CN103173501A - 一种以氢氧化钠作为中和剂生产d-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵生产D-乳酸的方法。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法，包括如下步骤：将芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）接种到发酵培养基中进行发酵培养，并在所述发酵培养过程中以氢氧化钠作为中和剂控制发酵液的pH，得到D-乳酸；所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）具体为为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）。本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法中，菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD CGMCC No.2185以氢氧化钠作为中和剂，大大的降低了原料成本，降低环境污染，并高效发酵产生旋光性99.3%聚合级的D-乳酸，具有很好的工业应用型前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种发酵生产D-乳酸的方法，特别涉及一种以氢氧化钠作为中和剂培养菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）生产高光学纯D-乳酸的方法。
背景技术
乳酸又称丙醇酸，分子式C3H6O3（CH3CHOHCOOH）。由于乳酸分子中存在一个不对称的碳原子，因此具有光学异构现象，从而分为D-型和L-型两种。其生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，化学法只能合成DL-乳酸，而发酵法根据所采用的菌株的不同，可以合成单一的L-乳酸、D-乳酸或者DL-乳酸。目前，约90%的乳酸是通过微生物发酵法生产的。用乳酸生产生物降解塑料，在我国具有极大的市场发展潜力，目前已成为开发的热点项目。但是，由光学纯L-乳酸制得的聚乳酸在强度、热稳定性等方面尚需进一步的改进才能适应更为广泛的应用的需要。有报道称，由聚L-乳酸和聚D-乳酸混合而成的聚乳酸与聚L-乳酸相比具有更佳的结构和性能。D-乳酸作为一种基本有机化工原料，在医药、农药、化工等方面均有十分广泛的应用。尤其是作为下一代生物可降解塑料聚乳酸的单体，正在引起全球大公司和科学家的高度关注。全球D-乳酸的需求量每年都以6%～8%的速度增长，目前全世界D-乳酸的产量为1.6万吨，而D-乳酸的需求量约2.6万吨，由此可见，D-乳酸的市场前景广泛。随着全球性的能源和资源供求关系的日益紧张，以可再生生物质原料的高浓度、高光学纯D-乳酸生物制造势在必行。发展光学纯D-乳酸生物制造技术，将会促进可降解材料——聚乳酸的发展，对实施石油替代战略，确保国家能源与资源安全具有极为重要的作用。
目前，从发酵液中提取乳酸的传统的方法是采用乳酸钙的结晶和硫酸酸化的工艺。但该工艺的主要缺点是工艺流程长、化工原料消耗多、产品回收率低，而且产生的硫酸钙对环境产生不利的影响。多年来，人们试图寻找其他的可行的提取工艺，主要有酯化法、溶剂萃取法、吸附法、离子交换法和电渗析法等，其中电渗析法技术比较成熟。但是在乳酸的发酵过程中，由于乳酸的积累pH值不断的下降，为了提高产率，需要在发酵液中添加中和剂，如CaCO3、NaOH和NH4OH等，其中CaCO3是最常用的，因为乳酸钙对菌体的胁迫要远远的低于乳酸钠，但在后续的提取过程中利用传统的中和剂（碳酸钙）来进行乳酸发酵时，膜分离技术就会存在很大的弊端—形成的氢氧化钙会吸附在膜上，增加膜的阻力，降低了电流效率，从而造成堵塞和污染膜。所以国内外对于乳酸钙的电渗析转化并不多见，最常见的是乳酸钠的转化。在实验条件下，电渗析器的电流效率接近1，乳酸钠的转化率可以达到95%。在工业条件下，应用双极膜电渗析法转化乳酸钠生产乳酸的方法对环境影响小，能降低乳酸的生产成本。但目前利用NaOH为中和剂来生产乳酸的菌种并不多，且还没有生产D-乳酸的报道。
发明内容
本发明是目的是提供一种氢氧化钠的新用途，以及发酵生产D-乳酸的方法。
本发明所提供的氢氧化钠的新用途，具体为氢氧化钠在作为中和剂发酵生产D-乳酸中的应用。
本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法，具体可包括如下步骤：将芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）接种到发酵培养基中进行发酵培养，并在所述发酵培养过程中以氢氧化钠作为中和剂控制发酵液（发酵体系，即发酵容器中的所有物质）的pH，得到D-乳酸。
在所述方法中，在所述发酵培养过程中，用所述氢氧化钠控制所述发酵液的pH恒定为5.0-7.0，如6.0-7.0，再如6.5。具体是通过流加15M的氢氧化钠水溶液来进行恒定控制的（氢氧化钠是通过pH探头检测自动流加到发酵液中的）。
在所述方法中，所述发酵培养基的碳源可为葡萄糖；所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度可为50-60g/L（如50g/L）。
在所述方法中，所述发酵培养基的氮源可为花生粕；所述花生粕在所述发酵培养基中的终浓度可为30-50g/L（如40g/L）。在本发明的一个实施例中，所述花生粕为北京康明威培养基技术有限责任公司产品，其产品目录号为38210000。
