KR100574348B1

KR100574348B1 - 그리세오풀빈을 생산하는 자일라리아 속 ａｈ001 균주,이를 포함하는 식물병 방제용 제제 및 이를 이용하여식물병을 방제하는 방법

Info

Publication number: KR100574348B1
Application number: KR1020040044899A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 조광연; 최경자; 이선우; 장경수; 임희경; 이향범
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2004-06-17
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2006-04-27
Also published as: KR20050119800A

Abstract

본 발명은 식물병에 대해 길항적인 활성을 갖는 그리세오풀빈 (griseofulvin) 또는 이의 생산능을 갖는 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주를 포함하는 식물병 방제용 제제, 상기 미생물 제제를 이용하여 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법, 상기 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈(dichlorogriseofulvin)을 생산하는 신규한 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주, 상기 균주로부터 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈을 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 그리세오풀빈 및 이의 생산능을 갖는 자일라리아 속 AH001 균주는 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

그리세오풀빈을 생산하는 자일라리아 속 ＡＨ001 균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법{XYLARIA SP. AH001 STRAIN PRODUCING GRISEOFULVIN, FORMULATION FOR CONTROLLING PLANT DISEASES CONTAINING SAME AND METHOD FOR CONTROLLING PLANT DISEASES USING SAME}

도 1은 감자추출물-덱스트로스 한천배지에서 배양된 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주의 사진이다.

도 2는 자일라리아 속 AH001 균주의 핵 리보좀 5.8S rRNA 유전자의 염기서열의 분석을 통한 자일라리아 속 AH001 균주의 계통발생학적인 계보를 나타낸 것이다.

도 3은 자일라리아속 AH001 균주로부터 분리한 그리세오풀빈의 전자충돌 질량스펙트럼 분석결과이다.

도 4는 자일라리아속 AH001 균주로부터 분리한 디클로로그리세오풀빈의 전자충돌 질량스펙트럼 분석결과이다.

도 5는 자일라리아속 AH001 균주로부터 배지에 따른 그리세오풀빈의 생성 정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 식물병에 대해 길항적인 활성을 갖는 그리세오풀빈(griseofulvin) 또는 이의 생산능을 갖는 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주를 포함하는 식물병 방제용 제제, 상기 제제를 이용하여 식물병을 생물학적으로 방제하는 방법, 상기 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈(dichlorogriseofulvin)을 생산하는 신규한 자일라리아(Xylaria) 속 AH001 균주 및 상기 균주로부터 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈을 생산하는 방법에 관한 것이다.

그리세오풀빈은 곰팡이가 생산하는 대표적인 항균활성을 지닌 항생물질로서 특히 피부병원균에 대하여 널리 이용되고 있다. 또한 그리세오풀빈은 동물의약 및 식물병에 대하여 효과가 있으며, 식물병 중에는 특히 보트라이티스(Botrytis)속 균이 유발하는 식물병에 효과가 있다고 알려져 있다 (Yamaguchi, Modern selective fungicides-properties, applications, mechanisms of action, pp.415-429(1995)). 그리세오풀빈은 많은 종의 페니실리움(Penicillium)속 균들에 의하여 생산되며, 곰팡이 균사의 심한 왜화현상(stunting), 과도한 가지 생성(excessive branching), 비정상적인 비대(abnormal swelling) 및 균사의 비틀어짐(twisting of hyphae) 등을 유기한다. 이 항균물질은 많은 균사체 곰팡이의 생장을 억제하나 효모, 방선균 및 난균강(Oomycetes) 등에 속하는 균에는 효과가 없는 것으로 알려져 있다.

