CN106609288B

CN106609288B - 一种通过优化发酵培养基提高工业阿维菌素B1a的产量的方法

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Publication number: CN106609288B
Application number: CN201510687755.8A
Authority: CN
Inventors: 陈虎杨; 黎亮; 郭美锦; 储炬; 庄英萍; 张嗣良; 王太富; 樊乐; 王得明
Original assignee: Qilu Pharmaceutical Inner Mongolia Co ltd; Shanghai Guojia Biochemical Engineering Technology Research Center Co ltd
Current assignee: Qilu Pharmaceutical Inner Mongolia Co ltd; Shanghai Guojia Biochemical Engineering Technology Research Center Co ltd
Priority date: 2015-10-21
Filing date: 2015-10-21
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2035-10-21
Also published as: CN106609288A

Abstract

本发明涉及一种通过优化发酵培养基提高阿维菌素B_1a的产量的方法。本发明人经过大量筛选发现，在阿维链霉菌发酵培养基中添加适当浓度的氯化钙能够显著地提高B_1a产量。本发明还提供了用于该方法的培养基。

Description

一种通过优化发酵培养基提高工业阿维菌素B1a的产量的方法

技术领域

本发明属于发酵生物学领域，更具体地，本发明涉及一种通过优化发酵培养基提高工业阿维菌素B_1a产量的方法。

背景技术

阿维菌素是由阿维链霉菌(Streptomyces aver-mitilis)生产的一组十六元大环内酯类抗生素(Burg R，Miller B，Baker E.Avermectins，new family of potentanthelmintic agents:producing organism and fermentation.Antimicrobial agentsand chemotherapy.1979，15(3):361)，具有广泛的杀虫和抗寄生虫等生物活性，在医药、农业及畜牧业上有着重要的作用(Campbell W C，Burg R， Fisher M.The discovery ofivermectin and other avermectins.1984，Pesticide Synthesis Through RationalApproaches.Chapter 1:5-20)。

阿维菌素包含八种组分A_1a，A_1b，A_2a，A_2b，B_1a，B_1b，B_2a，B_2b，但只有B_1a和B_1b具有药效，其中B_1a活性最高(Wann.K.T.The Cellular Actions of the Avermectins.Phytotherapyresearch.1987,1(4):331-334)。

但是，工业上利用阿维链霉菌大规模生产阿维菌素的生物发酵过程中，一直存在着产素期内B_1a产量不高的现象。

因此，改进工业发酵工艺，开发工业化高效生产B_1a的方法是本领域迫切需要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过优化发酵培养基提高工业阿维菌素B_1a产量的方法。

在本发明的第一方面，提供一种在利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素B_1a的过程中提高阿维菌素B_1a的产量的方法，所述方法包括：在阿维链霉菌的基本培养基中添加0.1±0.02g/L的氯化钙，利用该培养基培养阿维链霉菌，发酵生产阿维菌素B_1a。

在本发明的一个优选例中，所述的阿维链霉菌的基本培养基包括：可溶性淀粉，豆饼粉，酵母粉，酵母膏，硫酸铵，碳酸钙，氯化钴，钼酸钠，淀粉酶。

在本发明的另一优选例中，所述的阿维链霉菌的基本培养基包括：

在另一优选例中，所述的阿维链霉菌的基本培养基包括：

在另一优选例中，所述的阿维链霉菌的基本培养基包括：

上述发酵培养基中，各组分在基本培养基中的含量还可以在±10％的范围内，更佳地±5％的范围内浮动。应理解，可以预期在一定范围内配方的调整仍然可实现所需的技术效果。

在本发明的另一优选例中，添加0.1±0.02g/L的氯化钙的培养基的pH值为7.3～7.6。

在本发明的另一方面，提供一种用于利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素 B_1a的发酵培养基，所述发酵培养基包括：阿维链霉菌的基本培养基以及0.1 ±0.02g/L的氯化钙。

在本发明的一个优选例中，述的阿维链霉菌的基本培养基包括：可溶性淀粉，豆饼粉，酵母粉，酵母膏，硫酸铵，碳酸钙，氯化钴，钼酸钠，淀粉酶。

在本发明的另一优选例中，所述的发酵培养基中，所述的阿维链霉菌的基本培养基包括：

在本发明的另一优选例中，添加0.1±0.02g/L的氯化钙的培养基的pH 值为7.3～7.6。

在本发明的另一方面，提供一种用于利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素 B_1a的试剂盒，所述试剂盒中包括所述的发酵培养基。

