CN112877237B - 一株武夷菌素高产菌株、发酵方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株武夷菌素高产菌株、发酵方法及应用。菌株的保藏号为CGMCC No.19060。该菌株的发酵方法，包括以下步骤：将菌株接种到培养基，发酵培养。该菌株可以用于制备武夷菌素，并且菌株的发酵液对多种致病菌具有很好的抑菌作用。本发明所述菌株具有生长快、产孢多、武夷菌素产量高、效价高且稳定等优点。

Description

一株武夷菌素高产菌株、发酵方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一株武夷菌素高产菌株、发酵 方法及应用。
背景技术
武夷菌素是一种具有我国完全自主知识产权的低毒、高效、广谱、环保 的新型农用抗生素(化学结构式如式1所示)，由不吸水链霉菌武夷变种发 酵生产，对蔬菜和果树等多种作物的真菌性病害具有明显的防治效果，在农 业生产中得到了广泛的应用，创造了可观的经济、社会和生态效益。但是目 前在生产中面临菌种退化、发酵效价低、生产成本高的问题，制约了武夷菌 素的产业化。
Figure BDA0002923054430000011
高产菌株选育通常采用物理诱变(紫外、γ-射线、激光等)、化学诱 变(亚硝基胍、乙烯亚胺、硫酸二乙酯等)和基因工程育种等。其中，由于 有些微生物对传统的物理诱变方法非常敏感，致死效应远大于诱变效应；化 学诱变剂大都有毒，而且很多又是致癌物，其残留物、挥发物或者蒸汽等均 会对操作者的身体和周围环境造成危害；基因工程育种需要较长的周期和较 高的费用。
在前期武夷菌素高产菌株的选育过程中，采用物理、化学和高能粒子注 入相结合技术选育出高产菌株F64，发酵液效价提高150-200％，但是选育过 程复杂、周期漫长，且涉及到60Coγ射线、化学诱变剂等，具有一定的危险性； 采用基因工程技术选育出高产菌株W273，发酵液效价提高了132-317％，但 是过程复杂、周期漫长、费用昂贵。另外，菌株在生产过程中一直面临退化 的问题，因此迫切需要一种新的简便、高效、环保、安全的方法选育高产菌 株。
常压室温等离子体(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP) 是近年来兴起的一种诱变育种新技术，是在常压下产生的具有高活性粒子的 等离子体射流，离子体射流的温度可以控制在25-40℃之间；ARTP可以对 生物胞内DNA物质造成显著损伤，并诱发细胞发生突变；与传统的诱变技术 相比较，ARTP诱变育种技术具有突变率高、突变位点丰富和操作简便安全等 优点，已经广泛用于细菌、放线菌、藻类、酵母、霉菌和大型真菌等领域。但是ARTP技术获得的突变菌株具有一定的随机性，并且突变后筛选工作量 大，突变随机性强，且容易产生回复突变、菌株不稳定等问题，因此，能否 获得正向突变的武夷菌素高产菌株也是未知的。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一株武夷菌素高产菌株、发酵 方法及应用。该菌株具有生长快、产孢多、武夷菌素产量高、效价高且稳定 等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一株武夷菌素高产菌株，保藏号为CGMCC No.19060。本发明 针对目前武夷菌素产生菌株退化、发酵效价低、生产成本高的问题，采用一 种新方法选育出一株武夷菌素高产菌株，在本发明实施例中将其命名为M28， 分类学名称为不吸水链霉菌武夷变种M28(英文名称:Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis strain M28)，该菌株已于2019年12月 02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.19060，保藏地址为：中国北京。
