CN111304101B - 一种dse干菌剂及其在促进植物生长中的应用 - Google Patents

一种dse干菌剂及其在促进植物生长中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种DSE干菌剂及其在促进植物生长中的应用。DSE干菌剂的制备方法包括如下步骤：采用液体培养基培养针A2‑7(25‑28℃、150‑200r/min振荡培养6天)，得到菌液；收集所述菌液中的固体；20‑45℃干燥，得到DSE干菌剂。将DSE干菌剂接种于土壤，之后种植雅典娜紫花苜蓿种子，正常培养。结果表明，本发明提供的DSE干菌剂可以显著促进雅典娜紫花苜蓿鲜重增加，即促进雅典娜紫花苜蓿的生长。因此，本发明提供的DSE干菌剂不仅促进植物生长的效果良好，而且易于保存和运输，同时制备时间短(仅需6天)、成本低。本发明对于植物种植具有重大的应用推广价值，便与进行异地规模化应用。

Description

一种DSE干菌剂及其在促进植物生长中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DSE干菌剂及其在促进植物生长中的应用。
背景技术
深色有隔内生真菌(Dark Septate Endophytes，DSE)是一类可以与绝大多数植物根系形成互利共生关系的土壤真菌，其菌丝颜色较深，具有明显横隔。已有研究表明，DSE具有促进宿主植物吸收矿质营养、促进宿主植物对有机养分的吸收、提高宿主植物抗逆性和提高宿主抗病能力的生态功能，其在植物-微生物-土壤三位一体的生态系统中发挥着重作用。
目前，DSE菌剂主要通过将DSE菌块(固体培养获得)或DSE菌液(液体培养获得)接种至植物根部的方式实现。但DSE菌块和DSE菌液均不易于储存，也不适宜大批量运输。因此，DSE菌块和DSE菌液仅仅适用于实验室培养或小批量、就近施用，对于异地规模化应用则很不现实。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以促进植物生长且易于保存和/或运输的菌剂。
本发明首先保护一种DSE干菌剂，其制备方法可包括如下步骤：
(1)采用液体培养基培养针A2-7，得到菌液；培养的条件可为25-28℃(如25-26℃、26-27℃、27-28℃、25℃、26℃、27℃或28℃)、150-200r/min(如150-180r/min、180-200r/min、150r/min、180r/min或200r/min)振荡培养6天；
(2)收集所述菌液中的固体；
(3)干燥，得到DSE干菌剂。
所述步骤(1)中，针A2-7可以菌片或菌饼的形式加入。所述菌片或菌饼是将针A2-7接种在固体培养基(如PDA固体培养基)上，25-28℃(如25-26、26-27℃、27-28℃、25℃、26℃、27℃或28℃)培养7-10天(如7-8天、8-9天、9-10天、7天、8天、9天或10天)，然后在菌落边缘打孔获得的。所述菌片或菌饼的直径可为4-6mm(如4-5mm、5-6mm、4mm、5mm或6mm)。
所述步骤(1)中，菌片或菌饼与液体培养基的比例可为1个菌片或菌饼：(100-200mL)液体培养基，如“1个菌片或菌饼：(100-150mL)液体培养基”、“1个菌片或菌饼：(150-200mL)液体培养基”、“1个菌片或菌饼：100mL液体培养基”、“1个菌片或菌饼：150mL液体培养基”或“1个菌片或菌饼：200mL液体培养基”。
上述任一所述液体培养基可为液体MMN培养基。所述液体MMN培养基的制备方法可如下：将CaCl2 0.05g、MgSO4 0.15g、NaCl 0.025g、FeCl3 0.01g、KH2PO4 0.5g、Vitamin B1(硫胺素)0.0001g、(NH4)2HPO4 0.25g、葡萄糖10g、柠檬酸0.2g和Malt extract(麦芽提取物)10g混合，得到混合物，然后加入蒸馏水并定容至1L，分装，121℃高压灭菌30min。
所述步骤(2)中，收集菌液中的固体采用过滤或离心实现。所述过滤使用定性滤纸。所述定性滤纸可为中速定性滤纸，即孔径可为30～50微米(如30～40微米、40～50微米、30微米、40微米或50微米)的定性滤纸。
