CN102277349A - 生物复合酶生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物复合酶生产方法，本发明属于生物技术领域，特别涉及生物复合酶产品。本发明产品的具体生产方法步骤如下：分别培养制备泡盛曲霉培养物、植物乳杆菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂；菌剂按照如下比例复配混合：泡盛曲霉培养物50-80份。植物乳杆菌剂5-10份，枯草芽孢杆菌菌剂20-40份。经多年实验证明，土壤生物酶可促使活土层的土壤疏松，提高土壤肥力，营造一个适宜于作物根系生长的良好土壤环境。土壤生物酶的转化，在降低农业生产成本、减少化肥的使用、恢复土壤生态地力和有效提高农作物产量等方面均能起到显著的作用。充分发挥土壤的有机质效能。
Description
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及生物复合酶产品。
背景技术
生物复合酶普遍应用于纺织、食品加工、医药、发酵、烟草陈化、饲料等行业。但应用于改善土壤，促进农作物生长尚属首次，未见资料报导。
工业微生物生产的非常规胞外复合酶与胞内复合酶的合理配伍，能有效促进其它微生物的生长。并对大部分生物、代谢物的产生具有正面效应，同时对微生物酶激活作用明显，提出了开发发酵行业制剂产品的设想。
同时研发了针对土壤微生物的复合酶制剂(土壤生物复合酶)，从大发酵概念上看，地球可看做一个发酵罐，土壤微生物的生长，土壤有机质的合理转化，对植物生长的促进作用不可估量。我们认为利用工业微生物的代谢酶，促进并激活土壤微生物及植物的内源酶活性，促进微生物及植物生长。对土壤改善与提高作物产量具有重大意义。由于化肥的长期使用，会损害土壤合适的菌群结构及土壤的团粒结构。所以保护生态及地力已成为目前农业问题的重点。因为农业生产大量使用化肥，植物对化肥的依赖度不断加大，抑制了土壤转化能力。有机肥作用难以充分发挥，土壤结构不宜改善。
发明内容
本发明的目的是提供生物复合酶生产方法。
本发明产品的具体生产方法步骤如下：
分别培养制备泡盛曲霉培养物、植物乳杆菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂；菌剂按照如下比例复配混合：泡盛曲霉培养物50-80份。植物乳杆菌剂5-10份，枯草芽孢杆菌菌剂20-40份。
具体如下：1.菌剂培养制备：
枯草芽孢杆菌剂培养制备：枯草芽孢杆菌菌剂制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的40-50％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7∶1，载体组成为：CaCO3 20-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50℃。
植物乳杆菌剂的制备方法：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7∶1，载体组成为：CaCO3 20-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50℃。
泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，26-35℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物；
2.菌剂复配比例如下：
泡盛曲霉培养物50-80份。植物乳杆菌剂5-10份，枯草芽孢杆菌菌剂20-40份；采用的菌种为常见枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和泡盛曲霉(Aspergillu sawamori)。
本发明中酶活力单位IU定义为1分钟内催化1微摩尔底物转化所用的酶量。
本发明中采用微生物平板计数方法检测活菌数。
本发明中采用常规酶活力检测方法检测酶活。
本发明方法得到产品由泡盛曲霉培养物。植物乳杆菌剂和枯草芽孢杆菌菌剂组成，所述生物复合酶每克产品中枯草芽孢杆菌4.0～9.5×108个、泡盛曲霉4.0～8.5×107个、蛋白酶150～200IU、β-葡聚糖酶200～250IU、木聚糖酶50～150IU、纤维素酶100～120IU、淀粉酶250～300IU。
所述生物复合酶由泡盛曲霉培养物50-80份、植物乳杆菌剂5-10份、枯草芽孢杆菌菌剂20-40份组成；上述比例为质量比。
本发明中菌剂复配的较优比例为：泡盛曲霉培养物60-80份，植物乳杆菌剂5-8份，枯草芽孢杆菌菌剂20-30份。
本产品使用方法简单，每亩地使用量0.3-1公斤，成本仅为80-100元/亩，拌种或生长期灌水前地表喷洒。
有益效果：
经多年实验证明，土壤生物酶的转化能改善因长期偏施化肥而引起的土壤板结、酸化、盐渍化的问题。使沙土团聚、粘土疏松，增强保水、保肥能力，土壤中大量的生物酶有分解磷的能力，但长期使用大量的无机化肥和农药，使有些有益菌灭绝消失。所以，我们用适量的生物复合酶施入土壤，可促使活土层的土壤疏松，提高土壤肥力，营造一个适宜于作物根系生长的良好土壤环境。土壤生物酶的转化，在降低农业生产成本、减少化肥的使用、恢复土壤生态地力和有效提高农作物产量等方面均能起到显著的作用。充分发挥土壤的有机质效能。
