KR100851399B1

KR100851399B1 - 고추 작물을 위한 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔을이용한 미생물 제제

Info

Publication number: KR100851399B1
Application number: KR1020070062516A
Authority: KR
Inventors: 이용세; 장태현; 송치현
Original assignee: 대구대학교 산학협력단
Priority date: 2006-06-23
Filing date: 2007-06-25
Publication date: 2008-08-08
Also published as: KR20070122181A

Abstract

본 발명은 고추 역병 방제에 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔을 이용한 미생물 제제 개발에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 길항 미생물인 트라이코델마 하르지아눔과 이를 이용한 상업용 미생물제제 제조공정을 개발하여 고추 역병을 생물학적 방제하는 방제제로서 사용하고자 하며, 우수한 방제 효과가 있다.

트라이코델마 하르지아눔, 미생물 제제, 길항 미생물, 고추

Description

고추 작물을 위한 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔을 이용한 미생물 제제{A composition for biological control of pepper blight caused by Capsicum annuum L. using Trichoderma harzianum having antagonistic activity}

도 1은 본 발명의 미생물제제 DYMC를 보여주는 사진도이다.

도 2는 은박지로 포장한 DYMC를 실온에 12개월 동안 보관하면서 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 밀도를 경시적으로 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 3은 처리방법과 농도 따른 실내와 온실에서 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) DYMC의 활성 조사 결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 길항미생물제제인 DYMC를 포트에 처리한 다음 50일 후 고추 역병 발생 양상을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 고추 역병 방제를 위한 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔을 이용한 미생물 제제에 관한 것으로 더욱 상세하게는 길항 미생물인 트라이코델마 하르지아눔을 이용하여 고추 역병을 생물학적으로 방제하기 위한 개발제제로서 효 과가 뛰어난 미생물 제제와 미생물 제제의 제조방법에 관한 것이다.

고추(Capsicum annuum L.) 재배는 대부분의 농가에서 연작을 함으로서 토양전염병원인 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capcisi)에 의한 역병(Phytophthora blight) 피해가 심각하다. 이 병원균은 토양 속에서 장기간 생존하면서 발병을 하기 때문에 방제에 많은 어려움이 따르고 있다(Hwang, B. K. and Kim, C. H (1995) Phytophthora blight of pepper and its control in Korea, Plant Dis. 79, 221-227). 이와 같은 역병의 방제를 위해서는 화학적 방제와 미생물을 이용한 생물학적 방제가 알려져 있다(Cook, R. J (1990) Twenty-five years of progress towards biological control. Pl-4. In D. Hornby(ed.), Biological control of soil-borne plant pathogens, CAB Internaional, Wallingford, UK; Handelsman J. and Stabb, E. V (1996) Biocontrol of soilborn plant pathogens, Plant Cell. 8, 1855-1869). 일반적으로 화학 방제는 미생물농약에 비해 방제비가 적게 들며, 경제적인 방제를 할 수 있으나, 고추 역병은 그 해 기후 조건에 따라서 화학적인 방제의 효과가 경제수준 이하로 떨어지는가 하면, 과다 사용에 의한 토양 오염 등의 환경적인 문제와 인축에 대한 독성 문제가 대두되면서 길항미생물을 이용한 방제가 제기되어왔다.

길항미생물에 의한 생물적 방제 기작은 자연 생태계 내에서 서로 다른 두 종간에 일어날 수 있는 경쟁, 중복 기생, 포식작용, 항생물질생산 및 효소생산 등을 인위적으로 증대시켜 이용하는 것으로서, 1970년대 토양 내 미생물들의 상호작용에 의해 억제토양이 생긴다는 것이 보고된 이후부터 종합적 방제법의 일환으로 활발히 수행되어 방선균, 세균 및 균류에 속하는 길항미생물들이 생물적 방제를 위한 미생물로서의 효과가 부각됨으로써 여러 나라에서 꾸준한 연구가 수행돼 왔다(Elad, Y,. Kapat, A (1999) The role of Trichoderma harzianum protease in the biocontrol of Botrytis cinerea, Eur . J. Plant Pathol. 105(2), 177-189; Howell, C.R., Hanson, L.E., Stipanovic, R.D., and Puckhaber, L.S (2000) Induction of terpenoid synthesis in cotton roots and control of Rhizoctonia solani by seed treatment with Trichoderma virens, Phytopathology 90(3), 248-252; Yedidia, I., Benhamou, N., Chet, I (1999) Induction of defense responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum, Appl . Environ. Microbiol. 65(3), 1061-1070; Conway, K. E., Mereddy, R., Kahn, B. A., Wu, Y., and Hallgren, S. W (2001)　Beneficial effects of solid matrix chemo-priming in okra. Plant Dis. 85, 535-537; Dandurand, L-M., Mosher, R.D., and Knudsen, G.R (2000) Combined effects of Brassica napus seed meal and Trichoderma harzianum on two soilborne plant pathogens. Can. J. Microbiol ./Rev. Can. Microbiol. 46(11), 1051-1057; Dik, A., Elad, Y (1999) Comparison of antagonists of Botrytis cinerea in greenhouse-grown cucumber and tomato under different climatic conditions , Eur. J. Plant Pathol . 105(2), 123-137; Dik, A.J, Koning, G, and Koehl, J (1999) Evaluation of microbial antagonists for biological control of Botrytis cinerea stem infection in cucumber and tomato, Eur . J. Plant Pathol, 105(2), 115-122; Ahn, S. J. and Hwang, B. K (1992) Isolation of antibiotic-producing actinomycetes antagonistic to Phytophthora capsici from pepper-growing soils, Korean J. Mycol . 20, 259-268).

