CN102634471B - 一种阿维菌素B1a高产菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阿维菌素B1a高产菌株,其分类命名为阿维链霉菌streptomycesavermitilisAVE07-N2-16515,已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号:CCTCCNO:M2012094,本发明以低能氮离子注入-氯化锂(N+-LiCl)复合诱变结合紫外线-氯化锂(UV-LiCl)复合诱变,通过初筛、摇瓶发酵复筛选获阿维菌素B1a产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株,最终筛选出目标菌株AVE07-N2-16515,该菌株可较大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分并减少其他组分,且遗传稳定性良好。该菌株利用葡萄糖为速效碳源,玉米淀粉为迟效碳源,在5L发酵罐中发酵产阿维菌素B1a效价可达3048μg/mL,相对于原始出发菌株AVE07提高了23.4%,可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位,具有重大的经济应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及一种阿维菌素B1a高产菌株及其诱变方法与其在发酵生产阿维菌素B1a中的应用。
背景技术
阿维菌素(avermectin,AVM)是一种由放线菌阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)经液体发酵产生的一类十六元环内脂类抗生素,是一种全新无公害生物农用抗生素,具有高效、低毒及环境友好等特点,对蔬菜、果树、棉花、水稻等多种作物的相关害虫有良好防效杀灭作用,其杀虫活性比一般化学农药高出几到几十倍。作为一种农用杀虫剂,阿维菌素的作用机理独特,对害虫具有触杀和胃毒作用,对靶标作物有较强的渗透作用,能有效防治双翅目、同翅目、鞘翅目和磷翅目害虫。作为农用药物,它具有高选择性和高安全性。在常用剂量下,不仅对人畜安全,还不伤害大多种类的有益昆虫,不破坏生态。在光照条件下或在土壤微生物作用下迅速降解成无活性的化合物,其分子碎片最终作为碳源被植物和微生物分解利用,几乎无任何残留毒性。在水中易降解,无残留,不污染环境,且在生物体内也无积累和持久性残留。是目前世界上最有前途的生物杀虫杀螨剂。
目前,上千种阿维菌素衍生物已经合成出来,已经商品化的有伊维菌素(ivermectin,简称IVM),埃玛菌素(emamectin,又称甲氨基阿维菌素),道拉菌素(dormectin),埃珀利诺菌素(eprinomectin,又称乙酰氨基阿维菌素)和色拉菌素(selamectin)等。可见,阿维菌素不仅是一个优异的产品,更是一种宝贵的资源,被认为是继青霉素以来抗生素的又一次革命。因此,市场拉动和技术进步都推动了阿维菌素得迅猛发展。
经发酵产生的阿维菌素中包括结构类似物共8种,按其中的C5、C22-23、C26三个位置上的结构差异可以区分为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b 8种组分,其中B组分的生物活性优于A组分,其中以B1a组分活性最高且毒性最小。因此,提高发酵产物中B1a组分已经成为目前研究领域的重点。例如,河北大学生命科学学院赵丽坤等人利用紫外线-氯化锂(UV-LiCl)和紫外线-亚硝基胍(UV-NTG)对其进行复合诱变处理获得了一株相对出发菌株含量提高65%左右的高产菌株。沈阳药科大学生物技术与生物制药实验室采用NTG、DES、紫外线等诱变因子对阿维链霉菌的原始菌株进行了多次诱变处理,产量有了明显提高。CN201110003059.2公开了一种阿维菌素生产菌及其制备方法,其通过反复的诱变和筛选得到一株名为FT26-9的高产菌株,其应用于工业生产可提高发酵单位40%左右。但由于其诱变大多采用了具有致癌作用的剧毒有机试剂,且诱变工艺复杂,对人体健康和环境保护带来不利影响,上述技术方案有待进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种简单、高效、安全的阿维菌素B1a高产菌诱变方法,诱变筛选得到一株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分的阿维菌素B1a高产菌株。
本发明要解决的技术问题之二在于提供上述阿维菌素B1a高产菌株的应用。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种阿维菌素B1a高产菌株,其分类命名为阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)AVE07-N2-16515,已于2012年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号:CCTCC NO:M 2012094。
本发明所述的阿维菌素B1a高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的筛选方法是:将阿维链霉菌出发菌株,经低能氮离子注入-氯化锂(N+-LiCl)复合诱变结合紫外线-氯化锂(UV-LiCl)复合诱变后,通过初筛、摇瓶发酵复筛选获阿维菌素B1a产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株,重复上述诱变过程,最后筛选出阿维菌素B1a产量高的目标菌株。
本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下:
菌落颜色:灰白色。
需氧方式:好氧生长。
菌落大小:2~5mm。
适宜生长温度:27.5~28.5℃。
适宜生长pH:7.2~7.4。
菌体形态:圆形菌落,无光泽。
革兰氏染色:阳性。
本发明所提供的阿维菌素B1a高产菌株的诱变方法,具体步骤如下:
(a)、单孢子悬浮液制备:将阿维链霉菌出发菌株孢子制成孢子悬液,调整孢子浓度为106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变:取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上,以无菌风吹干,在10~18KeV、注入剂量为40×1014~240×1014ions/cm2下对阿维链霉菌进行氮离子注入,离子注入完毕后,取出平皿,在无菌环境下用1mL无菌水洗脱,涂布到氯化锂平板培养基上,在26~30℃下倒置培养6~7d。
(c)、紫外线-氯化锂复合诱变:取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中,进行紫外线照射诱变,照射时间为30~90s,诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上,在26~30℃下避光倒置培养6~7d。