所述步骤(3)中，干燥的温度为20-45℃(如20-25℃、25-30℃、30-35℃、35-40℃、40-45℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃)。从节约角度来讲，干燥温度为20-25℃(如20-23℃、23-25℃、20℃、23℃或25℃)时，成本最低。
所述步骤(3)中，干燥可为自然风干或鼓风干燥。
所述DSE干菌剂的制备方法中，进行步骤(2)前和/或进行步骤(3)前，可加入载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物。所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种。所述植物材料可为麸皮、豆粕、玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种。所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水。所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
所述DSE干菌剂的制备方法中，进行步骤(2)前和/或进行步骤(3)前，根据需要，还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
上述任一所述DSE干菌剂的含水量可为1-5％(如1-2％、2-5％、1％、2％或5％)。
上述任一所述DSE干菌剂的用途可为促进植物生长。
上述任一所述DSE干菌剂易于保存和/或运输。
本发明还保护上述任一所述DSE干菌剂在促进植物生长中的应用。
本发明还保护一种促进植物生长的方法，可通过向植物施加上述任一所述DSE干菌剂实现。
上述方法中，所述“向植物施加DSE干菌剂”可为向植物根系施加DSE干菌剂。
上述方法中，所述“向植物施加DSE干菌剂”可为先接种上述任一所述DSE干菌剂，再播种植物种子。
上述任一所述针A2-7的全称为深色有隔内生真菌(Darksidea sp.)针A2-7，已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18811。
上述任一所述促进植物生长具体体现为促进植物鲜重增加。
上述任一所述植物可为a1)-a5)中的至少一种：a1)蝶形花亚科植物；a2)苜蓿属植物；a3)苜蓿；a4)紫花苜蓿；a5)雅典娜紫花苜蓿。
当植物为雅典娜紫花苜蓿时，DSE干菌剂的施加剂量具体可为每10粒雅典娜紫花苜蓿种子施加0.06g DSE干菌剂。
将本发明提供的DSE干菌剂(如针A2-7干菌剂c、针A2-7干菌剂2、针A2-7干菌剂d、针A2-7干菌剂e、针A2-7干菌剂f和针A2-7干菌剂g)接种于土壤，之后种植雅典娜紫花苜蓿种子，正常培养。结果表明，本发明提供的DSE干菌剂可以显著促进雅典娜紫花苜蓿鲜重增加，即促进雅典娜紫花苜蓿的生长。因此，本发明提供的DSE干菌剂不仅促进植物生长的效果良好，而且易于保存和运输，同时制备时间短(仅需6天)、成本低。本发明对于植物种植具有重大的应用推广价值，便与进行异地规模化应用。
附图说明
图1为针A2-7的在根系内的形态照片。
图2为针A2-8的在根系内的形态照片。
图3为接种针A2-7干菌剂1的紫花苜蓿根内菌丝和微菌核的形态。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：Darksidea sp.
生物材料的菌株编号：针A2-7
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年11月19日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18811
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：Pleosporales sp.
生物材料的菌株编号：针A2-8
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年11月19日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18812
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：Darksidea sp.