现有的武夷菌素高产菌株育种方法采用紫外诱变、60Coγ射线和亚硝基胍 诱变。由于武夷菌素产生菌对紫外线和60Coγ射线敏感导致其致死率远高于突 变率，亚硝基胍属于有毒化学物质，操作起来具有一定的危险性，且以上两 种方法在菌株改造的初期发挥了重要作用，但是随着处理次数的增加，微生 物逐渐产生了一定的耐受性，这些方法将很难再起到明显的作用；基因工程 育种的方法，虽然目前已经获得一株高产菌株W273，但是经过CK15菌株的 基因组测序和组装，基因簇分析，遗传转化体系构建，基因功能验证，突变 体筛选等工作，工作量大，周期长，费用高。
本发明通过ARTP技术随机诱变获得了武夷菌素高产菌株，具有生长快、 产孢多、武夷菌素产量高、效价高且稳定等优点。本发明中采用的ARTP技 术本身温度低、活性粒子浓度高且种类多样；放电形式多样，可以针对需求 制成各种不同形式的处理装置，如可以使用管状的放电，深入组织内部，或 者制成表面的处理装置；设备简单、操作简易、运行成本低廉；本身对环境 无污染和危害。总之，本发明具有效率高、操作简易、设备简单、环保安全 等优点，对于提高发酵液效价、降低生产成本加速其产业化步伐和推广应用 具有重要意义。
本发明提供一种武夷菌素高产菌株的发酵方法，将上述菌株接种到培养 基，发酵培养。
具体的，发酵培养的方法可以包括摇瓶发酵或发酵罐发酵。
例如：
武夷菌素高产菌株的发酵方法可以包括以下步骤：
(1)菌种培养：接种菌株M28到MS平板上，28℃培养7天，挑选生 长状态良好的平板，用8mL无菌水将孢子洗脱到15mL的无菌corning管 中；
(2)发酵培养：将上述菌株全部的洗脱孢子液接种到5L的发酵罐， 内有3L培养基，在温度28℃，转速220rpm，空气流量比1:0.45，罐压 0.09kg/cm2的条件下培养64h。
武夷菌素高产菌株的发酵方法也可以包括以下步骤：
(1)菌种培养：接种菌株M28到MS平板上，28℃培养7天，用60mL 无菌水将孢子洗脱到200mL的无菌三角瓶中；
(2)种子液培养：将上述孢子液分别接种到50L的发酵罐，内有30L 培养基，在温度28℃，转速200rpm，空气流量比1:0.5，罐压0.1kg/cm2的条件下培养24h，得到种子液；
培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，蔗糖260 g/L。
(3)发酵罐培养：将生长旺盛的的一级种子液转入到500L的发酵罐 中，内有300L发酵培养基，在温度28℃，转速200rpm，空气流量比1:0.55， 罐压0.12kg/cm2的条件下发酵60h，得到武夷菌素的发酵液。
上述菌株可以在制备抑制致病菌生长的药物中进行应用。进一步，所述 致病菌可以为植物病原真菌。例如：番茄灰霉菌，番茄叶霉菌，尖孢镰刀菌， 匍枝根霉，杨树水泡溃疡病菌，小麦根腐病菌，玉米小斑病菌，苹果轮纹病 菌，葡萄黑腐病菌，黄瓜炭疽病菌，烟草赤星病菌，玉米大斑病菌，稻瘟菌， 小麦纹枯病菌等。
上述菌株可以在制备武夷菌素中的应用。
本发明提供一种制备武夷菌素的方法，发酵上述菌株，获得含有武夷菌 素的发酵液。采用上述方法具有武夷菌素产量高、效价高且稳定等优点。
进一步，为了获得纯度更高的武夷菌素还可以包括分离和/或纯化步骤。
本发明提供一种菌剂，包括上述菌株和/或菌株的发酵液。
本发明提供一种生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：发酵上述菌株。
本发明还提供上述菌剂在抑制致病菌生长中的应用。
进一步，所述致病菌可以为植物病原真菌。例如：番茄灰霉菌，番茄叶 霉菌，尖孢镰刀菌，匍枝根霉，杨树水泡溃疡病菌，小麦根腐病菌，玉米小 斑病菌，苹果轮纹病菌，葡萄黑腐病菌，黄瓜炭疽病菌，烟草赤星病菌，玉 米大斑病菌，稻瘟菌，小麦纹枯病菌等。
附图说明
图1为实施例1中诱变致死率的统计结果图。
图2为实施例1中突变株的抑菌活性结果图。
图3为实施例1中验证菌株的遗传稳定性的结果图。
图4为实施例2中菌株CK15和M28的菌落形态图。