그리세오풀빈은 화학적으로 합성하여 제조할 수 있으나(Lednicer and Mitscher, 1977, The Organic Chemistry of Drug Synthesis, pp. 313-317), 관련된 중간 반응들이 너무 많아 실제로 상업적으로 이용하기에는 경제성이 낮은 관계로, 현재 그리세오풀빈의 상업적 생산은 페니실리움속 균주에 의한 발효를 통하여 이루어지고 있는 실정이다(Venkata Dasu and Panda, 1999, Bioprocess Engineering 21:489-495). 그리세오풀빈을 생산하는 것으로 알려진 균에는 페니실리움 그리세오풀빈(P. griseofulvin), 페니실리움 파튤륨(P. patulum), 페니실리움 유티캐(P. urticae), 페니실리움 나이그리칸스(P. nigricans), 페니실리움 스클레로티게눔(P. sclerotigenum)(Mantle et al., 1984, J. Gen. Microbiol. 130:1293-1298; Yoshihiro et al., 1978, Tennen Yuki Kagobutsu Toronkai Koen Yoshishu 21:152-158), 아스퍼질러스 버시콜로(Aspergillus versicolor)(David and Paul, 1976, Phytochemistry 15:1037-1039) 및 스트렙토마이세스 알보론거스(Streptomyces albolongus)(Terekhova et al., 1992, Antibiotiki I Khimioterapita 37:19-21) 등이 있다. 이들 중에서 주로 페니실리움속 균의 돌연변이를 통한 다량 생산균주 개발 및 발효공정 개발 등을 통하여 상업적으로 경제성이 있도록 그리세오풀빈을 생산하게 되었다. 따라서 저렴하게 그리세오풀빈을 생산하기 위하여 새로운 균주를 선발하는 것은 상업적으로나 학문적으로 매우 중요하다.

이에 본 발명자들은 식물 특히 나무로부터 분리한 식물내생곰팡이가 생성하는 신물질에 대한 연구를 진행하던 중 한 균주의 배양액이 각종 식물병원균에 대하여 높은 항균활성을 갖는다는 사실을 발견하였고, 이를 동정한 결과 항균물질은 그리세오풀빈으로 밝혀졌으며, 이를 생산하는 균주는 이제까지 그리세오풀빈의 생산 균주로서 보고된 바 없었던 자이라리아(Xylaria) 속 균주라는 사실을 발견하였다. 또한, 이 균주의 배양액이 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 의한 잿빛곰팡이병 이외에 다른 식물병인 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병 등 여러 가지 식물병에 대해 길항작용이 있다는 사실을 발견하였다.

본 발명의 목적은 그리세오풀빈 또는 이를 생산하는 자일라리아 속 균주를 포함하는 식물병 방제용 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈 생산능을 갖는 자일라리아 속 균주를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 하기 화학식 1의 그리세오풀빈, 이의 생산능을 갖는 자일라리아 속 AH001 균주(KCTC 10629BP) 또는 상기 균주로부터 유래된 물질을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 제제를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 상기 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 자일라리아 속 AH001 균주(KCTC 10629BP)로부터 그리세오풀빈 또는 하기 화학식 2의 디클로로그리세오풀빈을 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 분리한 균주는 잣나무 줄기로부터 분리된 것으로, 균주의 형태적 특성, 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2) 서열 분석결과 자일라리아 속 균주로서 확인되었는 바, 이를 자일라리아 속 AH001으로 명명하고 2004년 5월 10일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 제 KCTC 10629BP호로서 기탁하였다.

본 발명의 자일라리아 속 AH001 균주는 다음과 같은 형태학적 및 생화학적 특징을 갖는다.

즉, 자일라리아 속 AH001 균주는 감자추출물-덱스트로스 한천배지(potato dextrose agar) 상에서 노란색의 공중 균사를 많이 생성하며, 시간이 지나감에 따라 배지 뒷면의 색은 갈색을 나타내게 된다. 또한 감자한천배지에서 오랫동안 배양할 경우 수직으로 긴 방망이 모양의 자좌(stromata)를 생성한다. 균주의 정확한 동정을 위하여 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2)의 염기서열(서열번호: 1)을 분석한 결과 진뱅크(GeneBank)에 등록된 자일라리아 코누다메(Xylaria cornu-damae) AF163031과 90％이상의 유사성을 나타내었다.

