CN115433683B - 一株多型炭角菌TJJs-7及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株多型炭角菌(Xylaria sp.)TJJ s‑7及其应用，该菌株于2022年5月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:62488。本发明的多型炭角菌(Xylaria sp.)TJJ s‑7对青霉具有显著的抑制作用，对环境友好兼容、无污染无残留，可作为无公害新型青霉抑菌剂，用于食用菌栽培过程中无害化生产过程。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株多型炭角菌(Xylaria sp.)TJJ s-7及其应用。
背景技术
防治食用菌病害与其他农作物病害不同，由于食用菌子实体裸露在外，不受保护且吸收水分能力强，化学菌剂或农药很容易对子实体产生伤害以及残留对人体有害物质，因此现阶段有很多杀菌剂并没有被各国批准使用，食用菌病害的防治主要以预防为主，但是空气中存在很多可对食用菌造成污染的真菌，比如青霉，在袋料栽培过程中，由于其适应能力强、繁殖速度快、空气中孢子量较大的特点，可通过多种渠道对食用菌造成侵染并迅速传播。而对食用菌进行化学防治无论是对环境危害还是人体危害都比较大，因此生物防治对于食用菌栽培中的病害防治具有非常重要的意义。生物防治方法是对食用菌病害抑制并防治的有效的新途径，具有广阔的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种生物防治食用菌青霉浸染的问题。
本发明的技术方案为：一株多型炭角菌(Xylaria sp.)TJJ s-7，该菌株于2022年5月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:62488。
一种制剂，含有上述所述的多型炭角菌TJJ s-7或其代谢产物。
上述所述的多型炭角菌TJJ s-7或其代谢产物在防治青霉上的应用。
进一步地，所述应用是指多型炭角菌TJJ s-7或其代谢产物在防治食用菌栽培过程中被青霉浸染上的应用。
进一步地，所述食用菌为木耳、平菇或荷叶离褶伞。
进一步地，所述代谢产物为多型炭角菌TJJ s-7发酵液的醇提物。
进一步地，所述代谢产物为多型炭角菌TJJ s-7发酵液的大孔树脂吸附物的乙醇洗脱物。
进一步地，所述大孔树脂为X-5大孔树脂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的多型炭角菌(Xylaria sp.)TJJ s-7对青霉具有显著的抑制作用，对环境友好兼容、无污染无残留，可作为无公害新型青霉抑菌剂，用于食用菌栽培过程中无害化生产过程。
生物保藏：多型炭角菌(Xylaria sp.)TJJ s-7，该菌株于2022年5月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:62488，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1为不同菌株对青霉的抑菌实验；
图2为菌株TJJ s-7的系统发育树；
图3模拟栽培菌袋示意图；
图4菌剂稀释液喷洒位置对青霉抑制作用的示意图；a1、a2为菌液铺于菌料表面，b1、b2为菌液吸收于脱脂棉中；
图5菌剂稀释液对青霉抑制效果；a、b、c：生长一周的木耳菌丝(未有明显青霉污染、菌料表面喷洒1000μL菌剂)，d、e、f：生长一周的木耳菌丝(已有明显青霉污染、菌料表面喷洒1000μL无菌水)；
图6菌剂对木耳菌丝体发育的影响；a：生长3天的木耳菌丝(菌料表面喷洒1000μL无菌水)，b：生长3天的木耳菌丝(菌料表面喷洒1000μL菌剂)；
图7菌剂对荷叶离褶伞丝体发育的影响；a：菌剂处理下的平菇菌丝体，b：菌剂处理下的平菇菌丝体，c：封瓶膜
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
一、菌株分离与纯化