미생물농약의 개발을 위해 다각도로 연구되는 대표적인 진균류인 트라코델마(Trichoderma) 속은 곰팡이 균류의 세포벽의 구성 성분인 다당류(polysaccharides), 키틴(chitin)과 글루칸(glucans)을 분해시키는 효소작용, 중복기생, 항생물질생산 및 경쟁 등의 기작(Lo C.T., Nelson E. B. and Harman G. E (1997). Improved biocontrol efficacy of Trichoderma harzianum 1295-22 for foliar phases of turf diseases by use of spray applications. Plant Dis. 81,1132-1138)때문에 식물병원균 억제에 매우 효과적인 곰팡이로 밝혀진 이후, 트라이코델마(Trichoderma)속을 이용한 작물병원균에 대한 생물학적방제에 관한 연구는 활발히 수행되어 왔으며(Elad, Y,. Kapat, A (1999) The role of Trichoderma harzianum protease in the biocontrol of Botrytis cinerea, Eur . J. Plant Pathol. 105(2), 177-189; Yedidia, I., Benhamou, N., Chet, I (1999) Induction of defense responses in cucumber plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent Trichoderma harzianum, Appl . Environ. Microbiol. 65(3), 1061-1070; Conway, K. E., Mereddy, R., Kahn, B. A., Wu, Y., and Hallgren, S. W (2001)　Beneficial effects of solid matrix chemo-priming in okra. Plant Dis. 85, 535-537; Dik, A., Elad, Y (1999) Comparison of antagonists of Botrytis cinerea in greenhouse-grown cucumber and tomato under different climatic conditions , Eur . J. Plant Pathol . 105(2), 123-137; 이인경, 김창진, 김신덕, 유익동 (1990) Streptomyces parvullus菌株가 生産하는 抗고추역병抗生物質, 韓國應用微生物學會誌. 18, 142-147), 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) T-39를 제형화 한 트리코덱스(TRICHODEX)는 현재 미국에서는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)에 의한 잿빛곰팡이병을 방제하는 미생물농약으로서 사용되고 있다. 우리나라에도 고추 역병에 대한 생물적 방제에 관한 연구는 1980년대 중반 이후부터 슈도모나스(Pseudomonas) 속과 바실러스(Basillus) 속을 이용한 연구가 활발히 수행되었다(Hong, S. S., Park, K. S., Kim, C. H. and Lee, E. J (1990) Granule formulation of Pseudomonas cepacia antagonistic to Phytophthora capsici and its viability on red-pepper, Korean J. Plant Pathol . 6, 434-439; 황병국, 김은수 (1992) 非病源性 Phytophthora capsici菌株에 의한 고추疫病의 抑制, 韓國植物病理學會誌 8, 1-7; Jee, H. J., Nam, C. G. and Kim, C. H (1988) Studies on biological control of Phytophthora blight of red pepper Ⅰ. Isolation of antagonists and evaluation of antagonistic activity in vitro and in greenhouse, Korean J. Plant Pathol. 4, 305-312; Kim, B. S. and Hwang, B. K (1992) Isolation of antibiotic-producing bacteria antagonistic to Phytophthora capsici from pepper growing soils and evaluation of their antibiotic activity, Korean J. Plant Pathol. 8, 241-248; Kim, C. H., Kim, K. D., and Jee, H. J (1991), Enhanced suppression of red-pepper Phyphthora blight by combined applications of antagonist and fungicide, Korean J. Plant Pathol . 7, 221-225; 이인경, 김창진, 김신덕, 유익동 (1990) Streptomyces parvullus菌株가 生産하는 抗고추역병抗生物質, 韓國應用微生物學會誌. 18, 142-147; Nam, C. G., Jee, H. J. and Kim, C. H (1988), Studies on biological control of Phytophthora blight of red-pepper Ⅱ. Enhancement of antagonistic activity by soil amendment with organic materials, Korean J. Plant Pathol . 5, 1-12; Park, H. H. and Kim, H. K (1989) Biological control of Phytophthora crown and root rot of greenhouse pepper with Thichoderma harzianum and Enterbacter agglomerans by improved method of application, Korean J. Plant Pathol. 5, 1-12; Park, K. S., Hagiwara, H. and Kim, C. H (1993) Isolation of an antibiotic substance from Pseudomonas cepacia antagonistic to Phytophthora capsici, Korean J. Plant Pathol . 9, 1-6; 박창석(1989). 미생물에 의한 연작지 염류장해 경감연구, 농시논문집101-108; Harman, G. E., Chet, I. and Baker R (1980) Trichoderma hamatum effects on seedling disease induced in radish and pea by Pythium spp. or Rhizoctonia solani , Phytopathology. 70, 1167-1172).