(d)、诱变菌株的筛选:
初筛:将步骤(b)和步骤(c)诱变得到的单菌落接种至斜面培养基上,在26~30℃下培养6~7d,铲取二分之一的菌体于离心管中,用丙酮浸泡12~15h,然后加入0.25mL乙酸乙酯,快速混匀,离心,取上清液测定各菌株浸取液中阿维菌素B1a效价,留取50%的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。
复筛:将初筛筛选到的菌株经斜面培养接入种子培养基扩大培养后,按2~10%(v/v)的接种量接入发酵培养基。在26~30℃,180~220rpm摇床转速下培养8~10d下摇床,取3mL发酵液于离心管中,3500rpm高速离心10min,弃上清液,加入甲醇至9mL,在快速混匀器上震荡30min;3500rpm高速离心10min,取上清液测定发酵液中阿维菌素B1a效价。取发酵液阿维菌素B1a效价最高的菌株作为下次诱变的出发菌株,重复步骤(a)~(d),直至筛选出阿维菌素B1a产量高的目标菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515。
步骤(b)中低能氮离子注入,优选诱变能量为16KeV,诱变剂量为160×1014ions/cm2。
步骤(c)中紫外线诱变,优选照射时间为60s。
步骤(b)和步骤(c)中所用的氯化锂平板培养基为:碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、氯化锂1.0moL·L-1,其余为水,pH 7.2~7.4;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合;所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合;所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合
步骤(d)中所用的斜面培养基为:碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水,pH 7.2~7.4;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合;所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合;所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
步骤(d)中所用的种子培养基为:碳源2.0%~3.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%,淀粉酶3~5u/g淀粉,其余为水,pH 7.0~7.2;其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合;所述氮源为有机含氮化合物,为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆(也可作为生长因子)、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合;所述的微量元素为氯化钴。
步骤(d)中所用的发酵培养基为:碳源5.0%~15.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%,淀粉酶3~5u/g淀粉,其余为水,pH 7.0~7.2;其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合;所述氮源为有机含氮化合物,为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆(也可作为生长因子)、酵母粉中的一种或几种的混合;所述的微量元素为氯化钴。
上述筛选出的阿维菌素B1a高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515在发酵生产阿维菌素B1a中的应用。
具体步骤如下:
(1)、平板培养:将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上,培养温度为26~30℃,培养时间为6~7d;
(2)、斜面培养:将步骤(1)平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上,培养温度为26~30℃,培养时间6~7d。
(3)、种子培养:将步骤(2)斜面培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到种子培养基中,250mL培养瓶中装液量为20~50mL,培养温度为26~30℃,180~220rpm摇床转速下培养30~45h;
(4)、发酵培养:将步骤(3)中的种子培养液接种到发酵培养基中,接种量为2~10%(v/v),250mL培养瓶中装液量为35~65mL,培养温度为26~30℃,180~240rpm摇床转速下培养8~10d。
其中,所述平板培养基包含如下质量百分数的组分:碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水,pH 7.2~7.4;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合;所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合;所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分:碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水,pH 7.2~7.4;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合;所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合;所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
所述种子培养基包含如下质量百分数的组分:碳源2.0%~3.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%,淀粉酶3~5u/g淀粉,其余为水,pH7.0~7.2;其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合;所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合;所述的微量元素为氯化钴。
