CN104419657A - 高生长及产酸速率的d-乳酸生产菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株高生长及产酸速率的D-乳酸生产菌及其应用，属有机酸发酵生产领域。本发明还涉及生产D-乳酸的方法。

Description

高生长及产酸速率的D-乳酸生产菌及应用
技术领域
本发明涉及一株高生长及产酸速率的D-乳酸生产菌及其应用，属有机酸发酵生产领域。 
背景技术
D-乳酸是一种重要的手性中间体和有机合成原料，广泛应用于化工、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域。近年来，高光学纯度的D-乳酸因其在提高聚乳酸材料性能方面的实际应用而得到了较多的关注。目前D-乳酸的生产方法主要包括化学合成法、酶法和微生物发酵法。与化学合成法和酶法相比，微生物发酵法具有原料来源广泛、生产成本低和环境友好等优点，已成为全世界近90%手性乳酸生产所采用的方法。2006年，Tanaka等以脱脂米糠为原料，利用Lactobacillus delbrueckii IFO3202发酵生产D-乳酸，发酵36h，D-乳酸最高产量达28g/L，光学纯度达97.5%（Tanaka T, Hoshina M, Tanabe S, et al. Production of D-lactic acid from defatted rice bran by simultaneous saccharification and fermentation. Bioresource Technology，2006年，97卷211~217页）。中国专利CN200610097453.6公开了一种组合发酵生产D-乳酸的工艺，产酸75~131g/L。南京工业大学何冰芳等利用离子束诱变技术，选育获得一株稳定高产菌株Sporolactobacillus sp. Y2-8，其D-乳酸的最高产量达143.6g/L（ZL200810098908.5）。2011年，许平等报道了以花生粕为氮源，利用菌株Sporolactobacillus inulinus CASD补料半连续发酵生产D-乳酸，其最高产量达到207g/L（Wang LM, Zhao B, Li FS, et al. Highly efficient production of D-lactate by Sporolactobacillus sp. CASD with simultaneous enzymatic hydrolysis of peanut meal. Applied Microbiology Biotechnology, 2011年89卷1009~1017页）。然而与L-乳酸生产相比，目前D-乳酸在发酵菌种的多样性及发酵水平方面仍具有较大的差距，因此进一步改良D-乳酸的生产菌株，尤其是进一步提高菌株的发酵速率对于推动D-乳酸工业的发展及扩大D-乳酸应用领域具有重要的意义。 
发明内容
本发明涉及一株优良的芽孢乳杆菌及其在制备D-乳酸中的应用。 
具体地，本发明涉及一株高生长及产酸速率的D-乳酸生产菌，已于2012年12月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国，武汉，武汉大学），其分类命名为芽孢乳杆菌（Sporolactobacillussp.）BS1-5，保藏登记号为CCTCC No. M2012516，其更具体地分类为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）。 
本发明提供了芽孢乳杆菌BS1-5在D-乳酸生产中的应用。 
在一个实施方案中，本发明提供了芽孢乳杆菌BS1-5在缩短D-乳酸发酵时间中的应用。 
在一个实施方案中，本发明提供了芽孢乳杆菌BS1-5在提高D-乳酸产量中的应用。 
在一个实施方案中，本发明提供了芽孢乳杆菌BS1-5在提高D-乳酸产酸速率中的应用。 
本发明提供了一种生产D-乳酸的方法，其包括将芽孢乳杆菌BS1-5进行培养和发酵后获得D-乳酸。 
本发明提供了一种生产D-乳酸的方法，其包括以下步骤： 
1）平板培养：将芽孢杆菌BS1-5接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30~45℃，培养时间20~48h；
2）种子培养：将经步骤1）平板培养的芽孢杆菌接种至种子培养基厌氧培养，培养温度30~45℃，培养时间12~24h；
3）发酵产酸：将步骤2）获得的种子培养液接种至发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3%~15%，发酵温度30~45℃，以总流速0.05~0.2L/min量通入氮气，采用中和剂将发酵体系pH控制在4.5~7.0。