본 발명은 고추 역병의 생물학적 방제 방법을 확립하기 위하여 길항 균주(T. harzianum)를 이용하여 상업적인 제품화를 위한 제품인 DYMC을 개발하고, 제품에 대한 균의 밀도변화를 평가하기 위해 실온과 토양에서 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 밀도를 조사하고, 고추역병방제 효과와 고추 생육 효과를 온실 시험을 통하여 검정함으로써 완성하였다.

본 발명은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로 길항 미생물인 트라이코델마 하르지아눔을 이용하여 고추 역병 방제에 효과가 있는 제형으로 개발하여 생물학적 방제 효과가 뛰어난 미생물 제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

본 발명은 고추 역병 방제를 위한 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔을 이용한 미생물 제제를 제공한다.

본 발명은 고추 작물에 발병이 심한 역병을 생물학적으로 방제하기 위한 길항 미생물 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)을 상업적으로 이용하기 위해 냉동보관중인 균을 감자 덱스트로즈 배지에서 20~28℃에서 48~96시간 동안 1차 배양 후, 상기 배양체를 2차 영양 배양체인 제오라이트 등의 배양체에 접종하여 20~28℃에서 5~10일간 2차 배양 동안 포자를 최대로 형성시킨 후 35 ~ 40℃에서 수분함량이 약 25 ~ 30%에 달할 때까지 7 ~ 10일 동안 건조하여 파우다 형태로 생산하기 위해 분쇄기에서 마쇄하여 제조됨을 특징으로 한다.

본 발명은 고추에 발병이 심한 역병을 생물학적으로 방제하기 위해 길항 미생물인 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)을 감자 덱스트로즈 배지에 전분과 무기영양소를 첨가하여 26~28℃에서 48~96시간 동안 1차 배양하여 얻은 배양액(A)와, 고추역병의 생물학적 방제를 위해 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 PDB(potato dextrose broth)배지에 옥수수 전분, 무기영양소 등을 함유한 액체 배지에 접종하여 26~28℃에서 24~36시간 동안 배양하여 얻은 1차 세균 배양액(B)을 각각 250ml를 준비하여 2차 배양체 (1kg 기준; 제오라이트 100g-200g, 하이트 카본 100g-400g, 수산화고토 100g-300g, 규조토 100g-400g, 탈크 50g-400g, 옥수수 전분 50g-200g, 포도당 50g-200g, KH2PO4 50g-50g, EDTA 철 5g-50g, 황산아연 1-10g 및 잔량의 물)에 접종하여 교반기에서 잘 교반한 반죽 상태의 배양체를 제조하는 단계;

물기가 빠지는 광목천 같은 망사천 위에 상기 단계의 배양체를 두께가 1-2cm가 되게 분주하여 편편하게 편 다음 27~28℃의 배양실에서 5~7일간 2차 배양하는 단계;

상기 단계의 배양 후 배양체 표면에 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 균사가 하얗게 피면, 엽 십자 모양으로 배양체 표면 위에서 바닥까지 1-3cm 간격으로 선을 그은 후, 균사에서 녹색의 포자가 최대로 형성할 때까지 5-7일간 습도를 유지한 채로 계속 배양하는 단계;

상기 단계의 배양 후 트라이코델마 하르지아눔의 포자형성이 최대로 되면 온도를 36 ~ 40℃로 유지하면서 환풍기로 배양실의 수분을 제거하여 배양체의 수분이 약 25 ~ 30%에 달할 때까지 5 ~ 7일 동안 건조하는 단계; 및

상기 건조 후 굳은 배양체를 분쇄기를 이용하여 마쇄함으로써 분상용 미생물 제제로 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 내생포자도 최대로 형성되는 제조방법이다.

본 발명에서 사용하는 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 곰팡이 균과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세균 균주는 상기 제조방법으로 제조가 가능한 균주로 서로 분리하거나 함께 배양이 잘되므로 혼합형태의 미생물제제로 제조가 가능하다. 본 발명에서 사용한 구체적인 균주 분리 방법은 다음과 같다. 먼저, 트라코텔마 하르지아눔(T. harzianum) 곰팡이 균과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 토양으로부터 분리하기 위해서 상온의 실험실에서 건조하여 2mm 채로 통과한 토양 5g을 50ml의 살균수에 넣고 진탕한 후, 상등액을 희석하여 각각의 선택배지에서 균을 선발하여 순수배양한 후 종명을 동정한 후 고추역병균을 대상으로 실내에서 대치배양을 거쳐서 우수한 길항효과가 있는 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 곰팡이 균 5종과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 3종을 선발하여 재차 종명을 동정하고 그 중에서도 가장 우수한 길항효과가 있는 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 곰팡이 균 1종과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 1종을 최종 선발하여 재차 종명을 동정하였다.

