CN108658698A

CN108658698A - 一种新型微生物复合肥的制备方法

Info

Publication number: CN108658698A
Application number: CN201810419050.1A
Authority: CN
Inventors: 李政; 张健飞; 巩继贤
Original assignee: Tianjin Polytechnic University
Current assignee: Tianjin Polytechnic University
Priority date: 2014-01-23
Filing date: 2014-01-23
Publication date: 2018-10-16
Also published as: CN108753639A; CN104805029B; CN104805029A; CN108676743A

Abstract

本发明涉及一种新型微生物复合肥的制备方法，属于农用肥料技术领域，所述新型微生物复合肥的重量份数组成为：解磷巨大芽抱杆菌菌剂，枯草芽孢杆菌培养物，黑曲霉培养物，植物乳杆菌剂,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li‑2013‑02保藏号为CGMCC No.7926，所述枯草芽孢杆菌培养物制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕后，发酵液经过板框过滤、干燥，获得含有枯草芽孢杆菌菌剂和酶制剂的培养物，该培养物具有能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力的特点。

Description

一种新型微生物复合肥的制备方法

本分案申请的原始发明专利的申请日为2014年01月23日，申请号为：201410034895.0,名称为“一种微生态肥的制备方法”。

技术领域

本发明涉及一种新型微生物复合肥，属于农用肥料技术领域。

背景技术

微生物肥料的功效发挥主要是通过对传统化肥、有机肥的增效作用，对土壤的改良活化作用，以及微生物的生理作用等方式来实现的。微生物肥是一种以微生物生命活动及其产物导致农作物得到特定肥料效应的微生物活体制品，它在培肥地力、提高化肥利用率、抑制农作物对重金属及农药等有害物质的吸收、净化和修复土壤、促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用、提高农产品品质等方面有着不可替代的作用。

微生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的基础，而不像其它肥料是以氮、磷、钾等主要元素的形式和多少为基础。正因为微生物肥料是活制剂，所以其肥效与活菌数量、强度及周围环境条件密切相关，包括温度、水分、酸碱度、营养条件及原生活在土壤中土著微生物排斥作用都有一定影响。

黑曲霉，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，其产物对人体安全无害，是重要的发酵工业菌种。比如申请号为“201110385820.3”的发明专利公开了一种黑曲霉进行固态发酵制备可溶性玉米肽，采用固态发酵在培养过程中无需震荡培养，培养条件相较于液态发酵简单，可以大大提高产物的反应效率、降低成本。

由于我国长期在微生物肥料方面研究缺乏投入，使得我国的微生物肥料产业依然存在整体水平不高、技术创新不足、产品质量与应用效果表现欠稳定的问题。在农业可持续发展已成为人类共识的今天，这些问题成了微生物肥行业函待打通的“瓶颈”。

发明内容

本发明所要解决的技术问题提供一种新型微生物复合肥的制备方法：

将以下重量份数的组分混合或混合后制粒：解磷巨大芽抱杆菌菌剂1-5份，枯草芽孢杆菌培养物16-25份，黑曲霉培养物10-18份，植物乳杆菌剂5-12份。

所述枯草芽孢杆菌培养物制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经过板框过滤、干燥后获得含有枯草芽孢杆菌菌剂和酶制剂的培养物。

植物乳杆菌剂的制备方法：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为：CaCO₃20-23份，糊精10-12份。流化床干燥，干燥温度50℃。

黑曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到固态发酵培养料中，26-33℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物；采用常见固态发酵法制备获得。

本产品使用方法简单，每亩地使用量0.3-1公斤，成本仅为80-100元/亩，拌种或生长期灌水前地表喷洒。

有益效果

本发明的肥料营养丰富，有机质含量高。能够满足有机食品的生产需要。

本发明的肥料由复合微生物发酵而成，能够改善土壤的微生态环境，为农作物的生长提供有益条件。

本发明的肥料能够增强作物的抗病虫害能力。

本发明的肥料能够改良土壤。肥料中有益微生物能产生糖类物质，占土壤有机质的0.1％，与植物粘液，矿物胚体和有机胶体结合在一起，可以改善土壤团粒结构，增强土壤的物理性能和减少土壤颗粒的损失，在一定的条件下，还能参与腐殖质形成。所以施用微生物肥料能改善土壤物理性状，有利于提高土壤肥力。

具体实施方式：

除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的反应条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

解磷巨大芽抱杆菌是芽抱杆菌属(Bacillus)中的一个种。运动，形成荚膜，好氧。从葡萄糖产酸，也常从阿拉伯糖和甘露醇产酸。水解淀粉，不产生卵磷脂酶，VP阴性。能分解土壤中的有机磷成为植物可利用的速效磷。

