로서, 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL000614 균주를 80~100g/ℓ의 가용성 전분; 6~10g/ℓ의 펩톤; 0.2~0.8g/ℓ의 황산마그네슘·7수화물; 0.2~0.8g/ℓ의 염화칼륨; 8~12mg/ℓ의 황산철·7수화물; 0.5~1.5mg/ℓ의 시트르산; 0.5~1.5mg/ℓ의 황산아연·7수화물; 0.15~0.25mg/ℓ의 황산제일철암모늄·6수화물; 0.01~0.1mg/ℓ의 황산구리·5수화물; 0.005~0.1mg/ℓ의 황산망간·1수화물; 0.005~0.1mg/ℓ의 붕산; 및 0.005~0.1mg/ℓ의 몰리브덴산나트륨·2수화물 성분으로 이루어진 배지에 접종하고 25℃에서 3주간 정치배양시키면 그람미신을 대량으로 생산할 수 있다. 상기 자일라리아 그람미카 EL000614 균주는 그람미신을 생산하는 균주이므로, 상기 균주를 본 발명의 액체 배지에 접종하여 배양함으로써 그람미신을 대량으로 생산할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 배양 조건 최적화
자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL000614 균주로부터 그람미신을 대량으로 생산하기 위한 최적의 배양온도 및 배양방법을 결정하기 위해 PDB(potato dextrose broth) 배지에 균을 접종한 후 20℃ 또는 25℃에서 진탕배양(shaking incubation) 또는 정치배양(stationary incubation)하였다. 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask, 250㎖)에 배지 50㎖을 넣고 멸균한 후 PDA(potato dextrose agar) 배지에서 왕성하게 자라는 균사의 가장자리에서 지름 6mm의 아가 플러그(agar plug)를 5개씩 떼어 플라스크 내 배지에 접종하였다. 접종 후 7일, 14일 및 21일 동안 20℃ 또는 25℃에서 진탕배양 또는 정치배양하고 얻어진 배양액을 4겹 거즈로 걸러 균사를 제거하여 배양여액을 수득하였고, 상기 수득된 배양여액은 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과하였다. 서로 다른 조건의 배지에서 얻어진 배양여액에 존재하는 그람미신(grammicin)의 함량을 비교하기 위해 HPLC(Shimazu)를 이용하여 정량분석을 수행하였다. HPLC는 XBridge C18(5㎛ pore size, 4.6×250 mm; Waters) 컬럼을 이용하였고, 이동상은 0.1% TFA(trifluoroacetic acid) 함유 증류수(A 펌프) 및 0.1% TFA 함유 아세토나이트릴(Acetonitrile; B 펌프)를 이용한 gradient 시스템으로 표 1과 같은 용매조건으로 분석하였다. 유속은 1.0㎖/분, 주입량은 10㎕이고, 210 nm에서 피크를 검출하였다.
HPLC 분석 조건
시간 유속 0.1% TFA 함유 증류수 0.1% TFA 함유 아세토나이트릴
0.01 1.0 100.0 0.0
40.00 1.0 50.0 50.0
45.00 1.0 0.0 100.0
55.00 1.0 0.0 100.0
그 결과, 25℃에서 정치배양한 자일라리아 그람미카에서 그람미신(grammicin)이 가장 많이 생산된 것을 확인하였고(도 1), 이를 통해 이후 실험에서는 자일라리아 그람미카를 25℃에서 정치배양하였다.
실시예 2. 배지 조건 최적화
자일라리아 그람미카 EL000614 균주로부터 그람미신을 대량으로 생산하기 위한 최적의 배지 조건을 선정하기 위해 최소배지에 다양한 탄소원과 질소원을 첨가하고 자일라리아 그람미카를 배양한 후 자일라리아 그람미카에서 생산된 그람미신의 양을 측정하였다. 실험에서 사용된 모든 배지는 삼각 플라스크(250㎖)에 배지 50㎖을 넣고 멸균하였으며, 상기 멸균된 배지에 PDA 배지에서 왕성하게 자라는 균사의 가장자리에서 지름 6 mm의 아가 플러그를 5개씩 떼어 플라스크 내 배지에 접종한 후 25℃에서 정치배양하였다. 최소배지의 조성은 하기 표 2와 같다. PDB 배지(potato dextrose broth)는 비교군으로 사용되었으며 기존에 균주 배양용 배지로 사용되고 있지만 실제 상업적으로 사용이 제한될 수 있다.
