CN102634471B

CN102634471B - 一种阿维菌素B1a高产菌株及其应用

Info

Publication number: CN102634471B
Application number: CN201210113850.3A
Authority: CN
Inventors: 虞龙; 龚文静; 崔莉; 黄思思; 陈晓双
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2032-04-18
Also published as: CN102634471A

Abstract

本发明公开了一种阿维菌素B1a高产菌株，其分类命名为阿维链霉菌streptomycesavermitilisAVE07-N2-16515，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCCNO：M2012094，本发明以低能氮离子注入-氯化锂(N⁺-LiCl)复合诱变结合紫外线-氯化锂(UV-LiCl)复合诱变，通过初筛、摇瓶发酵复筛选获阿维菌素B1a产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，最终筛选出目标菌株AVE07-N2-16515，该菌株可较大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分并减少其他组分，且遗传稳定性良好。该菌株利用葡萄糖为速效碳源，玉米淀粉为迟效碳源，在5L发酵罐中发酵产阿维菌素B1a效价可达3048μg/mL，相对于原始出发菌株AVE07提高了23.4%，可应用于工业生产并大幅度提高发酵单位，具有重大的经济应用价值。

Description

一种阿维菌素B1a高产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种阿维菌素B1a高产菌株及其诱变方法与其在发酵生产阿维菌素B1a中的应用。

背景技术

阿维菌素(avermectin，AVM)是一种由放线菌阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)经液体发酵产生的一类十六元环内脂类抗生素，是一种全新无公害生物农用抗生素，具有高效、低毒及环境友好等特点，对蔬菜、果树、棉花、水稻等多种作物的相关害虫有良好防效杀灭作用，其杀虫活性比一般化学农药高出几到几十倍。作为一种农用杀虫剂，阿维菌素的作用机理独特，对害虫具有触杀和胃毒作用，对靶标作物有较强的渗透作用，能有效防治双翅目、同翅目、鞘翅目和磷翅目害虫。作为农用药物，它具有高选择性和高安全性。在常用剂量下，不仅对人畜安全，还不伤害大多种类的有益昆虫，不破坏生态。在光照条件下或在土壤微生物作用下迅速降解成无活性的化合物，其分子碎片最终作为碳源被植物和微生物分解利用，几乎无任何残留毒性。在水中易降解，无残留，不污染环境，且在生物体内也无积累和持久性残留。是目前世界上最有前途的生物杀虫杀螨剂。

目前，上千种阿维菌素衍生物已经合成出来，已经商品化的有伊维菌素(ivermectin，简称IVM)，埃玛菌素(emamectin，又称甲氨基阿维菌素)，道拉菌素(dormectin)，埃珀利诺菌素(eprinomectin，又称乙酰氨基阿维菌素)和色拉菌素(selamectin)等。可见，阿维菌素不仅是一个优异的产品，更是一种宝贵的资源，被认为是继青霉素以来抗生素的又一次革命。因此，市场拉动和技术进步都推动了阿维菌素得迅猛发展。

经发酵产生的阿维菌素中包括结构类似物共8种，按其中的C₅、C_22-23、C₂₆三个位置上的结构差异可以区分为A1a、A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a、B2b 8种组分，其中B组分的生物活性优于A组分，其中以B1a组分活性最高且毒性最小。因此，提高发酵产物中B1a组分已经成为目前研究领域的重点。例如，河北大学生命科学学院赵丽坤等人利用紫外线-氯化锂(UV-LiCl)和紫外线-亚硝基胍(UV-NTG)对其进行复合诱变处理获得了一株相对出发菌株含量提高65％左右的高产菌株。沈阳药科大学生物技术与生物制药实验室采用NTG、DES、紫外线等诱变因子对阿维链霉菌的原始菌株进行了多次诱变处理，产量有了明显提高。CN201110003059.2公开了一种阿维菌素生产菌及其制备方法，其通过反复的诱变和筛选得到一株名为FT26-9的高产菌株，其应用于工业生产可提高发酵单位40％左右。但由于其诱变大多采用了具有致癌作用的剧毒有机试剂，且诱变工艺复杂，对人体健康和环境保护带来不利影响，上述技术方案有待进一步提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一在于提供一种简单、高效、安全的阿维菌素B1a高产菌诱变方法，诱变筛选得到一株可大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分的阿维菌素B1a高产菌株。