在一个实施方案中，所述平板培养基含有葡萄糖10~30g/L，酵母膏1~3g/L，无水乙酸钠1~4g/L，无水硫酸镁0.1~0.4g/L，磷酸二氢钾1~3g/L，琼脂18g/L，水余量。 
在一个实施方案中，所述种子培养基的碳源包括浓度为10~40g/L的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为2~20g/L的尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮的一种或多种的混合物；无水硫酸镁0.1~0.4g/L，碳酸钙10~30g/L，水余量。 
在一个实施方案中，所述的发酵包括批次发酵和间歇补料发酵。 
在一个优选的实施方案中，间歇补料发酵包括在发酵18~48h后补加碳源，进行D-乳酸的发酵生产。 
在一个优选的实施方案中，所述批次发酵培养的碳源包括浓度为100~180g/L的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为10~40g/L的尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无水硫酸镁0.1~1g/L，水余量。 
在一个优选的实施方案中，所述间歇补料发酵培养基的初始碳源包括浓度为50~100g/L的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；补加碳源为葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物，通过补加使得间歇补料发酵的总体积及碳源浓度与批次发酵的体积及碳源浓度相同；氮源及生长因子包括浓度为10~40g/L的尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无水硫酸镁0.1~1g/L，水余量。 
在一个实施方案中，发酵产酸所用的中和剂选自碳酸钠、氢氧化钠、氧化钙、碳氨、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水、碳酸钙中的一种或组合，优选碳酸钠和/或碳酸钙。 
本发明涉及的高生长及产酸速率的D-乳酸生产菌是以芽孢乳杆菌Y2-8为出发菌株，利用常压室温等离子技术诱变，通过高糖-溴甲酚绿平板和摇瓶发酵筛选获得的，并经传代实验证实菌株具有良好的遗传稳定性。 
本发明提供的D-乳酸生产菌生长旺盛，产酸快速且经多次传代后菌株不退化，具有较好的遗传稳定性。利用本发明的菌株实现了D-乳酸的高效发酵生产，测试结果显示，以碳酸钙为中和剂，菌株BS1-5的D-乳酸最高产量达133.7±6.8g/L，光学纯度大于99%，发酵时间79±3h，比出发菌株缩短了31h，产酸速率为1.69±0.05(g/(L·h))，比出发菌株提高了44.4%；以碳酸钠为中和剂，该菌株的D-乳酸最高产量达92.4±5.3g/L，光学纯度99%以上，发酵时间82±3h，比出发菌株缩短了30h，产酸速率为1.12±0.03(g/(L·h))，比出发菌株提高了43.6%，显著提高了D-乳酸的生产强度，具有重要的实际产业化价值。 
除非本文另有定义，本发明相关使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的发酵工程相关使用的命名以及技术，是本领域众所周知且普遍使用的那些。 
具体实施方式
实施例1 
本实施例说明芽孢乳杆菌BS1-5的选育。
供诱变的出发菌株为实验室前期利用离子束诱变选育获得的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）Y2-8，菌种保藏登记号为CCTCC M 208052。 
1. 常压室温等离子体诱变：取厌氧培养2天的芽孢乳杆菌Y2-8菌泥，用生理盐水制成菌悬液（OD660nm约为1），将菌悬液滴加在铁片上吹干后进行等离子体诱变，注射能量为100w，工作气体流量为10L/min，照射距离为2mm，处理时间为90s。 
2. 诱变菌株的筛选：诱变后的菌株经无菌生理盐水适当稀释后，涂布于高糖-溴甲酚绿显色平板，37℃厌氧培养，观察溴甲酚绿平板上变色圈产生的时间、大小和亮度，以出发菌变色圈为对照，最终筛选到5株变色圈出现时间及大小均明显高于原始菌的突变株。将5株突变菌株接入发酵培养基，37℃培养。发酵结束后采用C18柱以HPLC法对发酵产物进行定量检测，流动相为2.5mM的磷酸二氢铵溶液，紫外检测波长230nm。产物的光学纯度检测采用手性柱，配位交换柱型号为Sumichiral CA500，流动相为1mM的CuSO4溶液，紫外检测波长254nm。经发酵筛选，最终获得一株生长及产酸速率比出发菌株显著提高、D-乳酸光学纯度99%的菌株BS1-5。 