图5为实施例2中效价测定结果图，其中1为菌株M28，2为菌株CK15。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本 发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明针对目前武夷菌素产生菌株退化、发酵效价低、生产成本高的问 题，采用一种新方法选育出一株武夷菌素高产菌株M28，该菌株已于2019 年12月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏号为CGMCC No.19060。
同时，本发明提供了该菌株的发酵方法及应用。整个菌株选育过程不使 用有毒有害的化学试剂，具有清洁、环保、高效、低成本的特点。本发明对 于其它微生物发酵产品的高产菌株选育及应用也具有重要的借鉴意义。菌株 的获得包括以下步骤：
1、将不吸水链霉菌武夷变种CK15接种到直径9cm的MS平板中置于 28℃培养7天，然后用6-10mL无菌水洗脱孢子；
2、用血球计数板对孢子浓度进行计数，孢子液浓度大于107个/mL；
3、用移液器吸取8-10μL孢子液滴加到ARTP仪(无锡源清天木生 物科技有限公司ARTP诱变育种仪，型号是ARTP-IIS)的金属载体上；
4、将载有孢子液的金属载体放置于ARTP中，工作气流量为10-12 L/min，额定功率为100-120W，等离子体辐照距离2-5mm；
5、辐照时间设置为0-180s之间的不同辐照时间；
6、将金属载体放置于1mL的YEME培养基中，震荡2-3min，将孢 子从金属载体上洗脱下来；
7、按照每个平板50个孢子的数量取一定量上述孢子液加入到600 将平板置于28℃培养箱培养3天后，挑取生长快且大的菌落转接到MS培养 基上置于28℃培养箱培养，同时同样条件培养菌株CK15(μL YEME培养基 中，混匀后平均涂布3个MS平板；
8、即步骤1中的不吸水链霉菌武夷变种CK15)；
9、培养7天后，用手术刀切取2cm2菌块接种到装有200mL发酵培 养基的三角瓶中，在28℃，220rpm摇床上震荡培养64h；
10、过滤除去培养基，获得武夷菌素发酵液，分别用红酵母做指示菌 测定突变体和CK15发酵液的抑菌活性，比较抑菌圈的大小，筛选获得抑菌 圈面积显著增加的菌株；
11、将步骤10筛选获得的菌株用HPLC测定武夷菌素的效价，比较突 变体和CK15的效价差异，重复3次试验，筛选效价明显增加的菌株；
12、将以上获得的高产菌株传代5次以上，测定其抑菌活性和武夷菌 素效价，获得稳定的高产菌株。
上述不吸水链霉菌武夷变种CK15，也可以称作不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis)CK-15，记载于“王万群， 武夷菌素生产菌CK-15细菌人工染色体(BAC)文库构建，2008.6.1”一文中。 公众可以从中国农业科学院植物保护研究所获得，仅用于非商业目的的重复 本发明实验。该菌株也记载于专利号为ZL201510140981.4的名称为“一株 生物农药武夷菌素的高产菌株W-273及其应用”的发明专利中。
下面通过具体实施例来进一步介绍本发明的内容。
实施例1
1、武夷菌素产生菌株的培养
用无菌牙签将武夷菌素产生菌株-不吸水链霉菌武夷变种CK15转接到 MS培养基上，涂满平板，置于28℃培养。
MS培养基成分为：甘露醇20g/L，黄豆粉20g/L，琼脂粉20g/L，以 配制1L为例，先称量好培养基各组分，再加水定容到1L。
2、武夷菌素产生菌株的发酵培养
用手术刀将CK15从MS培养基上切取2cm2接种到装有200mL发酵培养 基的三角瓶中，在28℃，220rpm摇床上震荡培养64h。
发酵培养基成分为：玉米粉20g/L，黄豆粉25g/L，葡萄糖25g/L， 碳酸钙4g/L。
3、菌株的诱变
a)将不吸水链霉菌武夷变种CK15接种到直径9cm的MS平板中置于28℃ 培养7天，然后用6mL无菌水洗脱孢子；
b)用血球计数板对孢子浓度进行计数，孢子液浓度大于107个/mL；
c)用移液器吸取10μL孢子液滴加到ARTP仪的金属载体上；
d)将载有孢子液的金属载体放置于ARTP中，工作气流量为12L/mi n， 额定功率为120W，等离子体辐照距离3mm；
e)分别辐照0、20、40、60、80、100、120、150和180s；