本发明要解决的技术问题之二在于提供上述阿维菌素B1a高产菌株的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种阿维菌素B1a高产菌株，其分类命名为阿维链霉菌(streptomycesavermitilis)AVE07-N2-16515，已于2012年4月8日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2012094。

本发明所述的阿维菌素B1a高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的筛选方法是：将阿维链霉菌出发菌株，经低能氮离子注入-氯化锂(N⁺-LiCl)复合诱变结合紫外线-氯化锂(UV-LiCl)复合诱变后，通过初筛、摇瓶发酵复筛选获阿维菌素B1a产量高的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，重复上述诱变过程，最后筛选出阿维菌素B1a产量高的目标菌株。

本发明菌株的形态学及生理生化学特征如下：

菌落颜色：灰白色。

需氧方式：好氧生长。

菌落大小：2～5mm。

适宜生长温度：27.5～28.5℃。

适宜生长pH：7.2～7.4。

菌体形态：圆形菌落，无光泽。

革兰氏染色：阳性。

本发明所提供的阿维菌素B1a高产菌株的诱变方法，具体步骤如下：

(a)、单孢子悬浮液制备：将阿维链霉菌出发菌株孢子制成孢子悬液，调整孢子浓度为10⁶个/毫升。

(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，以无菌风吹干，在10～18KeV、注入剂量为40×10¹⁴～240×10¹⁴ions/cm²下对阿维链霉菌进行氮离子注入，离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1mL无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在26～30℃下倒置培养6～7d。

(c)、紫外线-氯化锂复合诱变：取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中，进行紫外线照射诱变，照射时间为30～90s，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，在26～30℃下避光倒置培养6～7d。

(d)、诱变菌株的筛选：

初筛：将步骤(b)和步骤(c)诱变得到的单菌落接种至斜面培养基上，在26～30℃下培养6～7d，铲取二分之一的菌体于离心管中，用丙酮浸泡12～15h，然后加入0.25mL乙酸乙酯，快速混匀，离心，取上清液测定各菌株浸取液中阿维菌素B1a效价，留取50％的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。

复筛：将初筛筛选到的菌株经斜面培养接入种子培养基扩大培养后，按2～10％(v/v)的接种量接入发酵培养基。在26～30℃，180～220rpm摇床转速下培养8～10d下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中阿维菌素B1a效价。取发酵液阿维菌素B1a效价最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a)～(d)，直至筛选出阿维菌素B1a产量高的目标菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515。

步骤(b)中低能氮离子注入，优选诱变能量为16KeV，诱变剂量为160×10¹⁴ions/cm²。

步骤(c)中紫外线诱变，优选照射时间为60s。

步骤(b)和步骤(c)中所用的氯化锂平板培养基为：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、氯化锂1.0moL·L^-1，其余为水，pH 7.2～7.4；其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合

步骤(d)中所用的斜面培养基为：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、其余为水，pH 7.2～7.4；其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。

步骤(d)中所用的种子培养基为：碳源2.0％～3.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0～7.2；其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合；所述氮源为有机含氮化合物，为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆(也可作为生长因子)、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。

步骤(d)中所用的发酵培养基为：碳源5.0％～15.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0～7.2；其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合；所述氮源为有机含氮化合物，为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆(也可作为生长因子)、酵母粉中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。

上述筛选出的阿维菌素B1a高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515在发酵生产阿维菌素B1a中的应用。

具体步骤如下：

(1)、平板培养：将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为26～30℃，培养时间为6～7d；

(2)、斜面培养：将步骤(1)平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，培养温度为26～30℃，培养时间6～7d。

(3)、种子培养：将步骤(2)斜面培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为20～50mL，培养温度为26～30℃，180～220rpm摇床转速下培养30～45h；

(4)、发酵培养：将步骤(3)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为2～10％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为35～65mL，培养温度为26～30℃，180～240rpm摇床转速下培养8～10d。

其中，所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、其余为水，pH 7.2～7.4；其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。