在上述筛选高生长及产酸速率的D-乳酸生产菌的方法中，使用的高糖-溴甲酚绿固体平板培养基配方为：葡萄糖150g/L，溴甲酚绿0.1g/L，酵母膏2g/L，无水乙酸钠2g/L，无水硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾2g/L，琼脂18g/L，水余量。发酵培养基配方为：葡萄糖150g/L，酵母膏2g/L，玉米浆15ml/L，无水硫酸镁0.5g/L，麸皮15g/L，碳酸钙90g/L，pH7.0。 
3. 遗传稳定性实验：将菌株BS1-5进行连续传代，然后以第一代、第三代和第七代进行发酵测试，菌株的D-乳酸产量和发酵时间基本保持原有水平，证实菌株具有良好的遗传稳定性，可作为进一步实验和开发的D-乳酸生产菌。 
实施例2 
本实施例说明利用芽孢乳杆菌BS1-5，以葡萄糖作为碳源，碳酸钙作为中和剂，批次发酵生产D-乳酸。
平板培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，无水乙酸钠2，无水硫酸镁0.2，磷酸二氢钾2，琼脂18，水余量，pH7.0 
种子培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米浆5ml，无水硫酸镁0.2，麸皮2，碳酸钙14，水余量，pH7.0
发酵培养基（g/L）：葡萄糖150，酵母膏5，玉米浆15ml，无水硫酸镁0.5，麸皮15，碳酸钙90，水余量，pH7.0
将诱变菌株BS1-5和出发菌株Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中37℃，培养36h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，并以2~3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为120rpm，培养16h后转接入发酵培养基。
选用5L发酵罐，配置3L发酵培养基，以10%接种量进行接种，以总流速0.1L/min量通入氮气，发酵温度37℃。搅拌转速200rpm，发酵结束后采用紫外分光光度计在660nm下检测菌体量，利用液相色谱测定发酵液中D-乳酸含量及纯度，计算D-乳酸生产速率，该实验共设3组重复。结果见表1所示，菌株BS1-5的生长明显比出发菌株Y2-8旺盛，并且产酸速率比出发菌株提高了46.2%。 
表1 芽孢乳杆菌BS1-5和Y2-8产D-乳酸的情况 
菌株 发酵时间（h） OD（660nm） D-乳酸产量（g/L） D-乳酸产率（g/(L·h)） 光学纯度（%）
Y2-8 126±4 11.8±1.2 132.4±6.6 1.04±0.03 99
BS1-5 88±3 12.2±1.5 133.6±6.2 1.52±0.06 99.1
实施例3 
本实施例说明利用芽孢乳杆菌BS1-5，以玉米糖化液作为碳源，碳酸钙作为中和剂，批次发酵生产D-乳酸。
平板培养基：同实施例2 
种子培养基（g/L）：葡萄糖30，酵母膏2，蛋白胨2，玉米浆5ml，无水硫酸镁0.2，麸皮2，碳酸钙14，水余量，pH7.0。
发酵培养基（g/L）：玉米糖化液（以葡萄糖计）150，酵母膏5，玉米浆15ml，无水硫酸镁0.5，麸皮15，碳酸钙90，水余量，pH7.0。 
将诱变菌株BS1-5和出发菌株Y2-8接入平板培养基中，置于厌氧培养箱中，37℃，培养24h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，并以2~3cm厚的液体石蜡液封培养，培养温度37℃，培养转速为120rpm，培养14h后转入发酵培养基。 
选用5L发酵罐，配置3L发酵培养基，以5%接种量进行接种，以总流速0.1L/min量通入氮气，发酵温度37℃，搅拌转速120rpm，发酵结束后采用紫外分光光度计在660nm下检测菌体量，利用液相色谱测定发酵液中D-乳酸含量及纯度，计算D-乳酸生产速率，该实验共设置3组重复，结果见表2所示，菌株BS1-5生长显著较出发菌旺盛，产酸速率比出发菌株也提高了45%。 
表2 芽孢乳杆菌BS1-5和Y2-8产D-乳酸的情况 
菌株 发酵时间（h） OD（660nm） D-乳酸产量（g/L） D-乳酸产率（g/(L·h)） 光学纯度
Y2-8 128±4 11.2±1.4 128.6±5.9 1±0.02 99
BS1-5 91±3 12.0±1.6 131.7±6.3 1.45±0.04 99.1
实施例4 
本实施例说明利用芽孢乳杆菌BS1-5，以葡萄糖为碳源，碳酸钠为中和剂，批次发酵生产D-乳酸。
平板培养基：同实施例2 
种子培养基（g/L）：玉米糖化液（以葡萄糖计）25，酵母膏2，蛋白胨2，玉米浆5ml，无水硫酸镁0.2，麸皮2，碳酸钙14，水余量，pH7.0。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖150，酵母膏5，玉米浆15ml，无水硫酸镁0.5，麸皮15，碳酸钙40，水余量，pH7.0。 
