CN116218690A - 一种产布雷非德菌素a的拟粗壮弯孢霉及其发酵方法 - Google Patents

一种产布雷非德菌素a的拟粗壮弯孢霉及其发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株拟粗壮弯孢霉(Curvul aria pseudorobusta)HDCC00041，于2022年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo. 40275。该菌株属于拟粗壮弯孢霉，可以发酵生产布雷菲尔德菌素A(简称BFA)；该菌株发酵液中的副产物少，BFA纯度高，更有利后续的提纯；该菌株可以耐受较高温度发酵，例如33℃，从而减少冷冻水的能源消耗；该菌株发酵周期短，相比于现有技术，可以提高BFA的生产效率；由于使用该菌株进行发酵，在能耗、后续提纯工艺、发酵周期短等方面的优势，使得工业化生产的成本更低，更有利于工业化放大生产。

Description

一种产布雷非德菌素A的拟粗壮弯孢霉及其发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种产布雷非德菌素A的拟粗壮弯孢霉及其发酵方法。
背景技术
1958年首次从Penicillium decumbens发酵液中发现Brefeldin A(BFA，布雷非德菌素A)，能诱导高尔基体分解、抑制蛋白质从内质网中转移为高尔基体的复合物，是具有抗真菌、抗病毒、抗有丝分裂、抗肿瘤等生物学活性的大环内酯类抗生素。美国肿瘤协会发现BFA能诱导肿瘤细胞分化，作为血疗法的试剂用于肿瘤治疗具有巨大的应用前景。目前，BFA作为一种重要的原料药已被广泛应用于医药领域。由于合成法制备BFA步骤繁琐，且收率低，成本高，不环保，而微生物合成BFA成本低，因此是主要的合成制备方式。
目前可以合成的BFA菌种较多，《Development of macrolide lactoneantibiotic brefeldin A fermentation process with Eupenicillium brefeldianumZJB082702》公开了通过Eupenicillium brefeldianum发酵得到，效价为1304.7mg/L。US3896002A公开通过Phyllosticta属的真菌发酵得到BFA，每10升培养基产量约3.0克。此外，Curvularia属的菌种产BFA也是一个研究方向，《Constituents of some Curvulariaspecies》首次公开在Curvularia属的菌种中发酵液中得到BFA，然而该文献发现了只有C.lunata菌种和C.subulata可以发酵得到，其中C.lunata的效价最高，有250mg/L。其后《Antiviral activity metabolites isolated from Curvularia pallescens》和《Brefeldin-A:an Antiproliferative Metabolite of the Fungus Curvulariatrifolii Collected from the Veracruz Coral Reef System,Mexico》也公开了在Curvularia pallescens和Curvularia trifolii的发酵液中发现了BFA，然而这些发酵得到的产量普遍偏低。为了寻找适合工业化生产BFA的菌种，申请人筛选得到了一株拟粗壮弯孢霉(Curvularia pseudorobusta)，其可以发酵得到BFA，且效价高，目前尚无文献公开报道该菌种可以得到BFA。
发明内容
为了得到一株布雷非德菌素A发酵效价高的菌株，本发明提供了一株拟粗壮弯孢霉(Curvularia pseudorobusta)HDCC00041，于2022年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40275。
CGMCC No.40275菌株经筛选、诱变后得到，该菌株可以在25℃发酵，甚至能耐受33℃的较高温度进行发酵。一般而言Curvularia属的菌种，或者拟粗壮弯孢霉无法耐受33℃进行发酵，或者在此温度下的活力大幅降低，而CGMCC No.40275菌株可以耐受33℃进行发酵。与25℃发酵时相比，在33℃下，CGMCC No.40275菌株可以将生产总周期由6d(40h+4d)缩短至4d(22h+3d)。一方面通过提高菌株的发酵时的适宜温度，从而降低冷却系统的动力成本消耗。另一方面可以缩短总的生产周期。
此外，CGMCC No.40275菌株于33℃培养3天，BFA产量高达8.9g/L，HPLC纯度为71.9％。更有利于后续的提纯、以及提高单位发酵体积下的产出量。
本发明还提供了一种所述拟粗壮弯孢霉的用途，用于制备布雷非德菌素A；
或者，用于制备含布雷非德菌素A的药品、饲料、添加剂、研究用试剂、抑菌剂中的一个或多个。
本发明还提供了一种所述拟粗壮弯孢霉的发酵产物。
本申请中所指的发酵产物为：微生物在培养基中经过培养后，形成含有活性成分的产物。
优选地，所述发酵产物为发酵液或种子液或培养液或菌悬液。
本发明还提供了一种所述发酵液的用途，用于制备布雷非德菌素A；
或者，用于制备含布雷非德菌素A的药品、饲料、添加剂、研究用试剂、抑菌剂中的一个或多个。
本发明还提供了一种所述拟粗壮弯孢霉生产布雷非德菌素A的发酵方法。
优选地，包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
优选地，所述可同化的碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甘油、大豆油、麦芽糊精、淀粉；或者所述可同化的碳源为葡萄糖和淀粉的组合。
优选地，所述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、蛋白胨、氨基酸、干酪素、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、麸质粉、酵母膏、牛肉膏；或者所述可同化的氮源为酵母抽提粉、蛋白胨和麸质粉的组合。
优选地，发酵培养基里还包括了无机盐。
优选地，所述拟粗壮弯孢霉的发酵温度为20～35℃；或者22～35℃；或者25～35℃；或者25～33℃；或者32～34℃；或者33℃。
优选地，所述拟粗壮弯孢霉的总发酵时间不超过6天；或者不超过5天；或者不超过4天。