f)将每个辐照时间的金属载体分别放置在1mL YEME培养基中，震荡2-3 min，将孢子从金属载体上洗脱下来；
g)按照每个PDA平板50个孢子的数量取一定量上述孢子液加入到600 μL YEME培养基中，混匀后平均涂布3个MS平板。
YEME培养基成分为：葡萄糖10g/L，麦芽提取物3g/L，酵母粉3g/L， 胰蛋白胨5g/L，蔗糖340g/L。
4、高产菌株的筛选
a)将平板置于28℃培养箱培养3天后，分别计算0、20、40、60、80、 100、120、150和180s九个时间点的菌落数量，计算致死率，致死率分别 为0、57.75％、43.75％、61.75％、64.74％、81.00％、73.00％、80.50％、81.00％ (如图1所示)；
挑取致死率超过80％的培养皿中生长快且大的菌落200个转接到含有红 酵母的PDA培养基(本实验使用的是美国BD公司的商品化培养基，称取7.8 g PDA(DifcoTM PotatoDextrose Agar)粉末到500mL的三角瓶中，再加 入ddH2O定容到200mL，充分混匀，120℃，高压灭菌保存备用)。
b)培养，并以同样条件培养野生菌株CK15。以红酵母作为指示菌，通过 比较抑菌圈面积大小，对突变株进行初步筛选，共筛选出56株抑菌圈面积 相对于CK15增加超过10％的突变株，突变株的抑菌活性结果图2所示，从图 2中可以看出突变株的抑菌圈相对于CK15不仅面积增大，而且透明度更高， 表明其中的抑菌活性成分含量更多；
抑菌活性测定方法：在100mL PDA培养基中加入1mL红酵母溶液充分 混匀倒平板，待PDA凝固后，用打孔器将菌落连同培养基一起挑选出来，将 菌落朝上，置于PDA表面于28℃培养，3天后测定抑菌圈直径，比较抑菌 活性高低；
c)将筛选出的56株突变株和CK15接种到MS培养基上于28℃培养7天， 分别用手术刀切取2cm2接种到装有200mL发酵培养基的三角瓶中，在 28℃，220rpm摇床上震荡培养64h；
d)过滤除去培养基，获得武夷菌素发酵液，分别用红酵母做指示菌测定 突变体和CK15发酵液的抑菌活性，比较抑菌圈的大小，筛选获得12株抑菌 圈面积增加超过10％的菌株。
抑菌活性测定方法：在100mL PDA培养基中加入1mL红酵母溶液充分 混匀倒平板，待PDA凝固后，放置无菌牛津杯，在每个牛津杯里分别加入200 μL突变体和CK15的发酵液，置于28℃培养，2天后测定抑菌圈直径，比 较发酵液抑菌活性高低；
e)用HPLC测定发酵液的效价，比较上述12株菌株和CK15发酵液的效 价差异(表1)，重复3次试验，获得3株效价增加超过10％的菌株：M19、 M26和M28。CK15、M19、M26和M28的效价分别为1218.09±74.04U/mL、 1430.20±37.70U/mL、1383.50±29.60U/mL和1442.95±134.61U/mL， 三株突变株的效价相比出发菌株分别提高17.41％、13.57％和18.46％。
表1不同菌株的发酵效价
Figure BDA0002923054430000091
Figure BDA0002923054430000101
HPLC的方法为YWG-Cl8(4.6mm x 250mm，10μm)色谱柱，流速为 l.2mL/min，检测波长254nm，进样量20μL，柱温25℃，流动相为的三 氯乙酸(1.4g/L，pH2.0)，在保留时间为14min处出现武夷菌素的峰；
将以上三株菌传代8次以上，测定每一代的抑菌活性和武夷菌素效价， 其抑菌活性和效价均保持稳定。验证菌株的遗传稳定性的结果如图3所示， 图3中，每组从左至右分别为CK15、M19、M26、M28，从图3中可以看出三 株突变株的效价在传代8代过程中保持稳定。
实施例2
1、武夷菌素产生菌株的5L发酵罐发酵培养
(1)菌种培养：分别接种CK15和M28到10个直径9cm的MS平板上， 两株菌各5个平板，28℃培养7天，二者菌落形态并无显著差异(如图4)， 气生菌丝呈灰色，间有白色次生菌丝产生；基内菌丝淡黄或浅黄，产生淡黄、 微黄或黄色的可溶性色素。各自挑选一个生长状态良好的平板，然后分别用 8mL无菌水将孢子洗脱到15mL的无菌corning管中；