이러한 특성을 갖는 자일라리아 속 AH001 균주로부터 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈을 생산할 수 있는데, 균주의 배양에는 감자추출물-덱스트로스 액체배지(potato dextrose broth; PD), 맥아추출물-펩톤-덱스트로스 액체배지(malt extract peptone dextrose broth; MPD), 맥아추출물-효모추출물 액체 배지(malt and yeast extract broth; MY), 글루코스-효모추출물-폴리펩톤 액체배지(YpSs broth; YpSs) 등 곰팡이의 배양을 위해 사용되는 통상의 배지들을 사용할 수 있으며, 특히 글루코스-효모추출물-폴리펩톤 배지가 바람직하다. 이들 배지 중 적합한 배지에 자일라리아 속 AH001 균주를 접종하고 3 내지 21 일, 바람직하게는 12 내지 18 일간 배양함으로써 다량의 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈을 생산할 수 있다.

상기 자일라리아 속 AH001 균주, 및 이로부터 분리된 그리세오풀빈은 벼 도 열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병에 대해 강한 길항작용을 나타낸다.

본 발명의 자일라리아 속 AH001 균주는 균주 자체, 또는 균주의 배양액, 추출물 또는 포자 단독으로 담체와 혼합하여 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 식물병 방제용 제제로서 사용할 수 있으며, 상기 담체로는 물, 화이트 카르본, 카올린 등을 사용할 수 있다.

제형화된 제제는 식물이 생장하고 있는 토양 또는 성장 중인 식물 표면에 처리함으로써 식물병에 의한 식물 성장의 억제 및 이로 인한 고사를 방제할 수 있다.

본 발명의 자일라리아 속 AH001 균주는 대상식물에 대해 10⁵ cells/㎖ 내지 10¹¹cells/㎖, 바람직하게는 10⁶cells/㎖ 내지 10⁸cells/㎖의 양으로 처리될 수 있으며, 상기 자일라리아 속 AH001 균주로부터 분리된 그리세오풀빈은 대상식물에 대해 100 ㎍/㎖ 내지 1000 ㎍/㎖, 바람직하게는 250 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 양으로 처리될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 자일라리아속 AH001 균주의 분리

국내에 자생하고 있는 전나무(Abies holophyiia)로부터 건강한 가지와 줄기 부위를 채집하고, 각각 1 ㎝ 정도의 크기로 자른 다음 96％ 에탄올에 1분, 3.25％ 차염화나트륨(NaOCl)에 3분간 침지시킨 후 다시 96％ 에탄올로 30초간 표면 살균하였다. 1차 표면 살균한 시료를 다시 알코올 램프를 이용하여 화염 살균한 다음 시료를 50 ㎎/ℓ 클로람페니콜(입수처: 미국 시그마사)이 첨가된 옥수수가루-맥아추출물-효모추출물 한천배지(cornmeal malt extract agar medium: 17.0 g 옥수수가루, 20.0 g 맥아추출물, 2.0 g 효모추출물, 1.0 ℓ증류수)에 치상하고, 25℃ 항온조건 하에서 균 분리를 실시하였다. 분리한 균들은 다시 감자한천배지(potato dextrose agar; 입수처: 미국 벡톤과 디킨슨사) 상에서 단 균사 분리를 실시하여 총 9개의 곰팡이를 분리하였다, 이들 균주의 장기 보관을 위하여 감자한천배지에서 7일간 배양한 균주의 선단부를 떼어내고 멸균 증류수에 넣은 다음 실온에 보관하거나, 또한 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO) 용액에 넣은 다음 -70℃에 보관하였다.