在红松阔叶林下，用水果刀取长、宽、高各为15cm的正方体土样，土壤标本编号为TZL-1。将整块土样(不要弄散)用锡纸整齐包好并在外层包上报纸防止水分蒸发及时带回实验室。
菌株分离：取土样，并在培养基中取5个位置将土样点上，用塑料封口膜将培养皿封口放于恒温培养箱中培养7d。菌株纯化：在生长出的菌落边缘挑取少量菌丝，接种在新PDA培养基上获得纯菌落，将分离的纯菌株保存在PDA斜面培养基上，冰箱保藏。
抑菌菌株的筛选：
1)制备发酵液：制作PD培养基，在500ml规格的锥形瓶中加入200ml PD培养液，高压灭菌备用。用直径为6mm的打孔器在长满待测菌株菌丝体的平板中打出菌饼，将菌饼接入PD培养基中，接种量为6个菌饼/瓶，在温度为25℃，转速为160r/min的摇培箱中培养7d。
2)制备青霉孢子悬浮液：用无菌水将PDA培养基上的青霉孢子洗脱，用两层纱布将洗脱后菌液中的菌丝体过滤，将过滤后的菌液用离心机以(1000r/min)的速度离心5min后倒去上清液，加入去离子水继续以(1000r/min)的速度离心5min后，(去离子水将孢子重悬浮)在100×的视野下约有200个孢子。
试验将无菌脱脂棉圆片浸入待测菌株发酵液，以放入无菌水中脱脂棉圆片为对照，浸泡2h。用移液枪吸取300μL青霉孢子悬浮液于PDA平板培养基中，用无菌涂布器涂匀。用无菌镊子夹取浸泡好的脱脂棉圆片于平板中央，30±1℃培养48h，每个菌株重复3次。记录数据、十字交叉法测量抑菌圈直径。
测试了分离得到的的三株菌株TJJ s-7、X-25和S-1，结果如图1所示，菌株TJJ s-7的抑菌效果最好。
二、菌株的形态学和生物学特征
菌株TJJ s-7的菌丝为白色，不产孢子。其在杂木屑培养基上生长量最大，日均生长量可达2.05cm菌丝状态也最旺盛和密集。最适温度为25℃，日均生长量为1.66cm。在pH4.5-9.2均能正常生长，在pH值为6.2时，菌丝的日均生长量最大为1.71cm。菌株生长的最佳碳源为葡萄糖，日均生长量为0.54cm，最佳氮源为蛋白胨，日均生长量为0.51cm。
三、菌株的鉴定
1)菌丝体收集
在超净工作台中，用接种针挑取保存于试管培养基中抑菌效果较好的菌株TJJ s-7菌丝，接种于PDA平板培养基中，用封口膜封口做好标记，放置在25℃恒温培养箱中避光培养7d。制作PD培养液，在500mL规格的锥形瓶中加入PD培养液200mL，高压灭菌备用。用直径为6mm的打孔器在平板培养基中打出菌饼，将菌饼接入PD培养液中，接种量为6个菌饼/瓶，在温度为25℃，转速为160r/min的摇培箱中培养15d，得到菌丝体。
2)菌株TJJ s-7 DNA提取
采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程上海股份有限公司)提取基因组DNA。将研钵消毒灭菌，在研钵中加入适量的石英砂同时加入约20mL95°的酒精，放置于空地中后用火柴点燃研钵内的酒精烧灼，晾凉后将其装入无菌菌袋中置于-20℃冰箱冷却备用。用四层纱布过滤摇培瓶中的菌丝体约100g，放入冷却后的研钵中并加入液氮充分研磨5-7次至菌丝体破壁肉眼观察为极细的细粉状(研磨期间液氮的加入不要中断)。将粉末迅速转移至1.5mL的无菌离心管中，并按照试剂盒中说明的操作步骤加入试剂，最终得到DNA溶液，做好标记放于-20℃冰箱内保存留以备用。
3)ITS序列的PCR扩增
rDNA-ITS序列扩增：选用真菌扩增的通用正向引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和反向引物ITS4(5'TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增。反应在25μL体系中进行，包括：1μLdNTPs(2.5mmol/L)，0.2μLTaq酶(5U/μL)，2.5μL10×PCR buffer，0.5μLprimer ITS1(10μmol/L)，0.5μL primer ITS4(10μmol/L)，0.5μL(约20mg/L)基因组DNA，加ddH2O至25μL。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃修复延伸10min，4℃下保存。反应结束后，用移液枪取扩增产物2μL，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。成功扩增后的PCR产物由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果用BLAST程序与NCBI中的核酸序列进行同源性分析比较，结合形态学鉴定来确定此菌株的种类和分类地位。