生物材料的菌株编号：针A2-1
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2019年4月8日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17465
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
液体MMN培养基(pH5.5)：将CaCl2 0.05g、MgSO4 0.15g、NaCl 0.025g、FeCl30.01g、KH2PO4 0.5g、Vitamin B1(硫胺素)0.0001g、(NH4)2HPO4 0.25g、葡萄糖10g、柠檬酸0.2g和Malt extract(麦芽提取物)10g混合，得到混合物，然后加入蒸馏水并定容至1L，分装，121℃高压灭菌30min，备用。
实施例1、菌株的获得和保藏
三个菌株(针A2-7、针A2-8、针A2-1)，均是发明人从内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市北电胜利矿区的针茅根系中分离纯化得到的菌株。
检测针A2-7的ITS序列，如SEQ ID No：1所示，鉴定为Darksidea sp.。针A2-7已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18811。深色有隔内生真菌的形态特征如下：菌丝在根系内呈深褐色，有明显的横隔。针A2-7在根系内的形态照片见图1。
检测针A2-8的ITS序列，如SEQ ID No：2所示，鉴定为格孢菌Pleosporales sp.。针A2-8已于2019年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18812。针A2-8的形态特征如下：具有典型的深色暗隔菌丝和由细胞壁膨大加厚的细胞紧密堆积形成的微菌核结构。针A2-8在根系内的形态照片见图2。
检测针A2-1的ITS序列，如SEQ ID No：3所示，鉴定为Darksidea sp.。针A2-1已于2019年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.17465。
实施例2、接种DSE湿菌剂和DSE干菌剂对紫花苜蓿侵染率和生长的影响
本实施例中自然风干的温度为25℃。
供试菌株分别为针A2-7、针A2-8和针A2-1。
紫花苜蓿品种具体为雅典娜紫花苜蓿。
一、针A2-7湿菌剂1—针A2-7湿菌剂4的制备
1、将活化的针A2-7接种于PDA固体培养基，28℃倒置培养7天；然后在菌落边缘打孔，得到直径为5mm的菌片。
2、完成步骤1后，将菌片接种至150mL液体MMN培养基，28℃、180r/min振荡培养4天，得到针A2-7菌液。
3、完成步骤2后，在无菌条件下用灭菌的定性滤纸(孔径为30～50微米，中速)过滤针A2-7菌液，收集定性滤纸上的固体。固体即为针A2-7湿菌剂1。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养6天，其它步骤均不变，得到针A2-7湿菌剂2。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养8天，其它步骤均不变，得到针A2-7湿菌剂3。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养10天，其它步骤均不变，得到针A2-7湿菌剂4。
二、针A2-7干菌剂1—针A2-7干菌剂5的制备
1、将活化的针A2-7接种于PDA固体培养基，28℃倒置培养7天；然后在菌落边缘打孔，得到直径为5mm的菌片。
2、完成步骤1后，将菌片接种至150mL液体MMN培养基，28℃、180r/min振荡培养4天，得到针A2-7菌液。
3、完成步骤2后，在无菌条件下用灭菌的定性滤纸(孔径为30～50微米，中速)过滤针A2-7菌液，收集定性滤纸上的固体。固体即为针A2-7湿菌剂a。
4、完成步骤3后，取针A2-7湿菌剂a，在无菌条件下自然风干，得到含水量为2％的针A2-7干菌剂1。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养6天，其它步骤均不变，得到针A2-7湿菌剂b，最后获得针A2-7干菌剂2。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养7天，其它步骤均不变，得到针A2-7湿菌剂c，最后获得针A2-7干菌剂3。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养8天，其它步骤均不变，得到针A2-7湿菌剂d，最后获得针A2-7干菌剂4。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养10天，其它步骤均不变，得到针A2-7湿菌剂e，最后获得针A2-7干菌剂5。
