CN103014092B - 一种提高丝裂霉素c产率的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高丝裂霉素C产率的制备方法，该方法向丝裂霉素C的发酵培养基中添加含瓜氨酸和精氨酸复合前体，以及HP-21树脂，制备出专用发酵培养基，将产生丝裂霉素C的头状链霉菌依次通过斜面培养基、种子培养基培养后，再转接于制备的专用发酵培养基培养。由于瓜氨酸和精氨酸复合前体的作用使得发酵产生的有效复合物中丝裂霉素C含量大幅度提高至30-45％，从而可以大幅降低丝裂霉素C的生产成本，因此该制备丝裂霉素C的方法具有良好的工业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高丝裂霉素C产率的制备方法，属于抗生素微生物发酵培养领域。
背景技术
丝裂霉素C是属于苯醌类抗生素，是一类具有独特结构和独特生物活性作用抗生素它的分子结构：
丝裂霉素C是有头状链霉菌产生的属于苯醌化合物的一种，丝裂霉素C不但具有广谱抗肿瘤作用，而且对青光眼、慢性泪囊炎等眼科疾病有良好的治疗作用，具有良好的应用前景。但目前工业上通过发酵培养方法生产丝裂霉素C时，所产生的产物中丝裂霉素C的含量通常仅占约12％以下，有时甚至只有痕迹量。
因此研发出一种提高丝裂霉素C产率的方法以降低生产成本、适应工业化生产的需要是本领域亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种丝裂霉素C的制备方法，采用该方法发酵产生的活性产物丝裂霉素C含量高，在代谢活性产物中含量可达30-45％，具有良好的工业化生产前景。
实现本发明的目的的技术方案是一种提高丝裂霉素C产率的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备专用发酵培养基：向丝裂霉素C的发酵培养基中添加含瓜氨酸和精氨酸复合前体，以及HZ-21大孔吸附树脂，每升发酵培养基添加0.02-0.06升复合前体溶液，每升发酵培养基添加2—5克HZ-21大孔吸附树脂，用质量百分比浓度不超过10%的碱溶液将pH值调至7.1-7.2，复合前体溶液的配制方法：每升纯化水中加瓜氨酸10—15克、精氨酸5—7.5克，且所加瓜氨酸与精氨酸的质量比为2:1，均质后至少静置20小时后使用；
（2）将产生丝裂霉素C的头状链霉菌接种于斜面培养基上进行培养，在28±2℃培养6-8天，然后接种于种子培养基培养，在28±2℃培养30-48小时，再转接于步骤（1）制备的发酵培养基于28±2℃培养168-192小时，当代谢产物中丝裂霉素C含量最高时放罐，从中回收HP-21大孔吸附树脂；
（3）然后向回收过HZ-21大孔吸附树脂后的发酵培养液中先加入质量为发酵培养液质量0.01％—0.05％的十二烷基磺酸钠，再加入质量为为发酵培养液质量0.01％—0.02％的硫酸锌，用质量百分比浓度不超过10%的碱溶液将pH值调至8.0-10.0后过滤，滤液再上HZ-21大孔吸附树脂柱动态吸附；
（4）合并回收的HZ-21大孔吸附树脂和动态吸附后的HZ-21大孔吸附树脂柱中的树脂，并对合并后的所有树脂进行提取和精制即得到丝裂霉素C产品。
且所用头状链霉菌为头状链霉ATCC27422或头状链霉ATCC27422的诱变菌种。步骤（4）提取和精制的过程为依次进行动态解析、浓缩、萃取、层析、再浓缩、结晶、真空干燥。
由上述技术方案可知，本发明向丝裂霉素C的发酵培养基中添加含瓜氨酸和精氨酸复合前体，以及HP-21树脂，制备出专用发酵培养基，，将产生丝裂霉素C的头状链霉菌依次通过斜面培养基、种子培养基培养后，再转接于制备的专用发酵培养基培养。由于瓜氨酸和精氨酸复合前体的作用使得发酵产生的有效复合物中丝裂霉素C含量大幅度提高至30-45％，从而可以大幅降低丝裂霉素C的生产成本，因此该制备丝裂霉素C的方法具有良好的工业化前景。
附图说明
图1为实施例1的高效液相图谱，图中横坐标是时间、纵坐标是峰高。
图2为实施例1的红外图谱，图中纵坐标是透过度、横坐标是波数。