具体实施方式
具体实施方式：除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的反应条件、分离提取条件进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：
本发明产品组成组成为：每克产品中枯草芽孢杆菌8.0×108个、泡盛曲霉4.0×107个、蛋白酶200IU、β-葡聚糖酶220IU、木聚糖酶100IU、纤维素酶110IU、淀粉酶270IU。
本发明产品的具体生产方法步骤如下：
菌剂培养制备：
枯草芽孢杆菌剂培养制备：枯草芽孢杆菌菌剂制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的50％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.6∶1，载体组成为：CaCO3 30份，糊精15份。流化床干燥，干燥温度50℃。
植物乳杆菌剂的制备方法：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.6∶1，载体组成为：CaCO3 30份，糊精16份。流化床干燥，干燥温度50℃。
泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，30℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床45℃干燥，粉碎干燥物；
菌剂复配重量比例如下：泡盛曲霉培养物70份，植物乳杆菌剂6份，枯草芽孢杆菌菌剂30份，采用的菌种如下：
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp)CGMCC1.1630，
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC1.124，
泡盛曲霉(Aspergillus awamori)CGMCC3.6484。
上述三种菌种的保藏单位是中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市中关村北一条13号中科院微生物研究所；邮编：100080。
泡盛曲霉菌剂的制备方法：
技术方案如下：
斜面菌种活化培养：将泡盛曲霉斜面菌种转接到斜面培养基上，27℃培养3天。
固体一级种子培养：挑取泡盛曲霉斜面菌种接入装有100克培养基的500毫升三角瓶中进行种子培养，30℃培养3天即可。
固体二级种子培养：将上述培养好的固体一级种子搅拌为碎块后加入装有1000克培养基的5000毫升三角瓶中进行种子培养，培养条件：30℃培养3天即可。
固体发酵培养：将二级摇瓶种子粉碎，加入装有灭菌培养基的发酵池或托盘中混合均匀后培养，曲料培养温度控制在26-35℃，湿度80-90％，每隔10小时翻料一次，培养时间5-7天；固体曲料的培养采用常用曲料培养技术；待培养料长满菌丝即可结束培养，培养基预先经高温蒸煮灭菌处理，灭菌条件控制温度121℃，时间1小时。
干燥粉碎：发酵结束培养料在流化床或其他干燥设备上进行干燥，干燥温度控制在60℃，干燥到水分含量在10％以下，然后将固体培养料进行粉碎，物料粉碎孔径在60目以上。
培养基组成：固体原料：麸皮80％，豆饼粉10％，玉米淀粉10％，添加等量自来水；初始pH自然。
枯草芽孢杆菌的制备：
1.发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得枯草芽孢杆菌发酵液。
(1)一级种子培养：将枯草芽孢杆菌斜面菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度30℃，培养时间24小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以10％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养时间24小时；
(5)发酵培养：将一级种子罐菌种以10％接种量接入总容积为1.5吨二级种子罐，发酵培养基装量1吨，培养条件培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养时间24小时。
培养基组成：葡萄糖6％，酵母提取物1％，蛋白胨0.2％，CaCO3 1％，pH6.8。
植物乳杆菌剂的制备方法：
(1)一级种子培养：将植物乳杆菌菌种接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；
(2)二级种子培养：将一级种子按照10％的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
(3)三级种子培养：将二级种子以10％接种量接入5000毫升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，培养温度30℃，培养时间24小时；