将诱变菌株BS1-5和出发菌株Y2-8接入平板培养基中，置于厌氧培养箱中，37℃培养30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，并以2~3cm厚的液体石蜡液封培养，37℃培养14h后转入发酵培养基。 
选用5L发酵罐，配置3L发酵培养基，以5%接种量进行接种，以总流速0.1L/min量通入氮气，发酵温度37℃，间歇流加碳酸钠溶液维持体系pH控制在5.5，搅拌转速120rpm，发酵结束后采用紫外分光光度计在660nm下检测菌体量，利用液相色谱测定发酵液中D-乳酸含量及纯度，计算D-乳酸生产速率，该实验共设3组重复。结果见表3所示，菌株BS1-5的生长显著较出发菌旺盛，并且产酸速率比出发菌株提高了45.6%。 
表3 芽孢乳杆菌BS1-5和Y2-8产D-乳酸的情况 
菌株 发酵时间（h） OD（660nm） D-乳酸产量（g/L） 发酵初始体积（V） 发酵结束体积（V） D-乳酸产率(g/(L·h)) 光学纯度（%）
Y2-8 127±5 8.8±0.9 87.6±4.2 3 4.4±0.1 0.68±0.02 99
BS1-5 92±3 9.2±1.1 91.5±4.8 3 4.5±0.1 0.99±0.03 99.1
实施例5 
本实施例说明利用芽孢乳杆菌BS1-5，以葡萄糖为碳源，碳酸钙为中和剂，间歇补料发酵生产D-乳酸。
平板培养基：同实施例2 
种子培养基（g/L）：玉米糖化液（以葡萄糖计）20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米浆5ml，无水硫酸镁0.2，麸皮2，碳酸钙14，水余量，pH7.0。
初始发酵培养基（g/L）：玉米糖化液（以葡萄糖计）100，酵母膏5，玉米浆15ml，无水硫酸镁0.5，麸皮15，碳酸钙40，水余量，pH7.0。 
将诱变菌株BS1-5和出发菌株Y2-8接入平板培养基中，置于厌氧培养箱中，37℃培养24h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，并以2~3cm厚的液体石蜡液封培养，37℃培养16h后转入发酵培养基。 
选用5L发酵罐，配置2.5L发酵培养基，以5%接种量进行接种，以总流速0.1L/min量通入氮气，发酵温度37℃，发酵24h，加入灭菌后的400g/L玉米糖化液（以葡萄糖计）0.5L，使得补料后总碳源浓度与批次发酵的碳源浓度相同，搅拌转速120rpm，发酵结束后采用紫外分光光度计在660nm下检测菌体量，利用液相色谱测定发酵液中D-乳酸含量及纯度，计算D-乳酸生产速率，该实验共设3组重复。结果见表4所示，菌株BS1-5的生长更为旺盛，且产酸速率比出发菌株提高了44.4%。 
表4芽孢乳杆菌BS1-5和Y2-8产D-乳酸的情况 
菌株 发酵时间（h） OD（660nm） D-乳酸产量（g/L） D-乳酸产率（g/(L·h)） 光学纯度（%）
Y2-8 110±3 10.7±1.4 129.3±6.3 1.17±0.03 99
BS1-5 79±3 11.8±1.6 133.7±6.8 1.69±0.05 99.1
实施例6 
本实施例说明利用芽孢乳杆菌BS1-5，以葡萄糖为碳源，碳酸钠为中和剂，间歇补料发酵生产D-乳酸。
平板培养基：同实施例2 
种子培养基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏2，蛋白胨2，玉米浆5ml，无水硫酸镁0.2，麸皮2，碳酸钙14，水余量，pH7.0。
初始发酵培养基（g/L）：葡萄糖100，酵母膏5，玉米浆15ml，无水硫酸镁0.5，麸皮15，碳酸钙40，水余量，pH7.0。 
将诱变菌株BS1-5和出发菌株Y2-8接入平板培养基中，置于厌氧培养箱中，37℃培养30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，并以2~3cm厚的液体石蜡液封培养，37℃培养14h后转入发酵培养基。 
选用5L发酵罐，配置2.5L发酵培养基，以5%接种量进行接种，以总流速0.1L/min量通入氮气，发酵温度37℃，发酵24h，加入灭菌后的400g/L葡萄糖溶液0.5L，使得补料后总碳源浓度与批次发酵碳源浓度相同，间歇流加碳酸钠溶液维持体系pH控制在5.5，搅拌转速120rpm，发酵结束后采用紫外分光光度计在660nm下检测菌体量，利用液相色谱测定发酵液中D-乳酸含量及纯度，计算D-乳酸生产速率，该实验共设3组重复。结果见表3所示，菌株BS1-5的生长显著较出发菌旺盛，并且产酸速率比出发菌株提高了43.6%。 
表5 芽孢乳杆菌BS1-5和Y2-8产D-乳酸的情况 
菌株 发酵时间（h） OD（660nm） D-乳酸产量（g/L） 发酵初始体积（V） 发酵结束体积（V） D-乳酸产率(g/(L·h)) 光学纯度（%）