解磷巨大芽孢杆菌剂由沧州旺发生物技术研究所提供，地址：中国河北沧州市运河区解放西路颐和国际商务中心A座1区807-812。

河北保定瑞谷生物科技有限公司提供胶质芽孢杆菌菌粉。

本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.7926。

所述菌株特点如下：

所述菌株在固体平板上菌落颜色为乳白色，表面干燥不透明，边缘整齐，为具有运动性的好氧菌。镜检为长杆状，革兰氏染色呈阳性。该菌可利用柠檬酸盐，硝酸还原、V-P实验成阳性。

所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Li-2013-02由一株保藏于天津工业大学实验室的产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，具体筛选步骤如下：

(1)菌悬液的制备

将在平板划线分离后长出的Li-2013单菌落接入种子培养基中，100r/min，40℃培养12h后，取1mL培养液离心后用生理盐水洗涤两次，并重悬与9mL生理盐水中。

(2)紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变

将菌悬液置于无菌平板中，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下搅拌照射100s。将经过照射的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板，并以未经紫外照射的菌液稀释涂平板做对照。将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上筛选出水解圈与菌落直径比值最大者挑至斜面保存，纯化后配制成菌悬液，经梯度稀释后与硫酸二乙酯原液充分混合，并于40℃震荡处理40min，将处理过的菌液经梯度稀释后涂布于氯化锂平板。

(3)高产菌种的初筛

将上述涂布均匀的平板，置40℃培养48h，在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后获得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03

(4)摇瓶发酵复筛

将获得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，40℃、100r/min培养72h，离心取发酵上清液制得粗酶液。

(5)酶活测定

酶活单位的定义：1mL粗酶液，于105℃、pH 4.2条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。

经测定，菌株Li-2013-02,为稳定的最高产菌株，且酶活达到30000U/mL，比原始菌株酶活提高1.6倍。

所述氯化锂平板：淀粉1％，蛋白胨1％，(NH)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂ 0.2％，氯化锂0.9％，琼脂2％。

所述的种子培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％。

所述的发酵培养基：玉米粉5％～15％，豆饼粉4％～10％，(NH)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂ 0.2％。

所述的摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10％(V/V)，100r/min、40℃发酵培养72h。

由菌株Li-2013-02发酵获得了一种耐高温的α-淀粉酶，其酶学性质如下：

(1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在105-115℃之间，且在110℃以下保存的温度稳定性较好，而115℃以上保存长时间温度稳定性较差。

(2)该酶最适反应pH值为4.2。在pH值3.0-7.0之间均有较高酶活力，在pH值为3.0时酶活完全稳定。

(3)酶活性：由本发明所提供的突变株Li-2013-02,制备的耐高温α-淀粉酶酶活力为30000-35000U/ml。

1、本发明使用紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变的方法获得了一株高产耐高温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌Li-2013-02，该菌株具有强耐酸、耐热性，产酶活力高的特点。

2、有该菌株生产所得的耐高温α-淀粉酶酶活力高达30000-35000u/ml,；适用温度范围为25-115℃，最适反应温度110℃，在110℃酶活完全稳定；适用反应pH值范围为3.0-7.0，在pH值为3.0时酶活完全稳定，最适反应pH值为4.2，比现有的耐高温α-淀粉酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。

本发明提供的黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03是由天津工业大学实验室保藏的一株产纤维素酶的黑曲霉Aspergillus niger Li-2010经亚硝基胍多轮诱变筛选，然后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillusniger Li-2013-03。

本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.7927。

本发明黑曲霉菌株Aspergillus niger Li-2013-03(CGMCC No.7927)具有以下微生物学特征：

1、形态学特征：

黑曲霉菌株CGMCC No.7927，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径45-75μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基10-20(长度)×4.5-7.0(直径)μm，瓶梗6-10(长度)×2.5-3.5(直径)μm，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5μm，褐色，壁粗糙。

2、培养学特征：

菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天孢子可铺满斜面；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。

3、生理生化特征：

黑曲霉菌株CGMCC No.7927可在玉米秸秆、稻草、木屑、马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生长，最适pH范围5-6，最适生长温度范围28-33℃，最适产酶温度范围28-30℃。

本发明黑曲霉菌株CGMCC No.7927的筛选技术路线为：出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→遗传稳定性测定→扩大实验(发酵性能测定)。

按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株黑曲霉菌Aspergillus niger Li-2013-03，发酵96小时后纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。

28℃发酵4天直径75mm，发酵液纤维素酶的的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。

产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：

1)斜面培养：将原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li-2010划线接种斜面培养基，30℃培养2～3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下：120Brix麦芽汁l000mL，pH值自然，121℃灭菌20min；