그 결과, 트라이코델마 하리지아눔(Trichoderma harzianum)은 트라이코델마 하리지아눔(Trichoderma harzianum) KCTC 6043과 동일한 균주로 판명되었으며, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC 1396과 같은 균주로 확인되었다.

그러나, 본 발명에서 사용하는 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 상기 제조방법으로 제조 가능한 것은 물론 상기 속에 속하는 균주이면 어느 것이나 사용 가능하며 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)으로는 KCTC 6426, KCTC 6385 등, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 KCTC 1325, KCTC 1327, KCTC 1333, KCTC 1334, KCTC 1396 등 종래 기 탁균주를 입수하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 대해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 식물재료 및 포트(pot) 토양 준비

본 발명에서 사용한 고추 품종은 거성 (㈜ 흥농)이며, 상토를 사용한 50공의 플러그 용기에 파종하여 온실에서 6 ~ 7엽기까지 육묘한 고추 묘를 온실 시험에 사용하였다. 온실시험에 사용한 포트의 흙은 매년 역병이 발생하는 대구대학교 부설농장 포장의 토양을 사용하였으며, 포트의 크기는 16×16×13 ㎝ 이었다. 시험기간 동안 온실의 주간 온도는 25 ~ 30℃, 야간에는 18 ~ 20℃를 유지하였다.

실시예 2: 고추 역병균의 포자 생산

접종원으로 사용되는 역병균(Phytophthora capsici)의 유주자낭 (zoospoangia)를 생산하기 위해서 V-8 주스 한천 배지 (V-8 juice 200 mL, CaCO₃ 2.0 g, Agar 20 g, D.W. 800 mL)에 보관 균주로부터 배양한 균사를 접종하여 28℃ 배양기에서 5일간 배양 한 후, 도말봉으로 배지 표면에 기중 균사를 밀어준 후 60W의 cool white 형광등 아래에서 24시간 배양하여 포자를 형성시켰다. 형성된 유주자낭은 멸균 생리식염수 5 ml를 넣은 후에 붓을 이용하여 회수하였다.

실시예 3: 길항미생물의 제형화

2000-2001년 경북도내 24개 지역에서 선발하여 동정된 결과 트라이코데마 하르지아눔(T. harzianum) KCTC 6043 균주로 확인된 길항곰팡이균인 트라이코데마 하르지아눔(T. harzianum)을 상업화를 목적으로 다음과 같은 과정을 거쳐 제형화 하였다.

먼저, 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 곰팡이 균과 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 세균(KCTC 1396)은 각각, 감자 덱스트로즈 배지(potato dextrose broth; PDB)에 옥수수전분, 포도당, 이인산가리 및 미량요소를 첨가한 배지에 원균을 접종하여 27℃ 미생물 배양기에서 곰팡이균은 72시간, 세균은 24시간 동안 각각 다른 배양조에서 배양하여 배양액을 얻었다. 이후 상업용 제형으로 제조하기 위한 2차 미생물 배양체 조성물인 하기 표 1과 같은 조성을 가진 배양체에 상기 미생물 배양액(세균과 곰팡이 각각)을 동량으로 접종하여 하기와 같이 배양 후 미생물제제로 제조하였다. 즉, 표 1의 조성물에 접종한 배양체를 27-28℃에서 5-7일간 2차 배양하여 균사가 하얗게 배양체 표면에 피면 엽 십자로 표면에서 바닥까지 1cm-3cm 간격으로 선을 그어 균사에 상처를 주었다. 그러면 2-3일 후부터 균사가지에서 수많은 녹색의 포자가 형성되는데 상기 녹색 포자가 최대로 형성될 때까지 5-7일간 더 배양한 다음 온도를 약 35℃ 전후로 조절한 다음 팬으로 수분을 제거하여 제제의 수분함량이 25%에 달할 때까지 7 ~ 10일 동안 건조시킨 다음 분쇄기에서 마쇄하여 포장하였다.

미생물 제제 제조용 조성물

원료명	투입비율
미생물(T. harzianum) 배양액	200g
미생물(Bacillus subtilis) 배양액	200g
규조토	200g
제오라이트	100g
탈크	50g
수산화고토	50g
화이트카본	50g
KH₂PO₄	15g
EDTA Fe	5g
ZnSO₄	5g
옥수수 전분	50g
포도당	50g
설탕	25g

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상기와 같이 제조한, 길항미생물제제인 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 제제(표1 조성물)를 이용하여 상업용 엽면시비와 관주가 가능한 수화제를 가칭 DYMC(Deagu Yongse Microbe Compounds)라 명명하였다(도 1). 은박지로 포장한 DYMC를 실온에 12개월 동안 보관하면서 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 밀도를 경시적으로 조사한 결과, 균의 밀도의 감소가 통계적인 유의 차이는 없을 정도로 유지되었다 (도 2).