在本发明的另一方面，提供所述的发酵培养基的用途，用于在利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素B_1a的过程中提高阿维菌素B_1a的产量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、发酵培养基中添加不同钙盐对阿维菌素B_1a效价的影响。不同的钙盐包括：硝酸钙、硫酸钙、碳酸钙、氯化钙、乳酸钙。

图2、实验组与对照组OUR的时序变化。

图3、实验组与对照组pH的时序变化。

图4、实验组与对照组总糖的时序变化。

图5、实验组与对照组粘度的时序变化。

图6、实验组与对照组PMV的时序变化。

图7、实验组与对照组B_1a的时序变化。

图8、实验组与对照组的B_1a效价。

图9A-B、标准品B_1a的HPLC图谱(A)以及放罐后收集的发酵液的 HPLC图谱(B)。

具体实施方式

针对工业上利用阿维链霉菌生产阿维菌素的生物发酵过程中产素期内 B_1a产量不高的现象，本发明人采取向发酵培养基中添加不同浓度的各种化合物，以筛选到能够有效提高阿维菌素B_1a产量的物质。经过大量的研究和筛选，发现在阿维链霉菌发酵培养基中添加适当浓度的氯化钙能够极其明显地提高B_1a产量。在此基础上完成了本发明。

工业规模利用阿维链霉菌生物法生产阿维菌素的培养基中，碳源主要是玉米淀粉。然而，本发明人在研究中发现，阿维链霉菌在利用玉米淀粉时需要通过自身淀粉酶的水解，因此胞内淀粉酶的活力大小将影响菌体对淀粉的利用，进而对B_1a合成途径产生影响。

本发明人的进一步研究发现，通过在发酵培养基中添加一定量的氯化钙，可显著地提高菌体对底物淀粉的利用效率，增强菌体代谢能力，提高阿维菌素B_1a合成通量。

在本发明的具体实施例中，针对工业阿维菌素生物发酵过程中产素期内 B_1a产率不高的现象，采取向发酵培养基中添加不同浓度的氯化钙、硝酸钙、硫酸钙、碳酸钙、乳酸钙等钙盐的方法，发现在发酵培养基中添加0.1g/L氯化钙能明显提高B_1a产量。与原发酵培养工艺相比，摇瓶中添加0.1g/L氯化钙的B_1a产量提高了22.50％，中试500L发酵罐的阿维菌素B_1a产量提高了 20.86％。可见氯化钙的添加可大大提高阿维菌素B_1a产量，具有极其显著的进步。

基于本发明人的新发现，还提供了一种用于利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素B_1a的发酵培养基，所述发酵培养基包括：阿维链霉菌的基本培养基以及0.1±0.02g/L的氯化钙。

所述的阿维链霉菌的基本培养基可以采用本领域技术人员已知的用于阿维链霉菌培养的培养基，在其中添加本发明建议添加的氯化钙即可。

作为本发明的优选方式，提供了一种用于阿维链霉菌发酵生产阿维菌素 B_1a的发酵培养基，包括：

	含量	较佳含量	更佳含量
				可溶性淀粉	8-20g/L	10-15g/L	12.5g/L
豆饼粉	1-4g/L	1.5-3g/L	2.0g/L
				酵母粉	0.2-1g/L	0.3-0.7g/L	0.5g/L
酵母膏	0.08-0.6g/L	0.1-0.4g/L	0.2g/L
				硫酸铵	0.001-0.008g/L	0.001-0.005g/L	0.003g/L

碳酸钙	0.02-0.1g/L	0.03-0.08g/L	0.05g/L
				氯化钴	0.0001-0.001g/L	0.0002-0.0008g/L	0.0004g/L
钼酸钠	0.0001-0.001g/L	0.0002-0.0008g/L	0.0003g/L
				淀粉酶	0.02-0.15g/L	0.03-0.08g/L	0.057g/L

上述更佳含量的发酵培养基中，各组分在基本培养基中的含量还可以在±10％的范围内，更佳地±5％的范围内浮动。应理解，可以预期在一定范围内配方的调整仍然可实现所需的技术效果。

上述列出的各组分均是本领域技术人员已知的组分，可以通过商业途径购买获得。

在进行培养基优化的基础上，所述的阿维链霉菌的培养方法可以采用本领域已知的方法。作为本发明的优选方式，利用发酵罐进行较大规模的发酵：在28±1℃左右，罐压0.05±0.01MPa左右，通气量为1：1(vvm)，发酵10 ±1小时开搅拌，转速为250±30rpm，发酵周期为约300-360小时。发酵约 140-160小时开始，每隔24±3小时间歇补加1.5±0.3kg的淀粉。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