有益效果：
1、本发明提供的CGMCC No.40275菌株属于拟粗壮弯孢霉，可以发酵生产BFA，而现有技术没有报道拟粗壮弯孢霉可以生产BFA；
2、本发明提供的CGMCC No.40275菌株产量高，并且发酵液中的副产物少，BFA纯度高，更有利后续的提纯，以及提高单位发酵体积下的产出；
3、本发明提供的CGMCC No.40275菌株可以在较高温度下发酵，例如33℃，从而降低因降温而带来的冷却系统的动力成本消耗；
4、本发明提供的CGMCC No.40275菌株发酵周期短，可以在更短的时间内发酵得到预期量的BFA；
5、由于使用本发明提供的CGMCC No.40275菌株进行发酵，在能耗、后续提纯工艺、发酵周期短等方面的优势，导致工业化生产中的成本更低，更有利于工业化放大生产。
附图说明
图1为Brefeldin A对照品的HPLC图谱。
图2为实施例5最终发酵液的HPLC图。
图3为通过正离子模式LCMS离子流扫描图谱,m/z＝281.2[M+H]+。
图4为通过负离子模式LCMS离子流扫描图谱,m/z＝279.3[M-H]-。
具体实施方式
下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中采用的材料、试剂等如无特殊说明，皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1
原始菌种分离纯化
在杭州市临安天目山取得野生石斛根茎叶，用自来水冲洗干净后用吸水纸吸干，再将其剪成小段，用无菌水反复冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。将处理好的材料在超净台中剪碎，加入无菌水，混匀，吸取清夜至PDA平板(含细菌抗生素)中，每个平板放2块，将第五次洗涤水稀释后涂布于PDA平板，以上平板都于25℃恒温培养10天。用打孔器将不同菌落挖块转移到涂有白色念珠菌的PDA平板培养基上，置于25℃培养7天，观察记录抑菌圈形成情况，筛选得到抑菌圈最明显的HZ-TM182号菌株。
将HZ-TM182号菌株菌落打散后接种到PDB培养基中，置于25℃培养3天，再以5％的比例接种到1.5倍浓度的PDB培养基中，置于25℃培养10天，取发酵液100ml，用4倍体积无水乙醇浸泡30min，真空旋转蒸发浓缩至178ml，加入3％大孔吸附树脂，吸附24h，分离收集树脂，将树脂用2倍体积的无水乙醇浸泡洗脱4h，分离树脂，继续用2倍体积的无水乙醇浸泡洗脱4h，合并洗脱液，真空浓缩至乙醇全部挥发，然后加入2ml无水乙醇复溶，以0.45μm膜过滤后进行检测，通过负离子模式LCMS离子流扫描图谱和正离子模式LCMS离子流扫描图谱确定得到的化合物分子量为280，与Brefeldin A(以下写作BFA)吻合。
实施例2
以HZ-TM182号菌株为试验对象，参照《真菌鉴定手册》、《中国真菌总汇》、《中国真菌》及《伯杰氏细菌鉴定手册》等进行形态学和生理生化性能研究。结果表明：该菌株菌落灰白色，毛绒状，孢子弯曲，有隔，有分枝，平滑，产孢细胞筒状，分生孢子弯曲，椭圆形，有3个隔膜，隔膜纵面见暗色晶体状点状物。较适宜生长温度为22～27℃，耐受生长温度为20～35℃；较适宜生长pH为5～6，耐受生长pH范围为4～7；可以利用甘油、葡萄糖、山梨糖、淀粉、硫酸铵、硝酸钾、尿素等营养物生长。
收集新鲜菌体，委托浙江工业大学生物工程研究所进行18S rDNA测序鉴定。该菌株的18S rDNA序列经校对后与GenBank数据库中相关种、属的序列进行同源序列BLAST比较，发现其和拟粗壮弯孢霉(Curvularia pseudorobusta)有很高的同源性，最高的达98.09％，同时结合菌株的形态学特征，将该菌株鉴定为拟粗壮弯孢霉(Curvulariapseudorobusta)。
实施例3
以HZ-TM182菌株孢子为实验对象，采用甲基磺酸乙酯进行诱变处理，经活化生长、点种纯化后获得突变菌落。突变菌落分别经种子和发酵培养后，筛选发酵液中BFA含量最高的菌株，结果获得菌株HDCC00041,该菌株于2022年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号·中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.40275。
实施例4
取CGMCC No.40275菌株甘油管，40℃解冻后取0.5ml接种PDA斜面，涂布均匀后置于25℃培养7天，获得成熟斜面孢子。然后刮取1cm2孢子接种到盛有100ml种子培养基的500ml三角瓶中，包扎好置于25℃、250rpm的摇床上振荡培养40h，控制种子液pH值5.0-6.0。将培养合格的种子液以2％(V/V)的比例接种到500ml发酵培养基中，包扎好置于25℃，培养4天。
发酵结束后，取发酵液1ml，用4倍体积无水乙醇浸泡30min，混匀后用无水乙醇继续稀释4倍，高速离心后取上清液采用HPLC检测，结果发酵液中BFA含量为8.7g/L，HPLC纯度为70.3％。
种子培养基配方组成为：葡萄糖1.5％，玉米淀粉1.5％，酵母抽提粉0.5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.2％，七水硫酸镁0.2％，碳酸钙0.2％，消毒前调pH至6.0，消毒条件为121～123℃、30min。
发酵培养基配方组成为：葡萄糖2％，玉米淀粉4％，可溶性淀粉4％，酵母抽提粉2％，蛋白胨1％，麸质粉1％，消毒前调pH至5.5，消毒条件为121～123℃、30min。
实施例5
同实施例4，区别在于，将CGMCC No.40275菌株在33℃的摇床上振荡培养种子液，培养时间为22h，随后将种子液以5％(V/V)的比例接种到装有25ml发酵培养基的摇瓶中，于33℃培养3天后结束发酵，发酵液经HPLC检测得到如图2所示的谱图，经计算得到发酵液中BFA含量为8.9g/L，HPLC纯度为71.9％。
对比例1
同实施例4，区别在于，培养的菌株为HZ-TM182菌株，该菌株在500ml液体发酵培养基中培养6天。发酵结束后，用HPLC测得发酵液中BFA含量为0.027g/L，HPLC纯度为20.3％。
对比例2
同实施例4，区别在于，培养的菌株为HZ-TM182菌株，发酵培养温度为33℃，该菌株在500ml液体发酵培养基中培养6天。发酵结束后，用HPLC测得发酵液中BFA含量为0.019g/L，HPLC纯度为16.5％。