길항균 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)을 이용한 DYMC의 생산은 1차 배양한 배양체를 점토 광물에 혼합하여 2차 배양을 하는 기간에 많은 포자를 형성시키는 것이 중요하다. 이들 포자는 제품 유통 중 장기간 길항균의 활력을 유지할 수 있을 뿐만 아니라 제품의 효과와 밀접한 관련이 있다. 일반적으로 미생물 제품은 길항 미생물의 특성에 따라 제형을 고상, 액상 및 분상으로 제형화 할 수 있으나, 유통기간이 긴 제형으로 개발하거나, 사용 편리성이 좋은 제형으로 개발하는 것을 우선적으로 검토되는 사항이다.

본 발명에서 개발한 분상 형태인 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) DYMC의 균 활성 밀도는 생산 직후 조사에서 1.9 × 10⁹ CFU / g 이었으며, 경시적으로 점차 균의 밀도가 낮아지는 경향은 보였다 (도 2). 1년간 실온에 보관한 샘플을 3개월 단위로 조사한 결과, 균의 밀도가 여전히 높은 0.9 × 10⁹ CFU / g 을 유지함으로써 상업용 제품으로서 안정성이 보장될 수 있는 것으로 조사되었다. 현행 비료법의 규정에 의하면 미생물제제의 유통기간이 1년인 점을 감안하면 유통 상품으로서 문제가 없는 것으로 생각된다.

실시예 4: 실내와 온실에서 트라이코델마 하르지아눔 ( T. harzianum ) DYMC 의 활성 조사

길항미생물 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)(KCTC 6043)을 이용하여 상업용으로 개발한 수화제 형태인 DYMC를 시중에 유통할 경우 포장 내 미생물의 생존 밀도변화를 조사하기 위해서 은박지로 밀봉 포장한 후 실온에 1년간 보관하면서 3개월 간격으로 DYMC의 길항균의 밀도 조사를 위해 각 포장당 1.0g씩 취하여 평판희석법에 의해 균의 밀도 (cfu / g)를 조사하였다. 온실 시험에서, 포트 토양에 트라이코델마속(Trichoderma spp.) 활성을 조사하기 위해 DYMC를 포트 상층 토양과 잘 혼합하여 처리하거나, 물에 희석한 현탁액을 포트 토양에 관주 하였다. 토양과 혼합처리로는 포트의 상층 토양 500 g과 DYMC 2.5 g 및 5 g을 각각 잘 혼합하여 포트 윗부분에 채워 두었으며, 관주 처리는 100 ml 물에 DYMC 2.5 g과 5 g을 각각 희석하여 현탁액을 만든 후 포트에 관주 하였다. 접종 후 건조를 방지하기 위하여 3일 간격으로 물을 주었다. 미생물의 활성 조사는 처리 후 5일부터 하였으며, 조사를 위한 토양 채취는 코르크 보러(직경 25 ㎜)를 사용하여 표면으로부터 3 ~ 4cm 깊이의 포트 토양을 약 10 g 채취하여 테트라시클린(tetracycline)이 25 ㎍/㎖ 첨가된 PDA 배지에서 평판희석법에 의해 조사하였으며, 5반복으로 수행하였다.

상업용 제형인 DYMC를 포트 토양과 혼합 처리와 현탁액으로 처리 한 후 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 밀도를 경시적으로 조사하여 ANOVA (분산분석) 분석을 한 결과는 하기 표 2과 같았다. 처리방법, 처리농도 및 경시적인 조사일수에서 통계적으로 중요한 유의 차이를 보였다(R² = 0.76, F = 10.5960, P = < .0001). 처리방법과 조사일수에 대한 상호작용은 나타나지 않았다.

처리방법과 농도에 대한 결과는 도 3과 같았다. DYMC를 포트 토양과 혼용하여 처리한 구에서 균의 밀도는 동일 량의 DYMC를 물에 희석하여 현탁액으로 처리한 구보다 높게 나타났으며, 동일한 처리 방법에서는 처리 농도가 높은 처리구에서 균의 밀도가 높게 나타났다. 포트당 DYMC를 5g 처리한 후 5일째인 6월 8일에 조사한 결과, 토양과 혼용 처리한 구의 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 밀도는 5.4 × 10⁵ cfu / g soil 이었고, 동일 양으로 물에 희석하여 현탁액으로 처리한 구에서는 4.2 × 10⁵ cfu / g soil로 나타났다.