2)孢子悬液制备(以下步骤均在无菌条件下操作)：向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。

3)亚硝基胍(NTG)诱变

A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成10⁶-10⁷个/mL。

B.取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。

C.在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。

D.适当稀释将孢子浓度调节为10³个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养2～3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。(所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min)。

E.复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％(v/v)，30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。(所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。

4)遗传稳定性试验

将Li-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。

5)放大试验

①种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus niger Li-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。

③种子罐培养：将种子液以10％(v/v)接种量接入装有7.5L发酵液的10L发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量(v/v)1:0.8-1.2,培养时间96h，溶解氧20-30％。所述发酵培养基组成为：纤维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min。

发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株Aspergillusniger Li-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株Aspergillus niger Li-2010提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。

实施例1

枯草芽孢杆菌培养物的制备方法：

1.发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液；

(1)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度35℃，培养时间24小时；

(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度35℃，培养时间24小时；

(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度35℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1:0.5,罐压0.05Mpa,培养时间24小时；

(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以10％接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度35℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1:0.5,罐压0.05Mpa,培养时间24小时。

培养基组成：葡萄糖6％,酵母提取物1％,蛋白胨0.2％，CaCO₃ 1％,pH6.8。

植物乳杆菌剂的制备方法：

常规种子发酵培养方法获得种子液；

发酵罐培养：将一级种子罐菌种以5％接种量接入总容积为3吨罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度28℃，罐压0.05Mpa,培养时间22小时。发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5:1，载体组成为：CaCO₃ 25份，糊精12份。流化床干燥，干燥温度50℃。

培养基组成为：酪蛋白胨1％,牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二胺0.2％，Tween 80 0.1％，K₂HPO₄ 0.2％，MgSO₄.7H₂O 0.02％，MnSO₄.H₂O0.005％，CaCO₃ 2％，琼脂1.5％，pH6.8。

植物乳杆菌菌种为CICC20261.

实施例2

新型微生物复合肥的重量份数组成为：解磷巨大芽抱杆菌菌剂3份，枯草芽孢杆菌培养物20，黑曲霉培养物15份，植物乳杆菌剂10份。

实施例3

新型微生物复合肥的重量份数组成为：解磷巨大芽抱杆菌菌剂1份，枯草芽孢杆菌培养物25，黑曲霉培养物18份，植物乳杆菌剂5份。

实施例4

新型微生物复合肥的重量份数组成为：解磷巨大芽抱杆菌菌剂5份，枯草芽孢杆菌培养物25份，黑曲霉培养物10份，植物乳杆菌剂12份。

制备方法：按照上述比例混合即可，必要时可造粒。

产品效果实验

试验地的选择与试验设计：试验于2009年3月27日—10月30日在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。

试验田达到田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.6公斤，出苗1个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.4公斤，对照组使用常规肥料。

发明产品使用玉米地玉米产量达到650公斤，对照组达到510公斤；该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了420公斤，比对照组单产提高了20％。且试验田土壤结构良好，无大块和板结。

Claims

1.一种新型微生物复合肥的制备方法，其特征在于，将如下重量份数的菌剂混合或混合后制粒：解磷巨大芽孢杆菌菌剂3份，枯草芽孢杆菌培养物20份，黑曲霉培养物15份，植物乳杆菌剂10份，所述枯草芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.7926，所述黑曲霉保藏编号为CGMCC No.7927；所述植物乳杆菌保藏编号为CICC No.20261；

(1)所述枯草芽孢杆菌培养物的制备方法如下：

①一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

②二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；

③三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；

④一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05MPa，培养时间24小时；

⑤发酵培养：将一级种子罐菌种以10％接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件：培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05MPa，培养时间24小时；

(2)所述黑曲霉培养物制备方法如下：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到固态发酵培养料中，26-33℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物；采用常见固态发酵法制备获得。

2.根据权利要求1所述的一种新型微生物复合肥的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌剂的制备方法：

利用常规种子发酵培养方法获得种子液；发酵罐培养：将一级种子罐菌种以5％接种量接入总容积为3吨罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度28℃，罐压0.05Mpa，培养时间22小时；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液；添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5：1，载体组成为：CaCO₃ 25份，糊精12份；流化床干燥，干燥温度50℃。

3.根据权利要求2所述的一种新型微生物复合肥的制备方法，其特征在于，

所述植物乳杆菌剂制备方法中的发酵培养基组成为：酪蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二胺0.2％，Tween80 0.1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，MnSO₄.H₂O 0.005％，CaCO₃ 2％，琼脂1.5％，pH6.8。