在所述方法中，所述发酵培养基还含有中性蛋白酶；其中，中性蛋白酶的酶活定义为：在测定条件（30±0.2℃；pH值7.5）下，每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长的吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位(即1U)，用U/g表示。所述中性蛋白酶用于处理所述花生粕，释放氮元素。在本发明的一个实施例中，所述中性蛋白酶具体为诺维信（中国）生物技术有限公司产品，CAS号为9068-59-1。所述中性蛋白酶在所述发酵培养基中的终浓度为1.5×104U/L。
具体的，在所述方法中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：葡萄糖50-60g/L；花生粕30-50g/L；中性蛋白酶1.5×104U/L。
更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：葡萄糖50g/L；花生粕40g/L；中性蛋白酶1.5×104U/L。
在本发明中，所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115℃高压灭菌10min。
在所述方法中，所述发酵培养的温度具体可为40-45℃（如42℃）；所述发酵培养的时间可为15-50h，如15-17h或24-50，再如15h，17h或50h。
所述发酵培养的培养方式可为震荡培养；所述震荡培养的转速具体可为50rpm（旋转半径为6cm）。
在所述方法中，为了有效的提高发酵产物D-乳酸的产量，所述发酵培养过程中，可随着发酵反应的进行向所述发酵液中补加葡萄糖；
具体的，所述补加葡萄糖的时间为所述发酵液中葡萄糖的含量开始低于20g/L时；所述补加葡萄糖的量为补加至所述发酵液中葡萄糖的含量达到50g/L。
在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的时间为50h，共进行了3次补料，分别为第12h、18h和26h。
在所述方法中，所述发酵培养的前12h（菌体的快速生长期）可进行通气，通气量为0.5(V／V·min)。所述通气量以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示，如0.5(V／V·min)表示每分钟内通入气体的体积为培养液体积的一半。12h后（生产积累D-乳酸期）可切断通气。
本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法中，接种到所述发酵培养基中进行培养的所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）是经过活化的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillussp.）。
在本发明的一个实施例中，其活化方法（适于不补料的单次发酵培养）具体包括如下步骤：将所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）接入种子培养基，在42℃静止培养48h，得到培养物，将所述培养物按照1：10的体积比转接到新的种子培养基中，继续42℃静止培养24h，得到所述活化的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）。
在本发明的另一个实施例中，其活化方法（适于多次补料发酵培养）具体包括如下步骤：1）将所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）接入种子培养基，在42℃静止培养48h，得到培养物1，将所述培养物1按照1：10的体积比转接到新的种子培养基中，继续42℃静止培养24h，得到培养物2；
2）将步骤1）所述培养物2按照1：10的体积比转接到新的种子培养基中，继续42℃静止培养24h，得到所述活化的芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）。
上述所有的所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，碳酸钙30g/L；pH为6.5。各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。所述酵母粉为商业化产品，可以从国内生产商购买，比如安琪酵母股份有限公司。
在所述方法中，所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus sp.）可为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）。
在本发明的一个实施例中，所述菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）具体为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD CGMCC No.2185。
本发明所提供的发酵生产D-乳酸的方法中，菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillusinulinus）CASD CGMCC No.2185以氢氧化钠作为中和剂，大大的降低了原料成本，降低环境污染，并高效发酵产生旋光性99.3%聚合级的D-乳酸，具有很好的工业应用型前景。
附图说明
图1为分批补料发酵模式高效生产D-乳酸，发酵液中相应葡萄糖和D-乳酸浓度的变化。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的各参数测定方法均如下：
（1）L-乳酸和葡萄糖的测定方法：采用SBA-40C分析仪，双电机系统测定L-乳酸和葡萄糖的原理是根据酶反应：L-乳酸（葡萄糖）+O2+H2O→丙酮酸（葡萄糖酸）+H2O2。此反应时在固定化的L-乳酸氧化酶（葡萄糖氧化酶）的作用下完成的，反应产生的H2O2与L-乳酸（葡萄糖）的含量呈正比，通过过氧化氢电极来检测H2O2的生成量，从而知道L-乳酸（葡萄糖）的含量。