토양 병에 대한 길항 미생물의 효과는 처리한 길항 미생물이 얼마나 토양에 잘 정착하고, 정착한 미생물이 얼마나 오랫동안 활력을 유지하느냐가 생물학적 방제의 성패를 좌우한다. 본 시험에서도 길항 미생물이 정착은 처리 후 약 25일 이상이 소요된 것으로 보이며 그 이후로는 일정기간 동안 균의 밀도 변화가 크게 변하지 않은 것을 볼 수 있었다. DYMC의 사용적인 측면을 보면, 토양에 직접적으로 사용하는 것이 효과가 우수하다. 미생물 제제를 사용 전에 물에 희석하여 현탁액 상태로 처리하였을 때 토양 혼용 처리구보다 길항균의 활착이 떨어지는 이유는 구체적으로 설명하기는 힘들지만, 토양에 정착 시 과다 수분에 의한 균의 활력저하나, 활착 기간 동안의 토양 표면의 온도 변화 등에 영향을 받지 않았는가 추측한다. Lo(Lo C.T., Nelson E. B. and Harman G. E (1997). Improved biocontrol efficacy of Trichoderma harzianum 1295-22 for foliar phases of turf diseases by use of spray applications. Plant Dis. 81,1132-1138)에 의하면 잔디 병 방제를 위한 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 1295-22를 그래뉼(granule) 형태로 사용하는 것이 포자 현탁액을 사용하는 것보다 토양에서 균의 밀도가 높다고 하였다. 김(Kim) 등은 길항력이 있는 트라이코델마 하마툼(T. hamatum), 트라이코델마 비라이드(T. viride) 등의 포트에 포자 현탁액을 직접처리 한 후 토양 근권 내에 길항균의 점유율 관찰한 결과, 토양 깊이 1 ~ 3 cm 범위에서 균의 점유율이 크게 높았으며, 4 cm 이하에서는 현저하게 감소하였다고 한다. 본시험의 결과도 김(Kim) 등과 유사한 시험 결과를 보임으로써 사용 방법에 따라 효과가 다르다는 것을 입증할 수 있었다.

상업용 제형인 DYMC를 포트 토양과 혼합 처리와 현탁액으로 처리한 후 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 밀도를 경시적으로 조사하여 ANOVA (분산분석) 분석을 한 결과

구분	df	F value	P>F
처리 타입	3	46.2055	<.0001
기간(Duration)	5	25.5180	<.0001
반복(Replication)	4	0.4106	0.8006
처리(Treatment) x기간( Duration)	15	1.2102	0.2742

실시예 5: 온실에서 고추 역병균 방제 및 고추 생육에 미치는 효과 조사

고추 역병에 대한 DYMC의 효과는 온실 포트에서 50일 동안 조사하였다. 본 시험에 사용된 약 6 ~ 7엽기의 고추 묘 (거성 품종)는 3월 25일에 정식하였다. DYMC 처리는 정식 바로 전에 하였으며, 처리 방법은 다음과 같았다. 토양과 혼합 처리는 포트 토양 상층 500 g과 DYMC 5 g과 2.5 g을 각각 잘 혼합한 후에 고추 묘를 정식하였으며, 정식 시에 물을 충분히 주었다. 현탁액의 처리는 고추 묘를 포트에 정식한 후 물을 충분히 준 후 1 시간 후에 동일량의 DYMC를 물 100ml에 희석한 현탁액을 포트 토양 위에 관주처리 하였다. DYMC 처리 시간은 길항균의 정착을 돕기 위하여 늦은 오후에 실시하였다. 균의 정착을 위해 온실의 온도는 20 ~ 28℃로 유지하였다. 역병의 발생을 높이기 위해 역병균을 인위 접종을 하였으며, 병원균의 접종은 DYMC 처리 7일 후 고추가 정상적으로 생육하는 것을 확인한 후 유주자낭 현탁액 (1 X 10⁵ zoosporangia / ㎖)을 이용하여 pot당 100 ㎖씩 관주 접종하였다.

고추 생육에 미치는 DYMC의 효과를 조사하기 위해서도 위와 같은 방법으로 DYMC를 포트에 처리하였다. 모든 처리구는 DYMC를 처리 후 토양에 균의 정착을 돕기 위해 3일 후부터 매일 오전 같은 시간에 스프레이형 스프링쿨러 장치를 이용하여 물을 주었다. 모든 시험은 5반복으로 1회 수행하였으며, 1반복 당 포트 수는 10개로 하였다.

역병 발생 억제 효과

길항미생물제제인 DYMC를 포트에 처리한 후 경시적으로 병 발생 양상을 조사하여 ANOVA 분석을 한 결과는 하기 표 3과 같았다. 처리 방법과 경시적 병 발생 율에서 통계적인 유의차이를 보였다 (R² = 0.82, F = 16.4758, P = < .0001). 처리방법과 경시적인 발병율에 대한 상호작용은 나타나지 않았다. 고추 역병의 발생은 병원균을 접종 후 15일부터 나타나기 시작하였다(도 4). DYMC 처리 50일에는 처리 구의 발병율이 무처리구의 발병율보다 현저하게 낮았다. 처리구별로는 DYMC 5g을 포트 상층 토양과 혼용 처리한 구에서 발병율이 28%로 가장 낮았으며, 무처리구의 발병율 (72%) 대비 62.5%의 병 방제 효과를 보임으로서, 처리구 중 역병 발생 억제 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 그러나 같은 량의 DYMC 5g을 물에 희석하여 현탁액으로 포트에 관주 처리한 구의 발병율은 32% (병 방제가: 55.5%)로 병 방생 억제 효과가 낮은 것으로 조사되었다. DYMC의 사용량을 반 량으로 줄여 포트당 2.5g을 처리한 시험구에서 발병율은 36 ~ 40%로 (방제가 50 ~ 45.5%) 병 발생 억제 효과가 현저히 낮은 것으로 조사되었다.