(4)一级种子罐培养：将三级种子以5％接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30℃，罐压0.05Mpa，培养时间18小时；
(5)发酵罐培养：将一级种子罐菌种以5％接种量接入总容积为3吨二级种子罐，发酵培养基装量2吨，培养条件培养温度30℃，罐压0.05Mpa，培养时间22小时。
培养基组成为：酪蛋白胨1％，牛肉提取物1％，酵母提取物0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二胺0.2％，Tween 800.1％，K2HPO40.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·H2O0.005％，CaCO3 2％，琼脂1.5％，pH6.8。
实施例2：基本同实施例1。
本发明产品组成为：每克产品中枯草芽孢杆菌4.0×108个、泡盛曲霉4.0×107个、蛋白酶150IU、β-葡聚糖酶250IU、木聚糖酶50IU、纤维素酶100IU、淀粉酶250IU。
本发明产品的具体生产方法步骤如下：
菌剂培养制备：
枯草芽孢杆菌剂培养制备：枯草芽孢杆菌菌剂制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的50％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5∶1，载体组成为：CaCO3 20份，糊精10份。流化床干燥，干燥温度50℃。
植物乳杆菌剂的制备方法：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％，得到菌浓缩液。添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.7∶1，载体组成为：CaCO3 40份，糊精20份。流化床干燥，干燥温度50℃。
泡盛曲霉培养物制备：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，30℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床45℃干燥，粉碎干燥物；
菌剂复配重量比例如下：泡盛曲霉培养物50份。植物乳杆菌剂10份，枯草芽孢杆菌菌剂40份。
产品效果实验：
试验地的选择与试验设计：试验于2009年4月27日-9月30日在宁夏盐池县花马池镇八堡村进行。
试验田达到田种植玉米10亩，分别在种植时使用本发明产品每亩0.5公斤，、出苗1个月左右通过锄地松土方式使用发明产品0.5公斤，对照组使用常规肥料。
发明产品使用玉米地玉米产量达到650公斤，对照组达到490公斤；发明产品的使用使玉米亩产量提高了30％。该地块在第2年种植春小麦，春小麦产量达到了410公斤，比对照组单产提高了20％。且试验田土壤结构良好，无大块和板结。
Claims (6)
1.一种生物复合酶生产方法，包括如下步骤：
分别培养制备泡盛曲霉培养物、植物乳杆菌剂、枯草芽孢杆菌菌剂；菌剂按照如下比例复配混合得到：泡盛曲霉培养物50-80份，植物乳杆菌剂5-10份，枯草芽孢杆菌菌剂20-40份。
2.一种如权1所述生物复合酶生产方法，其特征在于所述枯草芽孢杆菌剂培养制备方法如下：枯草芽孢杆菌菌剂制备：从斜面转接培养枯草芽孢杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕离心分离获得湿菌体和发酵液；发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的40-50％，得到菌浓缩液；添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7∶1，载体组成为：CaCO3 20-40份，糊精10-20份；流化床干燥，干燥温度50℃。
3.一种如权1所述生物复合酶生产方法，其特征在于所述植物乳杆菌剂的制备方法如下：从斜面转接培养植物乳杆菌，逐级扩培后的种子液转接入发酵罐中，发酵完毕发酵液经低温负压真空浓缩到原体积的45％；添加载体：向浓缩液中添加混合好的载体，混合均匀；浓缩液与载体的重量比为0.5-0.7∶1，载体组成为：CaCO3 20-40份，糊精10-20份。流化床干燥，干燥温度50℃。
4.一种如权1所述生物复合酶生产方法，其特征在于所述泡盛曲霉培养物制备方法如下：菌种培养，固体发酵培养：孢子液接种到米曲霉固态发酵培养料中，26-35℃培养至菌丝长满培养料，低温流化床干燥，粉碎干燥物。
5.一种如权1所述生物复合酶生产方法，其特征在于所述菌剂复配比例为泡盛曲霉培养物60-80份。植物乳杆菌剂5-8份，枯草芽孢杆菌菌剂20-30份。
6.一种如权1或5所述生物复合酶生产方法，其特征在于所述菌剂复配比例为：泡盛曲霉培养物50份。植物乳杆菌剂10份，枯草芽孢杆菌菌剂40份。
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