所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5％～1.5％、氮源0.1％～0.3％、无机盐0.5％～1.0％、琼脂1.2％～1.8％、其余为水，pH 7.2～7.4；其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。

所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0％～3.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH7.0～7.2；其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。

所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源5.0％～15.0％、氮源2.0％～4.0％、微量元素0.0001％～0.0004％，淀粉酶3～5u/g淀粉，其余为水，pH7.0～7.2；其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。

本发明有益效果：

本发明采用低能氮离子注入-氯化锂复合诱变和紫外线-氯化锂复合诱变相结合，最终筛选获得一株阿维菌素B1a高产菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515，可较大幅度提高发酵产物中阿维菌素B1a组分并减少其他组分，且遗传稳定性好，菌株连续传代5次后效价并无明显变化。在5L发酵罐中，以葡萄糖为速效碳源，玉米淀粉为迟效碳源，发酵产阿维菌素B1a效价达到3048μg/mL，相比原始出发菌株提高了23.4％。本技术发明完全符合工业化阿维菌素生产菌株的诱变和筛选需要，并可应用于工业化发酵生产，具有重大的社会意义和经济价值。

附图说明

图1：阿维链霉菌复合诱变图谱；

图2：为低能氮离子注入诱变不同能量、剂量下菌株的正负突变率，从图中可以看出，10KeV、14KeV以及18KeV下菌株的正突变率普遍低于16KeV，可以确定16KeV为菌种的最佳诱变能量，另外在诱变剂量为160×10¹⁴ions/cm²下正突变率最高，容易筛选出效价提高幅度超过10％的菌株，所以确定诱变能量16KeV，诱变剂量160×10¹⁴ions/cm²为本发明中所用最佳低能氮离子注入诱变条件；

图3：为紫外诱变的正负突变率，从图中可以看出，随着紫外诱变时间的延长，正突变率先上升后下降，在60s时，菌株的正突变率最高，达到18.1％，确定60s为本发明中所用紫外诱变最佳时间；

图4：实施例3发酵液中阿维菌素B1a色谱图，其中第3个峰为阿维菌素B1a色谱峰。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：本实施例说明将阿维链霉菌出发菌株进行诱变的方法。

以实验室保存的阿维链霉菌AVE07为出发菌株，进行诱变，具体步骤如下：

(a)、单孢子悬浮液制备：取26～30℃恒温培养6～7d的阿维链霉菌新鲜斜面加无菌水10mL，刮洗下孢子倾于带有一定玻璃珠的250mL三角瓶内震荡摇匀20min(250rpm)，打散孢子链，三层脱脂纱布过滤，滤液用血球计数板计数，调整孢子浓度10⁶个/毫升。

(b)、低能氮离子注入-氯化锂复合诱变：取0.1mL的步骤(a)中孢子悬液均匀涂布于无菌空平皿上，镜检无细胞重叠者进行低能氮离子注入。本实验低能氮离子注入机为多功能注入机。分别在10KeV、14KeV、16KeV、18KeV的能量下对阿维链霉菌进行离子注入。注入剂量分别为40×10¹⁴ions/cm²、80×10¹⁴ions/cm²、120×10¹⁴ions/cm²、160×10¹⁴ions/cm²、200×10¹⁴ions/cm²、240×10¹⁴ions/cm²。靶室真空度为10^-3Pa，以20S脉冲式注入，间隔15s，靶室内放置不接受注入的对照样。实验结果见图2，确定诱变能量16KeV，诱变剂量160×10¹⁴ions/cm²为最佳低能氮离子注入诱变条件。离子注入完毕后，取出平皿，在无菌环境下用1ml无菌水洗脱，涂布到氯化锂平板培养基上，在26～30℃下倒置培养6～7d。

(c)、紫外线-氯化锂复合诱变：取5mL步骤(a)中孢子悬液移入含有磁力转子的无菌空平板中，至于磁力搅拌器上。先开启20W紫外灯预热20min，再调整培养皿高度于紫外灯下30cm处，打开平皿盖，分别照射30s、45s、60s、75s、90s，诱变结束后取菌悬液涂布于氯化锂平板培养基上，于26～30℃条件下倒置避光恒温培养6～7d。实验结果见图3，确定60s为紫外诱变最佳时间，此时正突变率最高，达到18.1％。