每3g针A2-7湿菌剂a可以制备获得0.06g针A2-7干菌剂1。
每3g针A2-7湿菌剂b可以制备获得0.06g针A2-7干菌剂2。
每3g针A2-7湿菌剂c可以制备获得0.06g针A2-7干菌剂3。
每3g针A2-7湿菌剂d可以制备获得0.06g针A2-7干菌剂4。
每3g针A2-7湿菌剂e可以制备获得0.06g针A2-7干菌剂5。
三、针A2-8干菌剂1—针A2-8干菌剂4的制备
1、将活化的针A2-8接种于PDA固体培养基，28℃倒置培养7天；然后在菌落边缘打孔，得到直径为5mm的菌片。
2、完成步骤1后，将菌片接种至150mL液体MMN培养基，28℃、180r/min振荡培养4天，得到针A2-8菌液。
3、完成步骤2后，在无菌条件下用灭菌的定性滤纸(孔径为30～50微米，中速)过滤针A2-8菌液，收集定性滤纸上的固体。固体即为针A2-8湿菌剂1。
4、完成步骤3后，取A2-8湿菌剂1，在无菌条件下自然风干，得到含水量为2％的针A2-8干菌剂1。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养6天，其它步骤均不变，得到针A2-8干菌剂2。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养8天，其它步骤均不变，得到针A2-8干菌剂3。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养10天，其它步骤均不变，得到针A2-8干菌剂4。
每3g A2-8湿菌剂1可以制备获得0.06g针A2-8干菌剂1。
每3g A2-8湿菌剂2可以制备获得0.06g针A2-8干菌剂2。
每3g A2-8湿菌剂3可以制备获得0.06g针A2-8干菌剂3。
每3g A2-8湿菌剂4可以制备获得0.06g针A2-8干菌剂4。
四、针A2-1湿菌剂1—针A2-1湿菌剂4的制备
1、将活化的针A2-1接种于PDA固体培养基，28℃倒置培养7天；然后在菌落边缘打孔，得到直径为5mm的菌片。
2、完成步骤1后，将菌片接种至150mL液体MMN培养基，28℃、180r/min振荡培养4天，得到针A2-1菌液。
3、完成步骤2后，在无菌条件下用灭菌的定性滤纸(孔径为30～50微米)过滤针A2-1菌液，收集定性滤纸上的固体。固体即为针A2-1湿菌剂1。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养6天，其它步骤均不变，得到针A2-1湿菌剂2。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养8天，其它步骤均不变，得到针A2-1湿菌剂3。
按照上述步骤，将振荡培养4天替换为振荡培养10天，其它步骤均不变，得到针A2-1湿菌剂4。
五、向紫花苜蓿接种DSE湿菌剂或DSE干菌剂
DSE湿菌剂分别为针A2-7湿菌剂1—4和针A2-1湿菌剂1—4。
DSE干菌剂分别为针A2-7干菌剂1—5和针A2-8干菌剂1—4。
培养基质：从北京市北沙滩收集沙土，过筛(目数为2mm)，然后121℃高温高压蒸汽灭菌2h，自然风干。
试验用盆：取一次性纸杯(规格为270mL)，先75％(v/v)酒精水溶液消毒，然后每个纸杯装入250g培养基质，之后浇水至培养基质持水量的70％。
1、选取大小相近，颗粒饱满的紫花苜蓿种子，用浓度10％的H2O2溶液浸泡10min(目的为消毒)，然后无菌水清洗5-6次，得到无菌紫花苜蓿种子。
2、完成步骤1后，取无菌紫花苜蓿种子，设置18个组，每组三个重复，共54个试验用盆。每组进行处理分别如下：
第一组：取试验用盆，用无菌铁匙在培养基质上挖出孔穴；然后用无菌镊子将3g针A2-7湿菌剂1接种穴内，覆少许沙土；之后将无菌紫花苜蓿种子接种培养基质，覆土。
第二组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为3g针A2-7湿菌剂2，其它均不变。
第三组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为3g针A2-7湿菌剂3，其它均不变。