최소배지 조성
최소배지 조성
성분 함량
증류수(distilled water) 1000㎖
탄소원(글루코오스, glucose) 30g
질소원(질산나트륨, NaNO3) 2g
황산마그네슘·7수화물(MgSO4·7H2O) 0.5g
염화칼륨(KCl) 0.5g
황산철·7수화물(FeSO4·7H2O) 0.01g
미량원소 2㎖
미량원소 조성
성분 함량(g/ℓ)
시트르산(citric acid) 0.5g
황산아연·7수화물(ZnSO4·7H2O) 0.5g
황산제일철암모늄·6수화물(Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O) 0.1g
황산구리·5수화물(CuSO4·5H2O) 0.025g
황산망간·1수화물(MnSO4·H2O) 0.005g
붕산(H3BO4) 0.005g
몰리브덴산나트륨·2수화물(NaMoO4·2H2O) 0.005g
우선, 최소배지의 탄소원을 글루코오스에서 수크로오스(sucrose), 프룩토오스(fructose), 셀룰로오스(cellulose) 또는 가용성 전분(soluble starch)로 변경한 경우에는 그람미신의 생산량이 가용성 전분에서 가장 많이 증가하였으며, 최소배지의 질소원을 질산나트륨에서 펩톤(peptone), 효소 추출물(yeast extract), 황산암모늄((NH4)2SO4) 또는 트립톤(tryptone)으로 변경한 경우에는 그람미신의 생산량이 펩톤에서 가장 많이 증가한 것을 확인하였다(도 2). 이를 통해, 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증진시키기 위한 배지에 첨가되는 최적의 탄소원은 가용성 전분, 최적의 질소원은 펩톤임을 알 수 있었다.
상기 선정된 탄소원과 질소원의 최적 비율을 결정하기 위해 최소배지에 다양한 비율의 가용성 전분과 펩톤을 첨가한 후 4주 동안 자일라리아 그람미카 EL000614 균주를 배양하였으며, 1주일 간격으로 그람미신의 생산량을 측정하였다. 탄소원과 질소원의 비율 조건은 하기 표 3과 같이 조정하였다.
그 결과, 하기 표 3의 ⑥ 배지(가용성 전분 60g 및 펩톤 8g) 및 ⑨ 배지(가용성 전분 90g 및 펩톤 8g) 조건에서 자일라리아 그람미카의 그람미신 생산량이 가장 많이 증가하였다. 특히 ⑨ 배지 조건에서는 2주 및 3주 동안 그람미신 생산량이 가장 우수하였고, 기존에 균주 배양용 배지로 사용된 PDB 배지에 비해 그람미신의 생산량이 현저하게 증가한 것을 확인하였다(도 3).
상기 결과를 통해, 배지 1L 당 가용성 전분이 90g, 펩톤이 8g 포함된 ⑨ 배지(가용성 전분 90g, 펩톤 8g, 황산마그네슘·7수화물 0.5g, 염화칼륨 0.5g, 황산철·7수화물 0.01g, 시트르산 1mg, 황산아연·7수화물 1mg, 황산제일철암모늄·6수화물 0.2mg, 황산구리·5수화물 0.05mg, 황산망간·1수화물 0.01mg, 붕산 0.01mg 및 몰리브덴산나트륨·2수화물 0.01mg) 조건이 자일라리아 그람미카 균주로부터 그람미신의 생산을 증진시킬 수 있는 최적배지 조건임을 알 수 있었다.