测得其ITS序列为：
GAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTAAAGAGTTTTATAACTCCCAAACCCATGTGAACATACCGTACGTTGCCTCGGCAGGCTGCATCTCCCTGTGAGGTCCTACCCTGTAGGATGTTACGCTGTAAGGCTTAGCGGGAAGATGCATTAAAGCCTGCCGGCGGCCCATTAAACTCTGTTTATTTTTGAATTCTGAGGCTATAATAAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCACTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCCCTGTTGCTTAGTGTTGGGAGCCTACGGTCAGCGTAGCTCCTCAAATGTAGTGGCGGAGTTGGTTCACACTCTAGACGTAGTAATTTTTATCTCGCCTGTGAGTTGGACCGGTCCCTCGCCGTAAAACCCCCAAAAATTTTAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATACCCTTAAGCCCCT。
4)rDNA-ITS序列分析
从菌株TJJ s-7中提取DNA基因，用真菌通用引物ITS1、ITS4进行PCR扩增，得到菌株TJJ s-7的rDNA-ITS序列，长度为614bp。将所测得的rDNA-ITS序列在NCBI的BLAST进行比对，菌株TJJ s-7与炭角菌属(Xylaria sp.)相比较覆盖度为100％、相似度为99％，确定菌株TJJ s-7为炭角菌(Xylaria sp.)，并在GenBank进行注册，得到菌株号为MK720179。并将菌株TJJ s-7与炭角菌属其它菌种ITS序列构建系统发育树，结果表明菌株TJJ s-7与炭角菌属(Xylaria sp.)在同一分支上，可信度为100(如图2)。
5)生物保藏：多型炭角菌(Xylaria sp.)TJJ s-7，该菌株于2022年5月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:62488，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例1：菌株TJJ s-7发酵液抑菌产物提取
1)制备发酵液：制作PD培养基，在500ml规格的锥形瓶中加入200ml PD培养液，高压灭菌备用。用直径为6mm的打孔器在长满菌株TJJ s-7菌丝体的平板中打出菌饼，将菌饼接入PD培养基中，接种量为6个菌饼/瓶，在温度为25℃，转速为160r/min的摇培箱中培养7d。
2)抑菌活性成分的富集：称取200g型号为X-5的大孔树脂装入锥形瓶中，加入200ml5％盐酸浸泡，放入120r/min的震荡培养箱中4h，用蒸馏水洗至pH值为7，加入200ml5％氢氧化钠溶液浸泡，然后再放入120r/min的震荡培养中4h，最后用蒸馏水洗至pH值为7后加入200mL无水乙醇浸泡24h，最后用蒸馏水洗至中性。将其缓慢的装入层析柱中(整个过程不要产生气泡)，加入2000mL过滤后的发酵液进行上样(流速为4mL/min)。上样完成后用100mL90％浓度的乙醇水溶液洗脱，旋转蒸发仪及真空压缩泵洗脱液加压浓缩成浸膏，定溶至3ml，得到菌株TJJ s-7发酵液抑菌产物(洗脱物)。
实施例2：菌株TJJ s-7发酵液抑菌产物(洗脱物)在木耳栽培中抑菌作用