실시예 2: 분리한 균주들의 생체내( in vivo ) 항균활성 조사

상기 실시예 1에서 분리된 9개 균주들의 6가지 식물병에 대한 방제활성을 조사하기 위하여 다음과 같이 액체배양을 실시하였다. 멸균한 200 ㎖ 감자추출물-덱스트로스 액체배지(potato dextrose broth(PDB), 입수처: 미국 벡톤과 디킨슨사)에 감자추출물-덱스트로스 한천배지에서 배양된 균주의 선단부위를 코르크 절단기(cork borer, 지름 8 ㎜)로 떼어낸 다음 조각 4개씩을 접종하여 25℃, 150 rpm으로 10일간 진탕 배양하였다. 배양액을 10,000×g에서 15분간 원심 분리한 후 30 ㎖의 상층액에 트윈 20을 250 ㎍/㎖수준으로 첨가한 시료를 샘플로서 사용하였다 .

항균활성이 있는 균주를 선발하기 위해, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병의 식물병에 대하여 상기 9개 균주 배양 시료의 생체내 항균활성을 검정하였다. 벼(Oryza sativa), 토마토(Lycopersicon esculentum), 보리(Hordeum sativum) 및 밀(Triticum aestivum)을 지름 4.5 ㎝ 플라스틱 폿트에 원예용 상토 또는 수도용 상토를 70％ 정도 담고 온실(25±5℃)에서 1주에서 3주정도 키웠다.

벼 도열병은 2엽기 유묘에 벼 도열병균(Magnaporthe grisea; 입수처: 한국화학연구원) 포자현탁액 (5×10⁵포자/㎖)을 분무하여 접종한 후 25℃ 습실상에서 하루 동안 발병을 유도한 다음, 25℃ 항온실에서 5일간 두었다. 벼 잎집무늬마름병은 3엽기 유묘에 벼 잎집무늬마름병균(Thanatephorus cucumeris; 입수처: 한국화학연구원)이 7일 동안 배양된 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g, 증류수 100 ㎖)를 접종하고 25℃ 습실상에서 4일간 처리한 다음, 25℃ 항온실에서 4일간 배양하였다. 토마토 역병은 2엽기 토마토 유묘에 토마토 역병균(Phytophthora infestans; 입수처: 강릉대학교)의 유주자낭 현탁액(10⁵ 유주자낭/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무접종한 후 20℃ 습실상에서 발병을 유도하였다.

한편, 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 2엽기 유묘에 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea; 입수처: 한국화학연구원) 포자 현탁액(10⁶ 포자/㎖)을 처리한 후에 습실상 에서 발병시켰다. 밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물 기생균인 녹병균(Puccinia recondita; 입수처: 한국화학연구원)의 포자를 트윈 20 용액(250 ㎍/㎖)에 0.67 g 포자/ℓ 수준으로 현탁한 후 포자현탁액을 분무처리하여 하루동안 20℃ 습실상에서 발병을 유도한 후 항온실로 옮겨 배양하였다. 마지막으로 보리 흰가루병은 보리 유묘 1엽기에 숙주식물에서 계대 배양된 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei; 입수처: 한국화학연구원) 포자를 접종하고 20℃ 항온실에서 발병시켰다. 대조군으로는 1％의 DMSO를 혼합하고 있는 트윈 20 용액(250 ㎍/㎖) 30 ㎖을 사용하였다.

벼 도열병, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병은 7일 후에, 벼 잎집무늬마름병은 8일 후에, 그리고 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 각각 3일과 4일 후에 병반면적율을 조사하였다. 분리한 9개의 균주들 중에서 AH001이라 명명한 균주가 가장 강한 항균활성을 보였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

식물병	벼 도열병	벼 잎집무늬 마름병	토마토 잿빛 곰팡이병	토마토 역병	밀 붉은녹병	보리 흰가루병
방제가(％)	99	90	97	10	99	96
방제가(％) = (무처리 대조군 발병도 - 처리군 발병도) ÷무처리 대조군 발병도

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 자일라리아 속 AH001 균주는 6가지 식물병 중에서 토마토 역병을 제외한 나머지 5가지 식물병인 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 밀 붉은녹병 및 보리 흰가루병에 대하여 높은 방제활성 을 나타내었다.