가용성 전분 및 펩톤이 다양한 비율로 첨가된 배지 조성
성분(g/L) ① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨
가용성 전분 30g 30g 30g 60g 60g 60g 90g 90g 90g
펩톤 2g 4g 8g 2g 4g 8g 2g 4g 8g
황산마그네슘·7수화물 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g
염화칼륨 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g
황산철·7수화물 0.01g 0.01g 0.01g 0.01g 0.01g 0.01g 0.01g 0.01g 0.01g
시트르산 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg
황산아연·7수화물 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg
황산제일철암모늄·6수화물 0.2mg 0.2mg 0.2mg 0.2mg 0.2mg 0.2mg 0.2mg 0.2mg 0.2mg
황산구리·5수화물 0.05mg 0.05mg 0.05mg 0.05mg 0.05mg 0.05mg 0.05mg 0.05mg 0.05mg
황산망간·1수화물 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg
붕산 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg
몰리브덴산나트륨·2수화물 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg 0.01mg
또한, 상기에서 선정한 최적배지 ⑨와 기존에 균주 배양에 사용된 PDB에서 자일라리아 그람미카 균주를 4주 동안 배양한 후 배양여액을 수득하여 HPLC를 통해 그람미신의 생산량을 1주일 간격으로 측정하였다.
그 결과, 최적배지의 배양여액에서 확인된 그람미신의 생산량은 배양 1주째에 346.7 ㎍/㎖, 2주째에 4,768.1 ㎍/㎖, 3주째에 5,747.3 ㎍/㎖, 4주째에 3,105.9 ㎍/㎖이었고, PDB의 배양여액에서 확인된 그람미신 생산량은 배양 1주째에 82.3 ㎍/㎖, 2주째에 876.9 ㎍/㎖, 3주째에 1,362.0 ㎍/㎖, 4주째에 1,618.7 ㎍/㎖이었으며, 이를 통해 본 발명의 최적배지에서 자일라리아 그람미카 균주를 3주 동안 배양할 경우 그람미신의 생산량이 현저한 수준으로 증가되는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 3. 자일라리아 그람미카의 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신의 뿌리혹선충 및 고구마뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성 분석
살선충 활성에서 그람미신의 역할을 규명하기 위하여 자일라리아 그람미카 EL000614 균주를 3주간 배양한 최적배지의 배양여액을 그람미신 함량을 기준으로 최종농도가 0.137㎍/㎖~300㎍/㎖(41,902.62배~19.16배 희석)이 되도록 희석하여 2령 유충에 대한 살선충 활성을 측정하였다. 이 때 배양여액에서 순수하게 분리한 그람미신도 동일한 농도로 처리하여 비교하였다.
고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita)은 전남대학교 친환경농업연구소 생육방에서 인위적으로 고구마뿌리혹선충을 감염시킨 토마토 뿌리로부터 알을 획득하여 사용하였다. 구체적으로, 식물의 뿌리를 수돗물로 씻어내 이물질을 제거한 후 뿌리를 1cm 크기로 잘라 0.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액을 넣고 1분 동안 믹서기로 분쇄하였으며, 분쇄 후 63μm의 체와 25μm의 체를 이중으로 비스듬히 끼워 알을 분리하였고 분리한 알은 깔대기법(Baermann funnel)을 이용하여 25~28℃에서 부화시켰으며, 약 72시간 후 부화한 2령 유충을 실험에 사용하였다.
고구마뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성을 분석하기 위해, 100㎕에 40~60마리가 들어있는 2령 유충 현탁액을 96 well plate의 각 웰에 넣은 후 3주간 정치배양한 자일라리아 그람미카 EL000614 균주의 배양여액을 0.08~20% 농도가 되도록 처리하여 웰의 최종 부피가 100㎕가 되도록 하였다. 상기와 같이 시료를 처리한 후, 96 well plate를 30초간 교반하고 상대습도가 100%인 플라스틱 통에 넣어 실온에 보관하였다. 시료 처리 72시간 후 광학 도립현미경하에서 아래와 같은 식을 이용하여 살선충율을 산출하였다. 살선충율은 직선으로 곧게 뻗어 움직임이 없는 선충을 죽은 선충으로, 곡선형으로 움직임이 있는 선충을 살아있는 선충으로 측정하였고, 실험은 총 3 반복하였다.