(d)、诱变菌株的筛选：

初筛：将步骤(b)和步骤(c)诱变得到的单菌落接至斜面培养基上，在26～30℃下培养6～7d后，铲取二分之一的菌体于离心管中，用0.5mL丙酮浸泡12～15h，然后加入0.25mL乙酸乙酯，快速混匀，3000rpm离心10min，取上清液，取上清液测定各菌株浸取液中阿维菌素B1a效价，留取50％的高效价菌株上摇瓶发酵进行复筛。

复筛：将初筛筛选到的菌株经斜面培养后接入种子培养基中于26～30℃、180～220rmp摇床转速下扩大培养30～45h，以2～10％(v/v)的接种量接入发酵培养基，在26～30℃、180～240rpm摇床转速下培养8～10d下摇床，取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液测定发酵液中阿维菌素B1a效价。取发酵液阿维菌素B1a效价最高的菌株作为下次诱变的出发菌株，重复步骤(a)～(d)，如图1所示。最后筛选出阿维菌素B1a产量高的目标菌株streptomycesavermitilis AVE07-N2-16515。

步骤(b)和步骤(c)中所用的氯化锂平板培养基为：可溶性淀粉1.0％，(NH₄)₂SO₄ 0.25％，NaCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.12％，K₂HPO₄·3H₂O 0.3％，CaCO₃0.3％，氯化锂1.0moL·L^-1，琼脂粉1.5％，pH 7.2～7.4，蒸馏水配置。

步骤(a)及(d)中所用的斜面培养基为：可溶性淀粉1.0％，(NH₄)₂SO₄0.25％，NaCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.12％，K₂HPO₄·3H₂O 0.3％，CaCO₃0.3％，琼脂粉1.5％，pH 7.2～7.4，蒸馏水配置。

步骤(d)中所用的种子培养基为：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配置。

步骤(d)中所用的发酵培养基为：玉米淀粉6％，葡萄糖2％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配置。

实施例2：本实施例说明突变株的传代稳定性。

在以葡萄糖为速效碳源、玉米淀粉为迟效碳源的发酵培养基中，检测突变株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的传代稳定性，菌株传代发酵试验结果如表1所示：

表1高产突变菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515遗传稳定性试验

从实验结果可以看出，经过5次传代，突变菌株阿维链霉菌AVE07-N2-16515的阿维菌素B1a效价较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例3：本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

平板培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH₄)₂SO₄0.25％，NaCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.12％，K₂HPO₄·3H₂O 0.3％，CaCO₃0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配置。

斜面培养基：可溶性淀粉1.0％，(NH₄)₂SO₄0.25％，NaCl 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.12％，K₂HPO₄·3H₂O 0.3％，CaCO₃0.3％，琼脂粉1.5％，pH7.2～7.4，蒸馏水配置。

种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配置。

发酵培养基：玉米淀粉6％，葡萄糖2％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配置。

将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产阿维菌素B1a效价为3035μg/mL，相对于原始出发菌株提高了22.9％，发酵液中阿维菌素B1a色谱图见图4。

实施例4：本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

发酵培养基：玉米淀粉8％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配置。

将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为72，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产阿维菌素B1a效价为2987μg/mL，相对于原始出发菌株提高了21.0％。

实施例5：本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

种子培养基：种子培养基：玉米淀粉1.5％，葡萄糖1.0％，花生饼粉1.0％，黄豆饼粉0.8％，酵母粉0.5％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH7.0～7.2，自来水配置。

发酵培养基：葡萄糖8％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配置。

将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产阿维菌素B1a效价为3006μg/mL，相对于原始出发菌株提高了21.7％。

实施例6：本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

发酵培养基：麦芽糖8％，花生饼粉1.4％，黄豆饼粉1.2％，酵母粉0.3％，CoCl₂·6H₂O 0.0003％，淀粉酶4u/g淀粉，pH 7.0～7.2，自来水配置。

将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到发酵培养基中，初始pH为7.2，接种量为6％(v/v)，250mL培养瓶中装液量为50mL，培养温度为28.5℃，220rpm转速下培养9d(216h)，发酵产阿维菌素B1a效价为2895μg/mL，相对于原始出发菌株提高了17.3％。