길항균인 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 포자와 균사로 제형화 한 DYMC는 처리방법에 따라 역병 발생 억제 효과에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 이는 미생물제제를 토양에 사용 후 토양에 정착하는 길항균의 능력에 따라 토양 병의 방제에 대한 성패가 좌우될 것으로 본다면, 처리방법이 처리 농도 못지않게 중요하다는 것을 본 실험을 통해서 알 수 있었다.

본 실험에서 길항미생물을 물에 희석하여 현탁액으로 사용시 효과가 낮은 요인으로는 현탁액을 토양에 관수 하듯이 토양 표면에 처리함으로써 길항균의 포자나 균사가 토양 내 정착에 문제가 있는 것으로 생각된다. 즉, 포자가 골고루 토양에 접종이 되지 못하고 한곳으로 몰리는 현상도 있을 수 있으며, 또한 대부분의 포자가 토양 표면에 머물게 됨으로써 토양 내부로 정착하는 과정에서 포자 발아에 환경적인 제한 요인이나 병원균과의 경쟁, 직접적인 공격, 라이징(lysing)과 하이퍼파라사이타이즈(hyperparasitize)(Lo C.T., Nelson E. B. and Harman G. E (1997). Improved biocontrol efficacy of Trichoderma harzianum 1295-22 for foliar phases of turf diseases by use of spray applications. Plant Dis. 81,1132-1138)를 통하여 밀도가 감소하는 등의 요인으로 인하여 병원균인 역병균의 밀도를 줄이지 못함으로써 방제효과가 떨어지는 것으로 생각된다. Lo 등에 의하면 잔디 병 방제를 위한 길항미생물 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 1295-22를 과립 형태로 토양에 사용한 결과 포자 현탁액을 사용하는 것보다 방제 효과가 높았다고 하며, 달러 스팟(dollar spot), 뿌리썩음병(Pythium root rot), 갈색 반점(brown patch) 등 여러 잔디 병을 동시에 방제하려면 과립 시비와 포자현탁액 시비를 겸하는 것도 좋다고 하였다.

사용량에 따른 발병억제 효과에서도 고 농도의 처리 방법과 동일한 처리 방법으로 처리 시에도 병 발생 억제율이 낮은 것으로 조사되었는데, 이는 방제 대상 병원균에 따라 차이를 보일 수도 있으나, 길항 미생물을 일정량 이상 사용함으로써 병 발생을 줄일 수 있다는 것은 예비 시험을 통하여 알 수 있었다. 자연적으로 토양병원균이 감염된 토양에서 트라이코델마속(Trichoderma spp.)의 포자 발아는 7% 미만이라고 하였으며, 트라이코델마(Trichoderma) 정균 현상도 관찰되었다고 하였다. 1973년 이후 트라이코델마(Trichoderma) 속은 포장이나 온실에서 작물의 병을 방제하는 효과적인 생물학적 방제제로서 알려진 이후, 이들 곰팡이는 길항균으로서 병원균 곰팡이에 대하여 직접적으로 공격을 하거나, 용균과 중복기생의 능력을 가진다고 하였으며, 특히 트라이코델마 하마툼(T. hamatum) Tr-5는 피티움속(Pythium spp.)과 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대하여 중복기생균으로 작용한다고 하였다(Harman, G. E., Chet, I. and Baker R (1980) Trichoderma hamatum effects on seedling disease induced in radish and pea by Pythium spp. or Rhizoctonia solani , Phytopathology. 70, 1167-1172).

비록 온실 시험에 한정한 결과지만, 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) DYMC 5g을 토양에 사용하였을 때 62%의 병 방제가를 보인 것은 추후 보다 다양한 포장시험을 수행하게 하는 동기가 되었다. 포장시험에서도 온실과 유사한 결과를 얻을 수만 있다면, 현행 미생물농약에서 규정한 무처리농약에 대한 방제가가 50%인 점을 감안하면 미생물 농약으로서 개발 가능성을 보여주는 결과라고 보여졌다.

길항미생물제제인 DYMC를 포트에 처리한 후 경시적으로 병 발생 양상을 조사하여 ANOVA 분석을 한 결과

구분	df	F value	P>F
처리 타입(Treatment type)	4	66.0046	<.0001
연구 일수(Days of investigation)	6	24.7353	<.0001
반복(Replication)	4	1.4414	0.2237
처리(Treatment) x 연구 일수(Days of investigation)	15	1.8973	0.0691

고추 생육 효과

DYMC가 고추생육에 미치는 영향을 조사 분석한 결과, 줄기 크기에서만 P = 0.05에서 통계적인 유의차이를 보였다(표 4). 초장, 뿌리의 생물중과 포기 당 달린 고추 수는 0.5% 수준에서 유의 차이를 보였으나, 뿌리 건물 중에는 전혀 영향이 미치지 않은 것으로 나타났다.