1)配制孢子悬浮液：用无菌水将培养基上的青霉菌孢子洗脱，用两层纱布将洗脱后孢子悬浮液中的菌丝体过滤，将过滤后的孢子悬浮液用离心机以(1000r/min)的速度离心5min后倒去上清液，加入去离子水继续以(1000r/min)的速度离心5min，(去离子水将孢子重悬浮)在10×的视野下约有200个孢子，并加入0.5％葡萄糖溶液。
2)青霉防治装置模拟栽培中的菌袋(如图3)：选择封口膜，将封口膜中的滤纸取掉，用剪刀将脱脂棉剪成薄薄的一层且与封口膜中的滤纸同样大小，放入漏气孔中央留以备用，并沿着漏气孔将封口膜塑料层中央剪成1平方厘米的正方形孔。
选择50ml的加盖玻璃瓶(模拟栽培菌袋)，将栽培菌料混合搅拌均匀装入离心管中，用封口膜将离心管口盖住，再用盖子盖上。
3)洗脱物喷洒位置对青霉抑制作用:
试验用直径为3mm的打孔器在木耳培养基中打出菌饼，接入灭菌后的培养料中。用制作完成的脱脂棉封口膜将玻璃瓶口盖住(漏气孔放于中间)，a组:用移液枪吸取1000μL洗脱物均匀喷洒于菌料表面，b组:再用移液枪吸取相同量的菌剂在夹入脱脂棉的封口膜上端注入，让脱脂棉充分吸收稀释液。吸取200μL青霉孢子悬浮液均匀涂洒于封口膜的脱脂棉中，并将玻璃瓶的盖子盖好(不需要太紧)。
结果显示，a组洗脱物喷洒于菌料表面可以对青霉的生长具有较明显的抑制作用，而将洗脱物稀释液注射入脱脂棉时的抑制青霉生长的效果与a组相比明显较弱(如图4)。证明当洗脱物直接喷洒于菌料表面时，防治青霉的效果更佳，接下来的试验均选择将洗脱物均匀喷洒于菌料表面来测试其抑制青霉效果。
4)菌剂对青霉抑制效果：
培养料配比：木屑73％，玉米粉10％，麦麸10％，糖7％，磷酸二氢钾0.1％。培养温度：25℃。培养湿度：75％rh-80％rh。将1000μL洗脱物均匀喷洒于菌料上作为试验组，将1000μL的无菌水均匀喷洒于菌料上作为对照CK1。从图5中可以观察出与对照组相比，洗脱物的抑菌效果显著。(如图5)
5)洗脱物对木耳菌丝体发育的影响：
木耳培养料：木屑73％，玉米粉10％，麦麸10％，糖6.9％，磷酸二氢钾0.1％。培养温度：25℃。培养湿度：75％rh-80％rh。在发明装置中加入培养料灭菌后接入木耳菌饼，移液枪吸取1000μL洗脱物均匀喷洒于菌料中，以加入同样量的无菌水以同样的方式喷洒于玻璃瓶的菌料中作对照为CK2。根据图6中a、b对比可知，a、b两组玻璃瓶中生长3天的木耳菌丝体的几乎无发育差别(如图6)。
图7为将洗脱物分别喷洒于荷叶离褶伞及平菇菌料后，荷叶离褶伞与平菇的菌丝体发育良好，并未受菌剂的影响而阻碍其生长，因此，通过试验研究，我们认为栽培生产过程中此菌剂不会对食用菌菌丝体的生长发育形成阻碍。
说明栽培生产过程中洗脱物不会对木耳、平菇、荷叶离褶伞等食用菌菌丝体形成抑制作用。
Claims (5)
1.一株多型炭角菌（Xylaria polymorpha）TJJ s-7，该菌株于2022年5月20日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号 GDMCC No:62488。
2. 一种制剂，含有权利要求1所述的多型炭角菌（Xylaria polymorpha）TJJ s-7或其发酵液的X-5大孔树脂吸附物的90%浓度的乙醇水溶液洗脱物。
3. 权利要求1所述的多型炭角菌（Xylaria polymorpha）TJJ s-7或其发酵液的X-5大孔树脂吸附物的90%浓度的乙醇水溶液洗脱物在非疾病治疗目的的防治青霉上的应用。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用是指多型炭角菌（Xylaria polymorpha）TJJ s-7发酵液的X-5大孔树脂吸附物的90%浓度的乙醇水溶液洗脱物在防治食用菌栽培过程中被青霉浸染上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食用菌为木耳、平菇或荷叶离褶伞。
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