图3为实施例2的高效液相图谱，图中横坐标是时间、纵坐标是峰高。
图4为实施例2的红外图谱，图中纵坐标是透过度、横坐标是波数。
具体实施方式
以下实施例用来说明本发明，但不限制本发明范围。
实施例1
本实例所用的产生丝裂霉素C的菌种为头状链霉菌ATCC27422，培养基选用适合培养放线菌的常用培养基即可，本实施例中实际用的斜面培养基组成为淀粉1.0％、碳酸钙0.1％、硝酸钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.03％、天冬酰胺0.002％、麸皮2.0％、琼脂2.0％、其余为水PH自然（上述百分比均为质量百分比）。于120℃灭菌30分钟，铺制成固体斜面，将菌种接种于此斜面上，在28±2℃培养8天，将生长良好的斜面菌种用挖块法接种于经过120℃灭菌30分钟的种子培养基中，种子培养基的组成葡萄糖1％、淀粉3％、豆饼粉2.0％、玉米浆0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.01％、玉米油0.2％、其余为水pH调为7.00（上述百分比均为质量百分比）。接种后在28℃旋转振荡42小时后，做为种子用于发酵。发酵培养基在种子培养基组分的基础上加入瓜氨酸、精氨酸复合前体溶液，以及HZ-21大孔树脂，每升发酵培养基添加0.02-0.06升复合前体溶液，每升发酵培养基添加2—5克HZ-21大孔吸附树脂，用5％的氢氧化钠调整培养基pH至7.10—7.20后，同样于120℃灭菌30分钟，将培养好的种子转接于加有瓜氨酸、精氨酸复合前体溶液及HZ-21大孔树脂的发酵培养基中。28℃培养8天至代谢产物中丝裂霉素C含量最高，放罐回收发酵液中的HZ-21大孔树脂和发酵培养液。复合前体溶液按如下方法配制：每升纯化水中加瓜氨酸10—15克、精氨酸5—7.5克，且所加瓜氨酸与精氨酸的质量比为2:1，静止24小时后使用。
向回收HZ-21大孔树脂后的发酵培养液中加入质量为发酵培养液质量0.01％—0.05％十二烷基磺酸钠，搅拌5分钟。再加入质量为发酵培养液质量0.01％—0.02％硫酸锌搅拌5分钟，用5％的氢氧化钠调正PH至8.0—10.0，静止30分钟。过板框压滤收集滤液。把HZ-21大孔树脂树脂装入树脂柱按4倍流速每小时过柱三遍。合并所有HZ-21大孔吸附树脂合并漂洗装柱。用丙酮洗脱收集洗脱液，真空浓缩。浓缩液用二氯甲烷萃取三次，合并萃取液真空浓缩，过氧化铝柱层析，按峰位收集合并。真空浓缩、低温结晶、真空干燥即得丝裂霉素C产品。
如图1、图2所示，经HPLC检测产物峰保留时间和丝裂霉素C标准品相同。再经红外检测与丝裂霉素C对照图谱一致。表明该产物可确认为丝裂霉素C。采用本实施例所得的主要组分丝裂霉素C的产率在复合物中所占比例可达34％。
实施例2
本实例所用的产生丝裂霉素C的菌种为头状链霉菌ATCC27422其斜面培养基组成为淀粉1.0％、碳酸钙0.1％、硝酸钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.03％、天冬酰胺0.002％、麸皮2.0％、琼脂2.0％、其余为水PH自然。于120℃灭菌30分钟，铺制成固体斜面，将菌种接种于此斜面上，在28±2℃培养6天，将生长良好的斜面菌种用挖块法接种于经过120℃灭菌30分钟的种子培养基中，种子培养基的组成葡萄糖2％、淀粉1％、豆饼粉1.5％、玉米浆0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.01％、玉米油0.2％、其余为水PH调为7.00。接种后在28℃旋转振荡48小时后，做为种子用于发酵。发酵培养基在种子培养基的基础上加瓜氨酸、精氨酸复合前体溶液和HZ-21大孔树脂，每升发酵培养基添加0.02-0.06升复合前体溶液，每升发酵培养基添加2—5克HZ-21大孔吸附树脂，用5％的氢氧化钠调整pH为7.10后，同样于120℃灭菌30分钟，将培养好的种子转接于发酵培养基中。28℃培养7天收获HP-21树脂和发酵培养液。复合前体溶液的配制与实施例1相同。