Y2-8 113±4 8.6±0.9 88.4±4.5 2.5 4.5±0.1 0.78±0.02 99
BS1-5 82±3 9.0±1.1 92.4±5.3 2.5 4.6±0.1 1.12±0.03 99.1
尽管在本文中参考示例性的实施方案详细描述了本发明，但是应当理解的是，本发明不限于所述实施方案。具有本领域普通技能且可获取本文教导的人员会认识到在本发明范围内的其它变化、修改和实施方案。因此，本发明应与后面所述的权利要求一致地被广义地解释。 

Claims (15)

1. 一株高生长及产酸速率的D-乳酸生产菌，分类命名为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus），其保藏登记号为：CCTCC No. M2012516。
2. 权利要求1所述D-乳酸生产菌在D-乳酸生产中的应用。
3. 权利要求1所述D-乳酸生产菌在缩短D-乳酸发酵时间中的应用。
4. 权利要求1所述D-乳酸生产菌在提高D-乳酸产量中的应用。
5. 权利要求1所述D-乳酸生产菌在提高D-乳酸产酸速率中的应用。
6. 一种生产D-乳酸的方法，其包括将权利要求1所述D-乳酸生产菌进行培养和发酵后获得D-乳酸。
7. 一种生产D-乳酸的方法，其包括以下步骤：
1）平板培养：将权利要求1所述D-乳酸生产菌接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30~45℃，培养时间20~48h；
2）种子培养：将经步骤1）平板培养的菌种接种到种子培养基中进行厌氧培养，培养温度30~45℃，培养时间12~24h；
3）发酵产酸：将步骤2）获得的种子培养液接种到发酵培养基中进行发酵产酸，接种量为3%~15%，发酵温度30~45℃，以总流速0.05~0.2L/min量通入氮气，采用中和剂将发酵体系pH控制在4.5~7.0。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的发酵产酸包括批次发酵和间歇补料发酵。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述间歇补料发酵包括在发酵18~48h后补加碳源，进行D-乳酸发酵生产。
10. 根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述平板培养基中含葡萄糖10~30g/L，酵母膏1~3g/L，无水乙酸钠1~4g/L，无水硫酸镁0.1~0.3g/L，磷酸二氢钾1~3g/L，琼脂18g/L，水余量。
11. 根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的碳源包括浓度为10~40g/L的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为2~20g/L的尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无水硫酸镁0.1~0.4g/L，碳酸钙10~30g/L，水余量。
12. 根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述批次发酵培养基的碳源包括浓度为100~180g/L的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为10~40g/L的尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无水硫酸镁0.1~1g/L，水余量。
13. 根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述间歇补料发酵培养基的初始碳源包括浓度为50~100g/L的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；补加碳源为葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物，通过补加使得间歇补料发酵的总体积及碳源浓度与批次发酵的体积及碳源浓度相同；氮源及生长因子包括浓度为10~40g/L的尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无水硫酸镁1~10g/L，水余量。
14. 根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，发酵产酸步骤3）所用的中和剂选自碳酸钠、氢氧化钠、氧化钙、碳氨、氢氧化钙、氢氧化钾、氨水、碳酸钙中的一种或组合。
15. 根据权利要求14所述的方法，其特征在于，发酵产酸步骤3）所用的中和剂为碳酸钠和/或碳酸钙。
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