阿维链霉菌由内蒙古齐鲁制药(内蒙古)有限公司提供。

1.1.2仪器、设备

100L全自动机械搅拌不锈钢高级发酵罐：上海国强生化工程装备有限公司。

500L全自动机械搅拌不锈钢高级发酵罐：上海国强生化工程装备有限公司。

尾气质谱仪：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.1.3培养基

斜面培养基配方如表1。

表1(单位：g/L)

种子培养基配方如表2。

表2(单位：g/L)

发酵培养基配方如表3。

表3

1.2测定分析方法

1.2.1总糖测定

采用菲林法，如张云贵，刘祥云，李天俊；《生物化学实验指导》，天津科学技术出版社，2005中所记载的。

1.2.2菌浓PMV测定

取样摇匀发酵液后，准确量取10mL发酵液于带刻度的离心管中，离心机转速为4000转/分钟，离心10分钟，测得沉淀物的体积占10mL发酵液体积的百分含量即得PMV。

1.2.3粘度测定方法

取5mL发酵液倒入DV-111Plus流变仪(Brookfield engineeringlaboratoriesinc.，USA)的样品适配器中，根据发酵液粘度高低选择合适转子，设定测定流变控制程序，即确定初始转速和最终转速及转速增量。开始程序后测定的参数即为发酵液粘度值。

1.2.4阿维菌素测定方法

取样品液2.0mL于50mL容量瓶中，用分析纯甲醇稀释，定容至50mL，超声破碎20分钟，过滤，取上清液HPLC测定阿维菌素B1a效价。

色谱条件如下：

色谱柱为C18反相柱(250×4.6mm)；

检测波长为246nm；

流动相为V(甲醇)：V(水)＝(87:13)；

流速为1.0mL/min；

柱温25℃；

进样量：20uL。

根据积分面积，利用外标法计算出发酵液中B_1a效价。

II.实验结果与分析

实施例1、发酵摇瓶培养

发酵培养基中分别添加0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L三组不同浓度的不同种钙盐，如表4。

表4、钙盐添加方案

种子摇瓶：用接种铲挖取1cm²种子斜面接种到种子摇瓶中进行培养，种子摇瓶为500ml，装液量60ml，摇床转速250rpm/min，28℃恒温条件下培养2天。种子摇瓶不添加氯化钙，无诱导、无搅拌、无通气。

发酵摇瓶：种子摇瓶取2ml培养好的种子液至发酵摇瓶中进行发酵培养，发酵摇瓶为500ml，装液量40ml，摇床转速250rpm/min，28℃恒温条件下培养10天。发酵摇瓶培养为批发酵，过程无操作变量，即不添加氯化钙，无诱导、无搅拌、无通气。

培养10天后，测定发酵液中阿维菌素B_1a效价，结果见图1。

由图1可见，发酵摇瓶培养10天后，对照组中B_1a平均总效价为1.20×10⁵ U；实验组中，除了添加0.1g/L氯化钙高于对照组外，其它钙盐的添加与对照组相比无明显优势，添加0.1g/L氯化钙的B_1a平均总效价为1.47×10⁵U。

发酵摇瓶培养基中添加不同钙盐的实验结果表明，发酵培养基中添加0.1 g/L的氯化钙有利于阿维菌素B_1a的合成，阿维菌素的B_1a产量比对照组显著提高了22.50g/L。但是，本发明人也发现，添加其它类型的钙盐效果不明显。

实施例2、发酵罐培养

100L高级发酵罐作为种子罐，500L高级发酵罐作为发酵罐。对照组发酵培养基不作变化，实验组发酵培养基中添加0.1g/L的氯化钙。

种子罐

采用100L高级发酵罐。消后pH调至7.5，发酵液体积为60L，培养温度28℃，罐压0.05MPa，通气量为1：1.5(vvm)，发酵25小时开搅拌，转速为300rpm，培养40小时转种，接种方式为管道接种，转种量为8％。培养过程无其他操作变量，即不添加氯化钙、无诱导。

发酵罐

采用500L高级发酵罐。消后pH调至7.2，发酵液体积为300L，培养温度28℃，罐压0.05MPa，通气量为1：1(vvm)，发酵10小时开搅拌，转速为250rpm，发酵周期为330小时。培养过程中不补加氯化钙、无诱导，发酵150小时开始，每隔24小时间歇补加1.5kg的淀粉(补料液中淀粉含量按 20％w/v进行配料灭菌)。