第四组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为3g针A2-7湿菌剂4，其它均不变。
第五组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-7干菌剂1，其它均不变。
第六组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-7干菌剂2，其它均不变。
第七组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-7干菌剂3，其它均不变。
第八组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-7干菌剂4，其它均不变。
第九组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-7干菌剂5，其它均不变。
第十组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-8干菌剂1，其它均不变。
第十一组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-8干菌剂2，其它均不变。
第十二组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-8干菌剂3，其它均不变。
第十三组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为0.06g针A2-8干菌剂4，其它均不变。
第十四组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为3g针A2-1湿菌剂1，其它均不变。
第十五组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为3g针A2-1湿菌剂2，其它均不变。
第十六组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为3g针A2-1湿菌剂3，其它均不变。
第十七组：将第一组中3g针A2-7湿菌剂1替换为3g针A2-1湿菌剂4，其它均不变。
第十八组(空白对照组)：取试验用盆，用无菌铁匙在培养基质上挖出孔穴；然后将无菌紫花苜蓿种子接种培养基质，覆土。
各个试验用盆均匀接种10粒无菌紫花苜蓿种子。
各个试验用盆中DSE湿菌剂或DSE干菌剂的接种深度基本一致。
各个试验用盆中无菌紫花苜蓿种子的接种深度基本一致。
3、完成步骤2后，将54个试验用盆置于人工气候箱，23-25℃、光暗交替培养(16h光照/8h黑暗，光照培养时的光照强度为2000-3000lx)30天。培养期间，培养基质的持水量维持在60％-80％之间。
六、侵染情况
完成步骤五后，检测各个植株的DSE定殖率、菌丝定殖率和微菌核定殖率(定殖率又称为侵染率)，按组取平均值。
检测定殖率的方法：取植株的根，切成长度约为1cm的根段，每株植株随机取30个根段，采用酸性品红染色法进行处理，在显微镜下进行镜检，计算DSE总定殖率、DSE菌丝定殖率和微菌核定殖率(定殖率＝被定殖根段数/镜检总根段数×100％)。
统计结果见表1。
表1
Figure BDA0002455359130000091
Figure BDA0002455359130000101
接种针A2-7干菌剂1的紫花苜蓿根内菌丝和微菌核的形态见图3(A为菌丝，B为微菌核)。
结果表明，接种DSE湿菌剂和DSE干菌剂均建立了DSE-紫花苜蓿共生体系，DSE干菌剂的活性(即侵染率)比DSE湿菌剂有一定程度的提高或无显著差异(即DSE干菌剂的活性不低于DSE湿菌剂)；针A2-8虽然也是DSE菌，但制备成干菌剂的活性不如针A2-7。
七、对紫花苜蓿生长的影响
1、完成步骤五后，检测各个植株的鲜重，按组取平均值。
检测结果见表2。结果表明，与空白对照组相比，第六组、第七组和第八组处理的紫花苜蓿鲜重均显著增加且三组间无显著差异。
表2
Figure BDA0002455359130000102
Figure BDA0002455359130000111
2、以空白对照组(第十八组)处理的植株作为参比植株，计算第一组至第十七组的菌剂贡献率。对于鲜重来说，菌剂贡献率＝(各组处理后的植株的鲜重-参比植株的鲜重)/参比植株的鲜重×100％。
菌剂贡献率的结果见表3(3株植株的平均值)。
表3
接种的DSE湿菌剂或DSE干菌剂 对鲜重贡献率
第一组 3g针A2-7湿菌剂1 5.67％
第二组 3g针A2-7湿菌剂2 19.90％