将100升发酵培养液先收取其中的HZ-21大孔积分树脂，再向发酵培养液加入重量为发酵培养液重量的0.05％的十二烷基磺酸钠，搅拌5分钟。再加入重量为发酵培养液重量的0.02％硫酸锌搅拌5分钟，用5％的氢氧化钠调整pH至8.0，静置30分钟。过板框压滤收集滤液。把HP-21树脂装入树脂柱按4倍流速每小时过柱三遍。合并收集的HP-21树脂漂洗装柱。用丙酮洗脱收集洗脱液，真空浓缩。浓缩液用二氯甲烷萃取三次，合并萃取液真空浓缩，过氧化铝柱层析，按峰位收集合并。真空浓缩、低温结晶、真空干燥即的产品。
如图3、图4所示，经HPLC检测产物峰保留时间和丝裂霉素C标准品相同。再经红外检测与丝裂霉素C（918图）对照图谱一致。表明该产物可确认为丝裂霉素C。采用本实例高产率发酵法所得的主要组分丝裂霉素C的产率在复合物中所占比例可达31.5％。
其中本发明采用了经过选育优化的头状链霉菌（Streptoverticliumcaespitosus）作为丝裂霉素C的产生菌，其为已知菌种，有关形态特征、培养特征、生理特征及产物的抗菌已有已知文献报道，本发明中所用为采购的头状链霉菌ATCC27422。当然头状链霉ATCC27422的诱变菌种以及所有能够产生丝裂霉素C的菌种也都可用作本发明中的种子。
本发明采用的用于培养微生物的培养基可加入能被利用的碳源、氮源、无机盐、有机盐和能被利用的痕迹量营养物，这些成分可预先一次性地加入培养基中或间歇或连续地加入培养基中，实现丝裂霉素C的高产率化。
Claims (2)
1.一种提高丝裂霉素C产率的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备专用发酵培养基：向丝裂霉素C的发酵培养基中添加含瓜氨酸和精氨酸复合前体，以及HZ-21大孔吸附树脂，每升发酵培养基添加0.02-0.06升复合前体溶液，每升发酵培养基添加2—5克HZ-21大孔吸附树脂，用质量百分比浓度不超过10％的碱溶液将pH值调至7.1-7.2，复合前体溶液的配制方法：每升纯化水中加瓜氨酸10—15克、精氨酸5—7.5克，且所加瓜氨酸与精氨酸的质量比为2:1，均质后至少静置20小时后使用，所述丝裂霉素C的发酵培养基的组成为葡萄糖1％、淀粉3％、豆饼粉2.0％、玉米浆0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.01％、玉米油0.2％、其余为水，pH调为7.00，百分比均为质量百分比；
(2)将产生丝裂霉素C的头状链霉菌ATCC27422接种于斜面培养基上进行培养，在28±2℃培养6-8天，然后接种于种子培养基培养，在28±2℃培养30-48小时，再转接于步骤(1)制备的发酵培养基于28±2℃培养168-192小时，当代谢产物中丝裂霉素C含量最高时放罐，从中回收HP-21大孔吸附树脂，所述斜面培养基组成为淀粉1.0％、碳酸钙0.1％、硝酸钾0.1％、硫酸镁0.05％、氯化钠0.05％、磷酸二氢钾0.03％、天冬酰胺0.002％、麸皮2.0％、琼脂2.0％、其余为水，pH自然；所述种子培养基组成为葡萄糖1％、淀粉3％、豆饼粉2.0％、玉米浆0.5％、氯化钠0.1％、磷酸二氢钾0.01％、玉米油0.2％、其余为水，pH调为7.00，百分比均为质量百分比；
(3)然后向回收过HZ-21大孔吸附树脂后的发酵培养液中先加入质量为发酵培养液质量0.01％—0.05％的十二烷基磺酸钠，再加入质量为为发酵培养液质量0.01％—0.02％的硫酸锌，用质量百分比浓度不超过10％的碱溶液将pH值调至8.0-10.0后过滤，滤液再上HZ-21大孔吸附树脂柱动态吸附；
(4)合并回收的HZ-21大孔吸附树脂和动态吸附后的HZ-21大孔吸附树脂柱中的树脂，并对合并后的所有树脂进行提取和精制即得到丝裂霉素C产品。
2.根据权利要求1所述的提高丝裂霉素C产率的制备方法，其特征在于：步骤(4)提取和精制的过程为依次进行动态解析、浓缩、萃取、层析、再浓缩、结晶、真空干燥。
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