培养10天后，测定发酵液中阿维菌素B_1a效价。

表5、钙盐添加方案

对照组	原始的发酵培养基
		实验组	发酵培养基中添加0.1g/L的氯化钙

发酵过程中相关参数变化见图2至图7。其中，实验组与对照组OUR的时序变化见图2。实验组与对照组pH的时序变化见图3。实验组与对照组的发酵液中总糖的时序变化见图4。实验组与对照组的发酵液粘度的时序变化见图5。实验组与对照组的发酵液中PMV的时序变化见图6。实验组与对照组的发酵液中B_1a的时序变化见图7。

由阿维菌素发酵过程参数结果表明，阿维菌素为典型的非生长相关性产物，随着培养周期的进行：

生长期前期(0-15h)内：OUR增大、pH回升、总糖下降、粘度与PMV 增大；

生长后期(15-40h)内：OUR下降、pH回升、总糖下降、粘度与PMV增加；

生长与产素(即生产阿维菌素)的过渡期(40-60h)内：OUR相对稳定、pH 下降、总糖下降、粘度下降、PMV相对稳定；

产素期(60h-放罐)内：OUR缓慢下降、pH缓慢下降、总糖不断下降、 PMV与粘度相对平稳、B_1a效价增加。

发酵前期OUR快速上升、pH回升、粘度与PMV增大，总糖含量下降等现象表明，生长期内菌体利用培养基中的营养成分快速繁殖、生物量不断增加，该时期菌体对氮源分解速率超过对碳源的分解速率，随着有机氮源中的碳骨架被利用合成菌体，脱去的含氮部分使得发酵液中pH回升。与对照组对比，生长期内添加0.1g/L氯化钙的实验组中，OUR、pH值、PMV较高，而总糖及粘度较低，表明实验组中添加的氯化钙促进了菌体对碳、氮源的利用，提高了菌体的代谢能力，分解和利用碳、氮源速度较快，菌体生物量较多，并且菌体成球数量较多。

发酵中后期，实验组与对照组相比，OUR较高、pH较低、总糖含量较低、B_1a效价较高。这一结果表明，实验组中添加0.1g/L氯化钙改善了阿维链霉菌在发酵前期菌体生长和代谢能力，提高产素期内阿维菌素B_1a组分的合成。

最终在放罐时，对照组中B_1a效价为6049U/ml，放罐总效价为1.39×10⁹ U；添加氯化钙实验批B_1a效价为7200U/ml，放罐总效价为1.68×10⁹U，与对照组相比，添加氯化钙实验组中B_1a总产量显著提高了20.86％。

取发酵上清液HPLC测定阿维菌素B1a效价，实验组与对照组的B_1a效价见图8。

进行HPLC检测，结果如图9。由HPLC测定结果可见，标品的出峰时间为10.740min，发酵液样品的出峰时间为10.782min，并且出峰附近无杂峰。该结果表明添加氯化钙的发酵工艺下，发酵产品主要为B_1a，并且B_1a组分纯度也较高。

结论：

通过上述实验结果表明，发酵培养基中添加0.1g/L氯化钙有利于提高阿维菌素B_1a的产量。其中，发酵摇瓶中B_1a产量提高了22.50％，500L发酵罐中B_1a产量提高了20.86％。

本发明的技术方案的实施，将为阿维菌素生物发酵科技进步作出贡献的同时，也可使得企业在生产上获得巨大经济效益。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种在利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素B_1a的过程中提高阿维菌素B_1a的产量的方法，其特征在于，所述方法包括：在阿维链霉菌的发酵培养基中添加0.1g/L的氯化钙，利用该培养基培养阿维链霉菌，发酵生产阿维菌素B_1a，所述的阿维链霉菌的发酵培养基为：

且，添加0.1g/L的氯化钙的发酵培养基的pH值为7.3～7.6。

2.一种用于利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素B_1a的发酵培养基，其特征在于，包括：阿维链霉菌的发酵培养基以及0.1g/L的氯化钙；所述的阿维链霉菌的发酵培养基为：

且，添加0.1g/L的氯化钙的培养基的pH值为7.3～7.6。

3.一种用于利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素B_1a的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求2所述的发酵培养基。

4.权利要求2所述的发酵培养基的用途，其特征在于，用于在利用阿维链霉菌发酵生产阿维菌素B_1a的过程中提高阿维菌素B_1a的产量。