실시예 3: 자일라리아 속 AH001 균주의 동정

실시예 1에서 분리한 9가지 균주 중 AH001 균주의 동정은 여러 가지 형태적 특징 조사 및 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2)의 염기서열 분석을 이용하여 수행하였다.

(1) 배양적 및 형태적 특징

감자한천배지에서 배양된 AH001 균주는 노란색의 균사를 가지며(도 1) 배지 뒷면의 색은 시간이 지남에 따라 갈색으로 변하였다. 배양시간이 지난 후 균체 위에서 수직으로 긴 방망이 모양의 자좌(stromata)가 생성되었다.

(2) 5.8S rRNA 유전자(ITS1-5.8S-ITS2) 염기서열 분석

균주의 정확한 동정을 위하여 AH001 균주를 셀로판지가 깔린 감자한천배지 위에 접종하여 25℃에서 4일간 배양한 후 균사체로부터 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA로부터 ITS4와 5'-프라이머(White et al., 1990, PCR protocols: a guide to methods and application, pp.315-322)를 이용하여 핵의 리보솜 DNA(nuclear rDNA)의 ITS1-5.8S-ITS2를 증폭한 후 순도를 점검한 다음 ABI3700 자동 DNA 염기서열 분석기(ABI3700 automated DNA sequencer, 입수처: 미국 어플라이드 바이오시스템사)를 이용하여 염기서열을 결정하였다. ITS1-5.8S-ITS2의 염기서열(서열번호: 1) 분 석 결과 진뱅크(GeneBank)의 자일라리아 코누다메(Xylaria cornu-damae) AF163031과 90％이상의 유사성을 보여 자일라리아속 균주로 동정되었다. 도 2는 자일라리아 속 AH001 균주의 핵리보좀 ITS1-5.8S-ITS2 염기서열의 분석을 통한 자일라리아 속 AH001 균주의 계통발생학적인 계보를 나타낸 것이다.

상기와 같이 동정된 자일라리아 속 균주 AH001은 한국생명공학연구원 유전자은행에 2004년 5월 10일자로 기탁번호 제 KCTC 10629BP호로 기탁하였다.

실시예 4: 항균물질의 분리 및 정제

14 ℓ 감자즙액배지에 감자한천배지에서 자라고 있는 균주의 선단부위를 코르크 절단기(지름 8 ㎜)로 떼어낸 다음 감자즙액배지 200 ㎖당 4개씩 접종하고 25℃, 150 rpm에서 10일간 진탕 배양하였다. 배양액을 10,000×g에서 15분간 원심 분리한 후 상층액만을 취하여 동량의 에틸아세테이트로 2회 추출한 다음 40℃에서 감압, 농축하였다. 물층과 에틸아세테이트 추출물의 상기 6가지 식물병에 대한 항균활성을 조사한 결과 에틸아세테이트 추출물이 항균활성을 나타내었다. 이에 따라, 에틸아세테이트 추출물로부터 활성물질을 분리하기 위하여 에틸아세테이트 추출물 10 ㎖을 용매[클로로포름:메탄올, 95:5 (v:v)]로 평형화된 실리카겔(70∼230 메쉬, 200 g; 입수처: 독일 머크사)이 충진된 컬럼(3.6×60 ㎝)을 이용하여 TLC(용매: 클로로포름:메탄올 용매(95:5, 9:1 및 10:1, v:v))를 수행하였다. 그 결과, 세 개의 분획 F1, F2 및 F3을 얻었으며, 이 분획을 500 ㎍/㎖ 농도로 생체내 항균활성을 조사한 결과 F2(600 mg) 분획에서 활성을 보였다. F2 분획의 물질이 단일 물질인지 확인하기 위하여 TLC(20×20 ㎝, 두께 0.25 ㎜, Kiesel gel 60 F254; 입수처: 머크사)에 분석시료를 점적하여 분석을 실시하였다. 그 결과, 클로로포름:메탄올(9:1, v:v) 용매를 이용하여 TLC 분석을 수행한 경우에는 단일물질로서 나타나는 한편, 헥산:에틸아세테이트:메탄올(60:40:1, v:v:v) 용매 비율로 하여 TLC 분석을 수행한 경우에는 2 가지 물질로 나타났다. 따라서, F2(600 ㎎) 분획을 분취용 TLC 플레이트(20×20 ㎝, 두께 0.5 ㎜, Kiesel gel 60 F254; 입수처: 머크사) 및 헥산:에틸아세테이트:메탄올(50:50:2, v:v:v) 용매를 이용하여 두 가지 물질을 순수 분리하였다. 그 결과, 비극성 물질과 극성 물질이 각각 40 ㎎과 350 ㎎씩 순수하게 분리되었다.