Pot 정식 후 60일에 고추에 대한 지상부의 생장 량 과 지하부의 생장 량은 DYMC 처리구가 무처리구에 비해 약간 증가하는 경향을 보여줌으로써 길항균의 효과를 추후에 보다 다양하게 조사할 필요성을 인식하였다. 그러나 장기간 pot시험에서 길항균이 고추 생장에 미치는 효과를 조사하는 과정에서 환경적인 제약 요인이 크다는 것을 알게 되었다. 우선 온도나 습도에 대한 변화가 너무 크다는 것을 본 시험을 통해 알 수 있었으며, 이들 영향이 길항균이 정착 후 활동에 많은 제약이 되었으리라 생각된다. 그 이유로는 초기 생육은 육안 관찰을 통해 초장 등에서 차이를 보였으나 시간이 갈수록 차이가 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 잔디에서도 여러 병을 방제하기 위하여 분상으로 사용한 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum) 1295-22는 잔디병 방제 효과뿐만이 아니라 잔디의 생육도 좋았다고 보고한(Lo C.T., Nelson E. B. and Harman G. E (1997). Improved biocontrol efficacy of Trichoderma harzianum 1295-22 for foliar phases of turf diseases by use of spray applications. Plant Dis. 81,1132-1138) 점 등을 미루어 보아 추후 생장효과에 미치는 영향에 대해 통제된 환경 조건에서 보다 면밀한 조사가 필요하리라 생각되어졌다.

DYMC가 고추생육에 미치는 영향을 조사 분석한 결과

	대조구	DYMC g / soil 2 kg pot		DYMC 현탁액 100ml / soil 2 kg pot
	대조구	2.5 g	5 g	2.5 g	5 g	F	P>F
길이(Hight)	15.1±0.7	16.1±0.9	17.7±1.2	16.3±1.0	16.9±1.4	1.4059	0.169
줄기(Stem)	0.77±0.06	0.86±0.03	0.88±0.05	0.83±0.10	0.85±0.08	3.3443	0.0188
생물 중량(Fresh weight)	27.6±4.2	29.2±6.3	31.5±4.2	28.2±4.3	30.5±6.5	1.7918	0.1495
건물 중량(dry weight)	5.5±0.9	5.7±1.6	5.9±1.2	5.6±1.4	5.9±1.4	1.1267	0.5678
열매 수(No. of Fruit)	10.8±1.3	11.7±1.6	12.2±1.9	11.2±0.7	11..8±1.2	1.1174	0.3619

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 고추 작물의 역병을 방제하기 위한 길항 미생물인 트라이코델마 하르지아눔을 이용하여 제조한 미생물 제제는 현재 문제가 되는 고추 역병 방제용 상업용 미생물제제로 사용 시 고추역병 방제를 환경친화적으로 방제할 수 있는 미생물이므로 안전한 농작물생산을 위한 생물농약 개발에도 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)을 감자 덱스트로즈 배지에 옥수수 전분, 포도당, 무기영양소를 첨가한 후 배지에서 접종하여 26~28℃ 미생물배양기에서 48~96시간 동안 1차 배양하여 얻은 배양액(A)와, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 상기와 동일한 배지에서 배양하여 얻은 배양액(B)을 각각 250ml를 사용하여 제오라이트 100g-200g, 하이트 카본 100g-400g, 수산화고토 100g-300g, 규조토 100g-400g, 탈크 50g-400g, 옥수수 전분 50g-200g, 포도당 50g-200g, KH₂PO₄ 50g-50g, EDTA 철 5g-50g, 황산아연 1-10g 및 잔량의 물로 구성되는 1kg의 2차 배지에 접종하여 반죽 상태의 배양체를 제조하는 단계;

물기가 빠지는 천 위에 상기 단계의 배양체를 두께가 1-2cm가 되게 분주하여 편편하게 편 다음 20~28℃의 배양실에서 5~7일간 2차 배양하는 단계;

상기 단계의 배양 후 배양체 표면에 트라이코델마 하르지아눔(T. harzianum)의 균사가 하얗게 피면, 균사 위를 엽 십자 모양으로 배양체 표면 위에서 바닥까지 1-3cm 간격으로 선을 그어 포자형성을 촉진시켜 녹색의 곰팡이 포자가 최대로 형성될 때까지 3-7일간 습도를 유지한 채로 계속 배양하는 단계;

상기 단계의 배양 후 포자형성이 최대로 되면 온도를 35 ~ 40℃로 유지하면서 환풍기로 배양실의 수분을 제거하면서 건조시켜 배양체의 수분이 25 ~ 30%에 달할 때까지 5 ~ 7일 동안 건조하는 단계; 및

상기 건조 후 굳은 배양체 덩이를 분쇄기를 이용하여 마쇄함으로써 분상용 미생물 제제로 제조하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 고추역병 방제용 미생물 제제의 제조방법.
제 1항 기재의 제조방법으로 제조된 고추역병 방제용 미생물 제제.