所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分:碳源5.0%~15.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%,淀粉酶3~5u/g淀粉,其余为水,pH7.0~7.2;其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合;所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的一种或几种的混合;所述的微量元素为氯化钴。
本发明有益效果:
本发明采用低能氮离子注入-氯化锂复合诱变和紫外线-氯化锂复合诱变相结合,最终筛选获得一株阿维菌素B1a高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515,可较大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分并减少其他组分,且遗传稳定性好,菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中,以葡萄糖为速效碳源,玉米淀粉为迟效碳源,发酵产阿维菌素B1a效价达到3048μg/mL,相比原始出发菌株提高了23.4%。本技术发明完全符合工业化阿维菌素生产菌株的诱变和筛选需要,并可应用于工业化发酵生产,具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1:阿维链霉菌复合诱变图谱;
图2:为低能氮离子注入诱变不同能量、剂量下菌株的正负突变率,从图中可以看出,10KeV、14KeV以及18KeV下菌株的正突变率普遍低于16KeV,可以确定16KeV为菌种的最佳诱变能量,另外在诱变剂量为160×1014ions/cm2下正突变率最高,容易筛选出效价提高幅度超过10%的菌株,所以确定诱变能量16KeV,诱变剂量160×1014ions/cm2为本发明中所用最佳低能氮离子注入诱变条件;
图3:为紫外诱变的正负突变率,从图中可以看出,随着紫外诱变时间的延长,正突变率先上升后下降,在60s时,菌株的正突变率最高,达到18.1%,确定60s为本发明中所用紫外诱变最佳时间;
图4:实施例3发酵液中阿维菌素B1a色谱图,其中第3个峰为阿维菌素B1a色谱峰。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:本实施例说明将阿维链霉菌出发菌株进行诱变的方法。
以实验室保存的阿维链霉菌AVE07为出发菌株,进行诱变,具体步骤如下:
(a)、单孢子悬浮液制备:取26~30℃恒温培养6~7d的阿维链霉菌新鲜斜面加无菌水10mL,刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm),打散孢子链,三层脱脂纱布过滤,滤液用血球计数板计数,调整孢子浓度106个/毫升。
(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变:取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上,镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对阿维链霉菌进行离子注入。注入剂量分别为40×1014ions/cm2、80×1014ions/cm2、120×1014ions/cm2、160×1014ions/cm2、200×1014ions/cm2、240×1014ions/cm2。靶室真空度为10-3Pa,以20S脉冲式注入,间隔15s,靶室内放置不接受注入的对照样。实验结果见图2,确定诱变能量16KeV,诱变剂量160×1014ions/cm2为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后,取出平皿,在无菌环境下用1ml无菌水洗脱,涂布到氯化锂平板培养基上,在26~30℃下倒置培养6~7d。
(c)、紫外线-氯化锂复合诱变:取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中,至于磁力搅拌器上。先开启20W紫外灯预热20min,再调整培养皿高度于紫外灯下30cm处,打开平皿盖,分别照射30s、45s、60s、75s、90s,诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上,于26~30℃条件下倒置避光恒温培养6~7d。实验结果见图3,确定60s为紫外诱变最佳时间,此时正突变率最高,达到18.1%。
(d)、诱变菌株的筛选:
初筛:将步骤(b)和步骤(c)诱变得到的单菌落接至斜面培养基上,在26~30℃下培养6~7d后,铲取二分之一的菌体于离心管中,用0.5mL丙酮浸泡12~15h,然后加入0.25mL乙酸乙酯,快速混匀,3000rpm离心10min,取上清液,取上清液测定各菌株浸取液中阿维菌素B1a效价,留取50%的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。
复筛:将初筛筛选到的菌株经斜面培养后接入种子培养基中于26~30℃、180~220rmp摇床转速下扩大培养30~45h,以2~10%(v/v)的接种量接入发酵培养基,在26~30℃、180~240rpm摇床转速下培养8~10d下摇床,取3mL发酵液于离心管中,3500rpm高速离心10min,弃上清液,加入甲醇至9mL,在快速混匀器上震荡30min;3500rpm高速离心10min,取上清液测定发酵液中阿维菌素B1a效价。取发酵液阿维菌素B1a效价最高的菌株作为下次诱变的出发菌株,重复步骤(a)~(d),如图1所示。最后筛选出阿维菌素B1a产量高的目标菌株streptomycesavermitilis AVE07-N2-16515。
步骤(b)和步骤(c)中所用的氯化锂平板培养基为:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO4 0.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,氯化锂1.0moL·L-1,琼脂粉1.5%,pH 7.2~7.4,蒸馏水配置。
步骤(a)及(d)中所用的斜面培养基为:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH 7.2~7.4,蒸馏水配置。
步骤(d)中所用的种子培养基为:玉米淀粉1.5%,葡萄糖1.0%,花生饼粉1.0%,黄豆饼粉0.8%,酵母粉0.5%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
步骤(d)中所用的发酵培养基为:玉米淀粉6%,葡萄糖2%,花生饼粉1.4%,黄豆饼粉1.2%,酵母粉0.3%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH7.0~7.2,自来水配置。
实施例2:本实施例说明突变株的传代稳定性。
在以葡萄糖为速效碳源、玉米淀粉为迟效碳源的发酵培养基中,检测突变株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的传代稳定性,菌株传代发酵试验结果如表1所示:
表1高产突变菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515遗传稳定性试验
从实验结果可以看出,经过5次传代,突变菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的阿维菌素B1a效价较稳定,具有较好的传代稳定性,可作为进一步研究和开发的生产菌株。
实施例3:本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。
本实施例所用的培养基配方:
平板培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
斜面培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
种子培养基:玉米淀粉1.5%,葡萄糖1.0%,花生饼粉1.0%,黄豆饼粉0.8%,酵母粉0.5%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
发酵培养基:玉米淀粉6%,葡萄糖2%,花生饼粉1.4%,黄豆饼粉1.2%,酵母粉0.3%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上,培养温度为28℃,培养时间为7d;将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上,28℃培养7d后,取斜面培养物接种至种子培养基中,250mL培养瓶中装液量为30mL,培养温度为28℃,200rpm转速下培养32h;将种子培养液接种到发酵培养基中,初始pH为7.2,接种量为6%(v/v),250mL培养瓶中装液量为50mL,培养温度为28.5℃,220rpm转速下培养9d(216h),发酵产阿维菌素B1a效价为3035μg/mL,相对于原始出发菌株提高了22.9%,发酵液中阿维菌素B1a色谱图见图4。
实施例4:本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。
本实施例所用的培养基配方:
平板培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
斜面培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
种子培养基:玉米淀粉1.5%,葡萄糖1.0%,花生饼粉1.0%,黄豆饼粉0.8%,酵母粉0.5%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
发酵培养基:玉米淀粉8%,花生饼粉1.4%,黄豆饼粉1.2%,酵母粉0.3%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上,培养温度为28℃,培养时间为7d;将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上,28℃培养7d后,取斜面培养物接种至种子培养基中,250mL培养瓶中装液量为30mL,培养温度为28℃,200rpm转速下培养32h;将种子培养液接种到发酵培养基中,初始pH为72,接种量为6%(v/v),250mL培养瓶中装液量为50mL,培养温度为28.5℃,220rpm转速下培养9d(216h),发酵产阿维菌素B1a效价为2987μg/mL,相对于原始出发菌株提高了21.0%。
实施例5:本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。
本实施例所用的培养基配方:
平板培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
斜面培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
种子培养基:种子培养基:玉米淀粉1.5%,葡萄糖1.0%,花生饼粉1.0%,黄豆饼粉0.8%,酵母粉0.5%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH7.0~7.2,自来水配置。
发酵培养基:葡萄糖8%,花生饼粉1.4%,黄豆饼粉1.2%,酵母粉0.3%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上,培养温度为28℃,培养时间为7d;将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上,28℃培养7d后,取斜面培养物接种至种子培养基中,250mL培养瓶中装液量为30mL,培养温度为28℃,200rpm转速下培养32h;将种子培养液接种到发酵培养基中,初始pH为7.2,接种量为6%(v/v),250mL培养瓶中装液量为50mL,培养温度为28.5℃,220rpm转速下培养9d(216h),发酵产阿维菌素B1a效价为3006μg/mL,相对于原始出发菌株提高了21.7%。
实施例6:本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。
本实施例所用的培养基配方:
平板培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
斜面培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
种子培养基:种子培养基:玉米淀粉1.5%,葡萄糖1.0%,花生饼粉1.0%,黄豆饼粉0.8%,酵母粉0.5%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH7.0~7.2,自来水配置。
发酵培养基:麦芽糖8%,花生饼粉1.4%,黄豆饼粉1.2%,酵母粉0.3%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上,培养温度为28℃,培养时间为7d;将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上,28℃培养7d后,取斜面培养物接种至种子培养基中,250mL培养瓶中装液量为30mL,培养温度为28℃,200rpm转速下培养32h;将种子培养液接种到发酵培养基中,初始pH为7.2,接种量为6%(v/v),250mL培养瓶中装液量为50mL,培养温度为28.5℃,220rpm转速下培养9d(216h),发酵产阿维菌素B1a效价为2895μg/mL,相对于原始出发菌株提高了17.3%。
实施例7:本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。
本实施例所用的培养基配方:
平板培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
斜面培养基:可溶性淀粉1.0%,(NH4)2SO40.25%,NaCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.12%,K2HPO4·3H2O 0.3%,CaCO30.3%,琼脂粉1.5%,pH7.2~7.4,蒸馏水配置。