第三组 3g针A2-7湿菌剂3 11.58％
第四组 3g针A2-7湿菌剂4 0.80％
第五组 0.06g针A2-7干菌剂1 25.94％
第六组 0.06g针A2-7干菌剂2 30.31％
第七组 0.06g针A2-7干菌剂3 35.37％
第八组 0.06g针A2-7干菌剂4 38.39％
第九组 0.06g针A2-7干菌剂5 -4.62％
第九组 0.06g针A2-8干菌剂1 3.51％
第十组 0.06g针A2-8干菌剂2 22.12％
第十一组 0.06g针A2-8干菌剂3 5.48％
第十二组 0.06g针A2-8干菌剂4 2.77％
第十三组 3g针A2-1湿菌剂1 9.74％
第十四组 3g针A2-1湿菌剂2 21.75％
第十五组 3g针A2-1湿菌剂3 12.82％
第十六组 3g针A2-1湿菌剂4 0.31％
第十七组 无 0.00％
结果表明，第六组、第七组和第八组对紫花苜蓿鲜重的贡献率明显高于其它各组。
由此可见，针A2-7干菌剂2、针A2-7干菌剂3和针A2-7干菌剂4不仅能够有效促进紫花苜蓿的生长，而且便于保存和运输。其中，针A2-7干菌剂2的制备时间最短；从节约角度(如时间、成本、精力)来讲，针A2-7干菌剂2为最佳促进植物生长的菌剂。
实施例3、干燥温度对针A2-7干菌剂促进紫花苜蓿的生长的影响
一、针A2-7干菌剂a—针A2-7干菌剂h的制备
按照实施例2步骤二中制备针A2-7干菌剂2的方法，将25℃自然风干分别替换为10℃自然风干、15℃自然风干、20℃自然风干、30℃自然风干、35℃鼓风干燥、40℃鼓风干燥、45℃鼓风干燥或50℃鼓风干燥，其它步骤均不变，依次得到含水量均为2％的针A2-7干菌剂a、针A2-7干菌剂b、针A2-7干菌剂c、针A2-7干菌剂d、针A2-7干菌剂e、针A2-7干菌剂f、针A2-7干菌剂g和针A2-7干菌剂h。
二、向紫花苜蓿接种针A2-7干菌剂a—针A2-7干菌剂h
按照实施例2中步骤五的方法，向紫花苜蓿分别接种针A2-7干菌剂a—针A2-7干菌剂h、针A2-7干菌剂2和水。
三、对紫花苜蓿生长的影响
1、完成步骤二后，检测各个植株的鲜重，按组取平均值。
检测结果见表4。结果表明，与空白对照组相比，针A2-7干菌剂c、针A2-7干菌剂2、针A2-7干菌剂d、针A2-7干菌剂e、针A2-7干菌剂f和针A2-7干菌剂g处理的紫花苜蓿鲜重均显著增加且之间无显著差异。
表4
接种的针A2-7干菌剂 鲜重(g)
针A2-7干菌剂a 0.1839±0.0374
针A2-7干菌剂b 0.1909±0.0285
针A2-7干菌剂c 0.2206±0.0147
针A2-7干菌剂2 0.2115±0.0120
针A2-7干菌剂d 0.2173±0.0238
针A2-7干菌剂e 0.2111±0.0156
针A2-7干菌剂f 0.2272±0.0108
针A2-7干菌剂g 0.2143±0.0217
针A2-7干菌剂h 0.1880±0.0131
无(即空白对照组) 0.1623±0.0119
2、以空白对照组处理的植株作为参比植株，计算其它各组的菌剂贡献率。对于鲜重来说，菌剂贡献率＝(各组处理后的植株的鲜重-参比植株的鲜重)/参比植株的鲜重×100％。
菌剂贡献率的结果见表5(3株植株的平均值)。
表5
Figure BDA0002455359130000121
Figure BDA0002455359130000131
结果表明，针A2-7干菌剂c、针A2-7干菌剂2、针A2-7干菌剂d、针A2-7干菌剂e、针A2-7干菌剂f和针A2-7干菌剂g对紫花苜蓿鲜重的贡献率明显高于其它各组。
由此可见，干燥温度大于45℃或小于20℃制备的针A2-7干菌剂促进植物生长的效果不如干燥温度在20-45℃之间制备的针A2-7干菌剂。针A2-7干菌剂c、针A2-7干菌剂2、针A2-7干菌剂d、针A2-7干菌剂e、针A2-7干菌剂f和针A2-7干菌剂g不仅能够有效促进紫花苜蓿的生长，而且便于保存和运输。其中，针A2-7干菌剂c、针A2-7干菌剂2和针A2-7干菌剂d一般可以在自然条件下实现，自然条件不满足的话还可以通过装置(如鼓风机)实现；从节约角度(如能源；温度越高，耗费能源越多)来讲，针A2-7干菌剂c、针A2-7干菌剂2和针A2-7干菌剂d均为最佳促进植物生长的菌剂。
<110> 中国矿业大学（北京） 北京合生元生态环境工程技术有限公司
<120> 一种DSE干菌剂及其在促进植物生长中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 589
<212> DNA
<213> Darksidea sp.