MS培养基成分同实施例1。
(2)发酵培养：将上述两个菌株(每个菌株用8mL无菌水洗脱，最后 洗脱获得5-6mL孢子液)全部的洗脱孢子液分别接种到5L的发酵罐，内 有3L培养基，在温度28℃，转速220rpm，空气流量比1:0.45，罐压0.09 kg/cm2的条件下培养64h，得到武夷菌素发酵液；
发酵培养基成分同实施例1。
效价测定：用HPLC测定CK15和M28发酵液的效价，重复3次试验，CK15 和M28两株菌的效价分别为1372.50±82.50U/mL和1673.84±127.42U/mL， M28的效价提高21.96％(如图5所示，武夷菌素只有1个组分，图中两个峰 代表的是同一物质，HPLC重复性有点出入，没有完全重合。1代表的是M28 产生的武夷菌素，2代表的是CK15产生的武夷菌素，M28产量高，效价高， 所以峰面积大)。
HPLC测定方法同实施例1。
实施例3武夷菌素产生菌株的500L发酵罐发酵培养
(1)菌种培养：分别接种CK15和M28到20个直径9cm的MS平板上， 两株菌各10个平板，28℃培养7天，然后各种用60mL无菌水将孢子洗脱 到200mL的无菌三角瓶中；
MS培养基成分同实施例1。
(2)种子液培养：将上述孢子液分别接种到50L的发酵罐，内有30L 培养基，在温度28℃，转速200rpm，空气流量比1:0.5，罐压0.1kg/cm2的条件下培养24h，得到种子液；
培养基成分为：葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，蔗糖260 g/L。
(3)发酵罐培养：将生长旺盛的的一级种子液转入到500L的发酵罐 中，内有300L发酵培养基，在温度28℃，转速200rpm，空气流量比1:0.55， 罐压0.12kg/cm2的条件下发酵60h，得到武夷菌素的发酵液。
发酵培养基成分同实施例1。
(4)效价测定：用HPLC测定CK15和M28发酵液的效价，重复3次试 验，两株菌的效价分别为1411.43±69.58U/mL和1750.15±103.93U/mL， M28的效价提高24.03％。
HPLC测定方法同实施例1。
实施例4高产菌株M28生产武夷菌素田间用药
收集实施例3中的M28菌株发酵液，并过滤除去培养基残渣及菌体，然 后将过滤液用旋蒸仪减压浓缩6倍(70℃，-0.09MPa)，获得效价大约为 10000ppm的武夷菌素浓缩液，可作为田间用药使用，防治黄瓜白粉病、番 茄灰霉病等真菌性病害，防治效果为80％-95％。
实施例5高产菌株M28发酵液的抑菌谱测定
分别在不加物质的PDA、含有8％的CK15发酵液、含有8％的M28发酵液 的PDA平板上接种14种农业生产中常见的植物病原真菌(番茄灰霉菌，番 茄叶霉菌，尖孢镰刀菌，匍枝根霉，杨树水泡溃疡病菌，小麦根腐病菌，玉 米小斑病菌，苹果轮纹病菌，葡萄黑腐病菌，黄瓜炭疽病菌，烟草赤星病菌， 玉米大斑病菌，稻瘟菌，小麦纹枯病菌)，每个实验组每株菌接种3个重复， 置于28℃恒温培养箱中培养，7天后测量病原菌直径，计算抑菌率。
结果表明：CK15和M28发酵液对14种病原菌均具有较好的抑制作用， 生长7天时CK15发酵液的抑菌率从14.92％到60.37％，M28发酵液的抑菌率 从16.53％到66.25％(如表2所示)。
表2对主要植物病原真菌的抑菌率
Figure BDA0002923054430000121
Figure BDA0002923054430000131
上述涉及的菌株(番茄灰霉菌，番茄叶霉菌，尖孢镰刀菌，匍枝根霉， 杨树水泡溃疡病菌，小麦根腐病菌，玉米小斑病菌，苹果轮纹病菌，葡萄黑 腐病菌，黄瓜炭疽病菌，烟草赤星病菌，玉米大斑病菌，稻瘟菌，小麦纹枯 病菌)公众可以从中国农业科学院植物保护研究所获得，仅用于非商业目的 的重复本发明实验。
对比例1不同菌株的生长速度和产孢量
1、菌株培养
用无菌牙签分别将CK15、M28、F64和W273转接到MS培养基上，涂满 平板，每个菌株培养10个，置于28℃培养，用插片法观察菌丝生长和孢子 产生情况。