种子培养基:玉米淀粉1.5%,葡萄糖1.0%,花生饼粉1.0%,黄豆饼粉0.8%,酵母粉0.5%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
发酵培养基:玉米淀粉6%,葡萄糖2%,花生饼粉1.4%,黄豆饼粉1.2%,酵母粉0.3%,CoCl2·6H2O 0.0003%,淀粉酶4u/g淀粉,pH 7.0~7.2,自来水配置。
将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上,培养温度为28℃,培养时间为7d;将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上,28℃培养7d后,取斜面培养物接种至种子培养基中,250mL培养瓶中装液量为30mL,培养温度为28℃,200rpm转速下培养32h;将种子培养液接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中,接种量为10%(v/v),发酵温度28.5℃,搅拌转速100rpm。发酵培养216h后检测阿维菌素B1a效价达到3048μg/mL,相对于原始出发菌株提高了23.4%。
实施例8:本实例说明发酵液中阿维菌素B1a效价的检测方法。
仪器设备:高效液相色谱仪、色谱工作站、离心机、超声清洗器、漩涡混合器、微量进样器、微孔滤膜、色谱柱为Agilent不锈钢柱(内装填料PLRS-S,10nm,长250nm,内径4.6mm)等。
试剂:色谱甲醇、95%乙醇
检测条件:流动相为甲醇∶水(85∶15);流速为1.0mL·min-1;检测波长为245nm,进样量20μL。
操作步骤
(1)标样的制备
准确称取阿维菌素B1a标准品0.05g(精确至0.0002g)溶于50mL容量瓶中,用色谱甲醇溶解并定容至刻度,摇匀。再用移液管取1mL至10mL容量瓶,色谱甲醇溶解,并定容至刻度,备用。
(2)样品制备
取3mL发酵液于离心管中,3500rpm高速离心10min,弃上清液,加入甲醇至9mL,在快速混匀器上震荡30min;3500rpm高速离心10min,取上清液经一定稀释后用微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。
在上述条件下,待仪器稳定后注入标样溶液连续两针标样B1a峰面积相对变化小于1.5%后,再将制备好的样品进样检测。图2为标样及发酵液中阿维菌素B1a色谱图。
(3)计算方法
阿维菌素B1a效价(μg/mL)=(样品峰面积/标准品峰面积)×标准品浓度×稀释倍数。
Claims (7)
1.一种阿维菌素B1a高产菌株,其分类命名为阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)AVE07-N2-16515,已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC,保藏编号:CCTCC NO:M 2012094。
2.权利要求1所述的阿维菌素B1a高产菌株在发酵生产阿维菌素B1a中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述的发酵生产阿维菌素B1a的方法包含如下步骤:
(1)、平板培养:将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上,培养温度为26~30℃,培养时间为6~ 7d;
(2)、斜面培养:将步骤(1)平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上,培养温度为26~30℃,培养时间为6~7d;
(3)、种子培养:将步骤(2)斜面培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到种子培养基中,250mL培养瓶中装液量为20~50mL,培养温度为26~30℃,180~220rpm摇床转速下培养30~45h;
(4)、发酵培养:将步骤(3)中的种子培养液接种到发酵培养基中,接种量为按体积比2~10%接种,250mL培养瓶中装液量为35~65mL,培养温度为26~30℃,180~240rpm摇床转速下培养8~10d。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述平板培养基包含如下质量百分数的组分:碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水,pH 7.2~7.4;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合;所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合;所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分:碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水,pH 7.2~7.4;其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合;所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合;所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。
6.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述种子培养基包含如下质量百分数的组分:碳源2.0%~3.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%,淀粉酶3~5u/g淀粉,其余为水,pH 7.0~7.2;其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合;所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合;所述的微量元素为氯化钴。
7.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分:碳源5.0%~15.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%,淀粉酶3~5u/g淀粉,其余为水,pH 7.0~7.2;其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合;所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的一种或几种的混合;所述的微量元素为氯化钴。
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