测定方法：样品离心后收集上清，经适当稀释后由进样针吸取25μl，并注入反应池，底物透过酶膜圈与固定化酶层接触并反应，并产生电流信号，该电流信号与底物的浓度成线性比例关系，经微机控制的信号，可直接显示并打印结果。
（2）D-乳酸浓度的测定方法：采用Agilent1260液相色谱仪，配备手性分离柱（日本三菱化学公司，MCI GEL-CRS10W，4.6mm ID×50mm）。具体操作条件为：2mM的硫酸铜作为流动相，流量0.5mL/min，进样量5μL，紫外检测器，检测波长254nm，操作温度25℃。利用D-乳酸标准品做出标准曲线，再根据标准曲线计算出发酵液（发酵体系）中D-乳酸的含量。
（3）糖酸转化率均定义为：D-乳酸产量（克/升）÷葡萄糖的消耗量（克/升）×100%。
（4）光学纯度（optical purity）：是衡量旋光性样品中一个对映体超过另一个对映体的量的量度，它可用对映体过量值（enantiomeric excess）表示。本发明中D-乳酸的光学纯度按以下公式计算：D-乳酸含量÷（D-乳酸含量+L-乳酸含量）×100%。
菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD，该菌株已于2007年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.2185（专利授权公告号CN100485027C）。
花生粕：为北京康明威培养基技术有限责任公司产品，其产品目录号为38210000。
中性蛋白酶：为诺维信（中国）生物技术有限公司产品，CAS号为9068-59-1，其酶活为5×104U/g。其中，中性蛋白酶的酶活定义为：在测定条件（30±0.2℃；pH值7.5）下，每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长的吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位(即1U)。
种子培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：葡萄糖50g/L，酵母粉（安琪酵母股份有限公司）10g/L，碳酸钙30g/L；pH为6.5。各浓度为相应组分在所述发酵培养基中的终浓度。所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115℃高压灭菌10min。
实施例1、高效生产D-乳酸的最适pH值的确定
本实施例所用发酵培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：50g/L葡糖糖，40g/L花生粕，0.3g/L（相当于1.5×104U/L）中性蛋白酶。各浓度为相应组分在发酵培养基中的终浓度。所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115℃高压灭菌10min。本实施在整个发酵培养过程中，自始自终通过流加浓度为15M的氢氧化钠水溶液来恒定控制发酵液的pH值为5.0（或5.5，或6.0，或6.5或7.0）（氢氧化钠是通过pH探头检测自动流加到所述发酵培养基中的），分析不同pH值下D-乳酸产量、糖酸转化率、D-乳酸产量光学纯度以及发酵时间等，确定高效生产D-乳酸的最适pH值。
确定用于生产D-乳酸的最适pH值浓度的具体步骤如下：
1）种子菌培养：将保存在MRS固体培养基上的菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillusinulinus）CASD CGMCC No.2185用接种环接一环到含有6mL种子培养基的试管中，42℃静止培养48h，然后从中取3mL转接到含有30mL新鲜种子培养基的三角瓶中，42℃静止培养24h，得到种子液（活化的菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD CGMCC No.2185）。
2）将步骤1）的种子液按体积比1：10的接种量接到五份上述发酵培养基（2L/份）中。于42℃条件下50rpm（旋转半径为6cm）震荡发酵培养，期间通过流加浓度为15M的氢氧化钠水溶液来恒定控制五份发酵液的pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）（氢氧化钠是通过pH探头检测自动流加到所述发酵培养基中的）。从0h（将种子液接种到发酵培养基中的一刻）开始，每隔适当的时间，取发酵液，12000rpm离心10min后，取上清液稀释合适的倍数测定如下参数：葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度；计算糖酸转化率和D-乳酸的光学纯度。实验设3个重复，结果取平均值。
结果显示，当发酵液pH值为6.5时，发酵15h时葡萄糖基本消耗完毕；当发酵液的pH值为6.0和7.0时，发酵17h时葡萄糖基本消耗完毕；发酵液的pH值为5.0和5.5时，在20h发酵结束时残糖浓度依旧很高。在20h发酵结束时，五种不同pH值条件下（5.0，5.5，6.0，6.5，7.0），发酵液中D-乳酸的产量分别为：15.27g/L、22.54g/L、39.97g/L、48.21g/L和46.68g/L。依据发酵时间短，糖酸转化率高和D-乳酸产量高，确定发酵培养过程中的最适pH值为6.5。
表1 生产D-乳酸的最适pH的确定结果（42℃发酵20h）
实施例2、多次补料发酵生产高纯D-乳酸