Claims (11)

1.一株拟粗壮弯孢霉(Curvularia pseudorobusta)HDCC00041，于2022年8月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.40275。
2.一种如权利要求1所述拟粗壮弯孢霉的用途，其特征在于：
用于制备布雷非德菌素A；
或者，用于制备含布雷非德菌素A的药品、饲料、添加剂、研究用试剂、抑菌剂中的一个或多个。
3.一种含如权利要求1所述拟粗壮弯孢霉的发酵产物。
4.一种如权利要求3所述的发酵产物，其特征在于：
所述发酵产物为发酵液或种子液或培养液或菌悬液。
5.一种如权利要求4所述发酵液的用途，其特征在于：
用于制备布雷非德菌素A；
或者，用于制备含布雷非德菌素A的药品、饲料、添加剂、研究用试剂、抑菌剂中的一个或多个。
6.一种用如权利要求1所述拟粗壮弯孢霉生产布雷非德菌素A的发酵方法。
7.如权利要求6所述的发酵方法，其特征在于：
包括在含有可同化的碳源和/或氮源的发酵培养基里，进行发酵。
8.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于：
所述可同化的碳源选自葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、甘油、大豆油、麦芽糊精、淀粉；或者所述可同化的碳源为葡萄糖和淀粉的组合。
9.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于：
所述可同化的氮源选自酵母抽提粉、酵母粉、蛋白胨、氨基酸、干酪素、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉、麸质粉、酵母膏、牛肉膏；或者所述可同化的氮源为酵母抽提粉、蛋白胨和麸质粉的组合。
10.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于：
所述拟粗壮弯孢霉的发酵温度为20～35℃；或者22～35℃；或者25～35℃；或者25～33℃；或者32～34℃；或者33℃。
11.如权利要求7所述的发酵方法，其特征在于：
所述拟粗壮弯孢霉的总发酵时间不超过6天；或者不超过5天；或者不超过4天。
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