살선충율(%)=[(처리구의 치사율-무처리구의 치사율)/(100-무처리구의 치사율)]×100
그 결과, 고구마뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성은 도 5A에 나타난 바와 같이 그람미신과 자일라리아 그라미카 EL000614 균주의 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신 처리구에서는 거의 동일한 살선충 활성을 나타내었다. 300㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 처리구에서는 100%의 살선충 활성을 보였으며, 33.3㎍/㎖ 처리구에서는 그람미신이 57.54%, 최적배지의 배양여액이 57.09%의 살선충 활성을 보였고, 11.1 ㎍/㎖처리구에서는 그람미신이 46.31%, 최적배지의 배양여액이 45.64%로 서로 유사한 살선충 활성을 보였다. 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신의 고구마뿌리혹선충 2령 유충에 대한 EC50 값은 각각 19.55㎍/㎖과 18.39㎍/㎖이었으며, 최적배지 배양여액의 2령 유충에 대한 살선충 활성은 거의 그람미신에 의한 것임을 알 수 있었다.
땅콩뿌리혹선충(M. arenaria) 2령 유충에 대한 살선충 활성은 도 5B에 나타난 바와 같이 그람미신과 자일라리아 그라미카 EL000614 균주의 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신 처리구에서는 거의 동일한 살선충 활성을 나타내었다. 300㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 처리구에서는 100%의 살선충 활성을 보였으며, 33.3㎍/㎖ 처리구에서는 그람미신이 87.18%, 최적배지의 배양여액이 90.73%의 살선충 활성을 보였고, 11.1 ㎍/㎖ 처리구에서는 그람미신이 79.74%, 최적배지의 배양여액이 76.22%로 서로 유사한 살선충 활성을 보였다. 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신의 땅콩뿌리혹선충 2령 유충에 대한 EC50 값은 각각 4.83 ㎍/㎖과 5.75㎍/㎖이었다.
또한, 최적배지의 배양여액과 PDB 배지의 배양여액의 살선충 활성을 비교하기 위하여, 100㎖에 40~60마리가 들어있는 2령 유충 현탁액을 96 well plate의 각 웰에 넣은 후 3주간 정치배양한 최적배지의 배양여액을 19.16배(그람미신 300㎍/㎖에 해당)~41,902.62배(그람미신 0.137㎍/㎖에 해당) 희석하여 처리하였다. 또한 PDB의 배양여액도 동일한 배수로 희석하여 처리하였다. 3주간 정치배양한 최적 배지의 배양여액과 PDB의 배양여액의 그라미신 함량은 각각 5,747.3㎍/㎖과 1,362.0㎍/㎖이었으며, 약 4배 정도 차이가 나는 것으로 확인되었다.
고구마뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성은 도 6A에 나타난 바와 같이 최적배지의 배양여액과 PDB 배지 배양여액의 EC50 값은 각각 19.55㎍/㎖(293.96배 희석) 및 18.69㎍/㎖(72.87배 희석)이었고, 이를 통해, 본 발명의 자일라리아 그람미카 균주의 최적배지는 PDB에 비해 고구마뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성이 약 4배 정도 높은 것을 알 수 있었다.
땅콩뿌리혹선충 2령 유충에 대한 살선충 활성은 도 6B에 나타난 바와 같이 최적배지의 배양여액과 PDB의 배양여액의 EC50 값이 4.89㎍/㎖(1189.91배 희석), 4.67㎍/㎖(301.94배 희석)이었다.
실시예 4. 자일라리아 그람미카의 최적 배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신의 알 부화 억제 활성 분석
고구마뿌리혹선충(M. incognita)에 대한 알 부화 억제 활성을 분석하기 위해, 100㎕에 150~200개의 알이 있는 알 현탁액을 96 well plate의 각 웰에 넣은 다음 3주간 정치배양한 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 배양여액을 0.08~20% 농도가 되도록 처리하여 웰의 최종 부피가 100㎕이 되도록 하였다. 시료 처리 후 96 well plate를 30초간 교반하고, 96 well plate용 실링 필름을 붙여 상대습도가 100%인 플라스틱 통에 넣어 실온에 보관하였다. 시료 처리 2주 후 알 부화 억제율을 조사하였다. 대조구로는 아바멕틴(abamectin) 0.5㎍/㎖ 및 1㎍/㎖을 사용하였다. 실험은 총 3 반복을 수행하였고 2주 후 알 부화 억제율을 조사하였으며, 알 부화 억제율은 다음과 같은 식으로 산출하였다.
알 부화 억제율(%)=[(C-T)/C]×100.
C=무처리구의 알부화율*, T=처리구의 알 부화율.