实施例7：本实施例说明阿维菌素B1a高产菌株AVE07-N2-16515发酵生产阿维菌素B1a的工艺。

本实施例所用的培养基配方：

将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为28℃，培养时间为7d；将平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，28℃培养7d后，取斜面培养物接种至种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为30mL，培养温度为28℃，200rpm转速下培养32h；将种子培养液接种到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量为10％(v/v)，发酵温度28.5℃，搅拌转速100rpm。发酵培养216h后检测阿维菌素B1a效价达到3048μg/mL，相对于原始出发菌株提高了23.4％。

实施例8：本实例说明发酵液中阿维菌素B1a效价的检测方法。

仪器设备：高效液相色谱仪、色谱工作站、离心机、超声清洗器、漩涡混合器、微量进样器、微孔滤膜、色谱柱为Agilent不锈钢柱(内装填料PLRS-S，10nm，长250nm，内径4.6mm)等。

试剂：色谱甲醇、95％乙醇

检测条件：流动相为甲醇∶水(85∶15)；流速为1.0mL·min^-1；检测波长为245nm，进样量20μL。

操作步骤

(1)标样的制备

准确称取阿维菌素B1a标准品0.05g(精确至0.0002g)溶于50mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。再用移液管取1mL至10mL容量瓶，色谱甲醇溶解，并定容至刻度，备用。

(2)样品制备

取3mL发酵液于离心管中，3500rpm高速离心10min，弃上清液，加入甲醇至9mL，在快速混匀器上震荡30min；3500rpm高速离心10min，取上清液经一定稀释后用微孔滤膜过滤后进行HPLC检测。

在上述条件下，待仪器稳定后注入标样溶液连续两针标样B1a峰面积相对变化小于1.5％后，再将制备好的样品进样检测。图2为标样及发酵液中阿维菌素B1a色谱图。

(3)计算方法

阿维菌素B1a效价(μg/mL)＝(样品峰面积/标准品峰面积)×标准品浓度×稀释倍数。

Claims

1.一种阿维菌素B1a高产菌株，其分类命名为阿维链霉菌（streptomyces avermitilis）AVE07-N2-16515，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M 2012094。

2.权利要求1所述的阿维菌素B1a高产菌株在发酵生产阿维菌素B1a中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的发酵生产阿维菌素B1a的方法包含如下步骤：

(1)、平板培养：将阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种于平板培养基上，培养温度为26~30℃，培养时间为6~ 7d；

(2)、斜面培养：将步骤(1)平板培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到斜面培养基上，培养温度为26~30℃，培养时间为6~7d；

(3)、种子培养：将步骤(2)斜面培养的阿维链霉菌AVE07-N2-16515接种到种子培养基中，250mL培养瓶中装液量为20~50mL，培养温度为26~30℃，180~220rpm摇床转速下培养30~45h；

(4)、发酵培养：将步骤(3)中的种子培养液接种到发酵培养基中，接种量为按体积比2~10%接种，250mL培养瓶中装液量为35~65mL，培养温度为26~30℃，180~240rpm摇床转速下培养8~10d。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述平板培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH 7.2~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述斜面培养基包含如下质量百分数的组分：碳源0.5%~1.5%、氮源0.1%~0.3%、无机盐0.5%~1.0%、琼脂1.2%~1.8%、其余为水，pH 7.2~7.4；其中所述碳源为葡萄糖和可溶性淀粉中的一种或两种的混合；所述氮源为乙酸铵和硫酸铵中的一种或两种的混合；所述无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐中的一种或几种的混合。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述种子培养基包含如下质量百分数的组分：碳源2.0%~3.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%，淀粉酶3~5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0~7.2；其中所述碳源为玉米淀粉和葡萄糖中的一种或两种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉和酵母膏中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基包含如下质量百分数的组分：碳源5.0%~15.0%、氮源2.0%~4.0%、微量元素0.0001%~0.0004%，淀粉酶3~5u/g淀粉，其余为水，pH 7.0~7.2；其中所述碳源为玉米淀粉、葡萄糖和麦芽糖中的一种或几种的混合；所述氮源为花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉中的一种或几种的混合；所述的微量元素为氯化钴。