本实施例所用发酵培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：50g/L葡糖糖，40g/L花生粕，0.3g/L（相当于1.5×104U/L）中性蛋白酶。各浓度为相应组分在发酵培养基中的终浓度。所述发酵培养基需经高压灭菌，具体为115℃高压灭菌10min。本实施在整个发酵培养过程中，自始自终通过流加浓度为15M的氢氧化钠水溶液来恒定控制发酵液的pH值为6.5（氢氧化钠是通过pH探头检测自动流加到所述发酵培养基中的）。
多次补料发酵生产D-乳酸的具体步骤如下：
1）种子菌培养：将保存在MRS固体培养基上的菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillusinulinus）CASD CGMCC No.2185用接种环接一环到含有6mL种子培养基的试管中，42℃静止培养48h，然后从中取3mL转接到含有30mL新鲜种子培养基的三角瓶中，42℃静止培养24h，接着从中取20mL转接到含有200mL新鲜培养基的三角瓶中，42℃静止培养24h，得到种子液（活化的菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASDCGMCC No.2185）。
2）将步骤1）的种子液按体积比10%的接种量接到2L的上述发酵培养基中。42℃，搅拌转速为50rpm（旋转半径为6cm），培养发酵50小时，期间通过流加浓度为15M的氢氧化钠水溶液来恒定控制发酵液的pH值为6.5（氢氧化钠是通过pH探头检测自动流加到所述发酵培养基中的）。其中前12h进行通气，其通气量为0.5(V／V·min)（所述通气量以每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示，如0.5(V／V·min)表示每分钟内通入气体的体积为培养液体积的一半）。之后断掉通气。当发酵液中的葡萄糖的浓度开始低于20g/L时，向发酵培养基中加入高浓度（80g/100ml）的葡萄糖至葡萄糖的浓度达到初始葡萄糖的浓度（50g/L）。在第12h、18h和第26h各进行一次补料。从0h（将种子液接种到发酵培养基中的一刻）开始，每隔适当时间取发酵液，12000rpm离心10min后，取上清液稀释适当倍数测定如下参数：葡萄糖浓度、L-乳酸浓度和D-乳酸浓度；计算糖酸转化率和D-乳酸光学纯度。实验设3个重复，结果取平均值。
结果如图1和表2所示，发酵50h结束时通过3次补料，发酵液中D-乳酸浓度达到118.23g/L，糖酸转化率达到89.13%，D-乳酸的光学纯度达到99.3%。这一结果表明，菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASD CGMCC No.2185在以氢氧化钠为中和剂，并且在生长前期（前12h）通气培养使菌体快速生长，有利于后期（12h之后）的积累D-乳酸，从发酵生产D-乳酸中，显示出该方法有可能应用于工业上乳酸膜分离的应用前景。
表2 多次补料发酵模式实验高效生产D-乳酸3次重复实验的结果
| 重复 | D-乳酸产量（g/L） | 糖酸转化率（%） | D-乳酸光学纯度（%） |
| 1 | 115.24 | 89.1 | 99.2 |
| 2 | 120.89 | 87.5 | 99.4 |
| 3 | 118.56 | 90.8 | 99.2 |
| 平均值±标准差 | 118.23±2.84 | 89.13±1.65 | 99.3±0.1 |
Claims (10)
1.氢氧化钠在作为中和剂发酵生产D-乳酸中的应用。
2.一种发酵生产D-乳酸的方法，包括如下步骤：将芽孢乳杆菌（Sporolactobacillussp.）接种到发酵培养基中进行发酵培养，并在所述发酵培养过程中以氢氧化钠作为中和剂控制发酵液的pH，得到D-乳酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述发酵培养过程中，用所述氢氧化钠控制所述发酵液的pH恒定为5.0-7.0。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的碳源为葡萄糖；所述葡萄糖在所述发酵培养基中的终浓度为50-60g/L；或
所述发酵培养基的氮源为花生粕；所述花生粕在所述发酵培养基中的终浓度为30-50g/L；或
所述发酵培养基还含有中性蛋白酶；所述中性蛋白酶在所述发酵培养基中的终浓度为1.5×104U/L。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为40-45℃；或
所述发酵培养的时间为15-50h。
6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养方式为震荡培养；所述震荡培养的转速为50rpm。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养过程中，向所述发酵液中补加葡萄糖；
所述补加葡萄糖的时间为所述发酵液中葡萄糖的含量开始低于20g/L时；
所述补加葡萄糖的量为补加至所述发酵液中葡萄糖的含量达到50g/L。
8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的前12h进行通气，通气量为0.5(V／V·min)。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述芽孢乳杆菌（Sporolactobacillussp.）为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）为菊糖芽孢乳杆菌（Sporolactobacillus inulinus）CASDCGMCC No.2185。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130626 |