실시예 5: 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 구조 결정

상기 실시예 4에서 분리 정제된 두 활성물질을 질량분석기(JEOL JMS-DX303; 입수처:일본전자사)를 이용하여 질량분석을 실시한 결과, 두 물질의 분자량은 각각 352 Da(분자식 C₁₇H₁₇ClO₆) 및 318 Da(분자식 C₁₇H₁₈O ₆)로서 나타났으며, 이들을 전자 충돌 질량분석법(electron impact-Mass spectroscopy: EI-MS)으로 분석하여 그 결과를 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.

또한, 두 가지의 활성물질의 구조를 결정하기 위하여 각 20 mg을 완전 건조하여 0.5 ㎖의 CDCl₃에 녹인 후 5 mm NMR 튜브에 넣고 NMR 분석(Bruker-AMX 500(500 MHz))을 수행하였으며, ¹H-NMR은 500 MHz로, ¹³C-NMR은 125 MHz로 측정하였다. ¹H-¹³C COSY 스펙트럼을 통하여 탄소와 수소를 연결시키고, ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 통하여 탄소골격을 연결시킨 결과는 표 2에 나타내었다.

이에 따라 두 가지 물질은 각각 그리세오풀빈과 디클로로그리세오풀빈으로 결정되었으며, 두 물질의 구조식은 각각 화학식 1 및 2와 같다.

화학식 1

화학식 2

실시예 6: 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 시험관내( in vitro ) 항균활성 검증

상기 실시예 5에서 확인된 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 식물병에 대한 시험관내 항균활성을 측정하기 위해, 두 항균물질을 포함하고 있는 고체배지 상에서 벼 도열병균(Magnaporthe grisea; 입수처: 한국화학연구원), 푸자리움 시들음병균(Fusarium oxysporum; 입수처: 한국화학연구원), 고추 역병균(Phytophthora capsici; 입수처: 충남대학교), 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides; 입수처: 한국화학연구원), 토마토 역병균(Phytophthora infestans; 입수처: 강릉대학교), 사과 점무늬낙엽병균(Alternaria mali; 입수처: (주)경농), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea; 입수처: 한국화학연구원) 및 벼 잎집무늬마름병균(Corticium sasaki; 입수처: 한국화학연구원)의 8가지 식물병원균의 균사생육 정도를 조사하였다. 토마토 역병균과 고추 역병균은 V-8 쥬스한천배지를 이용하였고, 나머지 6가지 식물병원균은 감자한천배지를 이용하였다. 각각의 항균 배지를 멸균한 후 굳기 전에 DMSO에 용해한 항균물질을 배지에 가하여 물질을 최종농도가 200, 66.7, 22.2, 7.4, 2.5 및 0.82 ㎍/㎖이 되도록 하였다. 무처리군에는 DMSO 1％를 첨가하였다. 배지 한 가운데에 각 균의 균사조각을 치상한 후 토마토 역병균과 토마토 잿빛곰팡이병균은 20℃에서 배양하였고, 나머지 균들은 25℃에서 배양하였다. 2일 내지 6일 동안 배양 후 균사 생육 길이를 측정하여 50％ 균사 생육억제 농도를 결정하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.