F64是前期通过物理、化学和高能离子注入获得的一株武夷菌素高产菌 株，W273是前期通过基因工程方式获得一株武夷菌素高产菌株。
MS培养基成分同实施例1。
2、生长速度和产孢量
通过观察发现M28较CK15、F64和W273菌丝生长快，且产孢早。CK15 和F64培养4天开始产孢，W273培养3.5天产孢，而M28培养3天即产孢。 培养7天后，每个平板分别用8mL0.02％的Tween80洗脱孢子，每个菌株分 别洗脱3个平板，用血球计数皿计数，分别计算4个菌株的产孢量，具体数 据如下：
表3不同菌株的产孢量
Figure BDA0002923054430000141
对比例2不同菌株的发酵效价
分别将F64和W273菌株按照实施例1和2进行摇瓶和5L发酵罐发酵 培养，对获得的武夷菌素效价进行测定。发酵方法和武夷菌素效价测定方法 同实施例1和2。CK15、F64、W273和M28的效价如下：
表4不同菌株产武夷菌素的效价
Figure BDA0002923054430000142
Figure BDA0002923054430000151
由上表可以看出，M28菌株产武夷菌素效价最高。
对比例3不同菌株的产素稳定性
将对比例3中发酵罐发酵获得的武夷菌素分装到200mL塑料瓶中置于 室温放置，分别测定放置1,3,6,9,12个月后的效价，结果如下：
表5室温放置武夷菌素的效价变化
Figure BDA0002923054430000152
由上表可以看出，M28菌株产武夷菌素的稳定性最好。
上述涉及的F64、W273菌株公众可以从中国农业科学院植物保护研究所 获得，仅用于非商业目的的重复本发明实验。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株武夷菌素高产菌株，其特征在于，菌株为不吸水链霉菌武夷变种M28(Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis strain M28),保藏号为CGMCCNo.19060。
2.一种武夷菌素高产菌株的发酵方法，其特征在于，将权利要求1所述菌株接种到培养基，发酵培养。
3.根据权利要求2所述发酵方法，其特征在于，发酵培养的方法包括摇瓶发酵或发酵罐发酵。
4.权利要求1所述菌株在制备抑制致病菌生长的药物中的应用，其特征在于，所述致病菌选自番茄灰霉菌，番茄叶霉菌，尖孢镰刀菌，匍枝根霉，杨树水泡溃疡病菌，小麦根腐病菌，玉米小斑病菌，苹果轮纹病菌，葡萄黑腐病菌，黄瓜炭疽病菌，烟草赤星病菌，玉米大斑病菌，稻瘟菌，小麦纹枯病菌中的一种或几种。
5.权利要求1所述菌株在制备武夷菌素中的应用。
6.一种制备武夷菌素的方法，其特征在于，发酵权利要求1所述菌株，获得含有武夷菌素的发酵液。
7.根据权利要求6所述制备武夷菌素的方法，其特征在于，还包括分离和/或纯化步骤。
8.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述菌株和/或菌株的发酵液。
9.一种生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵权利要求1所述菌株。
10.权利要求8所述菌剂在抑制致病菌生长中的应用，其特征在于，所述致病菌选自番茄灰霉菌，番茄叶霉菌，尖孢镰刀菌，匍枝根霉，杨树水泡溃疡病菌，小麦根腐病菌，玉米小斑病菌，苹果轮纹病菌，葡萄黑腐病菌，黄瓜炭疽病菌，烟草赤星病菌，玉米大斑病菌，稻瘟菌，小麦纹枯病菌中的一种或几种。
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CN101050441A (zh) * 2007-03-30 2007-10-10 中国农业科学院植物保护研究所 武夷菌素高产菌株f64及发酵方法
CN104726379A (zh) * 2015-03-27 2015-06-24 中国农业科学院植物保护研究所 一株生物农药武夷菌素的高产菌株w-273及其应用

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