*알 부화율(%)=유충의 수/[알의 수+유충의 수]×100
그 결과, 알 부화 억제 활성은 그람미신과 자일라리아 그라미카 EL000614 균주의 최적배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신 처리구에서 거의 동일하게 나타난 것을 확인하였고(도 7), 이를 통해 자일라리아 그람미카 균주로부터 생산된 그람미신이 주요 알 부화 저해 활성 물질임을 알 수 있었다.
실시예 5. 자일라리아 그람미카의 최적 배지 배양여액 및 상기 배양여액에서 분리한 그람미신의 토마토 뿌리혹 선충병에 대한 방제 효과 분석
토마토 유묘검정은 전남대학교 친환경농업연구소 생육방(25±5℃)에서 수행하였다. 직경 5.5cm의 투명컵에 원예용 상토를 넣고 토마토(서광 품종)를 파종한지 4주 후에 직경 9.5cm의 포트에 원예용 상토와 멸균한 모래를 1:1 비율로 혼합한 배양토를 넣고 토마토를 이식하였다. 이식 후 각 포트마다 2,000 마리의 2령 유충을 접종하였다. 접종 1시간 후 각 포트마다 시료를 각각 20㎖씩 토양관주 처리하였고, 시료 처리 5주 후 토마토의 뿌리혹선충 발생 정도를 조사하였다. 상기 처리된 시료는 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 최적 배지 배양액의 5배 희석액, 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 최적 배지 배양액의 20배 희석액, 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 PDB 배지 배양액의 5배 희석액, 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 균체분쇄 PDB 배지 배양액의 20배 희석액, 4,000배 선충탄 액제 희석액이다. 상기 균체분쇄 최적 배지 배양액은 균체가 포함되어 있으며 식물체에 용이하게 처리하기 위해 균체를 분쇄한 것을 의미한다. 혹 형성지수(Galling index, GI)는 뿌리에 혹이 생긴 정도에 따라 0=1~10% galls, 1=11~20%, 2=21~50%, 3=51~80%, 4=81~90% 및 5=91~100%로 산출하였으며, 각 시료의 방제율은 하기와 같은 식을 이용하여 산출하였다.
방제율(%)=[(대조구의 galling index-처리구의 galling index)/대조구의 galling index]×100
그 결과, 자일라리아 그람미카 EL000614 균주 배양액(X. grammica OMCH) 모두 토마토 뿌리의 혹 형성(galling index)과 난낭 형성(egg mass)을 효과적으로 억제하였다. 전체적으로 최적배지 5배 희석액에서 PDB 배지 배양액 5배 희석액에 비해 토마토 뿌리혹 선충병 방제 효과가 우수하였다(도 8 및 도 9).
한국생명공학연구원 KCTC13121BP 20160928

Claims (7)

  1. 80~100g/ℓ의 가용성 전분; 6~10g/ℓ의 펩톤; 0.2~0.8g/ℓ의 황산마그네슘·7수화물; 0.2~0.8g/ℓ의 염화칼륨; 8~12mg/ℓ의 황산철·7수화물; 0.5~1.5mg/ℓ의 시트르산; 0.5~1.5mg/ℓ의 황산아연·7수화물; 0.15~0.25mg/ℓ의 황산제일철암모늄·6수화물; 0.01~0.1mg/ℓ의 황산구리·5수화물; 0.005~0.1mg/ℓ의 황산망간·1수화물; 0.005~0.1mg/ℓ의 붕산; 및 0.005~0.1mg/ℓ의 몰리브덴산나트륨·2수화물을 유효성분으로 포함하는 그람미신(grammicin)을 생산하는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL000614 균주(KCTC13121BP)로부터 그람미신의 생산을 증진시키기 위한 배지 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 배지 조성물을 이용하여 제조한 액체 배지.
  5. 제4항의 액체 배지에 그람미신(grammicin)을 생산하는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) EL000614 균주(KCTC13121BP)를 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 그람미신의 대량 생산 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, 상기 그람미신을 생산하는 자일라리아 그람미카(Xylaria grammica) 균주를 15~30℃에서 2~4주 동안 정치배양하는 것을 특징으로 하는 그람미신의 대량 생산 방법.
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