식물병원균	50％ 균사 생육농도(㎍/㎖)
식물병원균	그리세오풀빈	디클로로그리세오풀빈
벼 도열병균	1.7	＞200
푸자리움 시들음병균	30	＞200
고추 역병균	＞200	＞200
토마토 역병균	＞200	＞200
고추 탄저병균	1.7	＞200
사과나무 점무늬낙엽병균	18	＞200
토마토 잿빛곰팡이병균	5.0	＞200
벼 잎집무늬마름병	11	＞200

상기 표 3에서 보듯이, 그리세오풀빈은 디클로로그리세오풀빈보다 전반적으로 항균활성이 훨씬 높은 것으로 나타났다. 그리세오풀빈의 경우 토마토 역병균이 나 고추 역병균과 같이 난균강(Oomycetes)에 속하는 식물병원진균들에는 항균활성이 거의 없는 반면에 다른 진균에 대해서는 높은 항균활성을 보였다. 특히 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides)과 벼 도열병균(Magnaporthe grisea)에 대해서는 50％ 균사생육억제농도가 1.7 ㎍/㎖이었으며, 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대해서는 5.0 ㎍/㎖로 나타났다.

실시예 7: 그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 생체내( in vivo ) 항균활성

그리세오풀빈 및 디클로로그리세오풀빈의 식물병에 대한 항균활성을 상기 실시예 2와 동일한 방법을 실시하여 관찰하고 그 결과를 표 4에 나타내었다.

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 디클로로그리세오풀빈을 150 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 벼 잎집무늬마름병에 대하여 70％, 보리 흰가루병에 대하여 93％의 방제효과를 나타내었으며, 저농도인 50 ㎍/㎖의 디클로로그리세오풀빈 처리 구에서는 50％ 이하의 대체로 낮은 활성을 보였다. 한편, 그리세오풀빈은 150 ㎍/㎖로 처리하였을 경우 토마토 역병을 제외한 모든 식물병에 대해 60％ 이상의 높은 방제효과를 보였으며, 낮은 농도(50 ㎍/㎖)로 처리한 경우에도 우수한 방제효과를 나타내었다. 특히 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 벼 잎집무늬마름병에 대해서는 매우 높은 활성을 보였다.

실시예 8: 배지 및 배양기간에 따른 자일라리아 속 AH001 균주의 활성물질 생성

자일라리아 속 AH001 균주가 생성하는 두 가지 항균물질의 최대 생성조건을 결정하기 위하여 배지의 종류와 배양기간을 달리하여 생산량을 조사하였다. 배지로는 감자즙액배지, 맥아추출물-펩톤-덱스트로스배지(MPD; 20 g 맥아추출물, 20 g 덱스트로스, 1 g 펩톤, 1.0 ℓ 증류수), 맥아와 효모추출물배지(MY; 3 g 맥아추출물, 0.5 g KH₂PO_4, 2 g 효모추출물, 0.5 g MgSO₄·7H₂O, 1.0 ℓ 증류수) 및 글루코스-효모추출물-폴리펩톤배지 (YpSs; 20 g 글루코스, 2 g 효모추출물, 5 g 폴리펩톤, 0.5 g MgSO₄, 1 g KH₂PO₄, 1.0 ℓ증류수)를 사용하였다. 각각의 배지 200 ㎖을 500 ㎖ 삼각플라스크에 넣은 다음 멸균 후 감자한천배지에서 배양된 균주의 선단부위를 코르크 절단기(지름 8 ㎜)로 떼어내어 조각 4개씩을 접종하였다. 25℃, 150 rpm에서 진탕 배양하면서 3일, 6일, 9일, 12일, 15일, 18일 및 21일째의 배양 액 2 ㎖씩을 각 바이알에 옮겼다. 동량의 에틸에테르로 2회 추출하고 질소가스로 건조시킨 후 0.5 ㎖의 에틸아세테이트로 재용해한 다음 가스크로마토그래프-질량분석기(gas chromatograph-mass spectrometer; 입수처: 일본 시마쯔사)를 이용하여 선택적 이온 모니토링(selected ion monitoring, SIM) 모드로 정량분석을 실시하였다. 컬럼은 Hicap CBP20-M25-025 모세관컬럼을 이용하였고, 주입기 온도와 인터페이스 온도는 각각 280℃ 및 250℃로 조절하였다. 컬럼온도는 초기 200℃에서 15분간 지속하다가 분당 8℃로 온도를 올린 후 최종온도 280℃에서 15분간 지속하였다. 그리세오풀빈의 목적 이온(target ion)은 m/z 352으로 하였으며, 디클로로그리세오풀빈의 목적 이온은 m/z 318으로 설정하였다.