<400> 1
cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tacctggcct tgggccgctc gcgggagcta 60
gtcgcttgcg acgacgctac cgagggcgct tagcccttga ctatcacctt gactacgtgc 120
accttttgtt gtttcctcgg caggtcacct gccgccagga accccctaaa ccttttgtaa 180
tagcatccaa acttctgaaa acaaaccaaa ttatttacaa cttttaacaa tggatctctt 240
ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag tagtgtgaat tgcagaattc 300
agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccatg gtattccgtg gggcatgcct 360
gttcgagcgt catttacccc ctcaagctcc gcttggtgtt gggcgtctgt cccgcttcgc 420
gcgcggactc gccccaaagg tattggcagc ggtcgtgcca gcttctcgcg cagcacattg 480
cgcttctcga ggcaccggcg ggcccgcgtc catcaagctc accccccagt ttgacctcgg 540
atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 589
<210> 2
<211> 593
<212> DNA
<213> Pleosporales sp.
<400> 2
cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tacctggcct tgggccgctc gggggagcca 60
gtcgctcgcg acggcgctgc cttgggcgct tagcccttga ctatcacctt gactacgtgc 120
accttttgtt gtttcctcgg caggtcctct gccgccagga accccctaaa cctttttgca 180
atagcatcca aacttctgaa aacaaaccaa atcatttaca acttttaaca atggatctct 240
tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgatat gtagtgtgaa ttgcagaatt 300
cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgccccat ggtattccgt ggggcatgcc 360
tgttcgagcg tcatttaccc cctcaagctc cgcttggtgt tgggcgtctg tcccgcttcg 420
cgcgcggact cgccccaaag gtattggcag cggtcatgcc agcttctcgc gcagcacatt 480
gcgcttctcg aggcaccggc gggcccgcgt ccatcaagct ctcacccccc cagtttgacc 540
tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag gaa 593
<210> 3
<211> 589
<212> DNA
<213> Darksidea sp.
<400> 3
cttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat tacctggcct tgggccgctc gcgggagcta 60
gtcgcttgcg acgacgctac cgagggcgct tagcccttga ctatcacctt gactacgtgc 120
accttttgtt gtttcctcgg caggtcacct gccgccagga accccctaaa ccttttgtaa 180
tagcatccaa acttctgaaa acaaaccaaa ttatttacaa cttttaacaa tggatctctt 240
ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag tagtgtgaat tgcagaattc 300
agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgccccatg gtattccgtg gggcatgcct 360
gttcgagcgt catttacccc ctcaagctcc gcttggtgtt gggcgtctgt cccgcttcgc 420
gcgcggactc gccccaaagg tattggcagc ggtcgtgcca gcttctcgcg cagcacattg 480
cgcttctcga ggcaccggcg ggcccgcgtc catcaagctc accccccagt ttgacctcgg 540
atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 589

Claims (9)

1.一种DSE干菌剂，其制备方法包括如下步骤：
（1）采用液体培养基培养深色有隔内生真菌Darksidea sp.针A2-7，得到菌液；深色有隔内生真菌Darksidea sp.针A2-7，其保藏编号为CGMCC No.18811；所述培养的条件为25-28℃、150-200r/min振荡培养6天；
（2）收集所述菌液中的固体；
（3）干燥，得到DSE干菌剂。
2.如权利要求1所述DSE干菌剂，其特征在于：所述步骤（1）中，液体培养基为液体MMN培养基。
3.如权利要求1所述DSE干菌剂，其特征在于：所述步骤（2）中，收集菌液中的固体采用过滤或离心实现。
4.如权利要求1所述DSE干菌剂，其特征在于：所述步骤（3）中，干燥的温度为20-45℃。
5.如权利要求1所述DSE干菌剂，其特征在于：所述DSE干菌剂的含水量为1-5%。
6.权利要求1至5任一所述DSE干菌剂在促进雅典娜紫花苜蓿生长中的应用。
7.一种促进雅典娜紫花苜蓿生长的方法，通过向雅典娜紫花苜蓿施加权利要求1至5任一所述DSE干菌剂实现。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述向雅典娜紫花苜蓿施加权利要求1至5任一所述DSE干菌剂为向雅典娜紫花苜蓿根系施加权利要求1至5任一所述DSE干菌剂。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述向雅典娜紫花苜蓿施加权利要求1至5任一所述DSE干菌剂为先接种权利要求1至5任一所述DSE干菌剂，再播种雅典娜紫花苜蓿种子。
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