그 결과, 사용된 4가지 배지 중 YpSs 배지에서 가장 많은 양의 디클로로그리세오풀빈과 그리세오풀빈이 생성되었다. 도 5는 그리세오풀빈의 4가지 배지에서의 배양시간에 따른 생성량을 나타내는 것으로 배양 15일째에 최대의 생성량(800 ㎍/㎖)을 나타내었다. 배양 6일째부터 생성하기 시작하여 9일째 되는 날은 급격히 많은 양의 대사산물이 생성됨을 알 수 있다. 한편, MPD 배지 및 감자즙액배지에서도 소량의 활성물질이 생산되었는데, 이들 배지에서는 YpSs 배지와는 달리 배양 기간이 21일을 경과하여도 생성량이 지속적으로 증가하는 것으로 나타났다. 디클로로그리세오풀빈도 이와 매우 유사한 양상으로 생성되었으며, YpSs배지에서 배양 15일째에 최대의 생성량(579 ㎍/㎖)을 나타내었다.

이상 살펴본 바와 같이, 그리세오풀빈 및 이의 생산능을 갖는 자일라리아속 AH001 균주는 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병과 같은 식물병에 대해 강한 길항작용을 나타내므로 이를 식물병 방제에 유용하게 이용할 수 있다.

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Claims

그리세오풀빈, 이의 생산능을 갖는 자일라리아속 AH001 (KCTC 10629BP) 균주 또는 이 균주로부터 유래된 물질을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 제제.
제 1 항에 있어서,

상기 그리세오풀빈이 자일라리아 (Xylaria) 속 AH001 (KCTC 10629BP) 균주로부터 생산된 것임을 특징으로 하는 제제.
제 1 항에 있어서,

상기 자일라리아 속 AH001 균주로부터 유래된 물질이 균주의 배양액, 추출물 또는 포자인 것을 특징으로 하는 제제.
제 1 항에 있어서,

식물병이 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병인 것을 특징으로 하는 제제.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 제제를 이용하여 식물병을 방제하는 방법.
제 5 항에 있어서,

식물병이 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병, 푸자리움 시들음병, 고추 탄저병 또는 사과나무 점무늬낙엽병인 것을 특징으로 하는 방법.
그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈 생산능을 갖는 자일라리아(Xylaria) 속 AH001(KCTC 10629BP) 균주.
자일라리아(Xylaria) 속 AH001(KCTC 10629BP) 균주를 배양하는 것을 포함하는 그리세오풀빈 또는 디클로로그리세오풀빈의 생산 방법.
제 8 항에 있어서,

자일라리아 속 AH001 균주를 감자추출물-덱스트로스 액체배지(potato dextrose broth; PD), 맥아추출물-펩톤-덱스트로스 액체배지(malt extract peptone dextrose broth; MPD), 맥아추출물-효모추출물 액체 배지(malt and yeast extract broth; MY) 또는 글루코스-효모추출물-폴리펩톤 액체배지(YpSs broth; YpSs)에서 3 내지 21 일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.